实验十二：丙酮酸含量的测定

实验十二：植物组织中丙酮酸含量的测定

（2,4 一二硝基苯肼法）

一、目的

丙酮酸是一种重要的中间代谢物。通过本实验掌握测定植物组织中丙酮酸含量的原理和方法，增加对代谢的感性认识。

二、原理

植物样品组织液用三氯乙酸除去蛋白质后，其中所含的丙酮酸可与 2,4- 二硝基苯肼反应，生成丙酮酸－2，4 －二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈樱红色，其颜色深度可用分光光度计测量。与同样处理的丙酮酸标准曲线进行比较，即可求得样品中丙酮酸的含量。

三、仪器、试剂和材料

1 .仪器

分光光度计、离心机、容量瓶（ 25 ml ）、研钵、试管、刻度吸管、电子天平

2 .试剂

（ 1 ） 1.5 mol/L NaOH

（ 2 ） 8% 三氯乙酸（当日配制置冰箱中备用）

（ 3 ） 0.1% 2,4 一二硝基苯肼：称取 2，4 －二硝基苯肼 100mg, 溶于 2mol/L HCl 中使成 100ml ，盛入棕色试剂瓶，保存于冰箱内。

（ 4 ）丙酮酸标准液（ 60ug/ml ）：精确称取 7.5 mg 丙酮酸钠，用 8 ％三氯乙酸溶解并定容至 l00ml 保存于冰箱内。

3 .材料

大葱、洋葱或大蒜的鳞茎。

四、操作步骤

1. 植物材料提取液的制备

称取约1.5g 植物材料（记录实际重量）于研钵内，加适量 8% 三氯乙酸研磨成匀浆，再用 8% 三氯乙酸全部洗入到 25ml 容量瓶并定容到刻度。塞紧瓶塞，振摇提取，静置 30min 。过滤或离心（3000r/mim.5分钟），滤液（上清液）备用。

2. 丙酮酸标准曲线的制作及样品液的测定

取 8 支试管，按下表依次加入试剂及提取液：

在上述各管中摇匀，显色10min 后，以1号试管调零，在 520nm 波长下比色，记录各管的吸光度值。以1-6号试管内的丙酮酸含量为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标，作标准曲线。根据样品液吸光度值的平均值，在标准曲线上查得丙酮酸含量（也可以用EXCEL 处理数据，用公式计算），并根据下列公式计算100克样品组织中丙酮酸的含量。

