分子生物学问答题
问答题
第二章
一、用于基因重组的载体需要具有哪些条件？
1）具有自主复制能力，保证重组DNA分子可以在宿主细胞内得到扩增
2）具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体DNA分开，便于分离提纯
3）分子质量相对较小，易与操作，并能够容纳较大分子质量的目的基因
4）具多个单一限制性内切酶位点，便于目的基因克隆
5）有一个或多个筛选标记（如对抗生素的抗性、营养缺陷型或显色表型反应等）
6）具有较高的遗传稳定性
二、限制性内切酶主要分为几个类型？各有什么特点？
限制性内切酶主要分为三种类型，即Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。
Ⅰ型和Ⅲ型酶一般都是大的、多亚基的蛋白质复合物，同时具有内切酶活性和甲基化酶活性。均需ATP 水解供能。Ⅰ型酶能够识别特异的核苷酸序列，但是切割位点是随机的，Ⅲ型限制酶从距离识别位点一侧约25bq处单链切割DNA分子。识别序列是非对称的，现在已知的酶数量相当少。Ⅰ型和Ⅲ型酶在DNA重组技术中用处不大。
Ⅱ型限制性核酸内切酶只有一种多肽，通常以同源二聚体形式存在，核酸内切酶活性和甲基化作用活性是分开的。无需ATP水解供能，仅需Mg2﹢参与。具有序列特异性，可对靶DNA进行精确切割，在DNA 重组技术中有特别广泛的用途。
三、影响限制性内切酶作用的因素有哪些？
DNA第底物的纯度、DNA的甲基化程度、DNA分子的结构、酶切反应的温度、酶切反应的时间、酶切反应的缓冲体系等
四、DNA连接酶主要有哪些应用？
1）作为DNA重组技术的重要工具酶，催化两个具有黏性末端或平末端的DNA片段5’-P和3’-OH之间形成磷酸二酯键，组成新的重组DNA分子。
2）在DNA复制中发挥接合缺口的作用，这种单链缺口是由复制叉上的不连续性所产生
3）在DNA损伤修复、遗传重组、及DNA链的剪接中起缝合缺口的作用
五、反转录病毒载体有哪些优点？
1）具有广泛的哺乳动物细胞宿主
2）可主动感染分裂细胞
3）感染细胞后，病毒基因组反转录生成双链DNA，可整合到宿主染色体中，与染色体同时复制，持续表达外源基因
4）基因组自身含有完整高效的调控元件
六、腺病毒载体有哪些优点？
1）可插入大片段外源基因，可达35kb
2）宿主范围广，尤其人类是腺病毒的自然宿主
3）不仅可感染分裂期细胞，也可感染非分裂细胞
4）病毒滴度高，可达10^9-10^11pfu/ml
5）可原位感染组织，如肺等
6）重组载体进入细胞后并不整合到宿主染色体DNA上，而是游离于染色体外瞬时表达，安全性好
七、腺病毒载体有哪些不足？
①病毒基因组较大，构建载体较复杂
②几乎可感染所有细胞，缺乏特异性
③载体不发生整合，导致目的基因只能短暂表达，因此需要重复应用，可能诱发机体的免疫反应
第三章
①化学合成法
已知目的基因的核苷酸序列，或根据基因产物的氨基酸序列推导出其核苷酸序列，可利用全自动DNA合成仪化学合成该目的基因。化学合成基因具有快速、有效、不需收集基因组织来源的优点
②PCR法
如果已知目的基因的全序列或目的基因片段两侧的DNA序列，可以采用PCR方法从组织或细胞中获取目的基因。根据已知序列设计并合成一对引物，以染色体DNA或cDNA为模板，在DNA聚合酶催化下，大量快速地扩增目的基因片段。具有简便、快速、特异等优点
③从基因文库中筛选
大部分未知基因的获得，需要先构建基因组文库或cDNA文库，基因文库构建成功后，可利用适当的筛选出含有目的基因的克隆，再进行扩增、分离、回收，最后获取目的基因
二、影响连接酶作用的因素有哪些？
①DNA连接酶对黏性末端的连接效率远高于平末端的连接效率
②连接反应的温度是影响连接产物转化效率的重要参数之一，连接黏性末端的温度一般在4℃~15℃
③连接酶的用量也影响连接产物的转化效率，在平末端连接反应中所需的酶量高于黏性末端所需的酶量
④ATP的反应浓度一般应保持在10umol/L~1mmol/L之间
⑤构建重组载体时，为提高重组效率，载体分子与外源插入片段的摩尔数比值以1:3-10为宜
三、用限制性核酸内切酶切割DNA后，经电泳检查发现有拖尾现象，可能的原因是什么？
①蛋白与DNA的结合
②有酶的混杂，核酸外切酶的污染
③酶切条件不合适
④电泳条件不合适等
四、列出一个理想的克隆载体需要具备的特征？
①复制起始点
②两个辅助性选择标记基因：一个有抗生素抗性，或能够补充宿主的某些遗传突变，只有转化细胞能在选择性培养基中生长；另一个标记基因可通过插入失活将重组分子与非重组分子区分开
③一个多克隆位点序列，使载体更加实用
④如果是真核片段需要表达，需要有启动子序列、翻译起始和终止序列
五、何谓黏性末端连接法？它有什么不足之处？
黏性末端连接法：目的基因与载体分子经同一限制性核酸内切酶切割成具有相同黏性末端的DNA片段后，可通过黏性末端互补配对，再借助DNA连接酶封闭缺口，形成完整的重组DNA分子。这是DNA体外重组最普遍最方便的一种连接方式，但也有一些不足之处
①载体易自身环化
②同一种限制性核酸内切酶产生的黏性末端易连接但不易定向克隆
③较难插入特定的基因
④大片段DNA重组率低
⑤易产生多种串联重组体，增加筛选工作的难度
六、简述基因组克隆与cDNA克隆的构建上有何不同？
基因组DNA克隆的构建过程是分离纯化细胞基因组DNA，用适当的限制性内切酶将纯化的细胞基因组DNA 切割成一定大小的片段，再将这些片段与适当的克隆载体连接，获得一群含有不同DNA片段的重组体，继而将重组体转入受体菌。对于一个结构基因而言，可以通过基因组DNA文库的筛选来确定其上游启动子区、外显子、内含子及下游非编码区的结构
cDNA克隆构建过程除了基因组DNA克隆的构建步骤外，需要逆转录的过程。它将细胞的基因表达信息以cDNA 的形式储存于受体菌中，不包含基因组克隆中出现的内含子。
①黏性末端连接：目的基因与载体分子经同一限制性核酸内切酶切割成具有相同黏性末端的DNA片段后，可通过粘性末端互补配对，再借助DNA连接酶封闭缺口，形成完整的重组DNA分子，是DNA体外重组最普遍最方便的一种连接方式。
②平末端连接：某些限制性核酸内切酶对DNA分子切出平齐的末端，可利用T4DNA连接酶将两者连接，这就是平末端连接法。如果目的基因和载体上没有相同的限制性核酸内切酶位点，用不同的限制酶切割后产生的黏性末端消化平齐（如S1核酸酶）或补齐（Klenow酶），再用T4DNA连接酶连接。
③人工接头连接：是在要连接的外源基因或载体DNA的两端，先接上一段人工合成的DNA片段（称为接头），借此可再用一种或两种限制性核酸内切酶将其切开，产生黏性末端，将外源基因与载体DNA连接。
④同聚物加尾连接：如果待连接的两个DNA片段均为平末端，或者两个DNA片段的连接端不是互补的黏性末端，可通过同聚物加尾法在其末端引入互补粘性末端，即利用末端转移酶（TDT）把互补的多聚核苷酸接到两个DNA片段的末端，然后用DNA连接酶将其连接。
⑤T-A克隆：是一种直接将PCR产物插入到载体中的方法。T-A克隆载体两侧的3’末端带有突出的T碱基，而PCR扩增后产物两侧的3’末端会加上突出的A碱基，这样载体与产物之间通过T-A互补配对，再在DNA 连接酶的作用下封闭缺口形成重组分子。
第四章
一、简述α互补筛选重组体质粒细菌的原理？
α-互补：指在M13噬菌体DNA或PUC质粒序列中，插入了lac启动子-操纵子基因序列以及编码β-半乳糖苷酶N-端145个氨基酸的核苷酸序列，该序列不能产生有活性的β-半乳糖苷酶。这类载体对应的宿主菌的F游离体上的β-半乳糖苷酶基因也失去了编码11-41位氨基酸的碱基序列，因而宿主菌也不能产生有活性的β-半乳糖苷酶。只有当这类载体引入到宿主菌后，载体上的β-半乳糖苷酶N-端片端才能与宿主菌的缺陷β-半乳糖苷酶互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶，这种作用称为α-互补。PUC载体在lac Z基因片段处，引入多克隆位点，以供插入外源基因，将使lac Z基因片段灭活，不能使宿主菌产生α-互补现象，当使外源诱导物IPTG和人工底物X-gal加入后，底物不被转化，不能生成兰色菌落，而保持白色。基于α-互补原理的筛选方法又称为“蓝-白筛选”。
二、试述G418筛选稳定表达细胞系原理？
分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。
外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至少80%的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，最终整合进细胞染色体。细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素性基因提供。细菌Tn5转座子序列携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产生氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
三、重组DNA分子导入受体细胞的方法有哪些？
重组DNA分子导入受体细胞的方法有：
⑴转化：转化是指将质粒DNA分子或以质粒为载体构建的重组DNA分子导入细菌的过程。利用一定的方法处理细菌细胞，使之处于容易接受外源DNA分子的状态，即为感受态，此时的细菌就称为感受态细菌。最常用的转化方法是CaCl2法，即用低渗CaCl2溶液在0℃条件下处理快速生长的细菌，使细菌细胞壁和膜
的通透性增加，处于感受态，然后加入重组DNA分子或质粒DNA分子，通过42℃短时间热激作用促使DNA\ 分子进入细胞内，先在不含抗生素的培养基上孵育一段时间，使质粒的抗药性基因充分表达，随后在含相应抗生素的培养基上培养而得到转化的单菌落，挑选单菌落进行筛选和鉴定。此外还可采用电穿孔法进行转化。
⑵转染：转染是指将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的重组DNA分子导入真核细胞的过程。常用的转染方法有以下几种：①磷酸钙转染法将被转染的DNA和磷酸钙混合形成磷酸钙-DNA共沉底物后，使其附着在培养细胞的表面，外源DNA通过内吞作用被细胞捕获，并整合至受体细胞基因组中得以表达。②二乙氨乙基-葡聚糖介导转染法③电穿孔转染法：利用很短促的高压电脉冲，在哺乳动物或植物细胞的原生质膜上形成微孔，外源DNA可通过这些微孔进入细胞。④脂质体转染法：脂质体是一种人造类脂膜，可作为体内、外物质转运的载体。用脂质体包裹DNA，通过与细胞膜融合将外源DNA导入细胞。脂质体转染法可用于瞬时表达和稳定表达，操作简单，转染效率高，重复性好，且毒性低、包装容量大⑤显微注射法：通过显微注射装置将外源重组DNA直接注入细胞核中并进行表达。该法虽然转染效率高，但需要一定的仪器和操作技巧。主要用于进行稳定表达的细胞转染。
