分子与基因工程-生物技术-复习题

1、简述rRNA在肽链合成中的作用？

功能是作为mRNA的支架，使mRNA分子在其上展开，形成肽链

2、分别说出5种以上RNA的功能？

mRNA：信使RNA是转录产物，可翻译成多肽链。

tRNA：转运RNA，是用来翻译过程中运输氨基酸。

rRNA:核糖体RNA，构建核糖体的成分。

hRNA：小发卡结构RNA，是生成mRNA的前体RNA，也是在DNA干扰中起作用。

micRNA:反义RNA,对基因的表达起调节作用。

3、基因工程载体的必备条件是什么，列举三种以上的常用载体。

必备条件：a具有对受体细胞的可转移性b具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点c具有较高的外源DNA的装载能力d具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点e具有合适的筛选标记

常用载体：噬菌体，质粒，病毒DNA，噬菌粒

4、什么是报告基因，举例说明报告基因在分子生物学研究中的二种以上的用途？

报告基因: 是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。

应用：①β-D-葡萄糖苷酶基因，该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。②cat基因作为报告基因，检测时可通过放射自显影观察。荧光酶基因作为报告基因，具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点。

5、请列举三种以上检测基因表达的方法?

抗药性筛选、营养缺陷型筛选、显色筛选

6、以色氨酸操纵元为例说明衰减子如何控制基因转录？

在trp mRNA 5'端trpE基因的起始密码前有一个长162bp的mRNA片段被称为前导区,研究发现,当mRNA 合成起始以后,除非培养基中完全没有色氨酸,转录总是在这个区域终止,产生一个仅有140个核苷酸的RNA 分子,终止trp基因转录.因为转录终止发生在这一区域,并且这种终止是被调节的,这个区域就被称为弱化子.

Trp操纵子转录终止的调控是通过弱化作用实现的。当培养基中色氨酸的浓度很低时,负载有色氨酸的tRNATrp也就少,这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢,当4区被转录完成时,核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的trp密码子处）,这时的前导区结构是2-3配对,不形成3-4配对的终止结构,所以转录可继续进行,直到将trp操纵子中的结构基因全部转录

7、Southern blotting 和Northern blotting 的实验原理、目的及主要实验步骤。

S：目的：是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。原理：根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单练DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段。步骤：待测核酸样品的制备→待测DNA 样品的电泳分离→凝胶中核酸的（碱）变性→southern印迹→southern杂交→杂交结果检测

N：目的：主要用于分析检测特异性RNA。原理：Northern杂交是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术，首先将RNA混合物按它们的大小和分子量通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，分离出来的RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再与放射性标记的探针杂交，通过杂交结果可以对表达量进行定性或定量。步骤：RNA混合物进行琼脂糖凝胶电泳→分离得到的RNA转膜→与放射性标记的探针杂交→结果分析。

8、“生物进化过程中，最早出现的生物大分子是RNA，而不是DNA和蛋白质，即在进化某个阶段有一个RNA世界”这一观点已被普遍接受，谈谈对这一观点的认识。

最早出现的简单生命体中的生物大分子，应是既具有信息载体功能又具有酶的催化功能，因此，最早的生物大分子。进化之初是"RNA的世界"，RNA可以一身二任，既能保存信息，又能提供酶活性，因此仅有RNA 也足以把早期的进化引向新的阶段。

9、为实现外源基因在原核生物中高效表达，应考虑哪些因素？

启动子（启动子要有可控性，用启动能力强的启动子）

终止子（用终止作用强的终止子）

核糖体结合位点（用含有与启动子来源相同的核糖体序列结合位点）

密码子（解决密码子的偏爱性）

质粒拷贝数（重组质粒的扩增要可控）

10. 描述DNA滚环复制过程及其特征。

环状DNA可以采取上述典型的DNA复制方式进行复制，即从复制起点开始，双向同时进行，形成θ样中间物，故又称"θ"型复制，最后两个复制方向相遇而终止复制。但有些环状DNA采用另个一种方式，即滚环复制。例如许多病毒DNA的复制、F因子在接合(conufgation)转移时其DNA的复制，以及许多基因扩增时都采用这种方式。

在以这种机制进行的复制中，亲代双链DNA的一条链在DNA复制起点处被切开，其5'端游离出来。这样，DNA聚合酶Ⅲ便可以将脱氧核糖核苷酸聚合在3'-OH端。当复制向前进行时，亲代DNA上被切断的5'端继续游离下来，并且很快被单链结合蛋白所结合。因为5'端从环上向下解链的同时伴有环状双链DNA环绕其轴不断的旋转，而且以3'-OH端为引物的DNA生长链则不断地以另一条环状DNA链为模板向前延伸，因而称为滚环复制。由于只有一条DNA链是完整的，因而在DNA解链时不会产生拓扑学上的问题，即未解链的双螺旋区不会产生超螺旋。当5'-端从环上解下来后不久，即与单链结合蛋白结合，以后可移动的引发体便在其上形成，以引发RNA引物的合成，然后由DNA聚合酶Ⅲ催化合成冈崎片段。这个过程与前述的DNA 滞后链的合成一样。最后由DNA聚合酶Ⅰ切除RNA引物，并填充间隙构成完整的DNA链。5'端所以能从环上不断解链，主要是由于DNA聚合酶Ⅲ及引发体构成的复制体中的螺旋酶不停的向前移动所致。在这种复制方式中，DNA的延伸可以一直进行下去，产生的DNA链可以是亲代DNA单位长度的许多倍。这么长的DNA 链是如何转变为单位长度的DNA分子的，目前尚不清楚。可能是由特异的内切酶切开产生单位长度的子代DNA。这些DNA可自身环绕，或保持线性分子状态

特点

(1)以亲本链（+链）为模板合成互补的环状负链，形成闭合环状的复制形RF1；

(2)以成环滚环复制产生多个子代RF；

(3)以RF的负链为模板进行滚环复制产生多拷贝正链单环。

11．一个基因如何产生两种不同类型的mRNA分子？

一个基因可以有两种方式产生一种以上的mRNA.第一种是：一个转录初级产物含有一个以上的多聚腺苷化位点，就能产生一种以上的具有不同3’末端mRNA。第二种是：如果一个初级产物含有几个外显子，发生不同的剪接就会产生多种mRNA.。

12．在一个克隆基因的分析中发现：一个含有转录位点上游3.8kb DNA的克隆，其mRNA直接转录活性比仅含有3.1kb上游DNA克隆的转录活性大50倍。这表明了什么？

在转录位点上游3.8—3.1kb之间有一个增强子。

13.列举原核生物同真核生物转录的差异。

真核生物中编码蛋白质的基因通常是间断的、不连续的,由于转录时内含子和外显子是一起转录的,因而转录产生的信使RNA必须经过加工,将内含子转录部分剪切掉,将外显子转录部分拼接起来,才能成为有功能的成熟的信使RNA.而原核生物的基因由于不含有外显子和内含子,因此,转录产生的信使RNA不需要剪切、拼接等加工过程.

原核生物基因的转录和翻译通常是在同一时间同一地点进行的,即在转录未完成之前翻译便开始进行.如

大肠杆菌乳糖分解代谢过程中,三个结构基因的转录和翻译就是同时在细胞质中进行的.真核生物由于有

细胞核,核膜将核质与细胞质分隔开来,因此,转录是在细胞核中进行的,翻译则是在细胞质中进行的.可见,真核生物基因的转录和翻译具有时间和空间上的分隔.上述真核生物基因转录后的剪切、拼接和转移等过程,都需要有调控序列的调控,这种调控作用是原核生物所没有的.

14．简述乳糖操纵子的结构和功能。

①乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶,此外还有一个操纵序列O,一个启动子P和一个调节基因I.

②阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时,I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处,乳糖操纵子处于阻遏状态,不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时,乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构,不能结合于操纵序列,乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶.所以,乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控.

③CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点,当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时,cAMP浓度升高,与CAP结合,使CAP发生变构,CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点,激活RNA聚合酶活性,促进结构基因转录,调节蛋白结合于操④纵子后促进结构基因的转录,对乳糖操纵子实行正调控,加速合成分解乳糖的三种酶.协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制,互相协调、互相制约.

15. 简述遗传密码的兼并性和摆动假设。

遗传密码普遍存在与生物界中，由一种以上的密码子编码同一个氨基酸的现象称为遗传密码的兼并性。

遗传密码的摆动性，密码子与反密码子配对，有时会出现不遵从碱基配对规律的情况，称为遗传密码的摆动现象。这一现象更常见于密码子的第三位碱基对反密码子的第一位碱基，二者虽不严格互补，也能相互辨认。tRNA分子组成的特点是有较多稀有碱基，其中次黄嘌呤(inosine, I)常出现于反密码子第一位，也是最常见的摆动现象。

16. 何谓真核生物断裂基因？说明其结构并论述其转录表达的过程及调控。

真核生物的断裂基因由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成。能编码蛋白质的基因称为外显子，不能编码蛋白质的基因称为内含子。

转录表达的过程：

第一步合成原始转录产物（过程包括转录的启动、延伸和终止）；

第二步转录产物的后加工，使无生物活性的原始转录产物转变成有生物功能的成熟RNA。

第三布核糖体结合到mRNA上，由tRNA携带氨基酸合成多肽链

调控：

转录水平调控：顺式作用元件与反式作用因子相结合进行调控

转录后调控：5端加帽子，3端加PolyA尾。mRNA的选择剪接。RNA干扰现象

翻译水平调控：5端帽子结构的甲基化，翻译起始因子的调控

17. 试述DNA克隆的基本流程，并列举两种阳性克隆筛选的方法。

过程：一个完整的DNA克隆过程应包括：目的基因的获取，基因载体的选择与构建，目的基因与载体的拼接，重组DNA分子导入受体细胞，筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）。

筛选方法：1蓝白斑筛选

野生型大肠杆菌（E.Coli）产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝，使菌落呈现蓝色。重组后的大肠杆菌不能产生β-半乳糖苷酶，因此不会产生5-溴-4-靛蓝，菌落成白色。

2抗药性筛选:将抗药性基因与目的基因一同接入到载体中，然后转入受体细胞。在培养基中加入相应的药性物质，能生长的菌株就是含有目的基因的菌落，不含目的基因的菌株不能生长。

18. 简述位点特异性重组的机理

位点特异性重组（site-specific recombination）是遗传重组的一类。这类重组依赖于小范围同源序列的联会，重组也只发生在同源的短序列的范围之内，需要位点特异性的蛋白质分子参与催化，重组的蛋白不是rec 系统而是int 等，如噬菌体l 的定点插入。重组时发生精确的切割、连接反应，DNA不失去、不合成。两个DNA分子并不进行对等的交换，有时是一个DNA分子整合到另一个DNA分子上（插入重组）。

19. 简述乳糖操纵子中各种结构元件及其所起的作用。

调节基因，产生阻遏蛋白

启动子，使RNA聚合酶结合到DNA链上并且完成起始反应

操纵基因，控制一个邻近基因或基因群的表达

结构基因y，z，a。分别编码产生β-半乳糖苷酶，半乳糖苷透过酶，半乳糖甘转乙酰酶

20. 简述鸟枪法测序的基本原理和过程。

原理：将目的DNA随机地处理成大小不同的片段，再将这些片段的序列连接起来。

过程：(1).使用限制性内切酶将带有目的基因的DNA链切成若干小段。

(2).再使用DNA连接酶将其整合到载体的基因中,并使其表达。

(3).如果在某个细胞中得到了目的产物,就说明整合到该细胞中的DNA片段就是所需要的DNA片段。

21. 作为载体应该具备哪些基本条件？

作为运载体必须具有三个条件：①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入；③有一定的标记基因，便于进行筛选。

22. 简述哺乳动物外源基因转入受体细胞的方法。

磷酸钙共沉淀法，电击转化法，脂质体介导法，显微注射法，血影细胞介导法

23. 试论述现阶段生产人胰岛素的方法

答：基因工程法制人的胰岛素

1 A链和B链分别表达法

2 A连和B链同时表达法

3 人胰岛素原表达法

4 分泌型重组人胰岛素表达法

5 以酵母为受体分泌表达人胰岛素，胰岛素基因前端可加一个信号肽编码序列，这个信号肽引导合成的胰岛素分泌到周围的培养基中，简化了纯化过程，最后通过酶学反应使之变成人胰岛素。（P375 基因工程+讲义）

24. 试述细菌适应于外界营养环境的分子调控机制？

答：1 如乳糖操纵子的CＡＭＰ＿ＣＲＰ的正调节，当环境中葡萄糖存在时，细菌直接利用葡萄糖，细菌的ｃＡＭＰ水平低，且CAP以二聚体形式存在；当环境中葡萄糖缺乏时，CAMP升高结合CAP，其CAP－CAMP 复合物乳糖启动子上游，诱导DNA90度弯曲，增强RNA聚合酶结合启动子的能力，使转录增强５０倍从而分泌酶加速乳糖分解为葡萄糖，供细胞进行利用。

2 如色氨酸操纵子的阻遏系统，若外界色氨酸量充足，则它与游离的辅阻遏蛋白相结合，并使之与操纵区的DNA紧密结合，使色氨酸表达受阻；若外界的色氨酸供应不足时，则辅阻遏物失去色氨酸并从操纵区解离，色氨酸操纵子去阻遏，开始表达色氨酸。（P264）

