乳腺癌细胞培养
MCF-7 就是一种很好养的人乳腺癌细胞,培养基用DMEM或RPMI1640均可, 10－15％的小牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基,加入0、25％的胰酶1ml,轻轻晃动培养瓶,使胰酶流遍瓶壁,以去除残余的培养基。再加入2ml胰酶(25ml培养瓶)静置消化2－5min,待细胞缩起变圆,将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗,而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用,感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快,一般不放到培养箱中消化,以免消化太过。需要注意的就是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起,一般都来不及抢救。
MDA-MB-231人乳腺癌细胞
细胞中文名称人乳腺癌细胞
细胞英文名称 MDA-MB-231
物种人
细胞形态特征上皮样
细胞生长特性贴壁生长
细胞特种特性 MDA-MB-231就是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体与WNT7B癌基因
培养基 L15: Leibovitz Medium
血清 10%FBS
细胞传代方法 1:2~1:4传代;每周2~3次
细胞传代情况 C5
细胞冻存条件MDA-MB-231 人乳腺癌细胞基础培养基+5%DMSO+20%FBS
支原体检测阴性
说明
培养基:DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10%
培养条件:37℃ 5% CO2
消化条件:0、25% (w/v) Trypsin-0、53mM EDTA溶液,消化5-10min
传代的比例:1:2~1:4
换液时间:2~3天换液一次
冻存液比例:85%培养基,10%FBS, 5% (v/v) DMSO
冻存密度:1-2 ×10 6/管,液氮保存
MDA-MB-231 人乳腺癌细胞复苏方法:取出冻存管后,投入37 ℃水浴中,震荡解冻2 min,酒精消毒管壁外侧后,将其转入超净台中,将管内细胞转移至离心管中,加入5 ml 37 ℃预热的培养基,并清洗冻存管一次,将离心管离心(1000 rpm,5 min),弃去上清液,再加入2 ml培养基,转入培养瓶中培养。
产品名称:人正常乳腺细胞 Hs 578Bst
规格:70%密度的25cm2培养瓶的细胞一瓶
特点:细胞代数为4-5代左右
包装:内层无菌自封袋;专用防压泡沫盒;外层防压保温气泡袋;说明书
细胞来源:ATCC、sciencell、ICLC
货期:1-2周
运输方式:快递运输
售后:收到细胞后7天,如发现细胞有质量问题(如污染,死亡,快递运输等原因)时,应出具书面质量问题报告并及时传真或E-mail致销售人员,我们将尽快为您解决。
细胞培养常见问题分析
细胞培养
1、冷冻管应如何解冻？
取出冷冻管后,须立即放入37 ℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化,并注意水面不可超过冷冻管盖沿,否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时,必须注意安全,预防冷冻管之爆裂。
2、细胞冷冻管解冻培养时,就是否应马上去除DMSO？
除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外,绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞),在解冻之后,应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中,待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可,如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
3、可否使用与原先培养条件不同之培养基？
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基,若骤然使用与原先提供之培养条件不同之培养基,细胞大都无法立即适应,造成细胞无法存活。
4、可否使用与原先培养条件不同之血清种类？
不能。血清就是细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的种类与品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清,在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。
5、何谓FBS, FCS, CS, HS ?
FBS (fetal bovine serum)与FCS (fetal calf serum)就是相同的意思,两者都就是指胎牛血清, FCS 乃错误的使用字眼,请不要再使用。CS (calf serum)则就是指小牛血清。HS (horseserum)则就是指马血清。
6、培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？
一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统,而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3、7 g 时,细胞培养时应使用10 % CO2;当培养基中NaHCO3 为每公升1、5 g 时,则应使用5 % CO2 培养细胞。
7、何时须更换培养基？
视细胞生长密度而定,或遵照细胞株基本数据上之更换时间,按时更换培养基即可。
8、培养基中就是否须添加抗生素？
除于特殊筛选系统中外,一般正常培养状态下,培养基中不应添加任何抗生素。
9、附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？
一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0、05% trypsin-0、53mMEDTA、4 Na。次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于–20 ℃,避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低,并可减少污染之机会。
10、悬浮性细胞应如何继代处理？
一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中,稀释细胞浓度即可,若培养液太多时,可将培养角瓶口端稍微抬高,直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶,加入新鲜培养基稀释至适当浓度,重复前述步骤即可。
11、欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速？
欲回收动物细胞,其离心速率一般为300xg (约1,000rpm),5 - 10 分钟,过高之转速,将造成细胞死亡。
12、细胞之接种密度为何？
依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦就是造成细胞无法生长之一重要原因。
13、细胞冷冻培养基之成份为何？
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基就是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide)与90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意:由于DMSO 稀释时会放出大量热能,故不可将DMSO 直接加入细胞液中,必须使用前先行配制完成。
14、DMSO 之等级与无菌过滤之方式为何？
冷冻保存使用之DMSO 等级,必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650),其本身即为无菌状况,次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于4°C,避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质,并可减少污染之机会。若要过滤DMSO,则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。
15、冷冻保存细胞之方法？
冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃30~60 分钟→(-20 ℃30 分钟*) → -80 ℃16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase长期储存。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃至–80 ℃以下,再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 ℃不可超过1 小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
15、细胞欲冷冻保存时,细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial,融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。16、应如何避免细胞污染？
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒与霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技
术不当、操作室环境不佳、污染之血清与污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源与培养基配制就是减低污染之方法。
17、如果细胞发生微生物污染时,应如何处理？
加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。
18、支原体(mycoplasma)污染的细胞,就是否能以肉眼观察出异状？
不能。除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株,无法以其外观分辨之。
19、支原体污染会对细胞培养有何影响？
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数,代谢及研究之任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。
20、CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？
定期(至少每两周一次)以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
21、为何培养基保存于4 ℃冰箱中,颜色会偏暗红色,且pH值会越来越偏碱性？
培养基保存于4 ℃冰箱中,培养基内之CO2 会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果,将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时,可以通入无菌过滤之CO2,以调整pH 值。
22、各种细胞培养用的dish,flask就是否均相同？
不同厂牌的dish 或flask,其所coating 的polymer 不同,制造程序亦不同,虽对大部分细胞没有太大之影响,惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。23、购买之细胞冷冻管经解冻后,为何会发生细胞数目太少之情形？购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？
研究人员在细胞培养时出现存活率不佳,常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质
不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后,加以洗涤细胞与离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80℃太久。
24、收到之冷冻管瓶身破裂,瓶盖有裂纹,或瓶盖脱落之原因？
冷冻管瓶盖裂纹,或瓶身破裂,可能就是因为操作者夹取冷冻管时用力不当,造成冷冻管裂损,建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱,乃因热胀冷缩之物理现象,冷冻管有可能因此而造成细胞污染,故冷冻管于放入与取出液氮桶时,均应立刻将冷冻管再一次扭紧。25、如何选用特殊细胞系培养基？
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养就是一个好的开始,各种目的无血清培养首选AIM V(12005)培养基(SFM)。
26、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要不？它在溶液中不稳定不？
L-谷氨酰胺在细胞培养时就是重要的。脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成与核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但就是确切的