⑶感染：感染时是指以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重组DNA，经体外包装成具有感染性的噬菌体颗粒和病毒颗粒后，借助噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA注入细菌或真核细胞，使目的基因得以复制繁殖的过程。感染的效率很高，但重组体DNA需经过较为复杂的体外包装过程。
四、制备感受态细胞的原理是什么？目前常用的感受态
细胞制备方法有哪些？
转化是将外源基因DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（即带有异源DNA分子的受体细胞）。
目前常使用的感受态细胞制备方法有CaCl2法和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存半年，因此CaCl2法使用更广泛。
五、为了提高转化效率，实验中要考虑哪些重要因素？
⑴细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于-4℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种
中
直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以
刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600
来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在
5×107个/ml左右，这时比较合适。密度过高或不足均
会影响转化效率。
⑵质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超
螺旋态DNA。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成
正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转
化效率就会降低。lng的cccDNA即可使50μl 的感受态
细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感
受态细胞体积的5%。
⑶试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2等均需是最高浓
度的，并用超纯水配置,最好分装保存于干燥的冷暗处。
⑷防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌
条件下进行，所用器血，如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止
被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要
的麻烦。
六、何谓α-互补？举例说明如何利用α-互补筛选重组体？
指M13或PUC系列载体上的β-半乳糖苷酶N-端含145
个氨基酸的片段转化含缺陷型β-半乳糖苷酶的宿主菌后，在宿主菌所表达的两部分缺失片段，即α-肽和ω- 肽能够功能互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶，这种作用称为α-互补。以PUC系列载体为例，由于PUC载体在lac Z基因α-肽片段处，引入多克隆位点，以供插入外
源基因，将使lac Z基因α-肽片段灭活，不能与宿主菌产生α互补现象，致使宿主菌无β-半乳糖苷酶活性，
当外源诱导物IPTG和人工底物X-gal加入后，底物不被
转化，不能生成兰色菌落，而保持白色。基于α-互补原理的筛选方法又称为“蓝-白筛选”。
七、基因工程中重组体筛选与鉴定的方法有哪些？
㈠根据重组载体的遗传表型进行筛选：
⒈根据载体的抗药性标记筛选
⒉根据载体的抗药性标记插入失活选择
⒊根据β-半乳糖苷酶显色反应筛选
⒋根据插入的外源基因性状进行筛选
㈡限制性核酸内切酶酶切鉴定
㈢核酸分子杂交法
㈣PCR法
㈤免疫化学检测法
第五章
一、DAN变性的常用方法有哪几种？
导致DNA变性的常用方法有3种：热变法、碱变性和化
学试剂变性
①热变性：当温度升到90~100℃，核酸双键之间的氢键
完全断裂为单链DNA分子。
②酸碱变性：核酸溶液pH低于3或高于10时，核酸的
双键之间的氢键完全断裂为单链DAN分子
③化学试剂变性：某些化学试剂使DAN双键之间的氢键
完全断裂为单链DAN分子
实际上，DNA变性的发生不是一步进行的，一般是从AT
先解链，GC区后解链，变性曲线是阶梯式的。
二、简述DNA的复性过程
①单链分子间随机碰撞形成局部双链
②局部双链周围的碱基如不配对，双链重新解开
③局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列
④形成完整的双链分子
三、一个良好固相支持物应具备哪些特性？
①结合核酸能力强
②支持物不影响杂交反应
③结合核酸稳定
④非特异性吸附少
⑤机械性能好
四、一种理想标记物应具备哪些特性？
探针标记物一般分为两类：①同位素标记②非同位素标记
理想标记物应具备那些特性：
⑴高灵敏度：标记物标记探针杂交后，检测时灵敏度要高
⑵三不影响：标记物的性质不影响探针分子配对，标记物的性质不会影响探针分子理化特性，标记物的性质不会影响杂交特性
⑶检测方法特异性：标记物标记探针杂交后，检测方法要特异
⑷标记物对酶影响小，对环境污染小，价格低
五、随机引物法标记DNA探针的基本原理如何？
⑴加入变性剂，使双链DNA打开
⑵加入引物，（6-8个核苷酸），与打开DAN双链结合
⑶加入同位素标记核苷酸和DNA聚合酶Ⅰ，使之在引物的3-末端延5→3按碱基互补合成新的DNA链
⑷新合成的核苷酸与旧核苷酸链完全相同，不同的是由同位素标记的核苷酸代替了无标记的核苷酸
六、何谓核酸分子杂交？简述核酸杂交的基本原理
核酸分子杂交：利用变性作用将DNA双链分开，加入不同来源的DNA单链或RNA链，经过退火处理，不同来源的两条多核苷酸链依靠碱基互补关系形成杂种双螺旋的过程。
基本原理：
⑴核酸分子在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子
⑵变性DNA两条互补单链，在适当条件下重新缔合成双链的过程
⑶将DNA双链分开，加入不同来源的DNA单链或RNA链，经过退火处理，不同来源的两条多核苷酸链依靠碱基互补关系形成杂种双螺旋的过程
七、试述影响核酸分子杂交的因素
⑴探针浓度与长度：双链探针浓度大，DNA-RNA杂交受影响，单链探针浓度大，核酸杂交率一般增加。探针长，杂交率低；探针短，杂交率高
⑵碱基组成：G-C含量多，杂交率增加
⑶温度：温度低，杂交缓慢，易错配；温度过高不利于杂交；低于Tm20-25℃，杂交率最大；温度为Tm-5℃杂交率十分低下
⑷离子强度：低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加，但错配杂交体更稳定
⑸核酸分子大小：分子越大，越复杂，杂交难度大，杂交也慢。分子越小，易杂交
八、试述探针的种类及其两种最常用的核酸探针制备方法
种类：①基因组DNA探针②CDNA探针③RNA探针④CRNA探针⑤寡核苷酸探针
基因组DNA探针的制备：一般从基因文库中选取某一特定基因片段后大量扩增，纯化，酶切得到
寡核苷酸探针的制备：根据已知的核酸序列先设计一个20~50个碱基的核苷酸顺序，在DNA合成仪上合成得到
九、试述切口平移法标记DNA探针的原理
基本原理：
⑴双链DNA在DNA内切酶，Mg存在下，将DAN一条链上随机切开若干个切口，切口处为3-末端
⑵DAN聚合酶Ⅰ在3-末端逐个加入标记核苷酸，由于该酶具有5→3外内切酶作用，故同时在5端的核苷酸逐个切除。这样3端和5端同时进行，导致切口沿着DNA链移动而为缺口平移
⑶新合成的核苷酸链与旧核苷酸链完全相同，不同的是由同位素标记的核苷酸代替了无标记的核苷酸。
十、设计寡核苷酸探针的基本原则如何？其优点有哪些？
基本原则：
①探针长度10~50bp
②G-C为40~60%
③避免同一碱基的连续出现>4个
④避免碱基反向互补碱基对应>4 bp
⑤与非靶基因序列有70%以上的同源性，应重新设计
优点：可根据需要合成，探针短，杂交时间短，价格低
第六章
一、简述PCR的基本原理和步骤
基本原理为变性、退火和延伸。包括三步：
第一变性：将反应体现升温至95℃左右，样品中双链DNA解开成两条链，各自作为模板。
第二退火：将温度降至引物的Tm值以下（55℃左右），5’端和3’端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合。
第三延伸：将温度升到75℃左右，耐热的Taq DNA聚合酶催化四种dNTP，从引物3’-OH端开始，依据模板碱基序列互补方式依次聚合，合成一条互补的DNA链。
二、简述PCR技术的特点
⑴高度的敏感性：可将极微量DNA，扩增到紫外光可见的水平，这是最主要的特点，它可对单拷贝基因、单个细胞、单根头发、一滴血等微量标本进行分析
⑵高度的特异性：PCR扩增的特异性由两个引物的序列决定，因此引物设计至关重要
⑶适用样品的广泛性：对样品的要求并不十分严格：
①可以是DNA，也可以是RNA
②可以是纯化的，也可以是粗制的
③可以是新鲜组织，也可以是陈旧组织
④可以是细胞，也可以是体液
⑷操作简便，快速：PCR自动化，数小时完成。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广
三、设计引物时从那几个方面考虑可以提高PCR反应的特异性？
⑴引物长度要合适，一般为16~30个核苷酸，常用为20bp左右
⑵G+C含量一般占50~60%，有利于引物与模板的结合。G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带
⑶ATCG4种碱基随机分布，避免连续出现3个以上相同的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，最好随机分布。否则易使引物与模板的嘌呤或嘧啶密集区发生错配
⑷引物内部不能存在互补序列，以避免形成发夹结构
⑸两个引物之间不能存在互补序列，以避免形成引物二聚体
⑹引物与非特异性序列的同源性不能超过70％或不能有连续8个碱基互补，否则导致非特异性扩增
⑺引物3’末端碱基一定要与模板正确配对，引物3’端最佳碱基选择是G和C
⑻引物的5’端可以修饰，如：引入酶切位点、启动子序列等，用荧光素、生物素等标记