25. 试说明基因组DNA产生重复序列的可能机制。

答：1 复制滑动扩增2 滚环扩增3 不等交换 4 碱基置换突变等

26. 简述原核生物的RNA聚合酶各亚基的功能。

答：σ亚基与RNA聚合酶的四聚体核心(α2ββ')的形成有关;β亚基含有核苷三磷酸的结合位点;β'亚基含有与DNA模板的结合位点;而Sigma因子只与RNA转录的起始有关，与链的延伸没有关系，一旦转录开始，σ因子就被释放，而链的延伸则由四聚体核心酶(core enzyme)催化。

27. 简述色氨酸衰减子结构及其调控方式。

答：阻遏作用trp操纵子转录起始的调控是通过阻遏蛋白实现的。产生阻遏蛋白结合于trp操纵基因特异序列，阻止转录起始，但阻遏蛋白的DNA结合活性受trp调控，再有高浓度trp存在时，阻遏蛋白色氨酸复合物与色氨酸操纵子紧密结合，可以阻止转录。当trp水平低时，阻遏蛋白以一种非活性形式存在，不能结合DNA。在这样的条件下，trp操纵子被RNA聚合酶转录。trp生物合成途径被激活。……弱化作用：trp操纵子转录终止的调控是通过弱化作用实现的，大肠杆菌trp操纵子前导区的碱基序列包括4个片段，能以两种不同的方式进行碱基配对，当trp浓度很低时，翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度很慢，这时的前导区结构是2-3配对，不行成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行。当trp浓度很高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子再4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对，3-4区可以配对，行成终止结构，转录停止

28. 简述影响翻译水平高低的因素有哪些？

答：1、SD序列（核糖体结合位点）被封闭

2、小RNA作用于目标mRNA,使其降解或不能翻译

3、缺少某种氨基酸时,tRNA空载

4、密码子偏爱性

29. 简述原核生物反式作用因子的结构域特征。第六章ppt

反式作用因子含有两种不同的结构域

a.dna结合结构域1螺旋-反转-螺旋2锌指3基域（通常以二聚体结合于dna上0、）

b.转录激活结构域（功能域）1酸性激活域2谷酰胺丰富域3脯氨酸丰富域

阻遏域：专一性的直接阻遏的结构域

30. 简述Ⅱ型限制性内切酶的命名方式及特征。ppt11章

属名+种名+株名

Ⅱ型限制性核酸内切酶的特点是：一般能识别和切割 4~8 个碱基对的核苷酸序列；大多数识别序列具有回文结构；没有甲基化修饰酶功能。

Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割方式有三种：切割产生 5 ' 突出的粘性末端；切割产生 3 ' 突出的粘性末端；切割产生平头末端

31.试述利用原核表达载体进行外源基因表达的基本思路及方法步骤。(百度百科)

获得目的基因，

（1）通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

（2）通过RT-PCR方法：提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

构建重组表达载体

（1）载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

（2）PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体

获得含重组表达质粒的表达菌种

（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

（3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

32. 试述真核生物基因表达调控的多层次性。ppt第七章

染色体水平的调控组蛋白对基因活性的影响，组蛋白的乙酰化-去乙酰化，非组蛋白的调节，核基质的调控作用，基因丢失，基因扩增，基因重排

dna水平 dna甲基化

转录水平 rna聚合酶的活性，顺式作用元件，反式作用因子

转录后水平 5’短加帽和polyA尾的调控意义，mrna的选择剪接，mrna运输的控制，rna干涉

翻译水平 5'端UTR结构与翻译起始的调节，5’帽子结构的甲基化，翻译起始因子的调控

蛋白质加工和降解水平新生肽链的水解，肽链中氨基酸的共价修饰，通过信号肽分拣、运输、定位

33.说明启动子突变会导致基因表达发生变化的可能情况？

启动子突变可能会提高、降低或不影响基因的表达量。

1启动子突变提高基因的表达量。例子就是TERT promoter突变与人类癌症的关系。TERT启动子的突变在多种癌症中都广泛存在，超过一半的膀胱癌患者都携带这种突变。在对黑色素瘤的研究过程中发现TERT

启动子的突变可以使TERT基因的转录水平提高2-4倍。

2启动子突变降低基因的表达量。例子就是在一项对HD（亨廷顿氏病 Huntington's Disease）基因的启动子研究中,当把HD基因转录起始位点上游?126到?141这一段DNA删除后，HD基因的表达量显著下降。

3.启动子突变不影响基因的表达量。启动子里的突变是很多的，而且不同个体间的差异是很大的，从没有突变到3000+突变都有。但是大部分个体间的基因表达谱差异却不是很大，所以应该说大部分启动子内部的突变对基因表达的影响是微乎其微的。

34.简述基因工程的应用。

1．生物反应器通过基因工程可以大量生产所需要的生活活性物质，这个反应器的工厂可以是微生物，可以是动物细胞或转基因动物，也可以是转基因植物。

2、遗传改良植物方面可以培育出抗虫、抗病、增进品质的作物新品种；动物方面可以提高其生长、生殖或抗逆性等性能；微生物方面可以获得增强性能的生物杀虫剂、抗病剂、新型抗生素、土壤改良剂和环境净化剂等。

3、基因治疗将健康基因移植到相关组织或细胞可使遗传患者的症状减缓甚至消失。

35.简述DNA损伤后的修复类型有哪些？

1、错配修复一旦在DNA复制过程中发生错配，细胞能通过准确的错配修复系统识别新合成链中的错配并加以校正，DNA分子链中的错配几乎完全能被修复。

2、切除修复切除修复分为碱基切除修复和核苷酸切除修复两类，切除修复功能广泛存在于原核生物和真核生物中，也是人类的主要修复方式,啮齿动物 (如仓鼠、小鼠)先天缺乏切除修复的功能。

3、重组修复机体细胞对在复制起始时尚未修复的DNA损伤部位可以先复制在修复，即先跳过该损伤部位，在新合成的链中留下一个对应于损伤序列的缺口，该缺口由DNA重组来修复：先从同源DNA母链上将相应核苷酸序列片段移至链缺口处，然后再用新合成的序列补上母链空缺。

4、DNA的直接修复是把损伤的碱基回复到原来状态的一种修复，不需要切除碱基或核苷酸。

5、SOS反应细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，细胞为求生存而产生的一种应急措施。SOS反应包括诱导DNA损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制及溶原性细菌释放噬菌体等，细胞癌变也与SOS反应有关。

36.阐述蓝白斑筛选的原理及其应用。

现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG 的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克

隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基酸端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。应用于基因工程中重组子的筛选。

37.列举基因工程中常用的工具酶有哪些？

限制性核酸内切酶：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用；

DNA连接酶：修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键；修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键；连接多个平头双链DNA分子；

DNA聚合酶

核酸酶

核酸修饰酶

38. 简述用于高等哺乳动物细胞基因转移的方法。

哺乳动物细胞的物理转化法：利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻了负担。（磷酸钙共沉淀法；电击转化法；脂质体介导法；显微注射法；血影细胞介导法）

哺乳动物细胞的病毒转染法:以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒共转染特定的受体细胞。

39. 论述原核生物基因表达调控的机制。

遗传信息有序地传递到蛋白质或功能RNA分子的过程就称为基因表达。对该过程的调节就称为基因表达调控。

操纵子调控：（1）乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶，透酶，半乳糖甘转乙酰转移酶，此外还有一个操纵子0、一个启动序列P及一个调节基因I，在P序列上游还有一个-CAP结合位点，由P序列，0序列，CAP结合位点共同构成乳糖操纵子的调控区，三个编码基因由同一个调控区调节。乳糖操纵子调节机制可分为三个方面：(a)阻遏蛋白的负性调节：在没有诱导物存在时，阻遏蛋白与0序列结合，阻遏RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录启动。当有诱导物存在时，异乳糖作为一种诱导剂结合阻遏蛋白，改变了它的构象，使它序列解离，RNA聚合酶与P序列结合转录起始。（b）CAP的正性调节：分解代谢物基因激活蛋白CRP分子内有DNA结合区及CAP结合位点。没有葡萄糖时，cAMP浓度较高，结合cAMP的CRP结合在乳糖启动序列附近的CA位点结合，激活RNA转录活性。当葡萄糖存在时，cAMP浓度降低，cAMP与CA结合受阻，因此乳糖操纵子表达下降。（c）协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负控调控与CRP的正调控两种机制，相互协调，相互制约。

色氨酸操纵子：（a）阻遏作用trp操纵子转录起始的调控是通过阻遏蛋白实现的。产生阻遏蛋白结合于trp 操纵基因特异序列，组织转录起始。但阻遏蛋白的DNA结合活性受Trp调控，在有高浓度Trp存在时，阻遏蛋白-色氨酸复合物与色氨酸操纵子紧密结合，可以阻止转录。当Trp水平低时，阻遏蛋白以一种非活性形式存在，不能结合DNA。在这样条件下，trp操纵子被RNA聚合酶转录，Trp生物合成途径被激活。（b）弱化作用trp操纵子转录终止的调控是通过弱化作用实现的。大肠杆菌trp操纵子前导区的碱基序列包括4个片段，能以两种不同的方式进行碱基配对，当Trp浓度很低时，翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度很慢，这时的前导区结构是2-3配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行。当Trp浓度很高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前，核糖体久到达2区，这样使2-3不能配对，3-4区可以配对形成终止结构，转录终止。

40. 论述PCR反应的原理、过程及应用。

PCR为多聚酶链式反应，其基本原理就是在高温下使双链DNA变性，然后经低温退火使引物变性后的DNA 单链结合，经中温延伸，形成位于两引物之间的目的DNA，经过若干次循环可产生许多倍的目的DNA片段。过程：1.94℃预变性，3min

2.94℃变性 30s

退火 55℃ 30s

72℃延伸 60s

3.72℃延伸 10min

4 .保温 10℃

应用： 1.目的基因的克隆

2. 基因的体外突变

3 .DNA和RNA的微量分析

4. DNA的序列测定

5. 基因突变分析

41. 转录涉及模板链和编码链的分离，解释在转录中单链DNA是怎样被保护的。

S SB单链结合蛋白，其功能在于被解链酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构，以四聚体的形式存在于复制叉处，待单链复制完成后才离开，重新进入循环

被解链酶分离的两条单链迅速与单链结合蛋白（SSB）结合，以保持单链结构的稳定，避免双链结构重新形成，同时保持单链的完整性防止单链DNA被细胞内的极酸酶水解。

42. 简述真核、原核生物基因组的差异。

1原核生物基因组很小，一般只有一条染色体，真核生物基因组庞大

2原核生物DNA分子的绝大部分一般是用来编码蛋白质的，只有非常小的一部分不能转录，这与真核DNA 的冗余现象不同

3原核生物DNA序列中功能相关的RNA和蛋白质基因，往往以集中在在基因组的一个或几个特定的部位，形成功能单位或转录单位，它们可被一起转录为含有多个mRNA的分子，叫多顺反子。而真核生物中没有这种结构只有单顺反子。

4原核生物基因组中含有重叠基因，真核生物基因组中含有大量重叠基因

5真核生物基因组不连续，又内含子，外显子，二原核生物没有。

43. 为什么需要RNA引物来引发DNA的复制

DNA的复制需要RNA引物，这是由DNA聚合酶和RNA聚合酶的特性决定的。DNA聚合酶不能从头合成DNA，既不能催化2个游离核苷酸之间的磷酸二之键的形成，而只能通过3-oH末端添加新的核苷酸来延长已存在的多核苷酸链，而引物酶，从头合成新链的能力，能在单链模板上合成与之互补的RNA引物（5~10个核苷酸再由DNA聚合酶从引物的3-OH末端形成DNA链的合成）

44、简述遗传密码的特点。

1、密码子的连续性。翻译始于RNA的5‘端起始密码子，一个密码子接一个密码子连续阅读直到3’端终止密码子，密码子间无间断也无交叉，即起始密码子决定了所有后续密码子的位置

2、密码子的兼并性。遗传密码子最突出的特征之一是64种密码子中的61种分别编码20种氨基酸，这意味着很多氨基酸是由超过1种以上的密码子编码的，这种现象被称为密码子的兼并性。

3、密码子的通用性。密码子的通用性指蛋白质合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。

4、密码子的摆动性。TRNA的反密码需要通过碱基互补与RNA上的遗传密码反向配对结合，摆动性指出反密码子与密码子之间不严格遵守常见的碱基配对现象。

45、真核生物基因表达调控有哪些方面?

