22 生物化学实验--纸层析法测定肝组织的转氨基作用
纸层析法测定肝组织的转氨基作用
【目的】
1 ．掌握纸层析法的原理和方法。
2 ．熟悉相关转氨酶的临床意义。
【原理】
转氨基作用是氨基酸代谢的一个重要反应。在转氨酶作用下，将氨基酸的氨基转移到α- 酮酸上。每种转氨基反应均由专一的转氨酶催化。转氨酶广泛分布于机体各器官、组织，例如肝细胞中存在的丙氨酸氨基转移酶，能催化α- 酮戊二酸与丙氨酸之间的转氨基作用。反应式如下：
纸层析是以滤纸作为支持物，与滤纸纤维素结合的水（约占纸重 20 ～ 30 ％）称为层析中的“固定相”。另一种和固定相不能混合或部分混合的溶剂则为“流动相”。把欲分离的物质加在纸的一端，并使流动相借滤纸的毛细现象移动，此时，待分离溶质因分配系数不同而逐渐分布于滤纸的不同部位。层析过程中或层析结束时，用显色剂使被分离的物质显出颜色，成为一个个色斑。分配在固定相中趋势较大的成分在纸上随流动相移行的速度就小，色斑距原点的位置就较近。反之，分配在固定相内趋势较小的成分移行就远，色斑位置离原点也远。溶质在纸上的移动速率可用比移（R f ）表示：
同一氨基酸在相同的层析条件下 R f 值相同，不同氨基酸在相同层析条件下 R f 值不同，因此可以根据 R f 值来鉴定被分离的氨基酸。层析时，用显色剂茚三酮使氨基酸显色，将样品氨基酸的 R f 值与标准氨基酸的 R f 值比较，即可确定所分离氨基酸的种类。
【器材】
1 ．研钵
2 ．剪刀
3 ．恒温水浴
4 ．点样毛细管
5 ．漏斗
6 ．表面皿或小平皿
7 ．新鲜动物肝脏
8 ．直径 10cm 圆型新华滤纸
9 ．中试管和小试管
10 ．电炉或吹风机或烘箱
11 ．直径 10cm 的培养皿
【试剂】
1 ． 0.2mol/L ， pH7.4 磷酸缓种液
Na 2 HPO4 溶液 81ml 与 0.2mol/L NaH 2 PO4 溶液 19ml 混匀，再用蒸馏水稀释 20 倍。
2 ． 0.1mol/L 丙氨酸溶液
称取丙氨酸 0.891g 先溶于少量 pH7.4 磷酸盐缓冲液中，以 0.1mol/LNaOH 仔细调节至 pH7.4 后，用磷酸缓冲液加至 100ml 。
3 ． 0.1mol/L 谷氨酸溶液
称取谷氨酸 0.735g ，先溶于少量 pH7.4 磷酸缓冲液中，以 1mol/LNaOH 仔细调节至 pH7.4 后，用磷酸缓冲液加至 50ml 。
4 ． 0.1mol/L α- 酮戊二酸溶液
称取α- 酮戊二酸 1.46g 先溶于少量 pH7.4 磷酸缓冲液中，以 1mol/L NaOH 仔细调至 pH7.4 后，用磷酸缓冲液加至 100ml 。
5 ．层析剂（展开剂）
取 100ml 重蒸苯酚与 25ml 水摇匀，加入茚三酮使终浓度达 0.1% 。
【操作】
1 ．酶液制备
取新鲜的动物肝脏 1g ，放入研钵中用剪刀剪碎，取 9ml 冰冷 pH7.4 磷酸缓冲液，先加 2ml ，迅速研磨成匀浆，再加入 7ml 。
2 ．保温（酶促反应）
取干燥中试管 2 支，分别标明测定与对照，各加入肝匀浆 0.5ml 。测定管放入37℃ 水浴保温 10min ，对照管放入沸水浴中煮 10min ，冷却后于两管中分别加入 0.1mol/L 丙氨酸溶液 0.5ml ， 0.1mol/Lα- 酮戊二酸 0.5ml ， pH7.4 磷酸缓冲液 1.5ml ，摇匀，放37℃ 水浴保温 1h ，保温完毕，立即将测定管放入沸水浴中煮 10min 以终止反应，取出冷却后，将测定管和对照管分别过滤，收集滤液于小试管中备用，并分别标明测定与对照。
3 ．层析与显色
取直径为 10cm 的圆型新华滤纸一张，用圆规作半径为 0.5cm 的同心圆，通过圆心作三条夹角分别为60℃ 的直线（图 3-10 ），与同心圆相交叉为 6 个交点，按顺时针标记各点。在 1 、 4 两点分别点 0.1mol/L 丙氨酸溶液和
0.1mol/L 谷氨酸溶液 2 次。方法是用毛细点样管在滤纸上点样，注意斑点不要太大（一般直径约 0.3cm ），而且每点 1 次待晾干后再点第 2 次。照此方法，在 2 、 5 处各点测定管过滤液 3 次，在 3 、 6 两处各点对照管过滤液 3 次。
图 3-10 层析点样示意图
在滤纸圆心处打一小孔（如铅笔芯大小），另取同类滤纸约 1cm 2 , 下一半剪成须状，卷成圆筒如灯芯，插入小孔，稍突出滤纸面即可。
将层析剂放入直径为 3 ～ 5cm 的干燥表面皿或小平皿中，表面皿或小平皿管置于直径为 10cm 的培养皿中，将要层析的滤纸平放在培养皿上，滤纸芯浸入溶剂中，而后在其上再盖一培养皿以封闭（图 3-11 ），这时可见层析溶剂沿滤纸芯上升到滤纸，再向四周扩散，约 45min 后，等溶剂前缘距滤纸边缘 1cm 时即可取出，用电炉烤干或吹风机吹干或在60℃ 烘箱中烘干，此时可见紫色的同心弧色斑出现，比较色斑的位置，计算各斑点物质的 R f 值，分析实验结果。
若两人一组，可将层析滤纸沿 1 、 4 直线裁开，两人分别保存留用。
图 3-11 层析示意图
【注意事项】
1 ．滤纸芯卷得不要太紧，且要呈圆筒状，否则，展层不呈圆形。
2 ．在点样前应将手洗净，手只能拿滤纸的边缘，以免手指的汗迹等污染显色，影响对结果的观察分析。
3 ．若用第一种展开剂，展层完毕，要划出溶剂前缘的轮廓，然后再干燥之，以便计算 R f 值。
4 ．展开剂在滤纸上的各个方向上移动的速度不完全相同。如顺纹理方向溶剂移动的速度要快一些。因此，计算 R f 值时不能一概而论。
【思考题】
1 ．测定 R f 值的意义是什么？
2 ．纸层析法分离氨基酸的原理是什么？
3 ．本实验中固定相．流动相各是什么？
氨基酸的纸层析法