⑼引物扩增跨度，以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段
四、简述PCR反应体系中Taq酶的作用及特点
Tac DNA聚合酶是一种水生栖嗜热菌YT1株分离提取出来，催化四种dNTP，从引物3’-OH端开始，依据模板碱基序列互补方式依次聚合，合成一条互补的DNA链，其特点：①热稳定性好，能受DNA变性时的高温②Tac DNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，对Mg2+浓度非常敏感③忠实性，TacDNA聚合酶具有5’ →3’聚合酶活性和5’ →3’外切酶活性，而无3’ →5’外切酶活性，在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能④Tac酶的最适温度75℃左右
五、请问PCR循环次数是否越多越好？为什么？
不是。理论上，每增加1个循环，双链DNA片段会增加1倍，使DNA量可成指数（2n）增加。实际上，扩增效应低于指数增加，为（1+X）n。即PCR反应初期，目的DNA片段的增加成指数扩增。随着目的DNA 扩增产物的逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，此时DNA扩增产物的增幅减慢，即出现“平台效应“。到达平台期所需要的循环次数一般是在30次之后。一般进行30个左右的循环，特定区域的DNA量可至少增加10?6倍
六、试比较PCR与生物体内DNA复制的区别？
七、PCR出现非特异扩增产物的可能原因？如何解决？
⑴背景DNA存在有与引物同源性较高的其它位点
可通过在两个引物的内侧系列上再使用另一对引物对扩增的产物DNA再做PCR扩增
⑵过量的酶、dNTP和引物设计不合理可使PCR反应造成混乱，强行扩增出非特异产物DNA
适当降低这些试剂的量或重新设计引物有助于问题解决
⑶退火温度太低，引物与模板的配对是一个动态过程，分子的热运动使引物与模板结合与解离达到最佳配对位点。当退火温度太低，造成引物与模板的非特异性位点部分配对儿而未解离，这种不正确的配对，进入PCR反应过程就可扩增出非特异的产物DNA
提高反应的退火温度（有时比Tm值高出几度）将可改善结果
八、叙述实时PCR技术的工作原理
该技术在常规PCR基础上，添加了一条标有两个荧光基团的荧光双标记探针，一个标记在探针的5’端称为报告基团（R）；另一标记在探针的3’端称为萃灭基团（Q）。两者可构成能量传递结构，即5’端R 基团发出的荧光信号可被3’端Q基团抑制，3’端的-OH已被封闭，不具有延伸的能力。探针在无特异性PCR扩增时，荧光信号无变化，在PCR反应开始后，随着链的延长，Tac 酶沿着模板移动到荧光标记探针的结合，发挥它的5’ →3’外切酶酶活性，将荧光探针切断。一旦切断，Q基团的抑制作用消失，从而引
起R基团发出的荧光信号增长，被释放的游离R基团的数目和PCR产物的数量是一对一的关系，因此，R 基团的荧光信号的强弱就与PCR产物的数量成正比关系。测出前者就可以推算出后者，这就是实时PCR技术的工作原理。利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。第七章
一、基因诊断的特点是什么？
①针对性强：检测对象是病变的基因、异常表达的基因或病原体基因，属于病因诊断或发病原因分析
②特异性高：所用的分子生物学技术能特异的检出致病基因。如分子杂交技术采用特异序列探针，PCR采用特异序列引物，通过互补识别致病基因
③灵敏度高：只需极微量的标本，就能做出分析诊断。这主要依赖于所采用的高灵敏度的技术
a.分子杂交技术采用放射性同位素、酶或化学发光试剂标记探针，有很高的放大灵敏度
b.PCR扩增技术采用循环扩增至百万倍再分析致病基因，因而灵敏度更高
④易获得稳定的结果：核酸特别是DNA比蛋白质稳定，并且对核酸标本要求不高
⑤可快速、早期诊断疾病：大部分疾病的发生离不开自身基因结构或功能的异常，而基因诊断技术常只需数小时即可在基因水平上做出诊断
⑥适应范围广：可对遗传病、感染性疾病作出诊断，也可作肿瘤的基因检查分析，以及在法医学上进行个体识别、亲子鉴定等
二、基因诊断的主要内容和常用方法是什么？
⑴基因诊断主要内容：
①定性分析：a.个体基因序列的特征（基因型）分析
b.基因突变分析
c.判断是否存在外来基因
②定量分析：a.基因拷贝数测定
b.基因表达产物mRNA定量测定
⑵基因诊断的常用方法：
①核酸分子杂交：a.DNA或RNA点杂交 b.DNA或RNA印迹 c.原位杂交（检测基因拷贝数） d.基因芯片
②PCR扩增：a.PCR（检测DNA） b.逆转录PCR（检测RNA）
③DNA测序（最准确的基因诊断方法，但技术要求高）
三、试述ASO法的中文名称、基本原理和实验流程
ASO法中文名称为等位基因特异寡核苷酸探针杂交法
基本原理：
①事先设计和制备涵盖突变位点的一对正常寡核苷酸探针（无突变序列）和突变寡核苷酸探针，并标记显示物（如放射性同位素、荧光素等）
②将待测样品DNA进行变性处理。再一分为二，分别吸附于杂交膜上，形成两个待测斑点
③利用正常探针和突变探针分别与这两个斑点的待测DNA进行杂交
④洗除未杂交的探针，通过标记物显示杂交结果，最后分析结果
结果分析：
四、试述限制性内切酶酶谱分析法的基本原理和实验流程每一种限制性核酸内切酶能识别特定的DNA 序列（限制性识别位点），并在其中的某一特定碱基位点将DNA双链切断；利用限制性核酸内切酶的这一特点可获得特定的酶切位点，由此建立酶切位点图谱对DNA序列进行分析。
DNA突变对限制性酶切位点的影响有以下两种情况：
①若突变发生在限制性识别位点内，可丧失原有的酶切位点
②若突变发生在限制性识别位点外，可产生新的酶切位点
限制性内切酶酶谱分析法的基本原理和实验流程如下：
若基因突变导致某一限制性核酸内切酶识别位点改变（识别位点丧失或新增）→提取待测DNA样品进行PCR扩增→选用相应的限制性核酸内切酶对扩增DNA产物进行酶切（酶切后，基因突变样品所得到的DNA 限制性片段长度或数量与正常DNA样品不同）→通过凝胶电泳，核酸荧光显示结果→最后通过与正常DNA 样品结果进行比较，从而对待测样品是否有某种基因突变做出判断
五、试述RELP连锁分析的基本原理和实验流程
RFLP连锁分析是利用某些疾病基因（突变基因）与其相邻的某段DNA序列有着密切的依存关系，这类相邻的DNA序列被最为遗传标志，可通过鉴定遗传标志的存在与否来间接判断个体是否带有致病基因，而不是直接检测致病基因。
RFLP连锁关系有以下两种情况：
①某种RFLP一般存在于某一致病基因的染色体上相邻位置，若基因序列正常时则该种RFLP极少出现
②某种RFLP一般存在于某一正常基因的染色体上相邻位置，若基因序列异常时则该种RFLP极少出现RFLP连锁关系的基本原理和实验流程如下：
将于致病基因连锁的RFLP的限制性识别位点作为遗传标志（基因突变时该限制性识别位点可丢失或获得）→提取待测个体DNA样品及其家属的DNA样品进行PCR扩增→选用相应的限制性核酸内切酶对扩增DNA产物进行酶切（酶切后，基因突变样品所得到的DNA限制性片段长度或数量与正常DNA样品不同）→通过凝胶电泳，核酸荧光显示结果→最后通过与家属DNA样品结果进行比较，根据待测样品的遗传标志是否存在，从而间接推知待检样品是否与遗传标志连锁的基因突变
六、试述SSCP法的中文名称
单链构象多态性分析法
七、试述DNA指纹法基本原理和实验流程
不同个体间相同位点的微卫星的核心序列重复次数相差悬殊，而形成高度多态性，即彼此之间不相同（除部分同卵双生子外），因此根据个体间某些特异微卫星的DNA片段多态性做出个体识别。其基本原理和实验流程如下：
先设计和制备一对跨越微卫星两端的上下游引物，经PCR扩增特异微卫星片段后，再用分辨率较高的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同长度的微卫星，核酸荧光显示微卫星区带位置，结合家谱的电泳结果，即可做出判断。
结果分析：每种同源位点的微卫星至少有一对等位微卫星，一个是来自父亲，另一个来自母亲，因两者的核心序列重复次数不同，故长度不同。一个个体的等位微卫星与其父母的相同一半（即等位微卫星中一个与父亲相同，另一个与母亲相同）；与其兄弟姐妹或不完全相同，或完全不同；与非血缘者完全不同八、试述基因诊断的应用
①遗传病的诊断和产前诊断：基因诊断首先应用于遗传病的诊断，特别是用于遗传病的产前诊断，对于遗传病的预防和优生具有重要的现实意义
②感染性疾病的诊断
a.检测DNA病原体：目前应用最多是PCR法，可检测乙肝病毒、巨细胞病毒、乳头瘤病毒、结核杆菌等
b.检测RNA病原体：用逆转录PCR检测艾滋病病毒、丙肝病毒等
③肿瘤发病机制研究：
a.通过检测癌基因和抑癌基因的突变，分析肿瘤细胞发生、发展的原因和机制
b.疗效评价：主要应用于白血病治疗后的追踪观察，通过荧光原位杂交、PCR等技术检测微小残留白血病细胞的踪迹，从而判断疗效及预测复发
④疾病易感染性的预测：糖尿病、原发性高血压、肥胖和老年痴呆症等的发病一般有多个相关基因参与，
检测这些基因的突变或表达异常情况，可作为疾病易感性的预测
⑤法医学个体鉴定：常用DNA指纹技术，排查犯罪嫌疑人、亲子鉴定、确定个体间亲缘关系。
第八章
一、当前基因治疗拟采用哪些方法？
目前基因治疗拟采用的方法有基因矫正、基因置换、基因替代、基因增补、反义核酸技术及自杀基因的应用等
二、有哪几种反义核苷酸基因失活治疗法？简述其原理
⑴反义RNA技术：反义RNA可与mRNA互补结合形成RNA/RNA双链体，阻止核糖体与启动子结合，或阻止核糖体沿mRNA上移。
⑵反基因技术：根据癌基因序列制备形成三螺旋DNA，阻止癌基因的转录
⑶特异性核酶，根据癌基因设计特异的锤头或发夹结构，催化切割、降解异常表达基因的mRNA，影响基因的翻译
三、基因治疗的基本程序是怎样的？
基本程序：⑴治疗性基因的获得⑵基因载体的选择⑶靶细胞的选择⑷将治疗性基因导入细胞内⑸转导细胞的外源基因筛检⑹回输体内
四、基因治疗药物的给药途径？
基因治疗有两种途径：即ex vivo 及in vivo 方式
①ex vivo途径：这是指将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体细胞（或异种细胞），经体外细胞扩增后，输回人体。ex vivo基因转移途径比较经典、安全，而且效果较易控制，但步骤多、技术复杂、难度大，不容易推广；②in vivo 途径：这是将外源基因装配与特定的真核细胞表达载体，直接导入体内。这种载体可以是病毒型或非病毒型，甚至是裸DNA。in vivo基因转移途径操作简便，容易推广，但目前尚未成熟，存在疗效持续时间短，免疫排斥及安全性等以系列问题
五、简述目前恶性肿瘤的基因治疗策略
⑴抑制和杀伤肿瘤细胞
⑵肿瘤细胞的基因修饰