按性质可分为1第一类，瞬时调控或可逆调控，是细胞对环境变化（如底物浓度，激素浓度）的应答

2第二类，发育调控或不可逆调控，细胞的分裂，生长，分化，发育，形态构成。

按时间可分为染色体水平，DNA水平，转录水平，转录后水平，翻译水平，翻译后水平

（1）染色体水平：组蛋白的乙酰化-去乙酰化、非组蛋白的调节、核基质的调控作用、基因的丢失（不可逆）、基因扩增（增加基因的拷贝数）、基因重排。

（2）DNA水平：DNA甲基化（甲基化程度高，对基因转录抑制的调控能力越强）、去甲基化（基因转录激

活）

（3）转录水平：RNA聚合酶（启动子，调节序列和调节蛋白通过DNA-蛋白质相互作用，蛋白质-蛋白质相互作用影响RNA聚合酶活性。）、特异DNA序列（顺式作用元件：启动子、增强子、沉默子、绝缘子）、调节蛋白（反式作用因子：基本转录因子、转录调节因子、共调节因子）

（4）转录后水平：5’端加帽和3’端多聚腺苷酸化的调控、mRNA的选择剪接、mRNA运输的控制、RNAi

现象。

（5）翻译水平：5’端UTR（非翻译区）结构与翻译起始的调节、翻译起始因子的调控。

（6）翻译后水平：新生肽链的水解（酶解）、肽链中氨基酸的共价修饰（磷酸化、甲基化、酰基化）、通过信号肽分拣，运输，定位。

46.有哪些检测基因表达的方法?

可直接检测目的蛋白 western blot 绿色荧光蛋白

可间接检测目的mRNA是否存在，northern blot RT-PCR

转录水平检测 RT-PCR real-time PCR, northern blot

直接检测报告基因融合荧光蛋白

47.述为实现外源基因在原核生物中高效表达应考虑的因素。

（1）外源基因的拷贝数⑵外源基因的表达效率：①启动子的强弱②核糖体接合位点的有效性③SD序列和起始密码ATG的间距④密码子组成⑶表达产物的稳定性⑷细胞代谢负荷⑸工程菌的培养条件

48.简述真核细胞中翻译终止的过程。(P143)

真核生物字只需要一个终止因子eRF需要GTP,它识别所有的终止密码。终止密码UAG UAA UGA可引起蛋白质合成终止。在终止因子的参与下，核糖体上的转肽酶将合成完毕的肽链水解释出肽链延伸过程中当终止密码子UAA UGA UAG出现在核糖体的A位时，没有相应的AA-tRNA能与之结合，而释放因子能识别这些密码子并与之结合水解P位上多肽链与tRNA之间的二酯键。接着新生的肽链和tRNA从核糖体释放，核糖体大小亚基解开，蛋白质合成结束翻译终止。

49.简述大肠杆菌乳糖操纵子的主要结构和表达调控机制(P255-P256)

乳糖操控子是大肠杆菌中控制β半乳糖苷酶诱导合成的操纵子。包括调控元件P(启动子)和O(操纵基因)，以及结构基因lacZ(编码半乳糖苷酶)、lacY(编码通透酶)和lacA(编码硫代半乳糖苷转乙酰基酶)。

1、无乳糖时，调节基因lacI 编码阻遏蛋白，与操纵基因O 结合后抑制结构基因转录,不产生代谢乳糖的酶。

2、只有乳糖存在时,乳糖可与lac阻遏蛋白结合，而使阻遏蛋白不与操纵基因结合，诱导结构基因转录，代谢乳糖的酶产生以代谢乳糖。

3、葡萄糖和乳糖同时存在时，葡萄糖的降解产物能降低cAMP含量，影响CAP与启动基因结合，抑制结构基因转录，抑制代谢乳糖的酶产生。

补充：CAP：降解物基因活性蛋白，又称cAMP受体蛋白，这个蛋白先与cAMP结合，再与启动基因结合。它与启动基因结合时能促进RNA聚合酶与启动基因结合，促进结构基因转录

50.试述cDNA文库的构建过程及应用。

过程：1 cDNA克隆：选用目的基因含量丰富的组织细胞，提取总RNA根据3’末端polyA尾长度不一，用亲和层析法获取较纯的mRNA

2、第一股cDNA合成：以分离纯化的mRNA为模板，以Oligo(dT) 为引物在反转录酶的作用下，沿模板的3’→5’方向合成。对于较长的mRNA分子很难得到全长cDNA，也可用随机引物法，以6～8个核苷酸为随机引物，从mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链（RNA-DNA）

3、第二股cDNA的合成：⑴自身引导法

⑵置换合成法⑶外加引物合成法

4、cDNA与载体连接和导入宿主细胞：cDNA加头或衔接尾，使产生的黏性末端与载体相应的黏性末端互补，形成重组DNA。

应用：1.以成熟mRNA 为模板合成的cDNA无内含子，大大减小其长度，便于操作

2.真核生物细胞表达mRNA 的量比人类基因组少很多，因此减少了筛选目的基因的工作量

3.某一特定功能基因在mRNA 中拷贝量大于基因组，利于获得较多模板。

4.可从全长cDNA序列中直接找到编码区，推测氨基酸顺序，分析性质和功能。

5.基因克隆后可在原核细胞中表达有生物活性的蛋白

51.原核生物基因组的特点（P33）

（1）结构简练

（2）存在转录单元

（3）有重叠基因

52. 反转录转座子与反转录病毒区别。

反转录转座子是指通过RNA实现转座的遗传元件。反转录病毒是由一列反转录转座子构成含RNA基因组的侵染颗粒。

54. 简述增强子特点。P89

A.远距离效用一般位于上游-200bp处，但可增强远处启动子的转录，即使相距十多个千碱基对也能发挥作用。

B.无方向性无论位于靶基因的上游，下游或内部都可发挥增强转录的作用。

C.顺势调节只调节位于同一染色体上的靶基因，而对其他染色体上的基因没有作用。

D.无物种和基因的特异性可以连接到异元蛋白基因上发挥作用。

E.具有组织特异性 SV40增强子在3T3细胞中比多瘤病毒的增强子要弱，但在HeLa细胞中SV40的增强子比多瘤病毒的要强5倍。增强子的效应需特定的蛋白质因子参与。

F．有相位性其作用与DNA的构想有关。

G有的增强子可以对外部信号产生反应如如热休克基因在高温下才表达，金属硫蛋白基因在镉和锌的存在下才表达。某些增强子可以被固醇类激素所激活。

55. 简述DNA复制的几种类型及各自特征。P47.48

共性：DNA双链的复制大都半保留方式，绝大多数复制是以复制叉的形式进行的。

A.线性DNA双链的复制

DNA复制需RNA引物提供3’-OH才能起始。从一个或多个复制起始进行双向（少数为单向，如腺病毒）复制产生复制叉，每个复制起始完成的复制片段称为复制子。线性DNA复制子末端的复制需·特殊机制：a 将线性复制子转变成环状或多聚分子b在DNA末端形成发夹结构，使该分子没有游离的末端。

B.环状DNA双链的复制

a.θ型在原核生物中发现的一种DNA复制机制。复制是在环形DNA分子某一点(复制起始点)上开始的。当复制围绕着染色体的两个方向进行时，所形成的复制泡状物延续生长。这种复制是把一个环形染色体转化成两个子代染色体的方法。

b.滚环形噬菌体中常见。以亲本链(+链)为模板合成互补的环状负链，形成闭合环状的复制形RF1;以成环滚环复制产生多个子代RF;以RF的负链为模板进行滚环复制产生多拷贝正链单环。

c.环（D-loop）型单向复制的特殊方式。双螺旋的两条链并不同时进行复制，重链先开始复制，稍后轻链再开始复制，当复制沿轻链开始时，重链上产生了D环，随环形轻链复制的进行，D环增大，轻链后亦开始复制，最后两条链完成复制形成两条新的DNA双螺旋。

56. 葡萄糖是如何影响涉及糖代谢的操纵子（葡萄糖敏感型操纵子）的表达？

在缺乏葡萄糖时，cAMP的水平升高，CAP蛋白同每一个葡萄糖敏感操纵子中启动子内的CAP位点结合，转录作用协同起始。如果有葡萄糖，cAMP的．水平下降，CAP蛋白不再结合，转录的速率协同下降。

57. 构建基因表达载体常用的组件有哪些？

启动子（RNA聚合酶的识别部位和结合部位），终止子（终止基因转录过程），以及遗传标记基因（检测受体细胞中是否含有目的基因）、结构基因（负责编码目标蛋白）、复制原点（保证目的基因在受体细胞中自我复制遗传及表达）

58. 简述原核生物中反式作用因子的结构域特征。

反式作用因子含有两种不同的结构域：

1.DNA结合域：

a.螺旋-转角-螺旋

b.锌指结构

c.亮氨酸拉链

d.螺旋-突环-螺旋

2.转录激活域：

a、酸性激活域

b、谷酰胺丰富域

c、脯氨酸丰富域

59. 哺乳动物中，从母亲与父亲遗传而来的基因是差异表达的，这种现象的理论基础是什么？

答：在精子或卵子发生过程中一些基因被关闭或者甲基化。IGF-II在卵母细胞中被甲基化，因此遗传于母本的等位基因在后代中不表达。来源于父本的等位基因没有甲基化，客观存在能够表达。其他一些基因只在精母细胞中被甲基化，对这种基因而言，来源于母本的等位基因能表达。

60. 简述基因工程中获取目的基因的方法。

答：1、从基因文库中获取；2、PCR扩增；3、化学方法人工合成。

1、从基因文库中获取需要构建基因文库，构建的方法有：

（1）构建基因组文库：直接分离法

（2）构建部分基因文库如cDNA文库：逆转录法

2、PCR扩增是针对目的基因序列未知的情况，可采用PCR扩增。

3、人工合成有两种：

（1）逆转录法；

（2）化学方法人工合成；针对目的基因序列已知且较小的情况。

61. 试述如何将将所获得的目的基因插入到表达载体中，并阐述确定获得阳性重组DNA的方法。

答：1（1）先用限制性核酸内切酶切割载体，将载体环切开，然后再用DNA连接酶把所截取的目的基因连接。（2）直接选择法:抗药性标记选择，标志补救，分子杂交法。免疫学方法：化学分析法，酶联免疫检测分析

62. 试述人类基因组计划的科学意义。

答：1．确定了人类基因组中约2．5万个编码基因的序列及其在基因组中的物理位置，以及研究基因的产物及其功能。

2．了解转录和剪接调控元件的结构与位置，从整个基因组结构的宏观水平上理解基因转录与转录后调节。3．从整体上了解染色体结构，包括各种重复序列以及非转录“框架序列”的大小和组成，了解各种不同序列在形成染色体结构、DNA复制、基因转录及表达调控中的影响与作用。

4．研究空间结构对基因调节的作用。有些基因的表达调控序列与被调节基因从直线距离上看，似乎相距甚远，但若从整个染色体的空间结构上看则恰恰处于最佳的调节位置，因此，有必要从三维空间的角度来研究真核基因的表达调控规律。

5．发现与DNA复制、重组等有关的序列。DNA的忠实复制保障了遗传的稳定性，正常的重组提供了变异与进化的分子基础。局部DNA的推迟复制、异常重组等现象则导致疾病或者胚胎不能正常发育，因此，了解与人类DNA正常复制和重组有关的序列及其变化，将对研究人类基因组的遗传与进化提供重要的结构上的依据。

6．研究DNA突变、重排和染色体断裂等，了解疾病的分子机制，包括遗传性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引发的分子病理学改变及其进程，为这些疾病的诊断、预防和治疗提供理论依据。7．确定人类基因组中转座子、逆转座子和病毒残余序列，研究其周围序列的性质。了解有关病毒基因组侵染人类基因组后的影响，可指导人类有效地利用病毒载体进行基因治疗。

8．研究染色体和个体之间的多态性。这些知识可被广泛用于基因诊断、个体识别、亲子鉴定、组织配型、发育进化等许多医疗、司法和人类学的研究。此外，这些遗传信息还有助于研究人类历史进程、人类在地球上的分布与迁移以及人类与其他物种之间的比较。

63. 简述原核生物DNA复制的基本过程。

DNA的复制分为三个阶段，即复制的起始，延伸和终止。

DNA复制时需要在特定的位点起始，即复制的起始位点，在原核生物中，复制的起始位点通常只有一个。DNA复制的起始包括预引发和引发两个阶段。在预引发阶段，DNA解旋解链，形成复制叉，引发体组装，引发阶段，在引发酶的催化下以DNA链为模板合成一段短的RNA引物。

复制时DNA链的延伸由DNA聚合酶催化，以亲代DNA链为模板，引发体移动，从5’——3’方向聚合子代DNA链。

当子链延伸达到终止位点时，DNA复制就终止了，切除RNA引物，填补缺口，在DNA连接酶的催化下将相邻的冈崎片段连接起来形成完整的DNA长链。

64. 列出真核生物m RNA与原核生物m RNA的区别。

1真核生物的mRNA前体在细胞核内合成，合成后需经加工后才成熟为mRNA，从细胞核输入胞浆，起始蛋白质合成；原核生物的mRNA常在合成尚未结束时已开始翻译。

2真核生物mRNA含有m7Gppp形式的“帽子”，有由poly(A)形成的“尾巴”，为单顺反子，只含一条多肽链的遗传信息，合成蛋白质时只有一个合成的启动点，一个合成的终点，而原核生物的mRNA为多顺反子，含有蛋白质合成多个启动点和终止点，且不带有类似“帽子”和“尾巴”的结构，

3在5端方向启动信号的上游存在富含嘌呤的SD区段。真核生物的mRNA则无此区段。

4真核生物的mRNA代谢较慢，哺乳类动物的mRNA的半衰期为4~6h,而细菌的mRNA半衰期仅在1~3min

此外，真核生物的mRNA前体常含有插入序列，即内含子，需要在加工时切除。

65. 简述真核生物DNA水平上的基因表达调控．

DNA水平的调控是真核生物发育调控的一种形式，它包括基因的丢失、扩增、重排和易位等形式，通过这些方式可以消除或变换某些基因并改变他们的活性。

通过形成开放型活性染色质，DNA容易与RNA聚合酶和其他转录调控因子相结合，启动基因的转录。两栖类动物卵母细胞中的灯刷型染色质是染色体充分伸展，活跃转录的状态。

基因扩增是某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，是基因活性调控的一种方式，

基因重排是指将一个基因从远离启动子的地方移动到距它很近的位点从而启动转录，是调节基因活性的一种方式。

66. 真核生物中端粒的结构特征及其生物学意义?

