产3_羟基丙酸重组菌的构建及其转化甘油的研究
?研究报告?
生物技术通报
B I O TECHNOLOGY BULL ET I N
2009年第8期
产32羟基丙酸重组菌的构建及其转化甘油的研究
张晓梅1
诸葛斌2
许正宏1
窦文芳1
黄瑞2
许赣荣
2
(1江南大学医药学院制药工程研究室,无锡214122;2江南大学生物工程学院,无锡214122)
摘 要: 将连接编码甘油脱水酶的基因重组质粒pEtac 2dha B 和连接编码乙醛脱氢酶编码基因aldh 的重组质粒pUCtac 共转化大肠杆菌,得到产32羟基丙酸重组大肠杆菌J M109(pUCtac 2aldh,pEtac 2dha B ),并对影响该重组菌发酵的营养因子进行研究。试验结果表明:该重组菌转化甘油合成32羟基丙酸的适宜培养基组成为甘油40g/L 、酵母膏6g/L 、维生素B 120.02g/L 以及KH 2P O 47.5g/L;32羟基丙酸产量和转化率分别达到4.92g/L 和12.3%。
关键词: 32羟基丙酸 重组大肠杆菌 甘油 营养因子
Constructi on of Novel Reco mbi n ant Escherich ia coli Capable of
Produci n g 32hydroxypropi on i c Aci d and Its Conversi on of Glycerol
Zhang Xiaomei 1 Zhuge B in 2 Xu Zhenghong 1 Dou W enfang 1 Huang Rui 2 Xu Ganr ong
2
(1
Laboratory of Phar m aceutical Engineering,School of M edicine and Phar m aceutics,J iangnan U niversity,W uxi 214122;2
School of B iotechnology,J iangnan U niversity,W uxi 214122)
Abs trac t: The exp ressi on vect or pUCtac harboring aldh gene and the exp ressi on vect or pEtac harboring dhaB gene were trans 2
for med int o E .coli J M109t o construct recombinant Escherichia coli J M109(pUCtac 2aldh,pEtac 2dha B ).Some nutrient ingredient af 2fecting fer mentati on results of this recombinant strain were als o studied .The results de monstrated that the op ti m ized mediu m comp rised (g/L )glycer ol 40,yeast extract 6.0,KH 2P O 47.5and vita m in B 120.02.The 32hydr oxyp r op i onic acid concentrati on,yield on glyc 2er ol could reach 4.92g/L and 12.3%,res pectively .
Key wo rd s: 32hydr oxyp r op i onic acid (32HP ) Recombinant Escherichia coli Glycer ol Nutrient ingredient
收稿日期:2009203211
基金项目:教育部博士点新教师基金(20070295011)
作者简介:张晓梅(19692),女,研究方向:微生物制药;E 2mail:hanqiaowu@sina .com 通讯作者:许赣荣,硕导,教授,Tel:0510285864597,E 2mail:grxu@sytu .edu .cn
32羟基丙酸(32hydr oxyp r op i onic acid,简称32
HP )是一种重要的有机合成中间体,脱水生成丙烯酸,氧化生成丙二酸,还可以形成多种酯类聚合物[1]
。目前市场上销售的32羟基丙酸均采用化学合成法生产,但化学合成法具有设备投资大、技术难度高、需要重金属催化剂、污染环境等缺点,并且利用不可再生的石化资源为原料,随着石油资源的短缺,造成依赖于石油资源的各种化学品价格居高不
下,也限制了32羟基丙酸聚合物的发展[2]
。而微生物转化法以其利用可再生资源、清洁生产、对环境友好、有利于可持续发展等优点逐渐成为国内外研究的热点。但至今为止尚未发现一种自然菌株能将葡
萄糖或甘油直接转化为32羟基丙酸[3]
,利用自然筛
选的微生物还无法直接进行发酵法生产32羟基丙
酸,因此,采用基因工程技术构建高产菌株被认为是今后的研究方向。国内至今尚无文献报道利用基因工程菌发酵生产32羟基丙酸。
将先期构建的重组质粒pUCtac 2aldh [4]
和pEtac 2dha B [5]
共转化大肠杆菌E .coli J M109,得到可以利用甘油产32羟基丙酸的重组菌E .coli J M109(pUCtac 2al 2dh,pEtac 2dha B ),并考察了甘油浓度、酵母膏、维生素B 12等因素对重组菌发酵产32羟基丙酸的影响。
1 材料与方法
111 菌株和质粒
大肠杆菌(Escherichia coli )J M109,由本实验室
保藏,质粒载体pUCtac 2aldh,pEtac 2dha B 由先期构
2009年第8期张晓梅等:产32羟基丙酸重组菌的构建及其转化甘油的研究
建和保藏[5]。重组大肠杆菌J M109(pUCtac2aldh, pEtac2dha B)为本研究构建。
112 工具酶和试剂
限制性内切酶X ba I、Pst I,碱性磷酸酶C I A P购自TaKaRa公司;T
4
DNA连接酶及Taq DNA聚合酶购自上海华美生物工程公司;Gel Extracti on M ini Kit、PCR Purificati on M ini Kit购自上海华舜生物工程有限公司。丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、广范围蛋白质分子量标准为Pr omega公司产品。
113 S DS2P AGE
采用5%浓缩胶及12%分离胶的不连续垂直平板电泳,考马斯亮蓝R2250染色[6]。以大肠杆菌J M109作对照。
114 培养基和培养条件
LB培养基(g/L):蛋白胨10,酵母膏5,氯化钠10,固体培养基含20g/L的琼脂,固体和液体培养基在需要时加入卡那霉素或者氨苄青霉素至浓度50mg/m l。
种子培养基:采用LB培养基。
发酵培养基(g/L):甘油50,酵母膏5,KH
2
P O4 7.5,(NH4)2S O42.0,MgS O4?7H2O0.2,FeS O4?7H2O0.005,CaCl20.1,维生素B120.015,2mol/L K OH调pH值7.0。
发酵:从新鲜的LB培养基斜面上挑取一环菌株接入50m l摇瓶(装液量为10m l)中,于旋转式摇床中30℃、140r/m in培养16h得到种子液。按5%接种量接入500m l摇瓶(装液量50m l)中,在140 r/m in旋转式摇床中,培养至OD600为0.7,再加入1 mmol/L I PTG诱导过夜,同时以未加入I PTG诱导的发酵液为对照。
115 重组菌E.coli J M109(pEtac2aldh,pUCtac2al2 dh)质粒稳定性分析
单细胞生物的细胞呈几何级数2n增长,当n= 20时,220=1.05×106,将稳定期的菌液稀释10-6,再将其培养到稳定期,即可认为细胞已连续传代20次。具体方法如下:从新鲜转化平板上挑取单菌落。接种至2m l不含抗生素的LB中,30℃培养24h,即得20代的菌液,以此类推,直至连续传代至100代。其中每隔20代统计1次质粒丢失情况,将上述菌液涂布于不含抗生素的LB板上,从中挑选100个单菌落分别点在添加和不添加抗生素的平板上,通过计数即可测得该代数的质粒稳定性。
116 测定方法
32HP含量的检测:采用高效液相色谱法,色谱柱D ia monsal C
18
(5μm,250mm×4.6mm);流动相
∶甲醇∶水=5∶95,加入H
3
P O4至0.05%;紫外检测器。
甘油含量的检测:采用高效液相色谱法,色谱
柱:Z ORBAX NH
2
(5μm,250mm×4.6mm);流动相∶乙腈和水=70∶30;流速为1m l/m in;示差检测器。
生物量的测定:取适量发酵液用无菌生理盐水稀释至一定浓度后,于600n m测定吸光度(OD值)。