⑶调节和增强机体的免疫功能
六、评述基因治疗的发展前景及问题
已对若干人类单基因遗传病和肿瘤开展了临床的基因治疗。遗憾的是，除部分肿瘤、ADA缺乏症和乙型血友病有一定疗效外，其余都还在实验阶段。现阶段基因治疗还存在很多理论和技术上的问题，有待进一步研究和解决，主要表现在：
⑴需要更多的切实有效地治疗基因
⑵缺乏高效特异的基因导入系统
⑶治疗基因表达缺乏可调控性，实现可调控性表达的最理想方式是模拟人体内基因本身的调控形式，如采用特异的调控元件控制基因表达的时空性
⑷安全性问题和伦理学争议等
七、查阅文献，简述单基因遗传病——进行性肌营养不良和多基因遗传病——先天性心脏病的发病机制和基因治疗策略，并设计基因治疗方案
基因治疗方案：
⑴选择该病的治病基因或与该病发生密切相关的基因，作为治疗性基因
⑵根据治疗基因的特点选择合适的治疗方法
⑶选择理想的靶细胞
⑷选择高效、特异安全的载体，将治疗基因导入靶细胞内
⑸外源基因的表达与检测
⑹疗效观察
第九章
一、显微注射法制备转基因动物的主要过程是什么？
显微注射法是利用管尖极细（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射针，将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。这种技术的长处为任何DNA在原则上均可传入任何种类的细胞内。此法已成功运用于包括小鼠、鱼、大鼠、兔子及许多大型家畜，如牛、羊、猪等基因转殖动物。
二、逆转录病毒法制备转基因动物的主要过程
以逆转录病毒作载体，把重组的逆转录病毒载体DNA包装成高滴度病毒颗粒，感染发育早期的胚胎，将外源基因导入宿主的染色体内的方法称为逆转录病毒感染法
这一方法的优点是，重组逆转录病毒可同时感染大量胚胎，感染后的整合率高；外源DNA在受体细胞基因组中的整合通常是但拷贝的；不需要昂贵的显微注射设备
本法的缺点是，由于选用的受体是早期胚胎，不是受精卵，致使外源DNA在动物各种组织中分布不均，不易整合到生殖细胞中；由于病毒衣壳大小有限，限制了被导入的外源DNA的大小，一般不超过15Kb 三、什么是ES细胞？它在转基因动物中的应用如何？
胚胎干细胞（ES细胞）是指从囊胚期的内细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，具有发育全能性，能进行体外培养扩增、转化和制作遗传突变型等遗传操作。本法以整合有外源基因的ES细胞作为供体细胞，大致过程如下：
⑴获得发育至一定时期的胚胎，经培养后，剥离和分散内细胞团，再培养，最后分离、扩散、鉴定ES细胞
⑵通过基因打靶技术，将外源基因经逆转录病毒感染、电脉冲法等方法导入ES细胞，体外培养和筛选有外源基因表达者
⑶获得囊胚期胚胎，作为ES细胞的移植受体
⑷通过显微操作将ES细胞注入到囊胚期胚胎的腔内，使之与内细胞团紧靠在一起，成为嵌合体
⑸将注射过的胚胎，经培养后筛选无发育缺损的囊胚，移植到交配第3天的假孕受体动物子宫内，培养出转基因动物。
本法外源基因整合率高，植入囊胚前筛选合适的转化的ES细胞，克服了以前只能在子代选择的缺点，并能充分利用分子生物学发展起来的各种先进方法，是很有前途的技术。缺点是不易建立ES细胞系。并且由于通过嵌合体途径，所以实验周期长。
四、转基因动物有哪些应用？
⑴可以治疗相关遗传病：转基因动物可以将人类的蛋白基因成功复制，人体缺少的基因只要植入动物体内，就可以成功地从转基因动物体内提取，这种提取的基因就是我们通常所说的基因药物——药物蛋白质。不同种类的药物蛋白质可以治各种不同的病，许多人类迄今为止所谓的绝症，如癌症、血友病等都可以因此而得到治疗
⑵可以改变动物的遗传物质而改善其的产品品质，如抗感染动物
⑶可以培养新的动物种类，等等
五、基因敲除的具体实验步骤是什么？
基因敲除的具体步骤是：首先要进行同源重组载体的设计与构建，即选择具有一定长度（5~7kb以上）与目的基因功能区域同源的序列，并插入选择性标记基因（如新霉素抗性基因neo等），以便于筛选，用电染法等方法将此同源重组载体转染靶细胞。通过药性抗性来筛选重组细胞克隆，并用PCR和Southern杂交等方法对重组细胞进行基因型鉴定，这时得到的就是单个等位基因被敲除的杂合子细胞。为建立等位基因双敲除的细胞系，则还要将单个等位基因敲除的细胞大量传代培养，然后在更高浓度的选择性培养基中多次重复筛选，并对最终得到的阳性克隆进行基因型鉴定。
六、简述利用乳腺生物反应器构建动物药厂的方法
构建乳腺特异性表达载体使用较多的启动子有牛、绵羊、山羊的珠蛋白上游调控区，例如：牛β-乳球蛋白基因启动子（bBLG），绵羊β-乳球蛋白基因启动子（oBLG），小鼠乳清酸性蛋白启动子（mWAP），大鼠乳清酸性蛋白启动子（rWAP）以及兔乳清酸性蛋白启动子（rWAP）。这些基因都比较稳定，并能在乳腺中特异性表达。将所需目的基因构建入载体，加上乳腺特异性表达载体的调控序列，转入动物胚胎细胞，使转基因动物分泌的乳汁中含有所需要药用蛋白。
由于乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进人体内循环，不会影响转基因动物本身的生理代谢反应。而且从转基因动物乳汁中获取的基因产物不但产量高，易纯化，表达的蛋白经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。因此动物乳腺被认为是生产重组蛋白的理想器官，已有多种抗胰蛋白酶、凝血因子Ⅷ、葡萄糖苷酶、胶原蛋白、血清蛋白、药用蛋白在动物乳腺中得以表达
七、简述克隆动物的方法及应用
动物克隆方法主要有两种，一是胚胎分割；二是细胞核移植。胚胎分割技术克隆胚胎一次只能得到1-4个克隆，因此潜力有限。细胞核移植技术是动物克隆的主要手段，通常所说动物克隆技术是指动物细胞核移植克隆动物的技术。用于核移植的动物细胞又分两种，一是来自早期胚胎，即胚胎细胞；二是来自成体动物的各种组织，即体细胞。用胚胎细胞克隆动物的研究开展较早，1986年第一只克隆绵羊出生：用体细胞克隆动物的研究开展较晚，难度较大，直到1997年2月“多莉”的降生，才证实了体细胞克隆动物是可能的。
高等动物体细胞克隆的成功是生物科学技术的重大突破，克隆动物的研究在探索生命的产生和发育规律的基础理论研究方面具有重要意义，在解决生产实际问题方面具有广阔的应用前景
⑴克隆技术是研究发育生物学的有力工具
⑵动物克隆技术shiite畜牧业繁育优良品种的有效手段
⑶克隆技技术用于生物反应器及异种移植器官的制备
⑷把动物克隆技术用于拯救濒危动物
分子生物学试题整理
一、植物组织培养：狭义指对植物体组织或由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养直至生成完整植株。广义：无菌操作分离植物体一部分(即外植体)接种到培养基，在人工条件下培养直至生成完整植株。生物技术中的一个基本技术。 MS：MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其营养丰富，养分的数量和比例合适，不需要添加更多的有机附加物，能满足植物细胞的营养和生理需要,因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。 愈伤组织愈伤组织callus在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在植物体切面上产生。 cDNA文库：包含细胞全部的mRNA信息的反转录所得到的cDNA的集合体。 胚状体：是指植物在离体培养条件下，非合子细胞经过胚胎发生和发育的过程形成的胚状结构，又称体细胞胚。 体细胞杂交：体细胞杂交又称体细胞融合，指将两个GT不同的体细胞融合成一个体细胞的过程。融合形成的杂种细胞，兼有两个细胞的染色体。 分子标记：是指在分子水平上DNA序列的差异所能够明确显示遗传多态性的一类遗传标记。 基因工程原称遗传工程，亦称重组DNA技术，是指采用分子生物学手段，将不同来源的基因，按照人类的愿望，在体外进行重组，然后将重组的基因导人受体细胞，使原有生物产生新的遗传特性，获得新品种，生产新产品的技术科学。 细胞培养指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。过程：①取材和除菌；②培养基的配制；③接种与培养。 生物反应器是适用于林木细胞规模化培养的装置。 生物技术biotechmlogy：也称生物工程，是指人们以现代生命科学为基础，结合其他基础学科的科学原理，采用先进的工程技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。 外植体explant：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。 植物细胞的全能性：植物每一个具有完整细胞核的体细胞，都含有植物体的全部遗传信息，在适当条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。 再分化：脱分化的分生细胞（愈伤组织）在一定的条件下，重新分化为各种类型的细胞，并进一步发育成完整植株的过程。 器官发生organogenesis：亦称器官形成，一般指脊椎动物个体发育中，由器官原基进而演变为器官的过程。各种器官形成的时间有早有晚，通过器官发生阶段，各种器官经过形态发生和组织分化，逐渐获得了特定的形态并执行一定的生理功能 体细胞胚胎发生：单细胞或一群细胞被诱导，不断再生非合子胚，并萌发形成完整植株的过程。 PCR：聚合酶链式反应是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。Recombinant DNA重组DNA：是指采用分子生物学手段，将不同来源的基因，按照人类的愿望，在体外进行重组，然后将重组的基因导人受体细胞，使原有生物产生新的遗传特性，获得新品种，生产新产品的技术科学。 细胞融合：两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。 悬浮培养：悬浮培养是细胞培养的基本方法，不仅为研究细胞的生长和分化提供了一个
分子生物学简答题