氨基酸的纸层析法 一、实验目的 了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 二、实验原理 以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值） Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。 用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有甘氨酸、苯丙氨酸组成。 三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 四、实验试剂 1、混合氨基酸 2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中 五、实验步骤 1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画两个圆点（原点）。 2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在上面两个点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。 3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层（大约2~3小时）。 4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干（或烘箱60℃）烘干。 5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。 6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。 7、量取数值，计算各自的Rf值，与表中标准氨基酸Rf值比较，确定样品氨基
纸层析法分离氨基酸实验报告
纸层析法分离氨基酸 一、前言 纸层析法 纸层析法又称纸色谱法，是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。它是一种以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离(Rf值)与已知样比较，进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量(如光度法、比色法等)。 纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定;也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。
在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC应用普遍。 做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎，浸出绿色液体，将液体与层析液(石油醚)混合，将滤纸一段进入混合液体，四种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下4条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。 纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离，叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b，它们在层析液中的溶解度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快，反之则慢;含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下4条色素带，所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中的色素分离。 氨基酸 氨基酸是构成蛋白质的基本单位，广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为2l世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，品种变更越来越快，工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为100万吨，而需求总量是800万吨。我国自20世纪60年代起，氨基酸的应用在食品工业占61,，在饮料工业占30,，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。 氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用: （1）在食品行业的应用 （2）在医药工业的应用
浙江理工大学氨基移换反应产物的鉴定实验报告
氨基移换反应产物的鉴定 姓名：俞清专业班级：13国贸（全英文）上课时间：周二晚上一、背景知识 在氨基移换酶的催化下，氨基酸的α—氨基和α—酮酸的α—酮基可以互换，这种反应称为氨基移换反应。它对于生物体内的各大类物质的代谢在相互联系、相互转化上起着很重要的作用。转氨酶的种类很多，具有专一性，最适合的PH接近7.4。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中，在肝、心、肾等组织中的谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）活性较高。本实验利用纸层析法，检查由α—酮戊二酸和丙氨酸在酶的作用下所生成的谷氨酸，从而定性证明组织内的氨基移换作用。 二、实验方法 1、制备转氨酶液 2．氨基溶液制备 3．层析及显色：取滤纸一张，用铅笔进行6等分。找出圆心，用画一直径2 cm 的细圆圈，在圆心处截一小孔（孔径约0.2 cm）。在点样点的圆圈内用铅笔轻轻标记样品号，取毛细管依次在原点上点样，各点3次；点样时，要待前次点样干燥后方可再次点样，点样直径不超过0.3 cm。安装灯芯，层析结束，取出滤纸，用镊子拔出灯芯，滤纸用电吹风吹干，再用喷雾器向滤纸均匀喷洒0.3%茚三酮-丙酮溶液，烘干后分析比较实验结果。 三、结果与分析 1．氨基酸层析图谱：
2．氨基酸层析图谱的分析： 1号反应管：有丙氨酸和谷氨酸两条显色带。 2号反应管：只有一条丙氨酸的显色带，没有发生氨基移换反应。 3号反应管：没有出现显色带，没有发生氨基移换反应 4号反应管：只有一条丙氨酸的显色带，没有发生氨基移换反应。 谷氨酸标准品：出现一条圆弧状的紫红色显色带。 丙氨酸标准品：出现一条圆弧状的紫红色显色带。 优秀良好中等及格不及格 成 绩
实验四-氨基酸的纸层析法