2 结果与讨论
211 重组质粒稳定性分析
用双抗平板(含卡那青霉素50μg/m l和氨苄青霉素100μg/m l)筛选得到重组大肠杆菌E.coli J M109(pUCtac2aldh,pEtac2dha B),重组大肠杆菌E. coli J M109(pUCtac2aldh,pEtac2dha B)在添加氨苄青霉素,不添加卡那霉素,无卡那霉素选择压力的条件下,以及添加卡那霉素,不添加氨苄青霉素,无氨苄青霉素选择压力的条件下,连续转种5次,统计重组大肠杆菌E.coli J M109(pUCtac2aldh,pEtac2dha B)的菌落数。结果表明,传100代后重组大肠杆菌E. coli J M109(pUCtac2aldh,pEtac2dha B)的质粒保持率分别为85%和80%。
表1 重组菌 E.coli J M109(pUC t ac2a ldh,pEt ac2dhaB)连续转种后在不同平板上的菌落数
传代次数
pEtac2dha B
Kan(+)Amp(-)(%)
pUCtac2aldh
Amp(+)Kan(-)(%) 209998
409892
609288
808885
1008580
212 重组菌全细胞蛋白S DS2P AGE电泳分析挑取3个重组子大肠杆菌E.coli J M109(pEtac2 dha B),E.coli J M109(pUCtac2aldh),E.coli J M109 (pUCtac2aldh,pEtac2dha B)分别接种于含有卡那霉素50μg/m l或者氨苄青霉素100μg/m l的LB培养
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生物技术通报B iotechnology B u lletin
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基中,37℃培养至对数后期。1mmol/L I PTG 诱导培养5h,离心收集菌体,超声波破壁。加入1倍的S DS 2P AGE 电泳加样缓冲液中悬浮,100℃水浴5m in,进样量为10μl,重组菌E .coli J M109(pEtac 2dha B ),E .coli J M109(pUCtac 2aldh ),E .coli J M109(pUCtac 2aldh,pEtac 2dha B )全细胞蛋白S DS 2P AGE 电泳分析如图1所示。从图1可以看出,在,其中61、21和16k D 处出现蛋白质特征带正好对应甘油
脱水酶DHAB 3个亚基分子量的位置[7]
,说明已经存在表达产物。另外在54、49和12kD 处出现蛋白质特征带正好与乙醛脱氢酶酶ALDH 蛋白大小相符[8]
,说明表达产物中已经存在乙醛脱氢酶酶蛋白
。
M.蛋白质分子量标准;1.E .coli J M109(pUCtac 2aldh );2.E .coli J M109(pEtac 2dha B );3.E .coli J M109(pUCtac 2aldh,pEtac 2dha B );4.未
转入载体的E .coli J M109
图1 重组菌表达产物的S D S 2PAGE 电泳分析
213 重组菌的生长曲线
分别接种单菌落重组菌E .coli J M109(pUCtac 2
aldh,pEtac 2dha B )于100m l LB 培养基(含卡那霉素50μg/m l 和含氨苄青霉素100μg/m l ),37℃,120r/m in 培养36h,每隔2h 取一次样,重组菌的生长曲
线如图2。
根据重组菌的生长曲线的结果,确定将重组菌E .coli J M109(pUCtac 2aldh,pEtac 2dha B )的种子培养液接入发酵培养基的接种时间确定为16h
。
图2 重组菌 E.coli J M 109(pUC t ac 2
a ldh,pEt ac 2dhaB)生长曲线
214 重组菌发酵试验
21411 初始甘油浓度对重组菌发酵的影响 为了
考察本研究所构建的重组菌对发酵甘油产32HP 的
能力,对该重组菌在不同初始甘油浓度20、30、40、50、60、70、80g/L (其中酵母膏6g /L 、KH 2P O 47.5g/L 、VB 120.015g/L )的发酵培养基中37℃,140r/m in,发酵48h,结果如图3所示。
图3 甘油浓度对重组菌发酵产32HP 的影响
从图3可以看出,当甘油浓度超过70g/L 时,甘油的利用率明显下降。而当甘油浓度在40g/L 时,32HP 的产量最高可以达到3.37g/L,甘油转化率为8.4%。21412 维生素B 12浓度对重组菌发酵的影响 从甘油到32HP 的生物合成途径中,DHAB 需要VB 12作为辅酶才能催化甘油至32HP A 的反应,而且在催化
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张晓梅等:产32羟基丙酸重组菌的构建及其转化甘油的研究
甘油的同时,DHAB 会出现甘油导致的自杀性失活
现象。这主要是由于底物甘油导致辅酶B 12的C 2Co 键发生不可逆断裂,形成5′2脱氧腺苷和烷基钴氨素类似物(即被修饰的辅酶),而烷基钴氨素与DHAB
紧密结合,致使DHAB 失活[9]。Toraya 等[10]
研究表明,如果将与之结合的被修饰的辅酶B 12或VB 12与自由态辅酶B 12进行交换,可以恢复DHAB 的催化活性。维持发酵培养基中足够高的VB 12浓度,对于激活DHAB 活性和防止因甘油导致的自杀性失活,从而保证较高水平32HP 的产量是必需的,在保持发酵培养基中初始甘油浓度为40g/L 时,考察了VB 12的浓度对发酵的影响。结果如图4,从图4可以看出,当VB 12的浓度大于0.02g/L 时,培养条件为37℃,140r/m in 培养48h,发酵液中32HP 产量维持在3.8g/L,甘油转化率为9.5%
。
图4 VB 12浓度对重组菌发酵产32HP 的影响
21413 磷酸二氢钾浓度对重组菌发酵的影响 在
保持初始甘油和VB 12的浓度分别为40g/L 、0.02g/
L,培养条件为37℃,140r/m in 培养48h,考察了KH 2P O 4浓度对产32HP 重组菌发酵结果的影响(图5)。由图5可知,当KH 2P O 4浓度为7.5g/L 时,32HP 产量可达4.72g/L,甘油转化率为11.8%。当KH 2P O 4浓度逐渐增大时,32HP 的量开始下降,根据
试验测得发酵液OD 600可以看出菌体量逐渐增大(数据未列出),分析原因是由于过高的KH 2P O 4浓度,促进菌体生长和副产物形成,从而导致32HP 的产量迅速下降。
图5 KH2P O 4浓度对重组菌发酵产32HP 的影响
21414 酵母膏浓度对重组菌发酵的影响 本研究
在保持发酵培养基中初始甘油浓度为40g/L,VB 12的浓度为0.02g/L,KH 2P O 4浓度为7.5g/L 时培养条件为37℃,140r/m in 培养48h,考察了酵母膏浓度对重组菌发酵产32HP 结果的影响。由图6可看出,当酵母膏浓度为6g/L 时,32HP 的产量达到4.92g/L,甘油转化率为12.3%。但是随着酵母膏浓度的增大,32HP 的产量逐渐下降,分析原因可能是由于酵母膏浓度增大导致菌体生长和其他代谢产物的形成。因此,合适的酵母膏浓度对于维持重组菌32HP 的较高产量水平也是至关重要的
。
图6 酵母膏浓度对重组菌发酵产32HP 的影响
3 结论
甘油经甘油脱水酶DHAB 和乙醛脱氢酶ALDH 催化生成32HP,自然界现有的微生物体内没有这条
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代谢途径,可通过这两个酶构建以甘油为底物的32 HP基因工程菌微生物体内合成途经,合成途径的惟一中间产物为32羟基丙醛,其浓度过高将抑制菌体的生长和甘油的代谢[11],这可能是不能实现高产的主要限制因素之一。另外当E.coli J M109中同时引入表达载体pUCtac和pEtac时,质粒保持率分别为85%和80%,相比大肠杆菌E.coli J M109中只引入pUCtac或者pEtac稳定性有所降低。构建的重组菌E.coli J M109(pEtac2dha B,pUCtac2aldh)产32 HP4.92g/L,甘油转化率为12.3%。
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(上接第98页)
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11 徐俊杰,董大勇,宋小红,等.生物工程学报,2004,20(5):652～655.