分子生物学：研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。 C值反常：也称c值谬误，指c值往往与种系进化复杂性不一致的现象，及基因组的大小与遗传复杂性之间没有必然的联系，某些较低等的生物c值却很大。DNA重组技术：又称基因工程。将不同的DNA片段按照预先的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状的技术。 GU-AG法则：多数细胞核mRNA前体中内含子的5’边界序列为GU，3’边界为AG，因此，GU表示供体衔接点的5’端，AG 表示接纳点的3’端序列，习惯上，把这种保守序列模式称为GU-AG法则。 RNA干涉：是利用双链小RNA高效，特异性降解细胞内同源MRNA，从而阻断体内靶基因的表达，使细胞内出现靶基因缺失表性的方法。 摆动假说：crick为解释反密码子中子某些稀有成分的配对（如I）以及许多氨基酸中有两个以上密码子而提出的假设。编码链/有义链：在DNA双链中，与mRNA 序列（除t/u替换外）和方向相同的那条DNA，又称有义链 模板链：指双链DNA中能够作为模板通过碱基互补原则指导mRNA前体的合成的DNA链，又称反义链 操纵子：原核生物中由一个或多个相关基因以及转录翻译调控原件组成的基因表达单元。 反式作用因子：能直接或间接识别或结合在各类顺式作用元件中核心序列上参与调控靶基因转录效率的pro。 基因定点突变：向靶DNA片段中引入所需的变化，包括碱基的添加，删除，或改变基因家族：在基因组进化中，一个基因通过基因重复发生了两个或更多的拷贝，这些基因即构成一个基因家族，是具有显著相似性的一组基因，编码相似的蛋白质产物 基因敲除技术：针对一个序列已知打包功能未知的基因，从DNA水平上设计实验，彻底破坏该基因的功能或消除其表达机制，从而推测该基因的生物学功能 基因组DNA文库：某一生物体全部或部分基因的集合，将某个生物的基因组DNA 或cDNA片段与适当的载体体外重组后，转化宿主细胞，所谓的菌落或噬菌体的集合即为…… 基因治疗：是将具有治疗价值的基因即“治疗基因“装配于带有在人体细胞中表达所必备元件的载体中，导入人体细胞，通过靶基因的表达来治疗遗传疾病 聚合酶链反应：指通过模拟体内DNA复制方式在体外选择性的将DNA某个特定区域扩增出来的 魔斑核苷酸：在应急反应过程中，由大量GTP合成的ppGpp和pppGpp，它们的主要作用可能是影响RNA聚合酶与启动子结合的专一性，诱发应急反应，帮助细菌度过难关 弱化子：原核生物操纵子中能明显减弱甚至终止转录作用的一段核苷酸序列 同工tRNA：几个代表AA，能够被一个特殊的氨酰—tRNA合成酶识别的Trna 顺式作用元件：存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，包括启动子，增强子等，本身不编码任何pro，仅提供一个作用位点，与反式作用因子相互作用参与基因表达调控 原位杂交技术：用标记的核苷酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞及染色体水平上对核苷酸进行定位和相对定量研究的手段 转座/移位：遗传信息从一个基因座转移至另一个基因座的现象，由可移问位因子介导的遗传物质的重排 管家基因：维持细胞正常生长发育的必需基因，所以细胞中均需表达的一类基因转座子：是存在染色体上的可自主复制和移位的基本单位，参与转座子易位及DNA 链整合的酶称为转座酶 原癌基因：正常细胞中与病毒癌基因具有显著同源性的基因，本身没有致癌作用，但是经过致癌因子的催化下激活成为致 癌基因，使正常细胞向恶性转化。 SP序列：mRNA中用于结合原核生物核糖 体的序列 无义突变：在蛋白质的结构基因中，一个 核苷酸的改变可能是代表某个AA的密码 子变成终止密码子（UAG UGA UAA），使 pro合成提前终止，合成无功能或无意义 的多肽，这称— 错义突变：由于结构基因中某个核苷酸的 变化使一种AA的密码子变成另外一种AA 的密码 指导RNA：与已正确编码的RNA序列互补 的一小段RNA，被用来作为向未经编辑的 RNA中插入碱基的模板。 上游启动子元件：将TATA区上游的保守 序列称为— 启动子：与基因表达启动相关的顺式作用 原件，是结构基因的重要成分。它是一段 位于转录起始位点5’端上游区大约 100~200bp以内的具有独立功能的DNA序 列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA 准确地相结合并具有转录起始的特异性。 细菌转化：是一种细菌菌株由于捕获了来 自供体菌株的DNA而导致性状特征发生 遗传改变的过程，提供转化DNA的菌株叫 做供体菌株，接受转化DNA的菌株被称作 受体菌株。 实时定量PCR技术：利用带荧光检测的 PCR仪对整个PCR过程中扩增DNA的累积 速率绘制动态变化图。 基因工程：在体外将核算分子插入病毒， 质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新 组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持 续稳定增殖能力和表达。 应答原件：能与某个（类）专一蛋白因子 结合，从而控制基因特异表达的DNA上游 序列。 增强子：是指能使与它连锁的基因转录频 率明显增加的DNA序列（1.5分）。它可 以在启动子的上游，也可以在启动子的下 游，绝大多数增强子具有组织特异性（1.0 分）。 分子伴侣：是结合其他不稳定蛋白质并稳 定其构象的一类蛋白质（1.0分）。通过 与部分折叠的多肽协调性地结合与释放， 分子伴侣促进了包括蛋白质折叠、寡聚体 装配、亚细胞定位和蛋白质降 负调控：阻遏蛋白结合在操作子位点，阻 止基因的表达。没有调节蛋白时操纵元内 结构基因是表达的，而加入调节蛋白后结 构基因的表达活性被关闭，这种调节称为 负调节。 应急因子：是指与核糖体相结合的蛋白质 RelA，当空载的tRNA进入A位时，它催 化GTP形成pppGpp或催化GDP形成 ppGpp。 信号肽：在蛋白质合成过程中N端有 15~36个氨基酸残基的肽段，引导蛋白质 的跨膜。 密码的简并性:由一种以上密码子编码同 一个氨基酸的现象称为密码的简并性 移码突变(frame-shift mutation)：在 mRNA中，若插入或删去一个核苷酸，就 会使读码发错误，称为移码，由于移码而 造成的突变、称移码突变 简答题 1原核生物与真核生物基因组的不同？ 答：原核基因组：常仅由一条环状双链DNA 分子组成，结构简单；基因组中只有一个复 制起点；具有操纵子结构，转录的RNA为多 顺反子；有重叠基因（1、基因内基因 2、部 分重叠基因 3、一个碱基重叠）;无内含子； 编码pro的DNA在基因组中所占比例较大； 结构基因为单贝 真核基因组：真核基因组庞大，一般都远 大于原核生物；真核基因组存在大量的重复 序列；真核基因组的大部分为非编码序列， 占整个基因组序列的90%以上；真核基因组的 转录产物为单顺反子；真核生物为断裂基因、 有内含子结构；真核基因组存在大量的顺式 作用原件；真核基因组中存在大量的DNA多 态性；真核基因组具有端粒结构。 2比较RNA转录与DNA复制的异同？ 答：相同：都以DNA链作为模板；合成方向 均为5’—3’；聚合反应均是通过核苷酸之间 形成的3’，5’—磷酸二酯建使核苷酸链延长 不同：复制转录 模板：两条链均复制；模板链转录（不对称 转录） 原料：dNDP ; NTP 酶：DNA聚合酶；RNA聚合酶 产物：子代双链DNA；mRNA,tENA,rRNA 配对：A---T ,G---C; A—U,T---A,G---C 引物：RNA引物；无 试比较转录与复制的区别。： 1，目的不同，所使用的酶、原料及其它辅助 因子不同，转录是合成RNA，复制是合成DNA； 2，方式不同：转录是不对称的，只在双链DNA 的一条链上进行，只以DNA的一条链为模板， 复制为半不连续的，分别以DNA的两条链为 模板，在DNA的两条链上进行；3，复制需要 引物，转录不需要引物；,4复制过程存在校 正机制，转录过程则没有；5转录产物需要加 工，复制产物不需要加工；6复制与转录都经 历起始、延长、终止阶段，都以DNA为模板， 新链按碱基互补原则，5'→3’方向合成。 3、 RNA转录的基本过程？ 转录的基本过程包括：模板识别、转录起始、 转录的延伸和终止。 模板识别：RNA聚合酶与启动子DNA双链相互 作用并与之结合； 转录起始：RNA聚合酶结合在启动子上以后， 是启动子附近的DNA双链解旋并解链，形成 转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的 碱基配对，当RNA链上第一个核苷酸键产生 标志着转录的起始，一旦RNA聚合酶成功地 合成9个以上核苷酸并离开启动子区，转录 就进入正常的延伸阶段。 转录的延伸：RNA聚合酶释放因子离开启动子 后，核心酶沿模板DNA链移动并使新生成RNA 链不断伸长，在解链区形成RNA—DNA杂合物。 转录终止：当RNA链延伸到转录终止位点时， RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯建，DNA— RNA杂合物分离，转录泡瓦解，DNA恢复成双 链状态，DNA聚合酶和RNA链都从模板上释放 出来，转录终止。 4.DNA复制的过程和机制? 答：分三个阶段：即复制的起始、延伸、终 止。 复制的起始：DNA解旋解链，形成复制叉，引 发体组装，然后在引发酶的催化下以DNA链 为模板合成一段短的RNA引物。 延伸：DNA链的延伸由DNA聚合酶催化以亲代 DNA链为模板引发体移动，从5’—>3’方向 聚合子代DNA链，前导键的合成以5’—>3’ 方向随着亲本双链体的解开而连续进行复 制，后随链在合成过程中，一段亲本DNA单 恋首先暴露出来，然后以与复制叉移动相反 方向，按5’—>3’方向合成一系列冈崎片段。 终止：当子链延伸到终止位点时，DNA复制终 止，切除RNA引物，填充缺口，在DNA连接 酶的催化下将相邻的DNA片段连接起来形成 完整的DNA长链。 5、真核生物与原核生物在翻译的起始过程中 有哪些区别？ 答：真核生物的起始tRNA是met-tRNA met 原核是fmet-tRNA fmet； 真核生物核糖体小亚基识别mRNA的帽子结 构，而原核生物通过与mRNA的SD序列结合； 真核生物小亚基先与met-tRNAmet结合再与 mRNA结合，而原核生物小亚基先与mRNA结合 再与fmet-tRNAfmet结合；真核生物有较多 的起始因子参与，且核糖体较大为80S，而原 核生物有较少的起始因子参与，且核糖体较 小为70S 6.简述蛋白质生物合成过程。，以大肠杆菌为 例： (1)氨基酸的活化：游离的氨基酸必须经过活 化以获得能量才能参与蛋白质合成，由氨酰 -tRNA合成酶催化，消耗1分子ATP，形成氨 酰-tRNA。 (2)肽链合成的起始：由起始因子参与，mRNA 与30S小亚基、50S大亚基及起始甲酰甲硫氨 酰-tRNA(fMet-tRNAt)形成70S起始复合物， 整个过程需GTP水解提供能 (3)肽链的延长：起始复合物形成后肽链即开 始延长。首先氨酰-tRNA结合到核糖体的A 位，然后，由肽酰转移酶催化与P位的起始 氨基酸或肽酰基形成肽键，tRNA f 或空载tRNA 仍留在P位．