姓名：郭沈杰年级专业：2012级生物科学同组者：蔡萍萍 学号：12050011012 实验四氨基酸的纸层析法 一、实验目的 了解并掌握氨基酸纸层析法的原理和方法。 二、实验原理 以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为固定相，它与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。 在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（R f值） R f=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 氨基酸无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。
本实验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、苯丙氨酸。 三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 8、铅笔 9、直尺 四、实验试剂 1、精氨酸、苯丙氨酸、混合氨基酸（精氨酸、苯丙氨酸） 2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中 五、实验步骤 1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，在上面相同间隔画3圆点（原圈直径约5mm）。 2、取毛细管3支，分别吸取精氨酸、苯丙氨酸、氨基酸混合液少许，在原圈处点样，样点
实验六 纸层析法观察转氨基作用 实验报告
实验六纸层析法观察转氨基作用 【实验名称】：纸层析法观察转氨基作用 09救援一班第三大组李岚宇2009222336 室温：28° （一）实验目的： 1、学习氨基酸纸层析的基本原理。 2、掌握氨基酸纸层析的操作原理。 （二）实验原理： 转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应，在转氨酶的催化下，氨基酸的а-酮酸与α-酮基的互换反应称为转氨基作用。转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的α－氨基转移到另一α－酮基酸上。各种转氨酶的活性不同，其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化如下反应： α—酮戊二酸+ 丙氨酸 ? ?→ ←ALT 谷氨酸+ 丙酮酸 本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，用纸层析法检查谷氨酸的出现，以证明转氨基作用。纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲合力强，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。有机溶剂与水不相溶，把预分离物质加到滤纸的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配。由于物质分配系数的差异，而使移动速度就不一样，在固定相中，分配趋势较大的组分，随流动相移动的速度就慢，反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度快，最终不同的组分彼此分离，物质在纸上移动的速率可以用比值Rf表示： 物质在一定的溶液中的分配系数是一定的，故比值Rf也相对稳定，因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴定被分离的物质。 （三）实验材料与仪器： 试剂： 1、0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液。 2、0.2mol/L Na2HPO4溶液81ml与0.2mol/L NaH2PO4溶液19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍。 3、0.1mol/L丙氨酸溶液称取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0 N NaOH仔细调至pH7.4后, 加磷酸盐缓冲液至100ml。 4 、0.1mol/Lα－酮戊二酸称取α－酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0 N NaOH仔细调至pH 7.4 后，加磷酸盐缓冲液至100ml。 5、0.1mol/L 谷氨酸溶液称取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0 N NaOH仔细调至pH 7.4 后, 加磷酸盐缓冲液至50 ml。 6、0.5%茚三酮溶液称取茚三酮0.5克于100 ml丙酮中溶解。 7、层析溶剂：将重蒸过的酚2份和水1份按比例混合后，放入分液漏斗中，震荡，静置24小时后分层，将下部酚层转移到瓶中备用。 仪器：玻璃匀浆器、10ml试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、37℃恒温水浴箱、9cm圆滤纸、烘箱、手术剪刀、分液漏斗。
【实验报告】纸层析的实验报告
纸层析的实验报告 前言 纸层析法纸层析法又称纸色谱法，是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。它是一种以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离（Rf值）与已知样比较，进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量（如光度法、比色法等）。 纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤 纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。 在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC应用普遍。在