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生物化学与分子生物学技术 重点试题归纳
1、说出三种蛋白质的测定方法，若你选择，你会选择哪一种？为什么？ 答：双缩脲法、lowry改良法、考马斯亮蓝（Bradford）法、BCA（二喹啉甲酸）法、紫外线分光光度法。我会选择BCA法。双缩脲法灵敏度差，特异性不高。Lowry改良法对样品的溶解度要求高、易受物质干扰且容易产生测量误差。紫外线分光光度法的精确度差。而BCA 法则能较好地弥补以上方法的缺点。它具有操作便捷快捷、精确度高、抗干扰能力强、能使用于微板孔等特点。 2、western blot印记中封闭液的作用？ 答：封闭液可以结合非相关蛋白的位点以降低非特异性结合的背景。 3、γ球蛋白的提取过程。 答：（1）盐析—中性盐沉淀： 通过加入半包和硫酸铵可以使球蛋白沉淀，清蛋白留在溶液中。得到γ球蛋白粗制 品。 （2）脱盐—凝胶柱层析： 经过凝胶柱层析，使得大分子的蛋白质和小分子的盐分离。 （3）纯化—DEAE纤维素阴离子交换层析 用阴离子交换层析可以把在PH=6.3的缓冲液中的带负电的α、β球蛋白和带正电的 γ球蛋白分离。使γ球蛋白被洗脱出来被纯化。 （4）经过浓缩得到浓度高的γ球蛋白 4、离子交换剂的原理 答：离子交换剂是一种在高分子的不溶性载体上结合有若干活性基团，这些活性基团含可解离的离子并和溶液中的其他离子进行交换。 5、如果western blot中出现两条带，是否说明有杂质？为什么？ 答：并不说明有杂质。因为在实验中我们的检测对象是人血清IgG，IgG是由两条轻链和两条重链通过二硫键结合起来，变形后轻、重链分开，形成两条带（21KD、57KD） 6、分别简述DNA提取中蛋白酶K、SDS、无水乙醇、RNase的作用 答：蛋白酶K：将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。 SDS：破坏细胞的细胞膜、核膜并使组织蛋白和DNA分子分离 无水乙醇：可以使DNA沉淀 RNase：可以去除溶液中的RNA （EDTA：抑制细胞中的DNase活性） 7、试述转化质粒蓝白筛选的原理。 答：载体质粒DNA带有b-半乳糖苷酶N端146个氨基酸残基（α片段）的编码信息，经过改造的宿主菌含有b-半乳糖苷酶C端（ω片段）的序列。只有当两个片段都存在的时候才能形成有活性的b-半乳糖苷酶（这种现象称为α-互补）。b-半乳糖苷酶在IPTG的存在下可以使底物X-gal转变为蓝色产物，使菌落变为蓝色。当外源DNA片段插入载体的多克隆位点后。便不能表达α片段，转化细菌后不能分解底物，结果使菌落呈现白色。α互补筛选又称为蓝白筛选。 8、简述RT-PCR原理及核酸类型。 答：首先，经逆转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。
对甘油制备1,3-丙二醇工艺进行设计
对甘油制备1,3-丙二醇工艺进行设计 -发酵法制备1,3-丙二醇 摘要：本设计以甘油为原料，在无氧条件下，利用克雷伯氏菌发酵生产1,3-丙二醇，符合绿色化学的特点。通过测定菌体生物量、葡萄糖浓度、蛋白质浓度、甘油脱水酶、丙醛的浓度，可以初步判定发酵进行程度。设计实验对克雷伯氏菌发酵特性进行研究，分别研究温度、PH、甘油初始浓度、氮源对菌体生长和 1,3-PD 合成的影响。 关键词：1,3-丙二醇、甘油、克雷伯氏菌、厌氧发酵 1 前言 1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料，它可作为化学和医药工业中多种润滑剂、有机溶剂和前体的合成原料。它作为聚酯、聚醚和聚氨酯的重要单体原料合成的聚合物具有生物可降解性、安全无毒、可循环利用等优点，不仅在服装和工程塑料领域得到了广泛应用，在食品、药品和化妆品等领域也开始崭露头角。以 1,3-丙二醇为原料合成的食品添加剂丙二醇酯，是世界六大食品乳化剂之一，目前已被美国、日本和中国等国家及欧盟，联合国粮农组织和世界卫生组织批准使用[]1。20世纪90年代中期,工业上成功开发出了以1,3-PD为原料的新型聚酯材料-聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT), PTT性能优良,因此研究开发低成本的1, 3-PD生产技术成为关注的热点。1,3-PD的生产方法有化学法和生物转化法。 生物法合成 1,3-PD 符合“绿色化学”的特点，利用甘油或葡萄糖等可再生资源为原料，生产清洁，对环境无污染，符合我国可持续发展的需要。近几年，随着以大豆油与菜籽油为原料生产生物柴油产量的迅速增长，产生了大量副产物甘油；用甘油合成附加值更高的 1,3-丙二醇有利于资源的综合利用，引起了如杜邦公司、陶氏化学公司、亨斯迈公司等公司的关注[]2。发酵工程作为生物法合成 1,3-PD 的关键环节更是人们关注的热点。2003 年美国环境保护机构向杜邦授予“绿色化学总统奖”，专门用于表彰该公司对生物基 1,3-PD 工艺开发所作的研究。
生物化学——克隆
生物化学——克隆 学校： 院系:生物技术 班级：xxx班 学号：xx 姓名：songxw
克隆 克隆是英文"clone"或"cloning"的音译，而英文"clone"则起源于希腊文"Klone"，原意是指以幼苗或嫩枝插条，以无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物，如扦插和嫁接。在大陆译为“无性繁殖”在台湾与港澳一般意译为复制或转殖或群殖。中文也有更加确切的词表达克隆，“无性繁殖”、“无性系化”以及“纯系化”。克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。通常是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组织后代的过程。另有相关书籍和影视作品以此为题。 克隆的历史： 鲤鱼:1963年，中国科学家童第周早在1963年就通过将一只雄性鲤鱼的遗传物质注入雌性鲤鱼的卵中从而成功克隆了一只雌性鲤鱼，比多利羊的克隆早了33年。 绵羊:1996年，多利（Dolly） 猕猴:2000年1月，Tetra，雌性 猪:2000年3月，5只苏格兰PPL小猪；8月，Xena，雌性 牛:2001年，Alpha和Beta，雄性猫:2001年底，CopyCat（CC），雌性鼠:2002年兔:2003年3-4月分别在法国和朝鲜独立地实现； 骡:2003年5月，爱达荷Gem，雄性；6月，犹他先锋，雄性 鹿:2003年，Dewey 马:2003年，Prometea，（普罗米修斯）雌性 狗:2005年，韩国首尔大学实验队，史纳比 猪:2005年8月8日，中国第一头供体细胞克隆。 克隆的定义： 1963 年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克隆(Clone)”的术语。科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫“克隆”，这门生物技术叫“克隆技术”，其本身的含义是无性繁殖（中国大陆的翻译），即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。 克隆也可以理解为复制、拷贝和翻倍（港澳台的意译），就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同，但大多行为思想不同。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。这种来自同一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫“无性繁殖系”，简称无性系。简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与无性繁殖是不同的。克隆是指人工操作动物繁殖的过程，无性繁殖是指：不经过两性生殖细胞的结合由母体直接产生新个体的生殖方式，常见的有孢子生殖、被子生殖出芽生