端粒是真核生物线性染色体末端重要的DNA-蛋白质复合结构，由TTAGG重复序列和大量的端粒结合蛋白组

成。主要是由六个端粒结合蛋白TRF1、TRF2、POT1TIN2、TPP1和Rap1组成的复合体起着保护端粒的作用，被称为是遮蔽蛋白。其中端粒重复序列结合因子TRF1和TRF2是两个主要的端粒结合蛋白，它们通过相互作用来维持端粒的正常结构和功能。

端粒的功能：1、保护染色体末端：真核生物的端粒DNA-蛋白复合物，如帽子一般，保护染色体末端免于被化学修饰或被核酶降解，同时可能还有防止端粒酶对端粒进行进一步延伸的作用。改变端粒酶的模板序列将导致端粒的改变，从而诱导细胞衰老和死亡。

2、防止染色体复制时末端丢失：细胞分裂、染色体进行半保留复制时，存在染色体末端丢失的问题。随着细胞的不断分裂，DNA丢失过多，将导致染色体断端彼此发生融合，形成双中心染色体、环状染色体或其他不稳定形式。端粒的存在可以起到缓冲保护的作用，从而防止染色体在复制过程中发生丢失或形成不稳定结构。

3、决定细胞的寿命：染色体复制的上述特点决定了细胞分裂的次数是有限的，端粒的长度决定了细胞的寿命，故而被称为“生命的时钟”。

4、固定染色体位置：染色体的末端位于细胞核边缘，人类端粒DNA 和核基质中的蛋白相互作用，以′TTAGGG′结构附着于细胞核基质。

67. 简述基因工程操作过程中所涉及的酶有哪些。

限制性内切酶，DNA连接酶，逆转录酶，DNA聚合酶，DNA解旋酶。

68. 论述RT-PCR反应的原理、过程及应用。

原理

RT -PCR即逆转录-聚合酶链反应。原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

反应过程

1.从细胞或特定组织中提取总RNA；

2.逆转录实验；

3.扩增内参和目的基因并比较基因表达差异。

应用

RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞组织中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。

69. 请以获得重组人胰岛素为目标，设计一套完整的实施方案。

重组人胰岛素的大肠杆菌工程

1.A链和B链分别表达法：

①基因工程菌的构建策略：化学合成A链和B链的编码序列②表达后处理

2.人胰岛素原表达法：表达产物后处理路线一端第22位上的Arg和第29位上的Lys由于良好折叠的原因对胰蛋白酶不敏感

3.A链和B链同时表达法

4.分泌型重组人胰岛素表达法

70请列举可以在线性染色体的末端建立线性复制的三种方式。

1.染色体末端的短重复序列使端粒酶引发非精确复制

2.末端蛋白与模板链的5'端共价结合提供核苷酸游离的3'端

3.通过滚环复制，DNA双链环化后被切开，产生延伸的3'-OH端

71. 解释什么是“套索结构”，在内含子套索中的磷酸二酯键有什么特别之处？

当RNA分子的一端自身回折成环并与其自身的核苷酸形成共价结合时，便形成了一个套索结构。在内含子的套索结构中的磷酸二酯键很少见。因为它是由核苷酸的5’和2’上的碳原子连接起来的。而磷酸二酯

键通常是靠相邻的两个核苷酸的5’和3’的碳原子连接起来的。

72．CAP蛋白如何作为乳糖操纵子的正调节物起作用？

AP蛋白如何作为乳糖操纵子的正调节物起作用？答：CAP即cCAM活化蛋白，结合cCAM的CAP可进一步与乳糖操纵子的调控区结合，使RNA聚合酶对该DNA的转录增强。

73.设有一个基因的5’和3’端部分序列如下：ACTGATGCGAGATGCAATGAC………….CTAGTTGAGACCTAGTTC,请设计一对引物，写出其序列，使其扩增产物的5`端加上EcoRI（GAATTC），3`端加上XhoI（CTCGAG）位点，以便用于将其插入到某质粒的对应位点。

5＇—gcgGAATTC ACTGATGCGAGAGATGCAATGAC—3＇

5＇—cgcCTCGAG GAACTAGGTCTCAACTAG—3＇

74.简述乳糖操纵子的结构和功能。

一）结构基因 lacZ编码半乳糖苷酶，催化乳糖水解产生半乳糖化葡萄糖

lacY编码透过酶，将乳糖透过细菌的细胞壁和细胞膜 lacA编码硫代半乳糖苷转乙酰酶，

解除过多的半乳糖毒害作用

控制元件

调节基因

75.简述基因工程的基本条件

1、要有用于核酸操作的工具酶

有用于基因工程的载体

3、有用于基因转移的受体菌或细胞

76.论述PCR反应的原理、过程及应用。

PCR技术又称聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）技术,是一种在体外（试管、切片…）扩增核酸的技术.该技术模拟体内天然DNA的复制过程.其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下,特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应.每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应.每一循环的产物作为下一个循环的模板,如此循环30次,介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝（约为109个分子）.PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性. PCR技术广泛的应用于遗传性疾病的诊断,传染病病原体的检测、法医学,考古学和分子生物学的各个领域.

77.论述E.coli和真核表达体系各自的优、缺点。

E.col:优点培养方法简单，迅速，经济而又适合大规模生产工艺，开发较早，经验丰富

缺点：1）缺乏转录后加工机制

2）缺乏适当的翻译后加工机制

3）表达的产物活性不高

真核生物：优点：与E.col的缺点向反

缺点：表达系统操作难，成本高，外源基因导入真核细胞的效率低，染色体上DNA整合的位置及拷贝数不易控制

78.描述Meselson-Stahl实验，说明这一实验加深我们对遗传理解的重要性。

l）实验过程：实验分为两组，

①对照组：将大肠杆菌一直培养在含14N的培养基上生长。这样繁殖出的大肠杆菌DNA分子的碱基中的N 都是14N。

②实验组：先将大肠杆菌培养在含15N同位素的培养基上生长。使大肠杆菌DNA分子中的N都成为15N。

把含15N的大肠杆菌收集起来，洗去菌体外面的15N，并把它们转移到14N的培养基上生长，繁殖四次。

从实验组的五代大肠杆菌中分别提取DNA，在每分钟四万至五万转的速度下进行密度梯度离心二至三天后，不同重量的DNA分布在离心管中的位置不同

2）（1）双螺旋复制起点数多（2）大肠杆菌复制一次和复制两次后形成的DNA分子（3）DNA复制是双向的

79.哪些转录因子含有TBP？为什么它们被称为定位因子？请用一个模型解释为什么所有三种RNA聚合酶都能与TBP发生作用？

TBP是聚合酶I因子SL1、聚合酶II因子TFIID和聚合酶III因子TFIIIB的组成成分。所以这些蛋白都能帮组RNA聚合酶定位于起始位点的附近。TBP可能与这三种聚合酶都具有的一个亚基相互作用。

80.简述DNA修复的几种模式

1光修复；通过光修复酶完成

2切除修复；是细胞内最主要的修复方式,主要依赖的俩个重要的酶；DNA聚合酶1和连接酶

3 重组修复:此过程也叫复制后修复。对于DNA双链断裂损伤，细胞必须利用双链断裂修复，即重组修复，通过与姐妹染色单体正常拷贝的同源重组来恢复正确的遗传信息。

4错配修复:可校正DNA复制和重组过程中非同源染色体偶尔出现的DNA碱基错配，错配的碱基可被错配修复酶识别后进行修复

5SOS修复:指DNA受到严重损伤时细胞做出的应激反应。DNA分子严重损伤时，正常的复制和修复系统无法完成DNA的复制，此时会启动应急反应，在无模板DNA 情况下合成酶的诱导修复，故又称为为错误倾向修复。

81. 论述基因工程基本操作程序

(1)目的基因的获取

（2）基因表达载体的构建

（3）将目的基因导入受体细胞

（4）目的产物的检测与鉴定

82.简述PCR的用途有哪些？

1、核酸的基础研究：基因组克隆

2、不对称PCR制备单链DNA用于DNA测序

3、反向PCR测定未知DNA区域

4、反转录PCR（RT-PCR）用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA

5、荧光定量PCR用于对PCR产物实时监控

6、cDNA末端快速扩增技术

7、检测基因的表达

8、医学应用：检测细菌、病毒类疾病；诊断遗传疾病；诊断肿瘤；应用于法医物证学

83.简述用于高等哺乳动物细胞基因转移的方法

i)磷酸钙转染技术；(ii)DEAE-葡聚糖转染技术；(iii)聚阳离子-DSMO转染技术；(iv)电穿孔技术；(v)

显微注射技术；(Vi)原生质体融合技术。

84. 论述真核细胞和原核细胞在基因转录、翻译及DNA空间结构上存在哪些差异？

一.转录

1.RNA聚合酶

原核生物的RNA聚合酶是一种多聚体蛋白质（α2ββ'σ）；真核生物的RNA聚合酶有三种（RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），分别转录不同种类的RNA。（你这个题目太大，不展开论述了）

2.转录过程

⑴原核生物的转录过程

转录全过程均需RNA聚合酶催化。

①起始过程需核心酶，由σ亚基辨认起始点，被辨认的DNA区段是-35区。在这一区段酶与模板的结合松弛，酶移向-10区并跨入转录起始点。

②延长过程的核苷酸聚合仅需核心酶催化。

③终止分依赖ρ因子的和不依赖ρ因子的转录终止。

a.依赖ρ因子的转录终止：结合后ρ因子和RNA聚合酶都可发生构象变化，从而使RNA聚合酶停顿，解螺旋酶的活性使DNA/RNA杂环双链拆离，利于产物从转录复合物中释放。

b.不依赖ρ因子的转录终止：DNA模板上靠近终止出有些特殊碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊结构来终止转录。转录产物的3'-末端，常发现有多个连续的U。连续的U区5'-端上游的一级结构可形成茎环或发卡形式的二级结构。

⑵真核生物的转录过程

①转录起始前的-25bp区段多有典型的TATA序列，称为TATA box，通常认为这就是启动子的核心序列。此外DNA分子上还具有其他可影响转录的顺式作用元件，以及能直接、间接辨认和结合转录上游区段的蛋白质——反式作用因子，其中直接或间接结合RNA聚合酶的为转录因子。

真核生物RNA聚合酶不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。

②真核生物的转录延长过程与原核生物大致相似。

③真核生物mRNA有polyA尾巴结构，是转录后才加进去的。转录不是在polyA位置上终止，而是超过数百甚至上千核苷酸后才停顿。

二.翻译

1.原核生物与真核生物核蛋白体的组成不同

2真核生物肽链合成起始过程与原核生物相似但更复杂。真核生物有不同的翻译起始成分，起始因子种类更多，起始甲硫氨酸不需甲基化等。成熟的真核mRNA有5'帽子和3'polyA尾结构。

3.真核生物肽链合成的延长过程与原核生物基本相似，只是有不同的反应体系和延长因子。

4.真核生物的翻译终止过程与原核生物相似。

三.表达调控

原核基因表达调控与真核存在很多共同之处。但因原核生物没有细胞核，亚细胞结构及其基因组结构要比真核简单得多。

1.原核基因转录调节特点

⑴σ因子识别特异启动序列，不同的σ因子决定特异基因的转录激活，决定mRNA,rRNA和tRNA基因的转录。

⑵除个别基因外，原核生物绝大多数基因按功能相关性成簇的串联、密集于染色体上，共同组成一个转录单位——操纵子。一个操纵子只含一个启动序列及数个可转录的编码基因。

2.真核细胞结构及基因组结构远比原核复杂，其基因表达调控机制发生在染色体活化、基因转录激活、转录后加工、翻译及翻译后加工等水平的调节事件也要复杂的多。

四.DNA的空间结构

1.原核生物DNA的高级结构

绝大部分原核的DNA都是共价封闭的环状双螺旋分子。在细胞内进一步盘绕，并形成类核结构，以保证其以较致密的形式存在于细胞内。在细菌基因组中，超螺旋可以相互独立存在。

2.真核生物DNA的存在形式

在真核生物，DNA以非常致密的形式存在于细胞核中。在细胞周期的大部分时间里以分散的染色质形式出现在细胞分裂期形成高度组织有序的染色体。

85. 试述对于转化子的筛选鉴定方法有哪些？

1.载体遗传标记检测

抗药性筛选法

营养缺陷性筛选法

显色筛选法

2.克隆DNA序列检测

限制性酶切图谱法

菌落噬菌斑原位杂交法

DNA序列分析法

3.外源基因产物检测

蛋白质生物功能测定法

蛋白质生物结构鉴定法

凝胶电泳法

86.目前简述人类基因组计划成果体现的四个图谱。

①遗传图,是指基因或DNA标志在染色体上的相对位置与遗传距离,常用基因或DNA片段在染色体交换过程中的分离频率—厘摩（cm）表示.所用遗传标记为RFLP、重复序列以及分散于基因组中的单个碱基的差异（单个核苷酸的多态性）.②物理图,是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”,以碱基对作为基本测量单位（图距）的基因组图.用STS技术绘制基因组物理图是目前为止最有效的方法.③转录图,也称cDNA 图或表达序列标签图（EST）,是用所得到的cDNA或EST筛选全长的转录本,并将该基因准确地定位于基因组上.④人类基因组的核苷酸序列图,是分子水平上最高层次的、最详尽的物理图.测定30亿个核苷酸组成的全序列,目前已基本完成.