做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎，浸出绿色液体，将液体与层析液（石油醚）混合，将滤纸一段进入混合液体，四种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下4条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。 纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离，叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b，它们在层析液中的溶解度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快，反之则慢；含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下4条色素带，所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中的色素分离。 氨基酸氨基酸是构成蛋白质的基本单位，广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为2l世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，品种变更越来越快，工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为100万吨，而需求总量是800万吨。我国自20世纪20xx年代起，氨基酸的应用在食品工业占61％，在饮料工业占30％，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。 氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用： (1)在食品行业的应用 (2)在医药工业的应用 (3)在饲料添加剂行业的应用 (4)在化妆品行业的应用 (5)在农业上的应用 (6)在其他行业的应用
实验十六 转氨基作用
实验十六转氨基作用 【目的】 氨基酸的转氨作用在体内所有器官组织几乎都能进行，但不同的组织器官ALT（GPT）的活性大小不同。 【原理】 丙氨基酸与α-酮戊二酸在Ph7.4时，经ALT催化进行转氨基作用生成丙酮酸和谷氨酸。丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用，生成棕红色丙酮酸2，4-二硝基苯腙，用颜色深浅表示酶活性大小。本实验以肝和肌进行比较。 ALT 丙氨酸 + α–酮戊二酸谷氨酸 + 丙酮酸 37℃ 丙酮酸 + 2,4 –二硝基苯肼丙酮酸二硝基苯腙（棕红色） 【试剂】 1．0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4） 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.928g,磷酸二氢钾(KH2PO4)2.176g加蒸馏水溶解并稀释至1000ml。 2．ALT基质液 称取DT-丙氨酸1.79g, α-酮戊二酸29.2mg于烧瓶中,加0.1 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液80ml,煮沸溶解后待冷,用1mol/L NaOH调节pH至7.4(约加0.5ml),再用0.1mol/L磷酸盐缓冲液稀释到100ml,混匀加氯仿数滴置冰箱可保存数周。 3．2，4-二硝基苯肼溶液 2，4-二硝基苯肼19.8mg用10mol/L HCl 10ml溶解后,加蒸馏水100ml,置于棕色瓶内,冰箱保存。 4.0.4 mol/L氢氧化钠溶液 将16g氢氧化钠溶解于水中，并加水至1000ml。 【器材】 乳钵和细砂、滴管、试管、试管架、恒温水浴箱。 【操作】
1．将家兔处死后，立即取出肝和肌，分别以冰生理盐水洗去血液。取10g新鲜肝和肌组织，分别剪碎，加pH7.4缓冲液10ml加细砂研碎,研成匀浆后再加pH7.4缓冲液20ml混匀,用棉花过滤,此即为肝和肌的浸提液. 2.取试管2支按下表操作： 表3-18 转氨基作用操作步骤 【结果及分析】 【思考题】 比较两管颜色，说明哪种组织ALT活性高，为什么？
纸层析法分离氨基酸
纸层析法分离氨基酸 目的和要求 掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术(包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量)。学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方法。 原理 层析法亦称色层分离法、色谱分析法或色谱法。1903年俄国化学家茨维特(M. Tswett)发现用挥发油冲洗菊粉柱时，各种颜色的色素在吸附柱上从上到下排列成色谱，故称“色层分离法”。1931年有人用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体，显示了这一分离技术的高度分辩力，从此引起了人们的广泛注意。自1944年应用滤纸作为固定支持物的“纸层析”诞生以来，层析技术的发展越来越快，五十年代开始，相继出现了气相色谱和高压液相层析，其它如薄层层析、亲合层析、凝胶层析等也迅猛发展。层析分离技术操作简便，样品用量可大可小，既可用于实验室分离分析，又适用于工业生产中产品的分析制备。现已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科广泛应用而又必不可少的分析工具之一。 根据所用的支持物及其理化性质不同可将层析法分成三类：1. 用固体吸附剂做支持物的称吸附层析；2. 用吸附了某种溶剂的固体物质(如滤纸)做支持物的称为分配层析；3. 用其表面所含离子能与溶液中的离子进行交换的固体物质做支持物的称为离子交换层析。 纸层析所依据的原理是分配层析，故属于分配层析的范畴。 ㈠分配层析 分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而使之得到分离的方法。将分配层析法中的一种溶剂设法固定在一个柱内，再用另外一种溶剂来冲洗这个固定柱，同样可达到将不同物质分离的目的。我们把固定在柱内的液体称为固定相，把用作冲洗的液体叫做流动相。为了使固定相固定在柱内，需要有一种固体物质把它吸牢，这种固体物质本身对分离无作用，对溶质也几乎没有吸附能力，称为支持物。进行分离时由于被分离物质的各组分在两相中的分布不同，因此当流动相移动时，不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动就慢，结果得以分离。 显然，分配层析法中不同溶质的分离取决于其在两相(固定相和流动相)间分配系数的不同，分配系数(α)的定义是：α =溶质在固定相的浓度(C S)/溶质在流动相的浓度(C L) 滤纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。滤纸的成份是纤维素，其–OH基为亲水性基团，可吸附一层水或其它溶剂作为固定相(S)。通常把有机溶剂作为流动相(L)。当将溶质样品(被分离物)点在滤纸的一端后，该物质溶解在吸附于支持物上的水分子或其它溶剂分子的固定相中，有机溶剂作为流动相自上而