甘油催化转移氢解制备丙二醇及其反应机理
第４０卷第３期２０１２年６月 浙江工业大学学报 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＺＨＥＪＩＡＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．４０Ｎｏ．３ Ｊｕｎ．２０１２ 收稿日期：２０１１－０３－ ０４基金项目：浙江省钱江人才计划基金资助项目（２００６Ｒ１００１７ ）作者简介：李 菲（１９８６—），女，山西太原人，硕士研究生，研究方向为生物能源，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｆｅｉｌ＿２９０＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ． 通信作者：计伟荣教授，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｅｉｒｏｎｇ．ｊｉ＠ｚｊ ｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ．甘油催化转移氢解制备丙二醇及其反应机理 李 菲，夏 燕，应惠娟，计伟荣 （浙江工业大学化学工程与材料学院，浙江杭州３１００３２ ）摘要：以Ｒａｎｅｙ Ｎｉ为催化剂，甲醇为供氢体，水为溶剂，对甘油催化转移氢解反应进行了研究，探讨了反应温度和甘油浓度对氢解反应的影响， 并对甘油催化转移氢解反应机理进行了初步探索．与传统氢解方法相比，甘油催化转移氢解在较为温和的条件下得到了１，２－丙二醇．在温度为２１０℃，甘油初始浓度为０．６４ｍｏｌ／Ｌ，反应时间为１２ｈ的条件下，甘油转化率达到５４．７％，１，２－丙二醇的选择性为７４．１％．一般情况下，在Ｒａｎｅｙ Ｎｉ的催化作用下，甘油优先脱去伯位的羟基生成丙酮醇，随后加氢生成１，２－丙二醇． 关键词：甘油；甲醇；１，２－丙二醇；转移氢解；Ｒａｎｅｙ Ｎｉ中图分类号：ＴＱ０２８．４ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００６－４３０３（２０１２）０３－０２７５－ ０４Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｔｏｐｒｏｐｙ ｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ ｉｔ ｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍＬＩ Ｆｅｉ，ＸＩＡ Ｙａｎ，ＹＩＮＧ Ｈｕｉ－ｊｕａｎ，ＪＩ Ｗｅｉ－ｒｏｎｇ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｅｅｒｉｎｇ ＆Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００３２，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ（ＣＴＨ）ｏｆ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｏｖｅｒ Ｒａｎｅｙ Ｎｉｃａｔａｌｙｓｔ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｍｅｄｉａ ｗｉｔｈ ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｓ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｄｏｎｏｒ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ｍｏｌａｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇ ａｔｅｄ．Ａ ｒｅａｃｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｗａｓ ｐｒｏｐｏｓｅｄ．Ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｇａｓ，ｔｈｅ ＣＴＨ ｏｆ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｕｎｄｅｒ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｍｉｌｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ａｔ ２１０℃ａ５４．７％ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｗａｓ ａｃｈｉｅｖｅｄ ａｆｔｅｒ １２ｈｏｕｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｉｔｉａｌ ｇｌｙ ｃｅｒｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ０．６４ｍｏｌ／Ｌ，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ １，２－ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｗａｓ ｕｐ ｔｏ ７４．１％．Ｉｎｇｅｎｅｒａｌ，ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｉｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｏｎｅ ｏｖｅｒＲａｎｅｙ Ｎｉ ｃａｔａｌｙｓｔ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ａｃｅｔｏｌ，ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｆｕｒｔｈｅｒ ｔｏ ｂｅｃｏｍｅ １，２－ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙ ｃｅｒｏｌ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｇｌｙｃｅｒｏｌ；ｍｅｔｈａｎｏｌ；１，２－ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｅｒｏｌ；ｔｒａｎｓｆｅｒ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ；Ｒａｎｅｙ Ｎｉ 近年来， 生物柴油产业的发展使得其副产物甘油大量生成，导致目前甘油市场严重过剩［１－ ３］．寻找甘油利用的新途径，对降低生物柴油成本，提高生物 柴油产业链的经济效益有重要意义［４－ ５］． 目前，国内外已有许多关于甘油催化氢解生产高附加值产品的 报导，其主要产物为１，２－丙二醇和１，３－丙二醇．１，２－丙二醇和１，３－丙二醇都是重要的化工原料，常作为抗冻剂、溶剂、保护剂等应用于食品、医药、化妆品和涂料等行业中．此外，１，３－丙二醇还是合成新型聚酯 ＰＴＴ的单体之一［６］．早在１９８７年，Ｃｅｌａｎｅｓｅ公司［７ ］
生物化学BIOCHEMISTRY