87. 正调控和负调控的主要不同是什么？

正调控是通过激活蛋白与启动子上游序列结合,以促进RNA聚合酶与启动子结合,提高转录的效率.

负调控是阻遏蛋白与操纵基因结合使RNA聚合酶不能与启动子结合,因而抑制转录

88.什么是核酶？举二例说明

核酶（ribozyme）是指一类具有催化功能的RNA分子，通过催化靶位点RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性地剪切底物RNA分子，从而阻断基因的表达。如：锤头型核酶、I类自剪接内含子、II类自剪接内含子等

89.什么是报告基因，举例说明报告基因在分子生物学研究中的二种以上的用途？

报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。

LacZ报告基因——蓝白斑筛选

HIS3报告基因——HIS+筛选培养基（通常需要加入3AT来增加选择性性）

LEU2报告基因——LEU+筛选培养基

ADE2报告基因——ADE+筛选培养基

URA3报告基因——Ura+筛选培养基（可以通过添加FOA做阴性选择)

90.请列举三种以上检测基因表达的方法?

固—液相杂交：

膜上印迹杂交；

原位杂交。

液相杂交：

RNA酶保护分析法；

核酸酶S1保护分析法。

91.乳糖操纵子的结构?它是如何调控基因表达的?

乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶,此外还有一个操纵序列O,一个启动子P和一个调节基因I.

包括正负调控两种：（1）阻遏蛋白的负调控：①当细胞内有诱导物时，诱导物结台阻遏蛋白，此刻RNA聚合酶与启动子形成开放式启动子复合物转录乳糖操纵子结构基团。②当无诱导物时，阻遏蛋白与操纵基因结合，从而影响聚合酶与启动子的结合，结构基因不能转录。(2)CAP正调控：①当细胞内缺少葡萄糖时，cAMP与CAP形成cAMP-CAP复合物，结合于CAP位点，增强RNA聚合酶转录活性。②当葡萄糖存在时，cAMP 分解多合成少，CAP不与启动子上的CAP位点结合，RNA聚合酶不与启动子结合，无法起始转录，结构基因表达下降

92.Southern blotting 、Northern blotting及Western blotting 的实验原理、目的及主要实验步骤。实验原理与目的：

southern：用DNA作为探针杂交DNA.检测目标DNA的存在与否

northern：用DNA或RNA探针杂交RNA.检测目标RNA的存在与否

western：用抗体和目的蛋白结合进行杂交.检测目标蛋白的存在与否.

实验步骤：

Western blot包括三个步骤：①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体上,用非特异性,非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测.

Southern Blotting方法步骤：DNA 的提取；引物设计；DNA检测；探针制备；基因组DNA酶切；转膜；杂交；洗膜、信号检测

Northern blot实验步骤；经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳；将变性RNA转移至硝酸纤维素滤膜；转移至硝酸纤维素滤膜前后进行的RNA染色；杂交和放射自显影；

93. PCR引物是PCR成败的关键因素，在设计引物时需要遵循哪些原则？

1 、引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

2 、引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

3 、引物碱基：G C 含量以40-60%为宜，G C太少扩增效果不佳，G C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。上下游引物的GC含量不能相差太大。附加序列

(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们. 引物对的Tm差异不超过5℃，设计时温度和GC含量是个主要的参数，做复合扩增时更要设计成相近的温度，而且引物加个尾影响不大。但要切记BLAST，包括查阅文献的引物.如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃,或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。

4 、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。

5 、引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

6 、引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物5‘端引入酶切位点得黏性末端，随意加入3个保护性碱基，但是要注意不要形成引物二聚体，而且以A或G开头为好。

7 、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

8 、引物酶切：除非产物非常特异，直接酶切PCR产物效果有时不是很好，还有一般PCR体系里过量的dNTPs会影响酶切效果。酶切后，可以用标准得乙醇沉淀法沉淀酶切产物，获得高纯度的酶切产物，也即是你的黏性目断片断供后边得试验。

9 、设计软件：最好学会使用一种design software. PP5, Oligo6,

DNAstar, Vector NTI, Online design et al.

94.为实现外源基因在原核生物中高效表达，应考虑哪些因素？

⑴外源基因的拷贝数

⑵外源基因的表达效率

①启动子的强弱

②核糖体接合位点的有效性

③SD序列和起始密码ATG的间距

④密码子组成

⑶表达产物的稳定性

⑷细胞代谢负荷

⑸工程菌的培养条件

95.什么是RNA干扰技术，在RNA干扰中将长的双链RNA切割成小片段的酶是什么？

是指一种分子生物学上由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的基因沉默现象。由于使用RNAi 技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达（长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性），所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。RNAi现象在生物中普遍存在

双链RNA一旦进入细胞内就会被一个称为Dicer的特定的酶切割成21～23个核苷酸长的小分子干涉RNA(SiRNA)。Dicer酶能特异识别双链RNA，以ATP依赖方式切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割产生的SiRNA片断与一系列酶结合组成诱导沉默复合体(RISC)。激活的RISC 通过碱基配对结合到与SiRNA同源的mRNA上，并切割该mRNA，造成蛋白质无法合成

96. 什么是卫星DNA？组成特点是什么？举一例说明其应用。

卫星DNA是一类高度重复序列DNA

组成特点:多态性保守性

举例:Arranz等对牛的卫星和蛋白质标记的比较研究发现卫星标记比蛋白质标记具有更加丰富的多态性97. 试论基因重排在人体正常生存中抵御外部环境对机体产生危害的生物学意义。

淋巴细胞基因重排可以作为细胞克隆性增殖的证据，用于淋巴细胞恶性增生性疾病的诊断，也可以用于分析淋巴细胞肿瘤的克隆来源。

98.请列举三种以上检测基因表达的方法?

转录水平检测：RT-PCR，real-time PCR，northern blot

翻译水平检测：Western blot

直接检测，如报告基因、融合荧光蛋白等。

99. 简述DNA重复序列产生的可能机制及其生物学意义?

１、进化的必然结果：大量的重复序列确凿无疑地说明了物种在进化过程中，遗传物质不断地进行着自我复制，同时相互之间进行着水平交换，垂直交换。这样，就极大地扩增和丰富了遗传信息。从重复序列的广泛分布，我们可以大致得出遗传物质的进化途径。２、保护编码序列：随着物种分类地位的升高，编码序列的比率迅速下降，而间隔序列和重复序列的比率快速上升。比如人的功能基因片段不到基因组全长的１．５％，这样，就可以保护一些关键的结构基因免遭重组而发生破坏，因为很多关键的功能基因都是单拷贝的。３、产生进化的动力并形成新基因：人类有４５％的序列是散在重复序列，这说明人类的基因组含量至少有一半是通过转座子而来的。这就给遗传信息的自我扩增提供了重要的动力；而且，这种转座具有一定随机性，可以导致新基因的形成。

各种重复序列的类型与它在染色体上的分布密切相关。重复序列不是垃圾，而是影响着生命的进化、遗传、变异；同时它对基因表达、转录调控、染色体的构建以及生理代谢都起着不可或缺的作用。它们的功能及演化也正在被逐步阐明。

100、简述色氨酸衰减子的结构和功能。

答：阻遏作用trp操纵子转录起始的调控是通过阻遏蛋白实现的。产生阻遏蛋白结合于trp操纵基因特异序列，阻止转录起始，但阻遏蛋白的DNA结合活性受trp调控，再有高浓度trp存在时，阻遏蛋白色氨酸复合物与色氨酸操纵子紧密结合，可以阻止转录。当trp水平低时，阻遏蛋白以一种非活性形式存在，不能结合DNA。在这样的条件下，trp操纵子被RNA聚合酶转录。trp生物合成途径被激活。……弱化作用：trp操纵子转录终止的调控是通过弱化作用实现的，大肠杆菌trp操纵子前导区的碱基序列包括4个片段，能以两种不同的方式进行碱基配对，当trp浓度很低时，翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度很慢，这时的前导区结构是2-3配对，不行成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行。当trp浓度很高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子再4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对，3-4区可以配对，行成终止结构，转录停止

101、说明RACE技术的基本原理及其应用。

cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和 PCR 技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA 简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。

RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)

102、以噬菌体侵染细菌为例说明σ因子的调控作用。

σ亚基的作用：参与启动子的结合以及转录起始复合物的异构化。细胞内哪条DNA链被转录、转录的起始点的选择都与σ亚基有关。

a．σ因子独立存在时，N端部分抑制了C端的DNA结合活性，与DNA不能结合。

b．当σ因子与核心酶组成全酶的时，空间构象改变，N端对C端抑制作用消失，可与DNA发生特异结合。

c．转录起始完成后σ因子脱落，核心酶不再停留在启动区部位，向下游滑动完成转录。? σ亚基对识别DNA链上的转录信号是不可缺少的，它是核心酶和启动子之间的桥梁。σ因子的取代在细胞发育和对环境应答的反应中起主导作用。如在枯草杆菌中就有不同相对分子质量的σ因子。σ因子与核心酶结合帮助核心酶识别细菌启动子区启动转录。细菌都使用不同的σ因子来识别不同基因的启动子，使RNA聚合酶转录不同的基因。这是细菌的一种基因表达调控方式，它使细菌能针对不同环境条件的变化，改变基因的表达方式。

d．大肠杆菌的热激反应和枯草芽孢杆菌芽孢的发育过程，大肠杆菌在营养匮乏的情况下进入静止状态（稳定期），这一状态受到σS因子调控，他控制着50多种基因的诱导或者转录。e．某些噬菌体利用宿主细胞的RNA合成酶并为之提供σ因子，从而指导RNA聚合酶优先转录噬菌体的基因。

103、请说明一真核表达载体中所应该具备的各种组件（4分）

答：目的基因、启动子、终止子、标记基因

104. 描述RNA转录后的加工修饰。（10分）

一.mRNA

（1）首尾的修饰

5’端修饰时加帽子结构

3’端修饰时加上多聚腺苷酸尾巴

（2）mRNA的剪接

从DNA模板链转录出的最初转录产物中除去内含子,并将外显子连接起来形成一个连续的RNA分子

（3）mRNA编辑

分子生物学与基因工程主要知识点

分子生物学与基因工程复习重点 第一讲绪论 1、分子生物学与基因工程的含义 从狭义上讲，分子生物学主要是研究生物体主要遗传物质-基因或DNA的结构及其复制、转录、表达和调节控制等过程的科学。 基因工程是一项将生物的某个基因通过载体运送到另一种生物的活体细胞中，并使之无性繁殖和行使正常功能，从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。 2、分子生物学与基因工程的发展简史，特别是里程碑事件，要求掌握其必要的理由 上个世纪50年代，Watson和Crick提出了的DNA双螺旋模型； 60年代，法国科学家Jacob和Monod提出了的乳糖操纵子模型； 70年代，Berg首先发现了DNA连接酶，并构建了世界上第一个重组DNA分子； 80年代，Mullis发明了聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术； 90年代，开展了“人类基因组计划”和模式生物的基因组测序，分子生物学进入“基因组时代”； 目前，分子生物学进入了“后基因组时代”或“蛋白质组时代”。 3、分子生物学与基因工程的专业地位与作用：从专业基础课角度阐述对专业课程的支 撑作用 第二讲核酸概述 1、核酸的化学组成（图画说明） 2、核酸的种类与特点：DNA和RNA的区别 （1）DNA含的糖分子是脱氧核糖，RNA含的是核糖； （2）DNA含有的碱基是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T），RNA含有的碱基前3个与DNA完全相同，只有最后一个胸腺嘧啶被尿嘧啶（U）所代替； （3）DNA通常是双链，而RNA主要为单链；