实验十二转氨作用(精)
实验十二 转氨作用 【实验目的】 1．通过实验掌握水平方向滤纸层析原理和技术 2．了解转氨作用过程。 【实验原理】 转氨基作用是由转氨酶（氨基转移酶）催化的，在这个反应中，α-氨基酸的氨基与α-酮酸的酮基之间交换，α-氨基酸转变成相应的α-酮酸，α-酮酸变成新的一种α-氨基酸。转氨基作用是一种可逆反应。每个转氨基反应均由专一的转氨酶所催化，在不同的生物有机体中均有转氨酶分布。 本实验是将丙氨酸和α-酮戊二酸与肝匀浆一起水浴反应，肝中的丙氨酸氨基转移酶（ALT ，又称谷丙转氨酶GPT ）含量丰富，该酶可将丙氨酸的氨基转移给α-酮戊二酸，产生丙酮酸和谷氨酸。利用圆盘纸层析鉴定谷氨酸的存在，并且验证组织中的转氨作用。在肝脏谷丙转氨酶(GPT)催化的转氨基作用，反应方程式如下： CH COOH CH 2NH 2CH 2COOH + + C O COOH CH 3CH CH 3COOH NH 2 C COOH CH 2O CH 2COOH 谷氨酸 丙氨酸 丙酮酸α‐酮戊二酸 【实验材料】 1． 实验器材 培养皿；表面皿；滤纸；匀浆器；试管；试管架；恒温水浴锅；毛细管；移液管；喷雾器；剪刀；铅笔；格尺。 2． 实验试剂 ⑴ 0.01M pH7.4磷酸缓冲液：0.2MNa 2HPO 4溶液81ml , 0.2MNaH 2P04溶液19ml 混匀，蒸馏水稀释20倍。 ⑵ 0.1M 丙氨酸溶液：称取丙氨酸0.891克先溶于少量0.01MpH7.4磷酸缓冲液中，以1MNa0H 仔细调节至pH7.4后，用磷酸盐缓冲液加至100ml 。 ⑶ 0.01M ａ-酮戊二酸溶液：称取ａ-酮戊二酸1.461克先溶于少量0.01M pH7.4磷酸缓冲液中，用1M Na0H 仔细调节至pH7.4后，用磷酸盐缓冲液加至100ml 。 ⑷ 0.1M 谷氨酸溶液：称取谷氨酸0.735克先溶于少量0．01M pH7.4磷酸缓冲液中， 以1MNa0H 仔细调节至pH7.4后，用磷酸缓冲液加至100ml 。 ⑸ 0.2％茚三酮溶液：称取茚三酮0.2克溶于100ml 95％乙醇中。 (6)层析溶剂：水饱和的苯酚。 【实验操作】 1． 肝匀浆的制备： 取新鲜的猪肝5g,加入20m1预冷0.01M pH7.4磷酸缓冲液，用捣碎机迅速成匀浆(1万转大约30秒)。两人一组进行如下的实验。 2． 转氨反应： 取干燥大试管二支，分别标明测定管与对照管，按下表进行操作： 试剂(ml) 测定管 对照管 肝匀浆 0.5 0.5
氨基酸的纸层析
氨基酸的纸层析 一、实验目的 1、了解纸层析法的使用原理。 2、掌握用纸层析法分离蛋白质的操作步骤。 二、实验原理 1、纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析方法，滤纸上的纤维具有羟基，是亲水基团， 滤纸吸附水作为固定相，其上流经的有机溶剂即展层剂作为流动相。当展层剂流经固定相时，固定相上的样品由于亲水、疏水能力不同，在两相之间不断分配，疏水能力强的多溶于流动相，随流动相移动距离较远，亲水能力强的移动距离则较近。 2、所有的氨基酸的α碳上均连接一个氢原子和两个亲水基团羧基（—COOH）与氨基（—NH2）， 唯一的不同则在于R基团。因此R基团在氨基酸的亲水疏水能力对比中起到了决定性的作用。本实验采用脯氨酸、甘氨酸，苯丙氨酸，组氨酸，其亲水疏水能力迥异，能在滤纸上明显分开。 分配系数K=溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度 3、Rf值表示原点中心至显色斑点中心的距离与原点中心至流动相前沿的距离比。在一定条件 下，Rf值为定值，其影响的因素有物质本身的性质，溶剂的性质，PH值，温度，滤纸的性质等等，本实验不予探究。在测量原点中心至显色斑点中心的距离时，由于斑点的形状不规范（近似圆形），所以，一般取斑点的重心，测量出重心与起点的距离即可。
4、显色原理：茚三酮在弱碱性溶液中与α—氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氧，脱羧反应，最 后茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮发生作用生成紫色物质。 三、试剂 1.酸性层析液：正丁醇：88% 甲酸：水=15：3：2
2.显色储备液：0.4mol/L茚三酮—异丙醇：甲酸：水=20：1：5
实验六 氨基酸纸层析法
氨基酸的纸层析法 一．目的 了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 二、原理 以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。 在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。
三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 四、实验试剂 1、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸） 2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中 五、实验步骤 1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）。 2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。 3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层（大约2~3小时）。