生物化学BIOCHEMISTRY 绪论Prolegomena What is BIOCHEMISTRY? CHEMISTRY：the branch of science which deals with the identification of the substances of which matter is composed, the investigation of their properties and the ways in which they interact, combine, and change, and the use of these processes to form new substances Biochemistry: the branch of science concerned with the chemical and physic-chemical processes which occur within living organisms Including: The chemistry of the components in living organisms (static biochemistry) The principles for the chemical changes in living organisms (dynamic biochemistry) The chemistry of metabolism and cell functions (functional biochemistry) 生物化学的主要分支： 按化学的研究范畴划分：生物无机化学（bioinorganic chemistry），生物有机化学（bioorganic chemistry），生物物理化学（biophysical chemistry） 按生物学的研究领域划分：动物生物化学（animal biochemistry），植物生物化学（plant biochemistry），微生物生物化学（microbe biochemistry） 按研究对象划分：蛋白质化学（protein chemistry），核酸化学（nucleate chemistry） 按与生产、生活关系划分：生理生化（physiological biochemistry），工业生化（industrial biochemistry），农业生化（agricultural biochemistry），医药生化（medicinal biochemistry） 生物化学的使命：揭示生命现象的本质，促进生命科学发展；改善人类健康水平和生活质量；促进物种的改良和优化；带动工、农业的发展和变革 分子生物学Molecular biology： 什么是分子生物学：在分子水平上研究生物大分子的结构与功能，从而阐明生命现象本质的科学 主要研究领域：蛋白质体系，蛋白质-核酸体系，蛋白质-脂质体系 分子生物学的三个支柱学科：生物化学，遗传学，微生物学 分子生物学的地位：由学科分支成长为主流前沿，殊途同归的集大成者，生物学科走向统一的前驱 古代生物化学（在化学中萌芽）： 19世纪以前：A.L. Lavoisier, “呼吸作用的本质和燃烧是一样的”；C.W. Scheele, 多种生化物质的分离；J.von.Liebig, 新陈代谢（stoff wechsel)；Hoppe Seyler, 1877年，提出“biochemie”近代生物化学（由静态走向动态）： 19世纪中叶——20世纪50年代，相关学科的蓬勃发展：1804，John Dalton 提出原子论；1859，Port Darwin 进化论；1865，Gregor Mendel 遗传定律；1869，D.L.Mendelyeev 元素周期律 生物化学的发展： 1848, Helmhoitz & Bernard，肝脏的生糖功能；1869，J.F. Michel 分离“核素”（核酸）；1897，Bucher ，酵母榨出液可使蔗糖发酵生成乙醇；1902，D.A. Leeven，从核酸中分离胞嘧啶；1904，Knoop ，脂肪酸的 -氧化；1907，E.H. Fischer ，蛋白质的降解与合成；1912，F.G. Hopkins，确立维生素概念，形成剑桥生物化学学派；1921，F.G.班廷和C.H.贝斯特，分离纯胰岛素；1926，J.B. Sumner 分离脲酶，并证明其是蛋白质；1929，Lohmann & Fiske ，ATP的能量功能；1931，Warburg 制得呼吸酶并研究其生物氧化作用；1937，Krebs，三羧
生化实验五大技术
生化实验五大技术 一.分光光度技术 1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。而建立起来的一种定t 、定性分析的技术。 2.基本原理:（图1-1光吸收示意） 透光度T=It/lo 吸光度A=lg(lo/ I1) 朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLc K 为吸光率，L 为溶液厚度(em), c 为溶液浓度 (mol/L)] 摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为 I.cm 的吸光度。 c=A/ε 3. 定量分析: (1)标准曲线(工作曲线)法 (2) 对比法元-KCLCx (3)计算法: e=A/ε (4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀) (5) 多组分湖合物测定 4.技术分类 分子吸收法&原子吸收法:
可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法； 5.应用方向 有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法 二电脉技术 1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电 极方向按各自的速度进行脉动。使组分分离成族窄的区带，用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。 2.基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比，与其半径及介质粘度成反比。v=Q/6xrη 3.影响电泳迁移率的因素: 电场强度电场强度大，带电质点的迁移率加速 溶液的PH值: 溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移幸越大 溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低 电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗 4:技术分类: 自由电泳(无支持体) 区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压)，博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂，琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等 5. 电泳分析常用方法及其特点: 小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳 ⑴醋酸纤维素薄膜电泳 ①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小，消除纸电沫中出现的“拖尾”现象 ②分离理应快，电泳时间短 ③样品用最少: ④经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保 ------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球
以甘油为原料两步法制备1,2-丙二醇的工艺研究