（4）DNA的分子链一般较长，而RNA分子链较短。 3、DNA作为遗传物质的直接和间接证据； 间接： （1）一种生物不同组织的细胞，不论年龄大小，功能如何，它的DNA含量是恒定的，而生殖细胞精子的DNA含量则刚好是体细胞的一半。多倍体生物细胞的DNA含量是按其染色体倍数性的增加而递增的，但细胞核里的蛋白质并没有相似的分布规律。 （2）DNA在代谢上较稳定。 （3）DNA是所有生物的染色体所共有的，而某些生物的染色体上则没有蛋白质。（4）DNA通常只存在于细胞核染色体上，但某些能自体复制的细胞器，如线粒体、叶绿体有其自己的DNA。 （5）在各类生物中能引起DNA结构改变的化学物质都可引起基因突变。 直接：肺炎链球菌试验、噬菌体侵染实验 4、DNA的变性与复性：两者的含义与特点及应用 变性：它是指当双螺旋DNA加热至生理温度以上（接近100oC）时，它就失去生理活性。这时DNA双股链间的氢键断裂，最后双股链完全分开并成为无规则线团的过程。简而言之，就是DNA从双链变成单链的过程。增色效应：它是指在DNA的变性过程中，它在260 nm的吸收值先是缓慢上升，到达某一温度后即骤然上升的效应。 复性：它是指热变性的DNA如缓慢冷却，已分开的互补链又可能重新缔合成双螺旋的过程。复性的速度与DNA的浓度有关，因为两互补序列间的配对决定于它们碰撞频率。DNA复性的应用-分子杂交：由DNA复性研究发展成的一种实验技术是分子杂交技术。杂交可发生在DNA和DNA或DNA与RNA间。 5、Tm的含义与影响因素 Tm的含义：是指吸收值增加的中点。 影响因素： 1）DNA序列中G + C的含量或比例含量越高，Tm值也越大（决定性因素）；2）溶液的离子强度 3）核酸分子的长度有关：核酸分子越长，Tm值越大

基因工程练习题(附答案)

基因工程练习题 1、在基因工程中使用的限制性核酸内切酶，其作用是( ) A、将目的基因从染色体上切割出来 B、识别并切割特定的DNA核苷酸序列 C、将目的基因与运载体结合 D、将目的基因导入受体细胞 2、基因工程中常用细菌等原核生物作受体细胞的原因不包括( ) A、繁殖速度快 B、遗传物质相对较少 C、多为单细胞，操作简便 D、DNA为单链，变异少 3、基因工程是DNA分子水平的操作，下列有关基因工程的叙述中，错误的是( ) A、限制酶只用于切割获取目的基因 B、载体与目的基因可以用同一种限制酶处理 C、基因工程所用的工具酶是限制酶，DNA连接酶 D、带有目的基因的载体是否进入受体细胞需检测 4、运用现代生物技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因整合到棉花细胞中，为检测实验是否成功，最方便的方法是检测棉花植株是否有( ) A、抗虫基因 B、抗虫基因产物 C、新的细胞核 D、相应性状 5、转基因动物转基因时的受体细胞是( ) A、受精卵 B、精细胞 C、卵细胞 D、体细胞 6、基因工程中常见的载体是( ) A、质体 B、染色体 C、质粒 D、线粒体 7、水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中Asp、Gly、Ser构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技术中，这种蛋白质的作用是( ) A、促使目的基因导入宿主细胞中B、促使目的基因在宿主细胞中复制 C、使目的基因容易被检测出来 D、使目的基因容易成功表达 8、运用现代生物技术的育种方法，将抗菜青虫的Bt基因转移到优质油菜中，培育出转基因抗虫的油菜品种，这一品种在生长过程中能产生特异的杀虫蛋白质，对菜青虫有显著抗性，能大大减轻菜青虫对油菜的危害，提高油菜产量，减少农药使用，据以上信息，下列叙述正确的是( ) A、Bt基因的化学成分是蛋白质 B、Bt基因中有菜青虫的遗传物质 C、转基因抗虫油菜能产生杀虫蛋白是由于具有Bt基因 D、转基因抗虫油菜产生的杀虫蛋白是无机物 9、人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工合成，通过转基因技术，可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是( ) A、大肠杆菌 B、酵母菌 C、T 噬菌体 D、质粒DNA 4 10、不属于质粒被选为基因运载体的理由是（） A．能复制 B.有多个限制酶切点C．具有标记基因D．它是环状DNA

(完整版)分子生物学试题及答案(整理版)

分子生物学试题及答案 一、名词解释 1．cDNA与cccDNA：cDNA是由mRNA通过反转录酶合成的双链DNA；cccDNA是游离于染色体之外的质粒双链闭合环形DNA。 2．标准折叠单位：蛋白质二级结构单元α－螺旋与β－折叠通过各种连接多肽可以组成特殊几何排列的结构块，此种确定的折叠类型通常称为超二级结构。几乎所有的三级结构都可以用这些折叠类型，乃至他们的组合型来予以描述，因此又将其称为标准折叠单位。 3．CAP：环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMP receptor protein ），cAMP与CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMP activated protein ） 4．回文序列：DNA片段上的一段所具有的反向互补序列，常是限制性酶切位点。 5．micRNA：互补干扰RNA或称反义RNA，与mRNA序列互补，可抑制mRNA的翻译。 6．核酶：具有催化活性的RNA，在RNA的剪接加工过程中起到自我催化的作用。 7．模体：蛋白质分子空间结构中存在着某些立体形状和拓扑结构颇为类似的局部区域 8．信号肽：在蛋白质合成过程中N端有15~36个氨基酸残基的肽段，引导蛋白质的跨膜。 9．弱化子：在操纵区与结构基因之间的一段可以终止转录作用的核苷酸序列。 10．魔斑：当细菌生长过程中，遇到氨基酸全面缺乏时，细菌将会产生一个应急反应，停止全部基因的表达。产生这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸（pppGpp）。PpGpp与pppGpp的作用不只是一个或几个操纵子，而是影响一大批，所以称他们是超级调控子或称为魔斑。 11．上游启动子元件：是指对启动子的活性起到一种调节作用的DNA序列，-10区的TATA、-35区的TGACA 及增强子，弱化子等。 12．DNA探针：是带有标记的一段已知序列DNA，用以检测未知序列、筛选目的基因等方面广泛应用。13．SD序列：是核糖体与mRNA结合序列，对翻译起到调控作用。 14．单克隆抗体：只针对单一抗原决定簇起作用的抗体。 15．考斯质粒：是经过人工构建的一种外源DNA载体，保留噬菌体两端的COS区，与质粒连接构成。16．蓝-白斑筛选：含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。 17．顺式作用元件：在DNA中一段特殊的碱基序列，对基因的表达起到调控作用的基因元件。18．Klenow酶：DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’→3’外切酶活性 19．锚定PCR：用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。 20．融合蛋白：真核蛋白的基因与外源基因连接，同时表达翻译出的原基因蛋白与外源蛋白结合在一起所组成的蛋白质。 二、填空 1． DNA的物理图谱是DNA分子的（限制性内切酶酶解）片段的排列顺序。 2． RNA酶的剪切分为（自体催化）、（异体催化）两种类型。 3．原核生物中有三种起始因子分别是（IF-1）、（IF-2）和（IF-3）。 4．蛋白质的跨膜需要（信号肽）的引导，蛋白伴侣的作用是（辅助肽链折叠成天然构象的蛋白质）。5．启动子中的元件通常可以分为两种：（核心启动子元件）和（上游启动子元件）。 6．分子生物学的研究内容主要包含（结构分子生物学）、（基因表达与调控）、（DNA重组技术）三部分。7．证明DNA是遗传物质的两个关键性实验是（肺炎球菌感染小鼠）、（ T2噬菌体感染大肠杆菌）这两个实验中主要的论点证据是：（生物体吸收的外源DNA改变了其遗传潜能）。 8．hnRNA与mRNA之间的差别主要有两点：（hnRNA在转变为mRNA的过程中经过剪接，）、 （mRNA的5′末端被加上一个m7pGppp帽子，在mRNA3′末端多了一个多聚腺苷酸(polyA)尾巴）。 9．蛋白质多亚基形式的优点是（亚基对DNA的利用来说是一种经济的方法）、（可以减少蛋白质合成过程中随机的错误对蛋白质活性的影响）、（活性能够非常有效和迅速地被打开和被关闭）。 10．蛋白质折叠机制首先成核理论的主要内容包括（成核）、（结构充实）、（最后重排）。 11．半乳糖对细菌有双重作用；一方面（可以作为碳源供细胞生长）；另一方面（它又是细胞壁的成分）。所以需要一个不依赖于cAMP—CRP的启动子S2进行本底水平的永久型合成；同时需要一个依赖于cAMP—CRP的启动子S1对高水平合成进行调节。有G时转录从（ S2）开始，无G时转录从（ S1）开

基因工程、分子生物学和分子遗传学重要名词解释

基因工程、分子生物学和分子遗传学重要名词解释 5’Cap 5’-末端帽：有时简称帽，是在许多真核生物mRNA5`-末端发现的一种由7-甲基-鸟嘌呤核苷-5`-ppp –末端核苷构成的特殊构成的特殊结构。它是在转录后不久经酶催反应加入到TATA （Hogness）序列的附近，具有保护mRNA稳定性的功能。在原核生物的mRNA分子中不存在 5`-末端帽结构。 A protein A蛋白：他参与λDNA插入噬菌体头部和在粘性末端（cos）位点上裂解多联体DNA 的过程。 abortive lysgeny 流产溶原性：温和噬菌体感染敏感的宿主菌后，既不整合进宿主染色体中，也不进行复制，从而使每一个带有噬菌体的宿主菌分裂产生的两个细胞中，只有一个是溶原性的。abortive transduction 流产转导：这是得到不稳定转导子的一类转导，区别于得到稳定转导子的完全转导。在流产转导中，转导子分裂产生两个细胞时，只有其中的一个获得供体基因，另一 个细胞则仍属受体基因型。 Abundance of an mRNA mRNA丰度：是指每个细胞平均拥有的某一种特定mRNA的分子数,跟据丰度的差异可将分为两种不同的等级：其一是富裕型的，每个细胞拥有的平均考贝数为1000——10000，属于此型的mRNA约有100种；其二是稀少型的，每个细胞拥有平均考贝数仅有1——10个上下，属于这一类行的mRNA达10000多种。 Abzymes 抗体酶: 应用单克隆抗体技术生产的兼具抗体及酶催活性的工程蛋白质。也就是说，其行为如同蛋白酶一样，能够催化化学反应的一类新型的抗体。 Acceptor splicing site 受体拼接位点: 间隔子的右端和与其相连的表达子的左端之间的接合点。Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS 获得性免疫缺损综合征: 由人类免疫缺损病毒（HIV）引起的一种疾病，他最早于1980年在美国洛杉叽发现。HIV病毒通过血液和精液在人群中传播，感染了这种病毒之后，会使人体出现严重的免疫抑制和淋巴结病（lymphadenopathy）,并增加对机会病原体（opportunistic pathogen）的敏感性。这种综合征是由于HIV病毒的感染以及cd4类T细胞功能破坏所致。T细胞表面CD抗原CDS4是HIV病毒的受体。HIV病毒的感染使T细胞发生融合形成大的合胞体(syncytia)并最终裂解。AIDS是致命的，目前尚无法有效治 疗也无有效疫苗可用。 activator 活化物：1，在分子生物学中，活化物是一种蛋质，结合在某个基因上游DNA的一个位置上，激活从该基因开始的转录。2，在酶学中，活化物是一种小分子，与酶相结合从 而提高酶的催化活性。 Activator 激活物: 能够通过与结合在启动子上的RNA聚合酶发生相互作用，从而促使RNA聚合酶起动操纵子进行转录反应的一种正调节蛋白质。 Adaptor 接头：即DNA接头，是一类人工合成的非自我互补单链寡核苷酸短片段，当其同街接物(linker)自行退火时，就会形成具有一个平末端和一个粘性末端的双链的接头/衔接物结构。因此，同平端DNA分子连接之后，无需用核酸内切限制酶切割，就会提供符合预先设计要求的 粘性末端。 Adenovirus 腺病毒：一种具双链DNA的动物病毒，大小约为36kb。次种病毒在分子生物学研究中占有突出的位置，许多重要的分子生物学事件，诸如RNA剪辑，DNA复制及转录等，，都是腺病毒研究中发现的。现在腺病毒以被改造用作分离哺乳动物基因的克隆载体。Affinity chromatography 亲和层析：一种根据配体与特异蛋白质结合作用原理建立的层析技 术，该法主要应用于分离与纯化特异的蛋白质。 Agarose 琼脂糖：是从红色海藻的琼脂中提取的一种线性多糖聚合物，可用于配置核酸电泳凝胶。当琼脂糖溶液加热至沸点后冷确凝固，便会形成一种基质，其密度石油琼脂糖浓度决定的。可以被琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段的大小范围为0.2——50kb。经过化学上修饰的低熔点