纸层析法
纸层析法 植物叶绿体中色素的提取与分离 用具：剪刀一把、干燥的定性滤纸、50ml的烧杯及100ml的烧杯各3个、白纸3张、试管架一个、研钵一个、玻璃漏斗一个、尼龙布或纱布、毛细血管一只、药勺一个、10ml量筒一只，天平一只，试管3支、纸板一块、棉塞3个、培养皿3个、刻度尺、注射器一只、盖玻片试剂：无水乙醇（或丙酮）、层析液（20份石油醚、2份丙酮、1份苯配置而成）、二氧化硅、碳酸钙（或碳酸钠） 材料：新鲜的菠菜叶、青菜叶、大叶黄杨叶片 背景资料： 1、叶绿素等是脂溶性的有机分子，根据相似相溶的原理，叶绿素等色素分子溶于有机溶剂而不溶于有极性的水。故在研磨和收集叶绿色素时要用丙酮或乙醇等有机溶剂而不用水。 2、叶绿素分布于基粒的片层薄膜上，加入少许二氧化硅是为了磨碎细胞壁、质膜、叶绿体被膜和光合片层，使色素溶解于无水乙醇等溶剂中。即，加入少许二氧化硅（石英砂）是为了使磨碎充分，释放出色素。 3、破碎的细胞中含有草酸等有机酸，叶绿素分子中含有的Mg元素处于不稳定化合态，镁离子与有机酸结合将导致叶绿素分子破坏。加入少许碳酸钙使得钙离子与有机酸结合，减少镁离子的转移，防止研磨时叶绿体色素的破坏。所以在研磨时加入适量的碳酸钙保护色素（叶绿素），同时加入碳酸钠的道理亦如此。 4、在过滤时选用脱脂棉或纱布，而不用滤纸。原因主要有下：（1）色素分子比较大，不容易透过滤纸；（2）滤纸有较强的吸附性而使色素吸附在滤纸上，从而降低色素浓度，影响实验效果；（3）叶绿素是脂溶性，根据相似相容的原理，脱脂棉可以减少实验过程中色素的流失，增强实验效果。 5、根据物理学中的毛细现象，画滤液细线前，滤纸必须经过干燥处理，是为了阻止水分子堵塞滤纸中的毛细管而影响层析液的扩散。但如果用火烤的话，会使滤纸纤维变形同时破坏啦毛细管，而影响层析液的扩散。要自然阴干。为了使滤液细线处的色素足够，画滤液细线要重复多次，以积累足够的色素。否则，色素带颜色浅。 6、由于液面的不同位置表面张力不同，纸条接近液面时，纸条边缘的表面的张力较大，层析液沿滤纸边缘扩散过快，而导致色素带分离不整齐的现象。故而，插入层析液的滤纸条一端要剪去两个角。 7、为了防止滤纸条倒入层析液中而使层析实验失败，层析液要低于滤液细线。同时，防止因液体表面张力引起层析液沿滤纸条向上的“壁流”而导致色素溶解。 8、色素分离的原理：纸层析是用滤纸作为载体的一种色层分析法，其原理主要是利用混合物中各组分在；流动相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分离。滤纸上吸附的水为固定相（滤纸纤维常能吸20%左右的水），有机溶剂如乙醇等为流动相，色素提取液为层析试样。把试样点在滤纸的滤液细线位置上，当流动相溶剂在滤纸的毛细管的作用下，连续不断地沿着滤纸前进通过滤液细线时，试样中各组份便随着流动相溶剂向前移动，并在流动相和固定相溶剂之间连续一次就有一次的分配。结果分配比（溶解度）比较大的物质移动速度较快，移动距离较远；分配比较小的物质移动较慢，移动距离较近，这样，试样中各组分就分别聚集在滤纸的不同位置，从而达到分离的目的。
纸层析法分离氨基酸实验报告
前言 纸层析法纸层析法又称纸色谱法，是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。它是一种以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离（Rf值）与已知样比较，进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量（如光度法、比色法等）。 纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。 在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC应用普遍。在
做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎，浸出绿色液体，将液体与层析液（石油醚）混合，将滤纸一段进入混合液体，四种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下4条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。 纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离，叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b，它们在层析液中的溶解度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快，反之则慢；含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下4条色素带，所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中的色素分离。 图1 叶绿素的分离 氨基酸氨基酸是构成蛋白质的基本单位，广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为2l世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，品种变更越来越快，工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为100万吨，而需求总量是800万吨。我国自20世纪60年代起，氨基酸的应用在食品工业占61％，在饮料工业占30％，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。 氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用：
氨基移换反应及其产物鉴定