以甘油为原料两步法制备1,2-丙二醇的工艺研究利用生物质转化为高附加值的化学产品是绿色化学的一个重要研究方向[1,2]。绿色化学所追求的目标是化学过程不产生污染，并实现高效、高选择性的化学反应，尽可能不生成副产物，实现“零排放”，以达到“原子经济性”反应[3]。 甘油作为一种理想的可再生原料，以其为平台可以提供一条绿色且经济的生产大量化学产品的途径。它作为生物柴油的副产物大量生成，每生产9Kg生物柴油约产生1Kg粗甘油[4,5]。随着生物柴油持续升温，寻找和开发甘油的新用途，将其作为原材料加工成其他产品，不但可以降低生物柴油的生产成本，提高综合经济效益，还可以解决甘油的过剩问题。 目前国外两家公司作开发了利用微生物发酵甘油生成 1，3 -丙二醇的技术。国内清华大学和大连理工大学等单位也在生物发酵法制备 1，3-丙二醇方面进行了研究。并取得了一定成果。虽然微生物对甘油转化为1，3-丙二醇的选择性很高，且反应条件温和操作简单，但是在产率的提高和菌种的选择性上还存在着很多困难。 甘油催化氢解制备丙二醇的机理如下： 甘油催化氢解制备丙二醇的甘油催化氢解制备丙二醇的反应见下图。在催化剂作用和氢气存在的条件下，通过一次C-O断裂，甘油可以转化成1，2-丙二醇和1-3丙二醇。但是由于催化剂种类及反应参数的不同，可能发生以下副反应：在甘油过度氢解时，即经过2~3次C-O键断裂后，得到一元醇( 正丙醇、丙醇)和丙烷。如果经历1次C-C键的断裂则会生成乙二醇。经过2次C -C键的断裂将生成甲醇。甘油经过C-O键和C-C键同时或者交替的断裂可能得到正丙醇、丙醇、甲醇、和甲烷。 甘油的氢解反应甘油催化氢解的反应机理是比较复杂的，由于反应条件、催化剂的不同，甘油氢解制丙二醇的机理也存在着一定的差异。当反应在酸性或者中性条件下进行时，一般认为反应是下面的机理进行。脱水，生间产物烯醇及酮（醛）式互变异构体，之后中间产物进一步发生加氢反应生成1，2 -丙二醇或l，3-丙二醇。实验表明，反应体系中加入钨酸可以加快反应速率，变反应的选择性。但是在使用其他的无机酸如盐酸时，反应转率并不理想。这说明钨酸的酸性并不
甘油制备1.3-丙二醇
甘油制备1．3-丙二醇 l，3-丙二醇是一种重要的有机化工原料．广泛应用于增塑剂、洗涤剂、防腐剂、乳化剂、聚酯和聚氨酯的合。也可用作防冻剂、溶剂、保护剂等，其中最重要的应用是制备聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)。PTT是一种性能优异的聚酯材料，是目前国际上合成纤维开发的热点，被专家预测为2l世纪最主要的新纤维品种之一。 世界上已实现工业化生产1。3一丙二醇的合成路线有两条：一种方法是Shell公司的环氧乙烷羰基化法；另一种方法是Degussa公司的丙烯醛水合氧化法。其中环氧乙烷羰基化法设备投资大．技术难度高．其催化剂体系相当复杂．制备工艺苛刻且不稳定．配位体还有剧毒。丙烯醛水合氢化法成本较高．特别是丙烯醛本身属剧毒、易燃和易爆物品，难于储存和运输。由此可见．研究开发以生物柴油副产甘油为原料制备l，3一雨二醇的技术很具竞争性和发展潜力。目前国内外做了大量的研究，主要形成催化氢解法和微生物发酵法两项技术。(1)催化氢解法甘油催化氢解制备1．3一丙二醇是一个较复杂和困难的过程．目前人们刚刚在这方面开始研究。在均相催化体系中加入钨酸和碱性物质如胺或酰胺等，在3lMPa的合成气压力和200℃的温度下反应24h，甘油催化氢解生成1．3丙二醇的产率为21％，选择性为45％。Schiaf等选用Ru配合物为催化剂，在四氢噻吩砜、甲苯和1一甲基吡咯烷酮的混合溶剂中，在5．2MPa的氢压力和110℃的温度下反应19h，l，3丙二醇的选择性为44％，但转化率仅为5％。Shell公司于2000年开发了一种均相体系合成1．3一丙二醇．该法以含铂系金属的配合物为催化剂．加入甲磺酸或i氟甲磺酸作添加物．在水或环丁砜的溶剂中甘油被氢解生成1．3一丙二醇．其选择性可达30．8％。Chaminand等采用氧化锌、活性炭或三氧化二铝负载的cu、Pd或Rh作为催化剂．以钨酸作添加物．在水、环丁砜或二氧杂环已烷等溶剂中研究了甘油催化氢解反应。当温度为180℃、氢压为8MF，a时，产物中1，3一丙二醇与1．2丙二醇的摩尔比最好时可达到2．并认为Fe和Cu等有利于提高1．3一丙二醇的选择性。根据目前的研究结果来看，利用甘油催化氢解制备1，3一丙二醇研究还相对较少，且存在甘油转化率低和产品选择性差的问题，结果不太理想．因此还有待进一步对高效催化剂研究和开发。 (2)生物发酵法与催化氢解法相比，生物发酵法生产1，3丙二醇具有选择性高、操作条件温和等优点，近年来受到特别的重视。德国国家生物技术研究巾心(GBF)、美国杜邦和Genencor 公司等投人大量人力物力研究1．3丙二醇的发酵生产技术。目前研究主要集中在两个方向：其一是从工业甘油出发研究发酵生产1,3一丙二醇；其二是运用现代基因1_程改造菌种．试图将转化葡萄糖为甘油和将甘油转化为1，3丙二醇的两组基因重组到同一细胞内．但基因重组困难，且重组后基因的传代稳定性还有待长时间考验。2001年DuaPont与Denencor申请了多项以葡萄糖为底物．用基因工程菌直接生产1．3丙二醇的专利，已投资建成年产j 万吨的发酵法生产l，3丙二醇的装置。 国内生物法生产l，3一丙二醇的研究起步较晚，研究重点多集中于菌种筛选和发酵工艺优化方面。清华大学、大连理工大学等单位开展生物发酵法生产1，3一丙二醇的研究．虽然比德、美等国起步晚，但研究水平已赶上甚至超过国际先进水平。清华大学以葡萄糖或粗淀粉(如木薯粉)为原料．采用双菌种两步发酵法生产1，3丙二醇的技术．避开了杜邦公司的专利，开发出了直接利用生物柴油的副产粗甘油发酵生产1，3一丙二醇的技术，该技术通过5000L发酵罐实验表明：1，3丙二醇浓度可达70g／L，实现了酶法制备生物柴油和生物柴油副产物甘油发酵生产l，3丙二醇的工艺耦合。在后提取的过程中．研究人员针对发酵过程副产大量的有机酸(盐)的特点．在国际上率先将电渗析脱盐技术引入提取T艺。通过絮凝、浓缩和精馏等工序，制得的1，3一丙二醇产品纯度达到99．92％．收率达80％以上．填补了我国生物法生产1，3一丙二醇的空白。大连理工大学也已在实验室采用膜过滤将脂肪酶催化甲醇与油脂反应生成生物柴油和微生物转化甘油为1，3丙二醇两个过程耦联起来开
生物化学技术竞赛
班级姓名学号 第十四届学术科技节之生物化学实验技能大赛初赛试卷将正确答案按题号填写到下列表格中：
一、判断题（每题1分，共30题） 1.（）90%乙醇是指100ml乙醇中含有90g乙醇。 2.（）6.78950修约为四位有效数字是：6.790。 3.（）滴定分析中，为了减少滴定管读数误差，滴定体积越大越好。 4.（）酸式滴定管既可以用来盛装酸类溶液，也可以盛装氧化性溶液。 5.（）抽样检查中，抽取的样本数越多越好。 6.（）采样时必须注意样品的生产日期、批号、代表性和均匀性。 7.（）我国化学试剂分为优级纯、分析纯、化学纯和实验试剂。 8.（）天平的分度值越大灵敏度越高。 9.（）使用干燥箱时，试剂和玻璃仪器应该分开烘干。 10.（）在使用酒精灯时，当灯内的酒精少于1/3时也没有关系，当不用灯时，直接把灯帽盖上就可以了。 11.（）酵母菌发酵糖时，通常会产生二氧化碳。 12.（）革兰氏染色时最好选择处于稳定期的微生物细胞进行染色。 13.（）使用高压灭菌器时，在冷气排尽后，压力上升至15磅，温度是121℃。 14.（）若在紫外光区对样品进行分光光度分析，应使用玻璃比色皿。 15.（）用漏斗过滤时漏斗中的液面不要超过滤纸的 2/3。 16.（）配制盐酸标准滴定溶液可以采用直接配制方法。 17.（）金属离子指示剂H3In与金属离子的配合物为红色，它的H2In呈蓝色，其余存在形式均为橙红色，则该指示剂适用的酸度范围为pKa1 常用分子生物学技术的原理及其应用 一、选择题 （一）A 型题 1 ．分子杂交实验不能用于 A ．单链DNA 与RNA 分子之间的杂交 B ．双链DNA 与RNA 分子之间的杂交 C ．单链RNA 分子之间的杂交 D ．单链DNA 分子之间的杂交 E ．