最后核糖体沿mRNA5’→3’方 向移动一个密码子距离，A位上的延长一个氨 基酸单位的肽酰-tRNA转移到P位，全部过程 需延伸因子EF-Tu、EF-Ts，能量由GTP提供 (4)肽链合成终止，当核糖体移至终止密码 UAA、UAG或UGA时，终止因子RF-1、RF-2 识别终止密码，并使肽酰转移酶活性转为水 解作用，将P位肽酰-tRNA水解，释放肽链， 合成终止。 7.试比较真核生物与原核生物mRNA转录的主 要区别。 答：转录单元：原核生物常为多顺反子转录， 真核生物常为单顺反子转录。酶：RNA聚合酶 核心酶加p因子，原核生物为RNA聚合酶Ⅱ 聚合酶加转录因子。转录产物：真核生物不 需加工与翻译相偶联真核生物需加工与翻译 分开。转录过程：无核小体的结局和组装的 过程，原核生物有核小体的结局和组成的过 程。转录终止“原核生物两种方式分别是依 赖P因子的终止和不依赖P因子的终止，真 核生物转录的终止加尾修饰同步进行。反应 部位：原核生物在类核，真核生物在核内。 8.比较原核和真核生物mRNA的区别？ 答：（1）、原核生物mRNA5’端无帽子结构，3’ 端没有或只少较短的polyA结构，真核生物 5’端存在帽子结构，3’端具有polyA尾巴. （2）、许多原核生物mRNA可能以多顺反子形 式存在，而真核生物几乎都是单顺反子(3)原 核生物mRNA的半衰期短，转录与翻译是紧密 相连的，两个过程不仅发生在同一细胞间里， 而且几乎是同步进行的，真核生物mRNA的录 翻译是发生在不同空间和时间范畴内的。(4) 原核生物以AUG作为起始密码有时以GUG， UUG作为起始密码，真核几乎永远以AUG作为 起始密码。 9.乳糖操纵子调控机理 答：是大肠杆菌中控制半乳糖苷酶诱导合成 的操纵子。包括调控元件P（启动子）和O（操 纵基因）阻遏子（I），以及结构基因lacZ（编 码半乳糖苷酶）、lacY（编码通透酶）和lacA （编码硫代半乳糖苷转乙酰基酶）。转录时 RNA聚合酶首先与启动子结合，通过操纵区向 右转录，转录从O区中间开始，按Z→Y→A 方向进行，每次转录出来的一条mRNA上都带 有这3个基因，转录的调控是在启动区和操 纵区进行的。 1、无乳糖时，调节基因lacI编码阻遏蛋白， 与操纵子基因O结合后抑制结构基因转录， 不产生代谢乳糖的酶。 2、只有乳糖存在时，乳糖可以与lac阻遏蛋 白结合，而使阻遏蛋白不与操纵基因结合， 诱导结构基因转录，代谢乳糖的酶产生以代 谢乳糖。 3、葡萄糖和乳糖同时存在时，葡萄糖的降解 产物能降低cAMP的含量，影响CAP与启动基 因结合，抑制结构基因转录，抑制代谢乳糖 的酶产生。 10、色氨酸操纵子及机制？ 答：负责色氨酸的生物合成，当培养基中有 足够的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺 乏时操纵子打开，trp基因表达，色氨酸或与 其代谢有关的某种物质在阻遏过程中起作 用。由于trp体系参与生物合成而不是降解， 它不受葡萄糖或cAMP-CAP的调控。 弱化作用：当色氨酸达到一定浓度、但还没 有高到能够活化R使其起阻遏作用的程度时， 产生色氨酸合成酶类的量已经明显降低，而 且产生的酶量与色氨酸的浓度呈负相关。先 导序列起到随色氨酸浓度升高降低转录的作 用，这段序列就称为衰减子或弱化子。在trp 操纵元中，对结构基因的转录阻遏蛋白的负 调控起到粗调的作用，而衰减子起到细调的 作用。 11.原核生物和真核生物复制的差异？ 答：原核真核 复制起点：一般为单复制起点；一般为多复 制起点 主要的酶：DNA聚合酶Ⅲ；DNA聚合酶& 单链复制叉复制速度：快；慢 复制的延伸：无核小体的解聚及诚信组装； 有核小体…… 终止：两个复制叉相遇终止复制（环形DNA）； 端粒酶复制末端完成复制（线性DNA） 12原核细胞和真核细胞在合成蛋白质的 起始过程有什么区别。 ．(1)起始因子不同：原核为IF-1，IF-2， IF-2，真核起始因子达十几种。 (2)起始氨酰-tRNA不同：原核为 fMet-tRNA f ，真核Met-tRNAi (3)核糖体不同：原核为70S核粒体， 可分为30S和50S两种亚基，真核为80S 核糖体，分40S和60S两种亚基
分子生物学问答题
1.什么是转座? 转座因子在一个DNA分子内部或者两个DNA之间不同位置 间的移动。 2.病毒基因组有哪些特点?答：不同病毒基因组大小相差较大；不同病 毒基因组可以是不同结构的核酸；除逆转录病毒外，为单倍体基因组；病毒基因组有的是连续的，有的分节段；有的基因有内含子；病毒基因组大部分为编码序列；功能相关基因转录为多顺反子mRNA有基因重叠现象。 3.原核生物基因组有哪些特点?答：基因组由一条环状双链DNA组成； 只有一个复制起始点；大多数结构基因组成操纵子结构；结构基因无重叠现象；无内含子，转录后不需要剪接；基因组中编码区大于非编码区；重复基因少，结构基因一般为单拷贝；有编码同工酶的等基因；基因组中存在可移动的DNA序列；非编码区主要是调控序列。 4.真核生物基因组有哪些特点?答：每一种真核生物都有一定的染色 体数目；远大于原核基因组，结构复杂，基因数庞大；真核生物基因转录为单顺反子；有大量重复序列；真核基因为断裂基因；非编码序列多于编码序列；功能相关基因构成各种基因家族。 5.基因重叠有什么意义?答：利用有限的核酸储存更多的遗传信息，提 高自身在进化过程中的适应能力。 6.质粒有哪些特性? 答：在宿主细胞内可自主复制；细胞分裂时恒定地 传给子代；所携带的遗传信息能赋予宿主特定的遗传性状；质粒可以转移。 7.什么是顺式作用元件? 答：基因中能影响基因表达，但不编码RNA 和蛋白质的DNA序列。顺式作用元件主要包括启动子、增强子、负调控元件等。 8.简述原核基因表达的特点。答：(1)只有一种RNA聚合酶。(2)原核 生物的基因表达以操纵子为基本单位。(3)转录和翻译是偶联进行的。(4)mR
分子生物学试题及答案
分子生物学试题及答案
分子生物学试题及答案一、名词解释 1．cDNA与cccDNA：cDNA是由mRNA通过反转录酶合成的双链DNA；cccDNA是游离于染色体之外的质粒双链闭合环形DNA。 2．标准折叠单位：蛋白质二级结构单元α－螺旋与β－折叠通过各种连接多肽可以组成特殊几何排列的结构块，此种确定的折叠类型通常称为超二级结构。几乎所有的三级结构都可以用这些折叠类型，乃至他们的组合型来予以描述，因此又将其称为标准折叠单位。3．CAP：环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMP receptor protein ），cAMP与CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMP activated protein ） 4．回文序列：DNA片段上的一段所具有的反向互补序列，常是限制性酶切位点。 5．micRNA：互补干扰RNA或称反义RNA，与mRNA序列互补，可抑制mRNA的翻译。 6．核酶：具有催化活性的RNA，在RNA的剪接加工过程中起到自我催化的作用。 7．模体：蛋白质分子空间结构中存在着某些立体形状和拓扑结构颇为类似的局部区域 8．信号肽：在蛋白质合成过程中N端有15~36个氨基酸残基的肽段，引导蛋白质的跨膜。
除了5’ 3’外切酶活性 19．锚定PCR：用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。 20．融合蛋白：真核蛋白的基因与外源基因连接，同时表达翻译出的原基因蛋白与外源蛋白结合在一起所组成的蛋白质。 二、填空 1． DNA的物理图谱是DNA分子的（限制性内切酶酶解）片段的排列顺序。 2． RNA酶的剪切分为（自体催化）、（异体催化）两种类型。3．原核生物中有三种起始因子分别是（IF-1）、（ IF-2 ）和（IF-3 ）。4．蛋白质的跨膜需要（信号肽）的引导，蛋白伴侣的作用是（辅助肽链折叠成天然构象的蛋白质）。 5．启动子中的元件通常可以分为两种：（核心启动子元件）和（上游启动子元件）。 6．分子生物学的研究内容主要包含（结构分子生物学）、（基因表达与调控）、（ DNA重组技术）三部分。 7．证明DNA是遗传物质的两个关键性实验是（肺炎球菌感染小鼠）、（ T2噬菌体感染大肠杆菌）这两个实验中主要的论点证据是：（生物体吸收的外源DNA改变了其遗传潜能）。 8．hnRNA与mRNA之间的差别主要有两点：（ hnRNA在转变为mRNA 的过程中经过剪接，）、
分子生物学问题
1.分子生物学的定义。 2.简述分子生物学的主要研究内容 广义：是研究蛋白质及核酸等生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。从分子水平阐明生命现象和生物学规律。 狭义：主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调节控制等过程 分子生物学的主要研究内容 生物大分子本质：一切生物体中的各类有机大分子都是由完全相同的单体，如蛋白质分子中的20种氨基酸、DNA及RNA中的8种碱基所组合而成的。 生物大分子结构功能(结构分子生物学) DNA重组技术(基因工程) 基因表达调控(核酸生物学) 基因组学 ?2章DNA双螺旋模型是哪年、由谁提出的?简述其基本内容。 ?1953 DNA的双螺旋结构有哪几种不同形式，各有何特点？细胞内最常见的是哪一类构象？ ?B-DNA构象： 相对湿度为92%时，DNA钠盐纤维为B-DNA构象。在天然情况下，绝大多数DNA 以B构象存在。最常见 ?A-DNA构象： 当相对湿度改变（75%以下）或由钠盐变为钾盐、铯盐，DNA的结构可成为A构象。它是B-DNA螺旋拧得更紧的状态。DNA-RNA杂交分子、RNA-RNA双链分子均采取A构象。
?Z-DNA构象： 在一定的条件下（如高盐浓度），DNA可能出现Z构象。Z-DNA是左手双螺旋，磷酸核糖骨架呈Z字性走向。不存在大沟，小沟窄而深，并具有更多的负电荷密度。Z-DNA的存在与基因的表达调控有关 第四节DNA的变性和复性 简述DNA的C-值、C-值矛盾（C Value paradox）；核小体、断裂基因 C-值是一种生物的单倍体基因组DNA的总量 ?C-值矛盾（C-value paradox)： 形态学的复杂程度（物种的生物复杂性）与C-值大小的不一致，称为C值矛盾（C-值悖理） 核小体(nucleosome)定义：用于包装染色质的结构单位，是由DNA链缠绕一个组蛋白核心构成的 简述真核生物染色体上组蛋白的种类，组蛋白修饰的种类及其生物学意义 组蛋白：H1 H2A H2B H3 H4 如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化及ADP核糖基化等。修饰作用只发生在细胞周期的特定时间和组蛋白的特定位点上。 H3、H4的修饰作用较普遍。 所有这些修饰作用都有一个共同的特点，即降低组蛋白所携带的正电荷。这些组蛋白修饰的意义：一是改变染色体的结构，直接影响转录活性；二是核小体表面发生改变，使其他调控蛋白易于和染色质相互接触，从而间接影响转录活性 、