基因工程的应用和蛋白质工程

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【课 题】专题一——基因工程——第 1．3 基因工程的应用第 1。4 蛋白质工程的崛起
【教学目标】1.举例说出基因工程应用及取得的丰硕成果。 2.关注基因工程的进展。 3.认
同基因工程的应用促进生产力的提高。 4.举例说出蛋白质工程崛起的缘由。 5.简述蛋白质
工程的原理。 6.尝试运用逆向思维分析和解决问题。
【教学流程】
一、知识预习：
1、植物基因工程技术主要用于提高农作物的
（如
、
、
、
和
等），以及
和
利用植物生产
等方面。
2、目前防治作物虫害的发展趋势是从某些生物中分离出
，将其导
入
中，使其具有
。用于杀虫的基因主要是
、
、
、
等。
3、引起植物生病的微生物称为
，主要有
、
和
等。抗病转基因植物所采用的基因，使用最多的是
和
；抗真菌转基因植物中可使用的基因有
和
。
4、目前科学家利用一些可以调节
的基因，来提高农作物的抗盐碱和
能力；将鱼的
导入烟草和番茄，提高其耐寒能力；将
导入
作物，使作物抗除草剂。
5、利用转基因技术可以提高生物中的
的含量、延长贮存时间、改变花色等，
从而提高作物品质。
6、动物基因工程可用于
，
，
，
。
7、基因工程药物包括
、
、
、
、
等。
8、治疗遗传病的最有效手段是
，这种方法是把
导入病人体
内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到
的目的，可分为
和
两条途径。
9、基因工程的实质是将一种生物的
转移到另一种生物体内，使后者产生本不能
产生的
，进而表现出
。其缺点是在原则上只能生产
，而天然蛋白质的
符合
的需要，
却不一定完全符合
的需要。
10、蛋白质工程是指以蛋白质分子的
及其与
的关系作为基
础，通过
或
，对
进行改造，或制造
，以满足
的需求。
11、蛋白质工程的途径是：预测蛋白质功能→设计预期的
→推测应有的
→找到相对应的
。
12、蛋白质工程具有
的前景，但
。
-1

基因工程思考题答案--删减后

第二章 1. 名词解释 （1）顺反子(cistron)：基因所对应的一段核苷酸序列被称为顺反子（cistron），一个顺反子编码一种完整的多肽链。它是遗传的功能单位。 （3）转位因子（transposable elements）：是指可以从染色体基因组上的位置转移到另一个位置，甚至在不同的染色体之间跃迁的基因成分。 （4）基因组（genome）：细胞中，一套完整单倍体的遗传物质的总合。 （5）启动子（promoter）：是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始转录的序列，其大小不等，具有转录目标基因的mRNA的功能。启动子是基因表达不可缺少的重要元件。（6）基因（gene），基因是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 （7）顺反子(cistron)：基因所对应的一段核苷酸序列被称为顺反子（cistron），一个顺反子编码一种完整的多肽链。它是遗传的功能单位。 （8）终止子（terminator），在基因3 端下游外侧与终止密码子相邻的一段非编码的核苷酸短序列，具有终止转录的功能，叫做终止子（terminator）。 （9）断裂基因（split gene），真核生物的结构基因是不连续的，编码氨基酸的序列被非编码序列所打断，因而被称为断裂基因（split gene）。在编码序列之间的序列称为内含子（intron），被分隔开的编码序列称为外显子（exon）。 （10）顺式作用元件（cis-acting elements），指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的DNA序列。包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。 （11）反式作用因子（trans-acting elements），可结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子称为反式作用因子（trans-acting elements）。 （13）反应元件（response elements），是一类能介导基因对细胞外的某种信号产生反应的DNA序列，被称为反应元件（response elements）。 （14）增强子（enhancer），是一段DNA序列，其中含有多个能被反式作用因子识别与结合的顺式作用元件，反应作用因子与这些元件结合后能够调控（通常为增强）邻近基因的转录。（15）转位因子（transposable elements）：是指可以从染色体基因组上的位置转移到另一个位置，甚至在不同的染色体之间跃迁的基因成分。 （16）转座子（transposon，Tn），是一类较大的可移动成分，它是由几个基因组成的特定的DNA片段，除有关转座的基因外，至少带有一个与转座作用无关并决定宿主性状的基因（如抗药性基因）。 （17）假基因（pseudogene），假基因是多基因家族中的成员，因其碱基顺序发生某些突变而失去功能，不能表达或表达异常，生成无生物活性的多肽。 （18）重叠基因（overlapping genes），或嵌套基因（nested genes），是指基因的核苷酸序列（或阅读框）是彼此重叠的基因，称为重叠基因或嵌套基因。 （19）基因家族（gene family），就是指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的一组基因。 （20）反向重复序列，是指两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列。有两种形式，一种形式是两个反向排列的拷贝之间隔着一段间隔序列；另一种形式是两个拷贝反向串联在一起，中间没有间隔序列，这种结构亦称回文结构（palindrome）。 （21）看家基因（housekeeping gene），在几乎所有细胞中或发育过程中持续表达的基因，被称为看家基因。 （22）锌指（zinc fingers）结构，由约30个氨基酸残基组成的一段多肽序列，其中4个氨

(整理)分子生物学与基因工程复习题

一、名词解释 1、分子生物学 2、基因工程 3、DNA的变性与复性 4、细胞学说 5、遗传密码的简并性 6、DNA半保留复制、半不连续复制 7、SD序列 8、开放阅读框（ORF） 9、多顺反子 10、蓝白斑筛选 11、中心法则 12、限制修饰系统 13、断裂基因 14、单链结合蛋白 15、核酶 16、密码子家族 17、TA克隆 18、PCR 19、SNP 20、操纵子学说 21、DNA重组技术 22、减色效应-增色效应 23、可变剪接 24、反转录 25、同尾酶 26、加帽反应 27、蓝白斑筛选 28、表观基因组学 29、DNA的溶解温度 30、DNA的大C值 31、重叠基因 32、引物酶 33、逆转录 34、限制性内切酶 35、载体的选择标记 36、DNA甲基化

37、端粒 38、端粒酶 39、前导链 40、启动子 41、反式作用因子 42、同义密码子 43、多克隆位点（MCS） 44、基因组计划 45、C值悖论 46、顺式作用元件 47、胸腺嘧啶二聚体 48、寄主的限制修饰现象 49、拓扑异构酶 50、DNA的溶解 51、拓扑异构体 52、间隔基因 53、假基因 54、同源异型蛋白 55、翻译 56、多重PCR 57、抗终止作用 58、SD序列 59、空载tRNA 60、cDNA RACE 61、分子杂交 62、cDNA文库 63、载体 64、RT-PCR 65、反义RNA 66、延伸tRNA 67、起始tRNA 68、探针 69、反式剪接 70、增强子 71、动物基因工程 72、基因组 73、限制性内切酶 74、单顺反子

75、密码子 76、转录 77、RNA干扰 78、中心法则 79、回环模型 80、TATA box 81、前导链 82、目的基因 83、RFLP 84、RACE 二、判断 1、大肠杆菌DNA生物合成中，DNA聚合酶I主要起聚合作用。( ) 2、DNA半保留复制时，后随链的总体延伸方向与先导链的延伸方向相反。( ) 3、原核生物DNA的合成是单点起始，真核生物为多点起始。（） 4、以一条亲代DNA(3’→ 5’)为模板时，子代链合成方向5’→ 3’，以另一条亲代DNA链 5’→ 3’为模板时，子代链合成方向3’→ 5’。（） 5、RNA的生物合成不需要引物。（） 6、大肠杆菌RNA聚合酶全酶由4个亚基（α2ββ’）组成。( ) 7、大肠杆菌在多种碳源同时存在的条件下，优先利用乳糖。 ( ) 8、在DNA生物合成中，半保留复制与半不连续复制指相同概念。（） 9、逆转录同转录类似，二者均不需要引物。（） 10、真核生物染色体核心组蛋白的乙酰化、组蛋白H1的磷酸化，都会使基因得以失活。（） 11、在原核细胞中，起始密码子AUG可以在mRNA上的任何位置，但一个mRNA上只有一个起 始位点。( ) 12、蛋白质生物合成过程中，tRNA在阅读密码时起重要作用，他们的反密码子用来识别mRNA上的密码子。( ) 13、表观遗传效应是不可遗传的。( ) 14、cAMP与CAP结合、CAP介导正性调节发生在有葡萄糖及cAMP较高时。( ) 15、DNA甲基化永久关闭了某些基因的活性，这些基因在去甲基化后，仍不能表达。 （） 16、RNA聚合酶催化的反应无需引物，也无校对功能。( ) 17、基因是存在于所有生命体中的最小遗传单位 18、人类基因组中大部分DNA不编码蛋白质 19、蛋白质生物合成过程中，tRNA在阅读密码时起重要作用，他们的反密码子用来识别 mRNA上的密码子。 ( )

第二章基因工程习题答案

基因工程课程习题选择题 001 基因工程操作的三大基本元件是【Ａ】 I 供体II 受体III 载体IV 抗体V 配体 ＡI + II + III ＢI + III + IV ＣII + III + IV ＤII + IV + V ＥIII + IV + V 002 根据当今生命科学理论，基因工程的用途是【E】 I 分离纯化基因 II 大量生产生物分子 III 构建新型物种 IV 提高基因重组效率Ａ I + II + III Ｂ I + II + IV Ｃ I + III + IV Ｄ II + III + IV Ｅ I + II + III + IV 003 根据基因工程的定义，下列各名词中不能替代基因工程的是【A】 Ａ基因诱变 Ｂ分子克隆 Ｃ DNA重组 Ｄ遗传工程 Ｅ基因无性繁殖 004 基因工程的单元操作顺序是【B】 Ａ增，转，检，切，接 Ｂ切，接，转，增，检 Ｃ接，转，增，检，切 Ｄ检，切，接，增，转 Ｅ切，接，增，转，检 005 下列有关基因的叙述，错误的是【A】 Ａ蛋白质是基因表达的唯一产物 Ｂ基因是 DNA 链上具有编码功能的片段 Ｃ基因也可以是 RNA Ｄ基因突变不一定导致其表达产物改变结构 Ｅ基因具有方向性 006 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是【D】 Ａ修复自身的遗传缺陷

Ｂ促进自身的基因重组 Ｃ强化自身的核酸代谢 Ｄ提高自身的防御能力 Ｅ补充自身的核苷酸消耗 007 天然 PstI 限制性内切酶的来源是【D】 ＡBacillus amyloliquefaciens ＢEscherichia coli ＣHaemophilus influenzae ＤProvidencia stuartii ＥStreptomyces lividans 008 T 4 -DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起，其底物的关键基团是【D】 Ａ 2' -OH 和 5' -P Ｂ 2' -OH 和 3' -P Ｃ 3' -OH 和 2' -P Ｄ 3' -OH 和 5' -P Ｅ 5' -OH 和 3' -P 009若载体 DNA 用 M 酶切开，则下列五种带有 N 酶粘性末端的外源 DNA 片段中，能直接与载体拼接的是【D】 M N Ａ A/AGCTT T/TCGAA Ｂ C/CATGG ACATG/T Ｃ CCC/GGG G/GGCCC Ｄ G/GATCC A/GATCT Ｅ GAGCT/C G/AGCTC 010下列有关质粒分子生物学的叙述，错误的是【B】 Ａ质粒是共价环状的双链 DNA 分子 Ｂ天然质粒一般不含有限制性内切酶的识别序列 Ｃ质粒在宿主细胞内能独立于染色体 DNA 自主复制 Ｄ松弛复制型的质粒可用氯霉素扩增 Ｅ质粒并非其宿主细胞生长所必需 011带有多个不同种复制起始区的质粒是【A】 Ａ穿梭质粒 Ｂ表达质粒 Ｃ探针质粒 Ｄ整合质粒 Ｅ多拷贝质粒

关于分子生物学试题及答案

分子生物学试题（一） 一.填空题(,每题1分,共20分) 一.填空题(每题选一个最佳答案,每题1分,共20分) 1. DNA的物理图谱是DNA分子的（）片段的排列顺序。 2. 核酶按底物可划分为（）、（）两种类型。 3．原核生物中有三种起始因子分别是（）、（）和（）。 4．蛋白质的跨膜需要（）的引导，蛋白伴侣的作用是（）。5．真核生物启动子中的元件通常可以分为两种：（）和（）。6．分子生物学的研究内容主要包含（）、（）、（）三部分。 7．证明DNA是遗传物质的两个关键性实验是（）、（）。 8．hnRNA与mRNA之间的差别主要有两点：（）、（）。 9．蛋白质多亚基形式的优点是（）、（）、（）。 10.蛋白质折叠机制首先成核理论的主要内容包括（成核）、（结构充实）、（最后重排）。 11.半乳糖对细菌有双重作用；一方面（可以作为碳源供细胞生长）；另一方面（它又是细胞壁的成分）。所以需要一个不依赖于cAMP-CRP的启动子S2进行本底水平的永久型合成；同时需要一个依赖于cAMP-CRP的启动子S1对高水平合成进行调节。有G时转录从（S2 ）开始，无G时转录从（S1 ）开始。 12．DNA重组技术也称为（基因克隆）或（分子克隆）。最终目的是（把一个生物体中的遗传信息DNA转入另一个生物体）。典型的DNA重组实验通常包含以下几个步骤： ①提取供体生物的目的基因（或称外源基因），酶接连接到另一DNA分子上（克隆载体），形一个新的重组DNA分子。 ②将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为转化。 ③对那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定。 ④对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外援基因是否表达。 13、质粒的复制类型有两种：受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制的称为（严紧型质粒），不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制称为（松弛型质粒）。 14．PCR的反应体系要具有以下条件： a、被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的 DNA引物（约20个碱基左右）。 b、具有热稳定性的酶如：TagDNA聚合酶。 c、dNTP d、作为模板的目的DNA序列 15．PCR的基本反应过程包括：（变性）、（退火）、（延伸）三个阶段。 16、转基因动物的基本过程通常包括： ①将克隆的外源基因导入到一个受精卵或胚胎干细胞的细胞核中； ②接种后的受精卵或胚胎干细胞移植到雌性的子宫；