抗原与抗体分子之间的杂交 2 ．关于探针叙述错误的是 A ．带有特殊标记 B ．具有特定序列 C ．必须是双链的核酸片段 D ．可以是基因组DNA 片段 E ．可以是抗体 3 ．下列哪种物质不能用作探针 A ．DNA 片段 B ．cDNA C ．蛋白质 D ．氨基酸 E ．RNA 片段 4 ．印迹技术可以分为 A ．DNA 印迹 B ．RNA 印迹 C ．蛋白质印迹 D ．斑点印迹 E ．以上都对 5 ．PCR 实验延伸温度一般是 A ．90 ℃ B ．72 ℃ C ．80 ℃ D ．95 ℃ E ．60 ℃ 6 ．Western blot 中的探针是 A ．RNA B ．单链DNA C ．cDNA D ．抗体 E ．双链DNA 7 ．Northern blotting 与Southern blotting 不同的是 A ．基本原理不同 B ．无需进行限制性切酶消化 C ．探针必须是RNA D ．探针必须是DNA E ．靠毛细作用进行转移 8 ．可以不经电泳分离而直接点样在NC 膜上进行杂交分析的是 A ．斑点印迹 B ．原位杂交 C ．RNA 印迹 D ．DNA 芯片技术 E ．DNA 印迹 9 ．下列哪种物质在PCR 反应中不能作为模板 A ．RNA B ．单链DNA C ．cDNA D ．蛋白质 E ．双链DNA 10 ．RT-PCR 中不涉及的是 A ．探针 B ．cDNA C ．逆转录酶 D ．RNA E ．dNTP 11 ．关于PCR 的基本成分叙述错误的是 A ．特异性引物 B ．耐热性DNA 聚合酶 C ．dNTP D ．含有Zn 2+ 的缓冲液 E ．模板 12 ．DNA 链末端合成终止法不需要 A ．ddNTP B ．dNTP C ．引物标记 D ．DNA 聚合酶 E ．模板 13 ．cDNA 文库构建不需要 A ．提取mRNA B ．限制性切酶裂解mRNA C ．逆转录合成cDNA D ．将cDNA 克隆入质粒或噬菌体 E ．重组载体转化宿主细胞 14 ．标签蛋白沉淀是 A ．研究蛋白质相互作用的技术 B ．基于亲和色谱原理 C ．常用标签是GST D ．也可以是6 组氨酸标签 E ．以上都对 15 ．研究蛋白质与DNA 在染色质环境下相互作用的技术是 A ．标签蛋白沉淀 B ．酵母双杂交 C ．凝胶迁移变动实验 D ．染色质免疫沉淀法 E ．噬菌体显示筛选系统 脱水－水合－加氢三段工艺 Ｄｅｇｕｓｓａ公司［１５］在专利中报道一种同时生产１，３－丙二醇和１，２－丙二醇的方法，如图１所示，工艺包括３段：①将质量分数１０％～４０％甘油水溶液在固体酸催化剂作用下脱水为含丙烯醛和羟基丙酮的水溶液，反应温度在２５０～３４０℃，专利强调酸性催化剂的Ｈａｍｍｅｔｔ酸强度在－３．０～－８．２，包括酸性分子筛、负载的无机酸及其盐和氧化物等；②将①中得到的水溶液在酸性催化剂作用下进行水合反应，以将丙烯醛水和成３－羟基丙醛，水合温度控制在３０～１２０℃；③将②中得到的３－羟基丙醛和羟基丙酮水溶液催化加氢得到１，２－丙二醇和１，３－丙二醇的混合物，其中１，２－丙二醇收率达１０％，１，３－丙二醇收率可达６０％。 该工艺１，３－丙二醇选择性高，并且后两段反应单元与传统的Ｄｅｇｕｓｓａ公司商业化生产１，３－丙二醇过程［１６］相同，能够最大限度地利用现有的工艺，因此该工艺得到人们的普遍关注。不过甘油气相脱水制备丙烯醛的催化剂尚还不成熟，因此该工艺的核心部分为甘油脱水制备丙烯醛反应与丙烯醛产品的分离精制过程。以下对近期来甘油气相脱水制备丙烯醛反应的研究进行单独的总结。 Ｏｔｔ等［１７］报道在亚临界或超临界状态下（２５～３５ＭＰａ和２５０～２９０℃），以硫酸锌盐为催化剂，在优化条件下丙烯醛收率７５％，并发现通过增加溶液酸性可促进反应的进行，使丙烯醛的收率得到增加。Ｄｅｇｕｓｓａ公司［１８］申请一个甘油水溶液在液相或者气相条件下脱水制备丙烯醛的专利，根据专利催化剂的寿命和丙烯醛选择性可以通过提高水含量实现，对于液相和气相适宜反应温度分别为２５０～３４０℃和２７０～３２０℃，并报道酸性催化剂的Ｈａｍｍｅｔｔ酸强度在－３．０～－８．２。在示例的Ａｌ２Ｏ３负载的磷酸催化剂上催化剂的转化率在６２．２％～７５％之间。柴松海等［１９］研究了甘油在一系列的不同Ｈａｍｍ 21-生物化学习题与解析--常用分子生物学技术的原理及其应用 常用分子生物学技术的原理及其应用 一、选择题 （一） A 型题 1 ．分子杂交实验不能用于 A ．单链 DNA 与 RNA 分子之间的杂交 B ．双链 DNA 与 RNA 分子之间的杂交 C ．单链 RNA 分子之间的杂交 D ．单链 DNA 分子之间的杂交 E ．抗原与抗体分子之间的杂交 2 ．关于探针叙述错误的是 A ．带有特殊标记 B ．具有特定序列 C ．必须是双链的核酸片段 D ．可以是基因组 DNA 片段 E ．可以是抗体 3 ．下列哪种物质不能用作探针 A ． DNA 片段 B ． cDNA C ．蛋白质 D ．氨基酸 E ． RNA 片段 4 ．印迹技术可以分为 A ． DNA 印迹 B ． RNA 印迹 C ．蛋白质印迹 D ．斑点印迹 E ．以上都对 5 ． PCR 实验延伸温度一般是 A ．90 ℃ B ．72 ℃ C ．80 ℃ D ．95 ℃ E ．60 ℃ 6 ． Western blot 中的探针是 A ． RNA B ．单链 DNA C ． cDNA D ．抗体 E ．双链 DNA 7 ． Northern blotting 与 Southern blotting 不同的是 A ．基本原理不同 B ．无需进行限制性内切酶消化 C ．探针必须是 RNA D ．探针必须是 DNA E ．靠毛细作用进行转移 8 ．可以不经电泳分离而直接点样在 NC 膜上进行杂交分析的是 A ．斑点印迹 B ．原位杂交 C ． RNA 印迹 D ． DNA 芯片技术 E ． DNA 印迹 9 ．下列哪种物质在 PCR 反应中不能作为模板 A ． RNA B ．单链 DNA C ． cDNA D ．蛋白质 E ．双链 DNA 10 ． RT-PCR 中不涉及的是 A ．探针 B ． cDNA C ．逆转录酶 D ． RNA E ． dNTP 11 ．关于 PCR 的基本成分叙述错误的是 A ．特异性引物 B ．耐热性 DNA 聚合酶 C ． dNTP D ．含有 Zn 2+ 的缓冲液 E ．模板 12 ． DNA 链末端合成终止法不需要 A ． ddNTP B ． dNTP C ．引物标记 D ． DNA 聚合酶 E ．模板 13 ． cDNA 文库构建不需要 A ．提取 mRNA B ．限制性内切酶裂解 mRNA C ．逆转录合成 cDNA D ．将 cDNA 克隆入质粒或噬菌体 E ．重组载体转化宿主细胞 14 ．标签蛋白沉淀是 A ．研究蛋白质相互作用的技术 B ．基于亲和色谱原理 C ．常用标签是 GST D ．也可以是 6 组氨酸标签 E ．以上都对 15 ．研究蛋白质与 DNA 在染色质环境下相互作用的技术是 A ．标签蛋白沉淀 B ．酵母双杂交 C ．凝胶迁移变动实验 D ．染色质免疫沉淀法 E ．噬菌体显示筛选系统 16 ．动物整体克隆技术又称为 A ．转基因技术 B ．基因灭活技术 C ．核转移技术 D ．基因剔除技术 生物技术在食品添加剂工业中的应用 摘要：概述了生物技术在食用色素、食用香精香料以及食用防腐剂中的应用，并针对目前研究中遇到的问题提出了相应的解决办法。 关键词：生物技术，食品添加剂，应用 食品添加剂是为改善食品品质和色、香、味以及为防腐、保鲜和加工工艺的需要而加入食品的人工合成或者天然物质。食品添加剂能起到提高食品质量和营养价值，改善食品感官性质，防止食品腐败变质，延长食品保藏期，便于食品加工和提高原料利用率等作用。目前，我国有20多类、近1000种食品添加剂，如酸度调节剂、甜味剂、漂白剂、着色剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、营养强化剂等。