现代分子生物学复习题
现代分子生物学复习题
现代分子生物学 一.填空题 1.DNA的物理图谱是DNA分子的限制性内切酶酶解片段的排列顺序。 2.核酶按底物可划分为自体催化、异体催化两种类型。 3.原核生物中有三种起始因子分别是IF-1、 IF-2 和IF-3 。 4.蛋白质的跨膜需要信号肽的引导，蛋白伴侣的作用是辅助肽链折叠成天然构象的蛋白质。 5.真核生物启动子中的元件通常可以分为两种：核心启动子元件和上游启动子元件。 6.分子生物学的研究内容主要包含结构分子生物学、基因表达与调控、DNA重组技术三部分。 7.证明DNA是遗传物质的两个关键性实验是肺炎球菌感染 小鼠、T2噬菌体感染大肠杆菌这两个实验中主要的论点证据是：生物体吸收的外源DNA改变了其遗传潜能。 8.hnRNA与mRNA之间的差别主要有两点： hnRNA在转变为mRNA的过程中经过剪接、 mRNA的5′末端被加上一个m7pGppp帽子，在mRNA3′ 东隅已逝 2 桑榆非晚！
末端多了一个多聚腺苷酸(polyA)尾巴。 9.蛋白质多亚基形式的优点是亚基对DNA的利用来说是一 种经济的方法、可以减少蛋白质合成过程中随机的错误对蛋白质活性的影响、活性能够非常有效和迅速地被打开和被关闭。 10.质粒DNA具有三种不同的构型分别是： SC构型、 oc 构型、 L构型。在电泳中最前面的是SC构型。 11.哺乳类RNA聚合酶Ⅱ启动子中常见的元件TATA、GC、 CAAT所对应的反式作用蛋白因子分别是TFIID 、SP-1 和 CTF/NF1 。 12.与DNA结合的转录因子大多以二聚体形式起作用，转 录因子与DNA结合的功能域常见有以下几种螺旋-转角-螺旋、锌指模体、碱性-亮氨酸拉链模体。 13.转基因动物常用的方法有：逆转录病毒感染法、DNA 显微注射法、胚胎干细胞法。 14.RNA聚合酶Ⅱ的基本转录因子有、TFⅡ-A、TFⅡ-B、 TFII-D、TFⅡ-E他们的结合顺序是： D、A、B、E 。 其中TFII-D的功能是与TATA盒结合。 15.酵母DNA按摩尔计含有32.8%的T,则A为_32.8%_,G 为_17.2%_和C为_17.2%__。 16.操纵子包括_调控基因、调控蛋白结合位点和结构基因。 17.DNA合成仪合成DNA片段时，用的原料是模板DNA 东隅已逝 3 桑榆非晚！
现代分子生物学试题
现代分子生物学试题 邯郸学院12生技 Chapter 3 生物信息的传递——从DNA到RNA 一、名词解释： 1、Transcription 2、Coding strand (Sense strand) 3、Intron 4、RNA editing 5、Messenger RNA (mRNA) 二、判断正误： 1、基因表达包括转录和翻译两个阶段 2、mRNA是以有义链为模板进行转录的 3、转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生 4、σ因子的作用是负责模板链的选择和转录的起始 5、聚合酶可以横跨40个碱基对，所以解旋的DNA区域也是40个碱基对 6、流产式起始是合成并释放2~9个核苷酸的短RNA转录物 7、启动子是有义链上结构基因5’端上游区的DNA序列 8、大肠杆菌基因中存在-10bp处的TTCACA区 9、-35区是指5’到3’方向-35区最后一个碱基离+1碱基为35个bp 10、真核基因几乎都是单顺反子 三、单选： 1、_______号帽子存在于所有帽子结构中 A、0号 B、1号 C、2号 D、以上全不是 2、在对启动子识别中起关键作用的是_______ A、α亚基 B、β亚基 C、σ因子 D、β’亚基 3、RNA聚合酶中提供催化部位的是_______ A、α+α B、α+β C、α+β’ D、β+β’ 4、_______是细胞内更新率极高不稳定的RNA A、mRNA B、rRNA C、tRNA D、snRNA 5、mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式是_______ A、5’端帽子 B、多聚腺苷酸尾 C、ρ因子 D、以上都不是 6、真核生物RNA聚合酶II所形成的转录起始复合物不包括_______ A、TBP B、TFIIA C、TFIIC D、TFIID 7、真核生物转录的所在空间是_______ A、细胞质 B、细胞核 C、核孔 D、线粒体 8、ρ因子本质上是一种_______ A、核苷酸 B、蛋白质 C、多糖类 D、碱基
分子生物学问答题1
1↓参与复制所需要的酶和蛋白因子有哪些。 2↓ (1) RNA 指导的DNA 聚合酶活性； (2) DNA 指导的DNA 聚合酶活性； (3) RNase H 的活性是指它能够从5→'3'和3→'5'两个方向水解DNA-RNA 杂合分子中的RNA 。 ↓转录与复制的区别。 (1)转录只合成与模板互补的单链（不对称转录）。 (2)转录得到的链是由NTP 组成的，而不是dNTP 。 (3)RNA 聚合酶不需要引物，可以从头起始转录。 (4)RNA 产物不与模板保持互补状态。相反，RNA 聚合酶在NTP 添加处的几个核苷酸之后，便将正在延长的链从模板上置换下来。这一置换对于同步进行的翻译至关重要，同时也使得一个基因可以同时转录成多条RNA 。 (5)转录的精确度（10-4）不如复制（10-7），因为它缺乏广泛的校正机制。 ↓简述转录延长特点。 ① 核心酶负责RNA 链延长反应； ② RNA 链从5'-端向3' -端延长，新的核苷酸都是加到3'-OH 上； ③ 对DNA 模板链的阅读方向是3'-端向5'-端，合成的RNA 链与之呈反向互补，即酶是沿着模板链的3'向5'方向或沿着编码链的5'向3'方向前进的； ④ 合成区域存在着动态变化的8 bp 的RNA-DNA 杂合双链； ⑤ 模板DNA 的双螺旋结构随着核心酶的移动发生解链和再复合的动态变化。 ↓简述细菌的转录终止机制 称为终止子（terminator ）的序列引发RNA 聚合酶从DNA 上脱离并释放已合成的RNA 链。细菌有两种类型的终止子。 Rho 非依赖型终止子或称固有终止子，通过其转录产物形成的发夹结构而终止转录。 Rho 依赖型终止子需要一个称为Rho 的蛋白质来诱发终止反应。 ↓逆转录酶和逆转录过程； 逆转录酶：能催化以RNA 模板合成双链DNA 的酶，全称依赖RNA 的DNA 聚合酶； 逆转录过程：分三步：首先是逆转录酶以病毒基因组RNA 为模板，催化d ＮTP 聚合生成DNA 互补链，产物是RNA/DNA 杂化双链；然后，杂化双链中的RNA 被逆转录酶中有RNase 活性的组分水解，被感染细胞内的Rnase Ｈ（Ｈ＝Ｈybrid ）也可水解RNA 链。RNA 分解后剩下的单链DNA 再用做模板，由逆转录酶催化合成第二条DNA 互补链。 ↓原核生物的转录过程； 一、转录起始需要RNA 聚合酶全酶;1. RNA 聚合酶全酶(α2ββ'σ)与模板结合，形成闭合转录复合体；2. DNA 双链局部解开，形成开放转录复合体；3. 在RNA 聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物： 二、 RNA pol 核心酶独立延长RNA 链;1. σ亚基脱落，RNA –pol 聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA 模板前移；2. 在核心酶作用下，NTP 不断聚合，RNA 链不断延长。 三、原核生物转录延长与蛋白质的翻译同时进行; 四、原核生物转录终止分为依赖ρ(Rho)因子与非依赖ρ因子两大类;转录终止指RNA 聚合酶在DNA 模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA 链从转录复合物上脱落下来。 ↓真核生物的转录终止； 真核生物的转录终止和加尾修饰同时进行. 真核生物转录终止，和转录后修饰密切相关。转录不是在poly A 的位置上终止，而是超出数百个乃至上千个核苷酸后才停顿。在读码框架的下游，常有一组共同序列AATAAA ，再下游还有相当多的GT 序列。这些序列称为转录终止的修饰点。 ↓试述转录因子的分类及其作用特点。 一、通用转录因子，是RNA 聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白因子，决定三种RNA(mRNA 、tRNA 及rRNA)转录的类别。 二、特异转录因子，为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达。 ↓细胞内信号转导分子种类。 （1）第二信使：在细胞内传递信息的小分子物质，如：Ca2+、DAG 、IP3、Cer 、cAMP 、 cGMP 、花生四烯酸及其代谢产物等。环核苷酸是重要的细胞内第二信使。 特点：①分子的浓度或分布在细胞外信号作用下发生迅速改变； ②类似物可模拟细胞外信号的作用； ③阻断该分子的变化可阻断细胞对外源信号的反应。 ④作为别位效应剂在细胞内有特定的靶蛋白分子。 （2）许多酶可通过其催化的反应而传递信号，作为信号转导分子的酶主要有两大类。 ①催化小分子信使生成和转化的酶，如腺苷酸环化酶、鸟苷酸环化酶、磷脂酶C 、 磷脂酶D （PLD ）等 ②蛋白激酶，作为信号转导分子的蛋白激酶主要是蛋白酪氨酸激酶和蛋白丝/苏氨酸 激酶。 ↓Ca2+在信息传递中如何发挥作用? 一、Ca 2+能与胞浆内的PKC 结合聚集至质膜，在DAG 和膜磷脂共同诱导下，PKC 被激活。 二、可激活钙离子／钙调蛋白依赖的蛋白激酶(Ca 2 ／ CaM-PK)。 三、可与细胞内其它钙结合蛋白结合，直接导致其构象改变，而表达其信息效应。 ↓试述cAMP 信息传递途径。 cAMP －PKA 途径-活化：①信号分子与受体结合，引起受体构象变化②受体活化G 蛋白（结合GTP ，α与βγ解离）③活化后的G 蛋白激活腺苷酸环化酶（AC ）④AC 催化ATP 生成cAMP ⑤cAMP 活化PKA （依赖cAMP 的蛋白激酶）⑥PKA 使目标蛋白磷酸化，调节代谢酶的活性或调节基因的表达 cAMP －PKA 途径-失活：信息分子与受体解离，受体失活→G 蛋白失活（GTP 被水解成GDP ，αβγ亚基重新聚合）→AC 失活→cAMP 被磷酸二酯酶水解→PKA 失活。 ↓IP3、DG 在信号转导中的作用； 由PIP2水解产生的IP3是水溶性的小分子物质，离开细胞膜后能在细胞质内很快地扩散， IP3与内质网膜上的特异Ca2+-通道结合后，就能使内质网腔里的Ca2+释放到细胞质，而且释放的Ca2+具有正反馈效应，即释出的Ca2+结合到Ca2+通道，再促进Ca2+释放。 