精品文档 实验报告 课程名称： 生物化学实验 指导老师： 成绩： 实验名称：氨基移换反应及其产物的鉴定 实验类型： 同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、主要仪器设备（必填） 四、操作方法和实验步骤 五、实验数据记录和处理 六、实验结果与分析（必填） 七、讨论、心得 一、实验目的 1、 学习一种鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理。 2、 掌握纸层析的原理和操作技术。 3、 了解氨基移换反应在代谢中的作用。 二、实验原理 在氨基移换酶的催化下，氨基酸的α—氨基和α—酮酸的α—酮基可以互换，这种反应称为氨基移换反应。它对于生物体内的各大类物质的代谢在相互联系、相互转化上起着很重要的作用。转氨酶的种类很多，具有专一性，最适合的PH 接近7.4。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中，在肝、心、肾等组织中的谷丙转氨酶（GPT ）、谷草转氨酶（GOT ）活性较高。 本实验利用纸层析法，检查由α—酮戊二酸和丙氨酸在牛蛙肝细胞内谷丙转氨酶的作用下所生成的谷氨酸，从而定性证明组织内的氨基移换作用。反应式如下： L －谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富，活性高，催化L －谷氨酸氧化脱－NH2，加碘乙酸（或溴乙酸）能抑制其活性，从而可以保护氨基移换反应的产物L －谷氨酸。 三、仪器和试剂 1. 材料：动物肝脏（蟾蜍或猪）2g 专业： 姓名： 学号： 日期： 地点： 装 订 线
2. 试剂： ① 0.01mol/L pH7.4 磷酸缓冲液（转氨反应所需缓冲溶液） ② 0.1mol/L pH7.4 α－丙氨酸（转氨反应底物，同时作为纸层析点样时的标准品） ③ 0.1mol/L pH7.4 α－酮戊二酸（转氨反应底物） ④ 0.1mol/L pH7.4 α－L－谷氨酸（纸层析点样时的标准品） ⑤展层溶剂－酚溶液（纸层析用） ⑥ 10% 三氯乙酸（中止酶促反应，同时使转氨酶及其它蛋白质变性、沉淀下来） ⑦ 0.25% 碘乙酸溶液（抑制L－谷氨酸脱氢酶活性） 3. 仪器： ①试管及试管架②恒温水浴箱（37℃、100℃）③铅笔和尺④玻璃毛细管 ⑤新华定性滤纸（? 12cm）⑥剪刀和镊子⑦烘箱（80℃）⑧滴管 ⑨康氏皿（做层析缸）⑩电吹风机及喷雾器（喷洒茚三酮丙酮溶液） 四、实验步骤 1、酶液的制备 取新鲜牛蛙的肝脏约3g，在研钵中用剪刀充分剪碎。加少许石英砂，先研磨数分钟（约10分钟），再加入3mL磷酸缓冲液迅速研磨，成为均匀的浆质后，再加入9ml磷酸缓冲液，用2－4层纱布加上玻璃漏斗过滤，留取滤液，即得转氨酶提取液（为粗酶液）。 2、氨基移换反应 取4支洁净、干燥的试管，按下表操作（单位：ml） 管号 项目 1 2 3 4 酶液（mL） 1 1 1 1 0.25%碘乙酸溶液（mL）0.5 0.5 0.5 0.5 置37℃恒温水浴保温5min（预热反应体系）100℃沸水浴5 min（灭活酶） 0.1mol/L丙氨酸溶液（mL） 1 1 / 1 1 / 1 1 0.1mol/Lα—酮戊二酸 （mL） 磷酸缓冲液（mL） 1 2 2 1 酶促反应混匀, 置37℃恒温水浴保温40min(经常摇动) 中止酶促反应滴加10%三氯乙酸溶液2滴,置100℃恒温水浴保温5min
氨基移换反应及其产物鉴定
实验报告 课程名称： 生物化学实验 指导老师： 成绩： 实验名称：氨基移换反应及其产物的鉴定 实验类型： 同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、主要仪器设备（必填） 四、操作方法和实验步骤 五、实验数据记录和处理 六、实验结果与分析（必填） 七、讨论、心得 一、实验目的 1、 学习一种鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理。 2、 掌握纸层析的原理和操作技术。 3、 了解氨基移换反应在代谢中的作用。 二、实验原理 在氨基移换酶的催化下，氨基酸的α—氨基和α—酮酸的α—酮基可以互换，这种反应称为氨基移换反应。它对于生物体内的各大类物质的代谢在相互联系、相互转化上起着很重要的作用。转氨酶的种类很多，具有专一性，最适合的PH 接近7.4。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中，在肝、心、肾等组织中的谷丙转氨酶（GPT ）、谷草转氨酶（GOT ）活性较高。 本实验利用纸层析法，检查由α—酮戊二酸和丙氨酸在牛蛙肝细胞内谷丙转氨酶的作用下所生成的谷氨酸，从而定性证明组织内的氨基移换作用。反应式如下： L －谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富，活性高，催化L －谷氨酸氧化脱－NH2，加碘乙酸（或溴乙酸）能抑制其活性，从而可以保护氨基移换反应的产物L －谷氨酸。 三、仪器和试剂 1. 材料：动物肝脏（蟾蜍或猪） 2g
2. 试剂： ①0.01mol/L pH7.4 磷酸缓冲液（转氨反应所需缓冲溶液） ②0.1mol/L pH7.4 α－丙氨酸（转氨反应底物，同时作为纸层析点样时的标准品） ③0.1mol/L pH7.4 α－酮戊二酸（转氨反应底物） ④0.1mol/L pH7.4 α－L－谷氨酸（纸层析点样时的标准品） ⑤展层溶剂－酚溶液（纸层析用） ⑥10% 三氯乙酸（中止酶促反应，同时使转氨酶及其它蛋白质变性、沉淀下来） ⑦0.25% 碘乙酸溶液（抑制L－谷氨酸脱氢酶活性） 3. 仪器： ①试管及试管架②恒温水浴箱（37℃、100℃）③铅笔和尺④玻璃毛细管 ⑤新华定性滤纸（? 12cm）⑥剪刀和镊子⑦烘箱（80℃）⑧滴管 ⑨康氏皿（做层析缸）⑩电吹风机及喷雾器（喷洒茚三酮丙酮溶液） 四、实验步骤 1、酶液的制备 取新鲜牛蛙的肝脏约3g，在研钵中用剪刀充分剪碎。加少许石英砂，先研磨数分钟（约10分钟），再加入3mL磷酸缓冲液迅速研磨，成为均匀的浆质后，再加入9ml磷酸缓冲液，用2－4层纱布加上玻璃漏斗过滤，留取滤液，即得转氨酶提取液（为粗酶液）。 2、氨基移换反应 取4支洁净、干燥的试管，按下表操作（单位：ml） 管号 项目 1 2 3 4 酶液（mL） 1 1 1 1 0.25%碘乙酸溶液（mL）0.5 0.5 0.5 0.5 置37℃恒温水浴保温5min（预热反应体系）100℃沸水浴5 min（灭活酶） 0.1mol/L丙氨酸溶液（mL） 1 1 / 1 1 / 1 1 0.1mol/Lα—酮戊二酸 （mL） 磷酸缓冲液（mL） 1 2 2 1 酶促反应混匀, 置37℃恒温水浴保温40min(经常摇动) 中止酶促反应滴加10%三氯乙酸溶液2滴,置100℃恒温水浴保温5min