可以说“没有食品添加剂工业，就不可能有现代食品工业”，所有的加工食品都含有食品添加剂，食品添加剂对于食品工业是必不可少的，合理使用添加剂对人体健康以及食品有益无害，在食品生产中只要按国家标准添加安全的食品添加剂，消费者就可以放心食用。 目前，我国生产的食品添加剂按其来源分类，有化学合成、生物合成、天然提取物三大类。由于许多生物合成食品添加剂，如谷氨酸、柠檬酸、乳酸等的化学结构和天然提取的完全一样，在人体中能被吸收和代谢，同时还具有一定的营养功效和生理活性，国际上也将之视同天然物。食品添加剂的安全使用非常重要。理想的食品添加剂最好是有益无害的物质。食品添加剂，特别是化学合成的食品添加剂大都有一定的毒性，不仅影响食品的食用安全，其生产制备过程中还会产生对环境有污染的物质，所以天然食品添加剂越来越受到大家的广泛关注。由于天然资源有限，而且其中含量不高，提取工艺复杂，制备天然提取的食品添加剂受到限制。而采用生物法制备天然食品添加剂，可以克服以上缺点，因此备受青睐。用生物法生产的天然色素、天然新型香昧剂等，正在逐步取代人工合成的色素和香精，这也是现今食品添加剂研究的方向。 现代生物技术包含的主要技术范畴是基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和生化工程。其中基因工程主要包括目的基因的提取和剪切、基因与载体的重新连接（DNA体外重组）、重组DNA、导入新的寄主细胞、发酵培养、目的蛋白质的提炼和纯化技术；细胞工程包括细胞融合、细胞大规模培养和植物组织快速繁殖技术；酶工程主要包括酶的开发与生产、酶的固定化和酶的分子改造、修饰技术；发酵工程包括菌种选育、菌体生产、代谢产物的发酵以及微生物机能的利用等；生化工程包括生物反应器、膜分离、超临界CO2萃取、基因芯片、生物传感器等。现代生物技术在食品添加剂制备中的应用，为天然食品添加剂的生产打开了一片崭新的天地。 1 食用色素 食用色素的使用是为了满足人们对食品感官品质的要求。目前使用的食用色素有天然食用色素和合成食用色素两大类。合成食用色素由于成本低廉，色泽鲜艳，着色力强，对光、热、氧气和pH稳定，但有一个缺点，即具毒性（包括毒性、致泻性和致癌性）。这些毒性源于合成色素中的砷、铅、铜、苯酚、苯胺、乙醚、氯化物和硫酸盐，它们对人体均可造成不同程度的危害。天然食用色素是 生物化学实验原理与技术 中国农业科学院研究生院 生物化学与分子生物学教研室 1999年 12月 目录 蛋白质化学部分 实验一多酚氧化酶（PPO）的分离纯化 (4) 实验二多酚氧化酶（PPO）的活性测定 (8) 实验三考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质浓度 (10) 实验四 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量 及蛋白质的纯度鉴定 (12) 实验五等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点 (16) 实验六多酚氧化酶（PPO）的同功酶检测 (19) 免疫学部分 实验七多酚氧化酶（PPO）抗体的制备 (24) 实验八多酚氧化酶（PPO）扩散免疫电泳 (31) 实验九多酚氧化酶（PPO）火箭免疫电泳 (33) 实验十 Western bloting技术 (40) 实验十一亲和层析法分离纯化胰蛋白酶 (44) 核酸化学部分 实验十二植物染色体DNA的提取 (52) 实验十三质粒DNA的提取与纯化 (54) 实验十四 DNA片断的酶切技术 (57) 实验十五 DNA片断的连接技术 (59) 实验十六受体菌感受态细胞的制备 (61) 实验十七重组DNA片断的转化、克隆及筛选 (62) 作业 实验结束后按实验指导的格式写出实验报告，其中包括：实验目的与原理；材料与方法；实验结果与分析；实验结果讨论。实验结果照片、图表等要附在实验报告中。 蛋白质化学部分 实验一多酚氧化酶（PPO）的分离、纯化 一、实验原理与目的 多酚氧化酶（儿茶酚酶），它是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体内，可参与植物生长、分化和种皮透性的调节。植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O 2 氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以伤口醌类物质出现是植物防止伤口感染的愈伤反应，因而受伤组织一般这种酶的活性就会提高。多酚氧化酶的活性与植物抗病有一定联系，植物免疫与动物免疫的机理不同，后者是抗体与抗原的关系，前者的免疫机理现在认为主要是产生对病源有害物质。已发现具有免疫作用的有害物质是多种多样的，概括为两种类型，其中的一种类型就是原有的有毒物质，植物本身含有的一些对病菌有抑制作用，使病菌无法在寄主中生长。很早就发现酚类化合物与抗病有明显的相关，例如原儿茶酸与儿茶酚对有色洋葱磷茎炭疽病菌的抑制作用。多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用： ＋+醌 2O 底物+酚 2 但是PPO的存在是水果、蔬菜褐变的主要原因之一，影响一些经济植物产品的质量。在制茶加工工业中这种酶有重要作用，在制茶时要立即杀青，防止多酚氧化酶的活性，避免醌类物质的产生，保持茶色清香。因此，许多学者对此进行研究，并从一些植物组织中分离纯化这种酶，研究酶的理化性质和生化特性。 本实验将采用马铃薯为主要材料，通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液；再经过阴离子交换柱DEAE 第三篇污染物的生物化学转化技术 第七章活性污泥法 第一节废水生物处理 一．概述 废水生物处理是通过微生物的新陈代谢作用,将废水中有机物的一部分转化为为微生物的细胞物质,另一部分转化为比较稳定的化学物质(无机物或简单有机物)的方法。不论何种生物处理系统，都包括三各基本要素，即作用者．作用对象和条件。 生物处理的主要作用者是微生物，特别是其中的细菌。根据生化反应中氧气的需求与否，可把细菌分为好氧菌．兼性厌氧菌和厌氧菌。主要依赖好氧菌和兼性厌氧菌的生化作用来完成处理过程的工艺，称为好氧生物处理法；主要依赖厌氧菌和兼性厌氧菌的生化作用来完成处理过程的工艺，称为厌氧生物处理法。 再绝大多数情况下，生物处理的主要对象（即充作微生物营养基质的化学物质）为可生化的有机物；进在个别情况下，生物处理的主要对象可以是无机物（如好氧条件下进行的硝化处理对象是氦，厌氧条件下进行的反硝化处理的对象是硝酸盐）。 生物处理需要提供众多的环境条件，但从处理方法的分类角度看，最基本的环境条件当属氧的存在或供应与否。好氧生物处理必须充分供应微生物生化反应所必需的溶解氧；而厌氧生物处理过程则必须隔绝与氧的接触。由于受氧的传递速度的限制，微生物进行好氧生物处理时有机物浓度不能太高。所以有机固体废弃物．有机污泥．有机废液及高浓度有机废水的生物处理，自然是在厌氧条件下完成的。 （一）好氧生物处理 在废水好氧生物处理过程中，氧是有机物氧化时的最后氢受体，正是由于这种氢的转移，才使能量释放出来，成为微生物生命活动和合成新细胞物质的能源，所以，必须不断地供给足够的溶解氧。 好氧生物处理时，一部分被微生物吸收的有机物氧化分解成简单无机物（如有机物中的碳被氧化成二氧化碳，氢与氧化合成水，氮被氧化成氨．亚硝酸盐和硝酸盐，磷被氧化成磷酸盐，硫被氧化成硫酸盐等），同时释放出能量，作为微生物自身生命活动的能源。另一部分有机物则作为其生长繁殖所需要的构造物质，合成新的原生质。这种氧化分解和同化合成过程可以用下列生化反应表示。21生物化学习题与解析--常用分子生物学技术的原理及其应用
甘油绿色化学法制1,3-丙二醇
21-生物化学习题与解析--常用分子生物学技术的原理及其应用
生物化学产品制备技术
生物化学实验原理与技术
第三篇 污染物的生物化学转化技术