DG 的重要作用是激活蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)，PKC 是一类Ca2+依赖的蛋白激酶，能使选择性的靶蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化。因IP3作用升高的细胞质内Ca2+能使PKC 从细胞质转移到细胞膜胞质面。在Ca2+，DG 和细胞膜磷脂成分中的磷脂酰丝氨酸的共同作用下激活PKC 。哺乳动物中脑细胞的PKC 浓度最高，其作用是使神经细胞的离子通道蛋白磷酸化，从而改变神经细胞膜的兴奋性。在许多细胞中，PKC 能通过激活磷酸化级联反应，最后使一些转录因子磷酸化并激活，从而调控相关基因的表达。 ↓酵母双杂交原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N 端有一个由147个氨基酸组成的DNA 结合域(BD)，C 端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(AD)。GAL4分子的DNA 结合域可以和上游激活序列(UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS 下游的基因进行转录。但是，单独的DNA 结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS 的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 ↓翻译机器的组成及其作用。 翻译机器由4种基本成分组成：mRNA 、tRNA 、氨基酰-tRNA 合成酶和核糖体。 在遗传信息传递中，翻译远比DNA 到RNA 的转录复杂，因为mRNA 不可能直接作为模板指导多肽链的合成。 (1)mRNA 的蛋白编码区由称为密码子的三核苷酸单位组成，密码子决定氨基酸的顺序。 (2)tRNA 介导氨基酸与密码子的相互作用。 (3)氨基酰-tRNA 合成酶使氨基酸与tRNA 结合起来。 (4)核糖体协调mRNA 与tRNA 的识别，并催化肽键的合成。 ↓叙述使翻译生成的新生多肽链成为有功能的蛋白质所需要经过的加工步骤。 加工步骤包括：化学修饰、折叠、亚基聚合等，其中最重要的是折叠。蛋白质合成后经靶向运输到达细胞的特异空间。 （1） 氨基酸残基的化学修饰：个别氨基酸可进行甲基化和乙酰化修饰；蛋白质糖 基化是一种复杂的化学修饰； 某些蛋白质加入异戊二烯基团；结合蛋白质加入辅基； 大多数蛋白质有二硫键的形成。 （2）肽链的折叠是按等级进行的： ① 在数毫秒内二级结构即沿多肽链形成。蛋白形成紧密但未折叠的结构，将其疏水基团置于内部，与水隔离； ② 其后的数秒或数分钟内，二级结构相互作用，通常经过一系列中间体构象，三级结构逐渐成形。 ③ 多肽链通过非极性残基间疏水作用的介导，自动折叠成一个称之为“熔球”的紧密结构。 ↓遗传密码的特点； 1.方向性:翻译时遗传密码的阅读方向是5'→3'，即读码从mRNA 的起始密码子AUG 开始，按5'→3'的方向逐一阅读，直至终止密码子。 2.连续性:编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码子及密码子的各碱基之间既无间隔也无交叉。 3.简并性:一种氨基酸可具有2个或2个以上的密码子为其编码。这一特性称为遗传密码的简并性。 4.摆动性:反密码子与密码子之间的配对有时并不严格遵守常见的碱基配对规律，这种现象称为摆动配对; 5.通用性:从简单的病毒到高等的人类，几乎使用同一套遗传密码，因此，遗传密码表中的这套“通用密码”基本上适用于生物界的所有物种，具有通用性。 ↓试述（乳糖）操纵子的组成和功能。 大肠杆菌乳糖操纵子含Z 、Y 、A 三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵元件O ，一个启动子P 和一个调节基因I （是调节基因，编码产生阻遏蛋白）。 ↓试述乳糖操纵子的负性、正性调节机制。 一、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I 基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O 处，抑制RNA 聚合酶与启动子结合，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。 二、CAP 的正性调节：lac 启动子是弱启动子，在启动子上游有CAP 结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP 浓度升高，与CAP 结合，使CAP 发生变构，CAP 结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP 结合位点，激活RNA 聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。 ↓以乳糖操纵子例，说明细菌基因表达的调控原理； 1、乳糖操纵子（lac operon ）的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z 、Y 、A 三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵元件O ，一个启动子P 和一个调节基因I （是调节基因，编码产生阻遏蛋白）。 2、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I 基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O 处，抑制RNA 聚合酶与启动子结合，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。 3、CAP 的正性调节：lac 启动子是弱启动子，在启动子上游有CAP 结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP 浓度升高，与CAP 结合，使CAP 发生变构，CAP 结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP 结合位点，激活RNA 聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。 4、协调调节：乳糖操纵子中的I 基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP 的正调控两种机制，互相协调、互相制约。 ↓当培养基中葡萄糖和乳糖共同存在时，细菌先利用哪一种糖？为什么? 1）乳糖操纵子由启动子、操作基因和编码β-半乳糖苷酶、通透酶和乙酰基转移酶的结构基因组成(这三个酶参与乳糖代谢)。若葡萄糖和乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。 2）当葡萄糖存在时，其代谢产物使得cAMP 的浓度降低，使CAP 处于失活状态(其不能单独结合于CAP 位点)，RNA 聚合酶不能结合于乳糖操纵子上，使得三个酶的基因不能转录，从而细菌也不能利用乳糖。葡萄糖对Lac 操纵子的阻遏作用称为分解代谢阻遏。
(完整版)分子生物学复习题及其答案
一、名词解释 1、广义分子生物学：在分子水平上研究生命本质的科学，其研究对象是生物大分子的结构和功能。2 2、狭义分子生物学：即核酸（基因）的分子生物学，研究基因的结构和功能、复制、转录、翻译、表达调控、重组、修复等过程，以及其中涉及到与过程相关的蛋白质和酶的结构与功能 3、基因：遗传信息的基本单位。编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的遗传信息的基本单位，是染色体或基因组的一段DNA序列(对以RNA作为遗传信息载体的RNA病毒而言则是RNA序列)。 4、基因：基因是含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，包含产生一条多肽链或功能RNA 所必需的全部核苷酸序列。 5、功能基因组学：是依附于对DNA序列的了解，应用基因组学的知识和工具去了解影响发育和整个生物体的特定序列表达谱。 6、蛋白质组学：是以蛋白质组为研究对象，研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学。 7、生物信息学：对DNA和蛋白质序列资料中各种类型信息进行识别、存储、分析、模拟和转输 8、蛋白质组：指的是由一个基因组表达的全部蛋白质 9、功能蛋白质组学：是指研究在特定时间、特定环境和实验条件下细胞内表达的全部蛋白质。 10、单细胞蛋白：也叫微生物蛋白，它是用许多工农业废料及石油废料人工培养的微生物菌体。因而，单细胞蛋白不是一种纯蛋白质，而是由蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸及不是蛋白质的含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团。 11、基因组：指生物体或细胞一套完整单倍体的遗传物质总和。 12、C值：指生物单倍体基因组的全部DNA的含量，单位以pg或Mb表示。 13、C值矛盾：C值和生物结构或组成的复杂性不一致的现象。 14、重叠基因：共有同一段DNA序列的两个或多个基因。 15、基因重叠：同一段核酸序列参与了不同基因编码的现象。 16、单拷贝序列：单拷贝顺序在单倍体基因组中只出现一次，因而复性速度很慢。单拷贝顺序中储存了巨大的遗传信息，编码各种不同功能的蛋白质。 17、低度重复序列：低度重复序列是指在基因组中含有2～10个拷贝的序列 18、中度重复序列：中度重复序列大致指在真核基因组中重复数十至数万（<105）次的重复顺序。其复性速度快于单拷贝顺序，但慢于高度重复顺序。 19、高度重复序列：基因组中有数千个到几百万个拷贝的DNA序列。这些重复序列的长度为6~200碱基对。 20、基因家族：真核生物基因组中来源相同、结构相似、功能相关的一组基因，可能由某一共同祖先基因经重复和突变产生。 21、基因簇：基因家族的各成员紧密成簇排列成大段的串联重复单位，定位于染色体的特殊区域。 22、超基因家族：由基因家族和单基因组成的大基因家族，各成员序列同源性低，但编码的产物功能相似。如免疫球蛋白家族。 23、假基因：一种类似于基因序列，其核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同、但却不能合成功能蛋白的失活基因。 24、复制：是指以原来DNA（母链）为模板合成新DNA（子链）的过程。或生物体以DNA/RNA