分子生物学与基因工程原理

分子生物学与基因工程原理复习资料 一、名词解释 1. 分子生物学:是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学；是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。 2. 染色体：是细胞在有丝分裂时遗传物质存在的特定形式，是间期细胞染色质结构紧密包装的结果。 3. DNA 多态性：是指DNA 序列中发生变异而导致的个体间核苷酸序列的差异，主要包 括单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism , SNP)和串联重复序列多态性 ( tandem repeats polymorphism )两类。 4. DNA 的半保留复制：DNA 复制过程中，由亲代DNA 生成子代DNA 时，每个新形成的子代DNA 中，一条链来自亲代DNA ，另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制。 5. 冈崎片段：在DNA 复制过程中，前导链能连续合成，而滞后链只能是断续的合成5 3 的多个短片段，这些不连续的小片段称为冈崎片段。 6.SNP：single nucleotide polymorphism ，单核苷酸多样性，是基因组DNA 序列中单个核苷酸的突变引起的多态性。 7. “基因”的分子生物学定义：产生一条多肽链或功能RNA 所必需的全部核甘酸序列。 8. 获得性遗传：是有机体在生长发育过程中由于环境的影响而不是基因突变所形成的新的遗传性状。 9. DNA 甲基化：是基因的表观修饰方式之一，指生物体在(DNA methyltransferase ，DNMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。 10. CDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，体外合成cDNA，与适当的载体 (常用噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖 扩增。这样包含着细胞全部mRNA 信息的cDNA 克隆集合称为该组织细胞cDNA 文库。11. 基因组：是指一个细胞或者生物体所携带的全部遗传信息。生物个体的所有细胞的基因组是固定的。 12. 蛋白质组学：指在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。 13. 转录组：广义上指某一生理条件或环境下，一个细胞、组织或生物体内所有转录产 物的总和，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA ;狭义上指细胞中转录出来的所有mRNA 的总和。 14. 基因定点突变技术：通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列的一

基因工程原理练习题及答案

基因工程原理练习题及其答案 一、填空题 1．基因工程是_________年代发展起来的遗传学的一个分支学科。 2．基因工程的两个基本特点是：(1)____________，(2)___________。 3．基因克隆中三个基本要点是：___________；_________和__________。 4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的___________。 5．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自_______，第二、三两个字母取自_________，第四个字母则用___________表示。 6．部分酶切可采取的措施有：(1)____________(2)___________ (3)___________等。 7．第一个分离的限制性内切核酸酶是___________；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是_____________。8．限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是_________，它们属于_____________。 9．DNA聚合酶I的Klenow大片段是用_____________切割DNA聚合酶I得到的分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性：(1)____________；(2)________________的活性。 10．为了防止DNA的自身环化，可用_____________去双链DNA__________________。 11．EDTA是____________离子螯合剂。 12．测序酶是修饰了的T7 DNA聚合酶，它只有_____________酶的活性，而没有_______酶的活性。 13．切口移位(nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用_________的_______和______的作用。 14．欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采用_________或_______________。15．反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有____________的作用，可以将DNA- RNA杂种双链中的___________水解掉。 16．基因工程中有3种主要类型的载体：_______________、_____________、______________。 17．就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：_______________、_____________、______________。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 18．一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测 不出质粒，这种现象叫。 19．pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来自于，它的氨苄青霉素抗性基因来自于。 20．Y AC的最大容载能力是，BAC载体的最大容载能力是。 21．pSCl01是一种复制的质粒。 22．pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过 和两种质粒改造而来。它的复制子来自，Amp 抗性基因则是来自。 23．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。 24．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是 和。 25．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS位点序列来自，最大的克隆片段达到kb。 26．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。 27．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。 28．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，总的长度应在噬菌体基 因组的的范围内。 29．在分离DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是 。 30．用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加人单价的阳离子，如NaCl和NaAc， 其目的是。 31．引物在基因工程中至少有4个方面的用途：(1) (2) (3) (4) 。 32．Clark发现用Taq DNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出 碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆PCR产物的。 33．在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在 。 34．乙醇沉淀DNA的原理是。 35．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：

分子生物学复习题(有详细答案)

绪论 思考题：（P9） 1.从广义和狭义上写出分子生物学的定义？ 广义上讲的分子生物学包括对蛋白质和核酸等生物大分子结构与功能的研究，以及从分子水平上阐明生命的现象和生物学规律。 狭义的概念，即将分子生物学的范畴偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA结构与功能、复制、转录、表达和调节控制等过程。其中也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。 2、现代分子生物学研究的主要内容有哪几个方面？什么是反向生物学？什么是 后基因组时代？ 研究内容： DNA的复制、转录和翻译；基因表达调控的研究；DNA重组技术和结构分子生物学。 反向生物学：是指利用重组DNA技术和离体定向诱变的方法研究已知结构的基因相应的功能，在体外使基因突变，再导入体内，检测突变的遗传效应，即以表型来探索基因结构。 后基因组时代：研究细胞全部基因的表达图式和全部蛋白质图式，人类基因组研究由结构向功能转移。 3、写出三个分子生物写学展的主要大事件（年代、发明者、简要内容） 1953年Watson和Click发表了?脱氧核糖核苷酸的结构?的著名论文，提出了DNA的双螺旋结构模型。 1972~1973年，重组DNA时代的到来。H.Boyer和P.Berg等发展了重组DNA 技术，并完成了第一个细菌基因的克隆，开创了基因工程新纪元。 1990~2003年美、日、英、法、俄、中六国完成人类基因组计划。解读人类遗传密码。 4、21世纪分子生物学的发展趋势是怎样的？ 随着基因组计划的完成，人类已经掌握了模式生物的所有遗传密码。又迎来了后基因组时代，人类基因组的研究重点由结构向功能转移。相关学说理论相应诞生，如功能基因组学、蛋白质组学和生物信息学。生命科学又进入了一个全新的时代。 第四章 思考题：（P130） 1、基因的概念如何？基因的研究分为几个发展阶段？ 概念：基因是原核、真核生物以及病毒的DNA和RNA分子中具有遗传效应的核苷酸序列，是遗传的基本单位和突变单位以及控制形状的功能单位。 发展阶段：○120世纪50年代以前，主要从细胞的染色体水平上进行研究，属于基因的染色体遗传学阶段。 ○220世纪50年代以后，主要从DNA大分子水平上进行研究，属于分

基因工程与分子生物学

基因工程与分子生物学重点 1．限制性核酸内切酶：凡是识别切割双链的DNA分子内特定核苷酸序列的酶称为限制性核酸内切酶，简称为限制性酶。 2．限制性核酸内切酶的一般性质：37℃，pH为7.2~7.6，用Tris—HCl，Gly—NaOH两种缓冲液，Mg2+Buffer，5mM，盐浓度，巯基试剂：β-ME，DTT，BSA（牛血清白蛋白，稳定酶的作用）；决定生产的特定的DNA片段的大小，识别顺序具有180°的旋转对称，识别顺序一般是4~6个碱基，也有6个以上的，但是没有4个以下的，产生三种不同的切口:形成平头末端（SmalⅠ）：连接困难，效率较低；形成5’粘性末端（EcoRⅠ）：相对而言，5’突出尾，3’凹末端；形成3’粘性末端（PstⅠ）相对而言，3’突出尾，5’凹末端。 3．星活性：在非标准条件下（低盐和高pH，高甘油浓度>5%），限制酶识别顺序与切割顺序发生改变的现象。 4．大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）：将Pol1切下一个小片段失去5’到3’外切酶活性。补平限制酶切割DNA产生3’凹槽（5’到3’合成），用[32p]dNTP补平3’凹端，对DNA片段进行末端标记，对带3’突出端的DNA进行末端标记（利用置换活性），在cDNA 克隆中，用对和陈那个cDNA的第二条链，在体外诱变中用于从单链模版合成双链DNA，应用Sanger双脱氧末端终止法进行DNA测序，消化限制酶产生的3’突出端，应用于PCR 技术。 5．基因工程的工具酶：T7噬菌体DNA聚合酶，修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，TaqDNA 聚合酶（没有校正功能），大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段，T4噬菌体DNA聚合酶。 6．末端转移酶：将相同的核苷酸依次连接到3’末端，然后两条DNA通过同源多聚尾巴连接在一起，在表达前将ploy(G)切除，否则影响蛋白质的生物活性。 7．T4噬菌体多核苷酸激酶：使DNA的5’端磷酸化，也可以使DNA的5’端去磷酸化。可以发生正向反应，也可发生交换反应。正向反应：5’CTGCAG在酶和ATP（ATP具有α，β，γ磷酸基团，其中γ可给出）的作用下，生成5’pCTGCAG；交换反应：5’pCTGACG在酶和ADP的共同作用下，去磷酸化，将DNA链上的磷酸基团给出，生成5’CTGCAG和ATP，在酶和被标记的A TP作用下使得DNA再次被磷酸化同时被标记，生成ADP和5’*pCTGCAG。 8．基因工程载体种类：质粒，噬菌体的衍生物，科斯质粒或粘粒，噬菌体质粒，单链DNA 噬菌体M13，真核病毒载体，酵母质粒载体，杆状病毒。 9．质粒：在细菌细胞内作为与宿主染色体有别的复制子而进行复制，并且在细胞分裂时能恒定传递给子代细胞的独立遗传因子。 10．质粒作为基因工程载体所必备的条件：1）具有较小的分子量和松弛的复制子，2）基因组上有1~2个筛选标记，便于在平板中区分重组体和非重组体，3）DNA链上有1到几个限制酶的单一识别与切割位点，便于外源DNA的插入，4）具有插入失活（或是插入表达）的筛选标记，便于从平板中直接筛选阳性重组体。 11．Ti质粒：引起植物形成肿瘤—冠瘿瘤的质粒称为诱导肿瘤的质粒。 12．Ti质粒的优点：宿主范围广泛，Ti质粒能过转化所有的双子叶植物，并将外源基因导入植物细胞；整合到宿主细胞ch—DNA上的T—DNA成了染色体的正常遗传成分，永远居留，代代相传；T—DNA上的Opine合成酶基因有一个强大的启动子，能启动外源基因在植物细胞中高效表达。 13．分子杂交（杂交，hybrdization）：核酸研究中一项最基本的实验技术，它是指在一定条件下互补核酸链复性形成双链的过程。 14．分子杂交的原理：(一)DNA的变性：指分子有稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结

“基因工程与蛋白质工程”知识归纳及试题例析

“基因工程与蛋白质工程”知识归纳及试题例析 一、知识归纳 1．与DNA分子相关的酶 名称作用参与的生理过程应用限制性核酸内切 酶 切割某种特定的脱氧核苷酸序列基因工程DNA连接酶连接两个DNA片段基因工程 DNA聚合酶在脱氧核苷酸链上添加单个脱氧 酸 DNA复制 RNA聚合酶在核苷酸链上添加单个核糖核苷 酸 转录 解旋酶使碱基间氢键断裂DNA复制及转录 逆转录酶以RNA为模板合成DNA逆转录及基因工程 特别注意： （1）限制性核酸内切酶的来源：多数来自原核生物；作用特点：主要切割外源DNA，对自身的DNA不起作用从而达到保护自身的目的；作用结果：形成DNA片断末端。 （2）各种酶都具有专一性，特别是限制酶只能识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定的碱基之间切开。 2．基因工程的基本操作程序 （1）获取目的基因 ①基因文库：是将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中通过 克隆而储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。 ②基因组文库：基因文库中含有一种生物所有的基因就叫做基因组文库。 ③部分基因文库：含有一种生物的部分基因，就叫做部分基因文库，如cDNA文库。 PCR技术与DNA复制的比较 比较项目PCR技术DNA复制 相 同 点 原理DNA双链复制（（碱基互补配对） 原料四种游离的脱氧核苷酸 条件模板、ATP、酶等 不 同 解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化 场所体外复制主要在细胞核内

点 酶 热稳定的DNA聚合酶（Taq 酶） 细胞内含有的DNA聚合酶结果 在短时间内形成大量的DNA 片段 形成整个DNA分子 （2）基因表达载体的构建（基因工程的核心） ①构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目 的基因能够表达和发挥作用。 ②一个基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因等。 ③构建方法 生物 种类 植物细胞动物细胞微生物细胞常用 方法 农杆菌转化法显微注射技术Ca2+处理法受体 细胞 体细胞受精卵原核细胞 转化 过程 将目的基因插入Ti质粒 的TDNA上→农杆菌→导 入植物细胞→整合到受体细 胞的DNA→表达 将含有目的基因的表达 载体提纯→取卵（受精卵） →显微注射→受精卵发育→ 获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞→感受态 细胞→重组表达载体与感受 态细胞混合→感受态细胞吸 收DNA分子特别注意：受体细胞中常用植物受精卵或体细胞（经组织培养）、动物受精卵（一般不用体细胞）、微生物──大肠杆菌、酵母菌等，但要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必 需用真核生物酵母菌──需内质网、高尔基体的加工、分泌。一般不用支原体，原因是它营 寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟红细胞，原因是它无细胞核和众多的细胞器，不能合成 蛋白质。