22 生物化学实验--纸层析法测定肝组织的转氨基作用
纸层析法测定肝组织的转氨基作用 【目的】 1 ．掌握纸层析法的原理和方法。 2 ．熟悉相关转氨酶的临床意义。 【原理】 转氨基作用是氨基酸代谢的一个重要反应。在转氨酶作用下，将氨基酸的氨基转移到α- 酮酸上。每种转氨基反应均由专一的转氨酶催化。转氨酶广泛分布于机体各器官、组织，例如肝细胞中存在的丙氨酸氨基转移酶，能催化α- 酮戊二酸与丙氨酸之间的转氨基作用。反应式如下： 纸层析是以滤纸作为支持物，与滤纸纤维素结合的水（约占纸重 20 ～ 30 ％）称为层析中的“固定相”。另一种和固定相不能混合或部分混合的溶剂则为“流动相”。把欲分离的物质加在纸的一端，并使流动相借滤纸的毛细现象移动，此时，待分离溶质因分配系数不同而逐渐分布于滤纸的不同部位。层析过程中或层析结束时，用显色剂使被分离的物质显出颜色，成为一个个色斑。分配在固定相中趋势较大的成分在纸上随流动相移行的速度就小，色斑距原点的位置就较近。反之，分配在固定相内趋势较小的成分移行就远，色斑位置离原点也远。溶质在纸上的移动速率可用比移（R f ）表示： 同一氨基酸在相同的层析条件下 R f 值相同，不同氨基酸在相同层析条件下 R f 值不同，因此可以根据 R f 值来鉴定被分离的氨基酸。层析时，用显色剂茚三酮使氨基酸显色，将样品氨基酸的 R f 值与标准氨基酸的 R f 值比较，即可确定所分离氨基酸的种类。 【器材】 1 ．研钵
2 ．剪刀 3 ．恒温水浴 4 ．点样毛细管 5 ．漏斗 6 ．表面皿或小平皿 7 ．新鲜动物肝脏 8 ．直径 10cm 圆型新华滤纸 9 ．中试管和小试管 10 ．电炉或吹风机或烘箱 11 ．直径 10cm 的培养皿 【试剂】 1 ． 0.2mol/L ， pH7.4 磷酸缓种液 Na 2 HPO4 溶液 81ml 与 0.2mol/L NaH 2 PO4 溶液 19ml 混匀，再用蒸馏水稀释 20 倍。 2 ． 0.1mol/L 丙氨酸溶液 称取丙氨酸 0.891g 先溶于少量 pH7.4 磷酸盐缓冲液中，以 0.1mol/LNaOH 仔细调节至 pH7.4 后，用磷酸缓冲液加至 100ml 。 3 ． 0.1mol/L 谷氨酸溶液 称取谷氨酸 0.735g ，先溶于少量 pH7.4 磷酸缓冲液中，以 1mol/LNaOH 仔细调节至 pH7.4 后，用磷酸缓冲液加至 50ml 。 4 ． 0.1mol/L α- 酮戊二酸溶液 称取α- 酮戊二酸 1.46g 先溶于少量 pH7.4 磷酸缓冲液中，以 1mol/L NaOH 仔细调至 pH7.4 后，用磷酸缓冲液加至 100ml 。 5 ．层析剂（展开剂） 取 100ml 重蒸苯酚与 25ml 水摇匀，加入茚三酮使终浓度达 0.1% 。
生物化学实验 氨基酸的纸层析法
实验氨基酸的纸层析法 一、目的 了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 二、原理 以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值） Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。 三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 四、实验试剂 1、混合氨基酸溶液（甘氨酸，苯丙氨酸），甘氨酸溶液，苯丙氨酸溶液 2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中 五、试验步骤 1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）。 2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不
6氨基移换反应及其产物的鉴定
实验报告 课程名称：生物化学实验（甲） 指导老师：杨劲树 同组学生姓名： 一、实验目的和要求三、实验材料和主要仪器五、实验数据记录和处理七、实验讨论和心得二、实验内容和原理四、实验方法和步骤六、实验结果和分析 一、实验目的和要求 1、学习鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理； 2、学习纸层析的原理和操作技术。 二、实验内容和原理 1.氨基移换反应： 在氨基移换酶（转氨酶)的催化下，氨基酸的α-氨基和α-酮酸的α-酮基之间发生的互换反应。 转氨酶的种类很多，任何一种氨基酸进行转氨作用时都由其专一的转氨酶催化。转氨酶的最适pH接近7.4，在各种转氨酶中，谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活性最强。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。在肝、心、肾等组织中谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）活性较高。 GPT催化下的转氨基反应为： L－谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富，活性高，催化L－谷氨酸氧化脱－NH2，加碘乙酸能抑制其活性，从而可以保护氨基移换反应的产物L－谷氨酸。 本实验用纸层析法，检查由丙氨酸和α—酮戊二酸在肝细胞谷丙转氨酶（GPT) 的作用下所生成的谷氨酸，证明组织内的氨基移换作用。 2. 纸层析原理： 滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。利用不同物质在两个互不相溶的溶剂中分配情况（溶解度）的不同来分离混合物的一种技术。 层析溶剂是由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。进行分离时，由于被分离物质的组分在两相中的分布不同，随着流动相的移动，物质将在两相间进行连续的、动态的不断分配，从而造成不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动慢，于是得到分离。