样品中丙酮酸含量（mg / g 鲜重）= ────────────────

式中， A 为在标准曲线上查得的丙酮酸的微克数。 五、注意事项

1. 所加试剂的顺序不可颠倒，先加丙酮酸标准液或待测液，再加 8% 三氯乙酸，然后加0.1％的

2.4 —二硝基苯肼液，最后加 1.5mol/L NaOH 。 2 .需要反应 10min 后再比色。

A ×

提取液的总体积

────────

测定时取用的体积

样品重（g ）× 1000

丙酮酸在只有酵母菌细胞质基质中有氧和无氧条件下产物

在有氧条件下丙酮酸能否在细胞质基质中分解成酒精和二氧化碳 丙酮酸是营养物质代谢过程的中间产物，有氧代谢时进一步分解为水和二氧化碳和ATP，无氧代谢时进一步分解为乳酸。 对于真核生物，细胞的有氧代谢是在线粒体中进行的，经过线粒体内膜上一系列的复合酶催化完成，最终产物为二氧化碳和水。细胞质基质中因没有反应所必需的复合酶，故无法进行该过程。 部分原核生物，细胞以细胞质膜内褶完成类似的活动，即在细胞质基质中完成。 综上，部分原核生物，在有氧且氧气不充足时，丙酮酸可能会在细胞质基质中分解成酒精和二氧化碳。 【急需】向分离出来的细胞质基质中加入丙酮酸，会反应吗？？ 答案上说能， 不是先由葡萄糖分解出[H]和丙酮酸，丙酮酸又和[H]反应生成酒精（酵母菌）和二氧化碳呀。 光放丙酮酸没有[H]呀，应该不能反应吧（原来不应该有[H]留着吧，有也应该反应了） 满意回答 作为一个高中生，你犯了大忌，就是把题目太当真。 首先说了是细胞质基质，那就只用考虑无氧呼吸了，因为没有线粒体。 以典型的呼吸过程为例，丙酮酸如果是产生酒精，则是丙酮酸先脱羧产生乙醛和二氧化碳，这个过程不需要NADH（也就是所谓的[H]），乙醛转变成乙醇则是需要NADH的。 如果丙酮酸是产生乳酸，那么确实需要NADH作为还原剂。 如果丙酮酸是产酸，则是在甲酸裂解酶作用下分解成甲酸和乙酸，也不需要NADH。 所以题目本身就是模棱两可的，因为根本没说明是什么细胞。而且我上面说的也仅仅是典型的代谢途径而已。更何况你怎么保证细胞质中的NADH都反应掉了？要知道有机反应基本都是不能完全反应的。 所以要在中国念好书，就别把高中的书本太当回事，进了大学你会发现好多都是不严谨不科学，甚至是错误的。

丙酮酸的测定方法

丙酮酸的测定方法内部编号：（YUUT-TBBY-MMUT-URRUY-UOOY-DBUYI-0128）

实验七丙酮酸含量的测定 一、实验目的 掌握植物组织中丙酮酸含量测定的原理和方法。 二、实验原理 植物样品中的组织液，用三氯乙酸去蛋白质后，其中所含的丙酮酸可与2,4—二硝基苯肼作用，生成丙酮酸—2,4—二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈樱红色，其颜色可用分光光度计测量，与已知丙酮酸标准曲线进行比较，即可求得样品中丙酮酸的含量。 三、实验器材与试剂 1、.实验器材 分光光度计；研钵；具塞刻度试管：20mL×8；容量瓶：100mL×2；移液管： 1mL×15mL×4； 量筒：10mL×1；离心机；天平； 大蒜、大葱或洋葱 2、试剂 （1）8%三氯乙酸(当日配制置冰箱中备用)

（2）1.5mol/L氢氧化钠 （3）0.1%2,4—二硝基苯肼:称取2.4—二硝基苯肼100mL，溶于2mol/LHCl中配成100mL溶液，盛入棕色试剂瓶，保存于冰箱内。 （4）丙酮酸钠 四、实验操作步骤 1.丙酮酸标准曲线的制作： 称取丙酮酸钠7.5mg于烧杯中，用8%三氯乙酸溶解，转入100mL容量瓶中，并用8%三氯乙酸定容，此液为60μg/mL的丙酮酸原液。 取6支试管，按下表数据配制不同浓度的丙酮酸标准液： 1.5mol/L的氢氧化钠溶液，摇匀显色，在520nm波长下比色。做标准曲线。 2.植物样品组织液的提取： 称取植物样品（大蒜、大葱或洋葱）5g，于研钵中加入少许石英沙及少量8%三氯乙酸，仔细研成匀浆，再用8%三氯乙酸洗入100mL容量瓶中（沙留在研钵内），

定容至刻度。静置30min，取10mL匀浆液离心（4000r/min）10min，取上清液备用。 3.组织液中丙酮酸的测定1.5mol/L氢氧化钠溶液，摇匀显色。在520nm波长下比色，记录吸光度，在标准曲线上查得丙酮酸的含量。 五、结果处理 式中：A—标准曲线中查得的丙酮酸克数。 六、思考题：测定丙酮酸含量的基本原理是什么？

丙酮酸(pyruvic acid PA)含量测定试剂盒使用说明

丙酮酸（pyruvic acid PA）含量测定试剂盒使用说明 货号：BC0970 规格：50管/48样 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体5mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：液体25mL×1瓶，4℃保存。 产品说明： 丙酮酸通过乙酰CoA连接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代谢，起着重要的枢纽作用。丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，在碱性溶液中呈樱红色。需自备的仪器和用品： 可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水。操作步骤： 一、丙酮酸提取： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），静置30min，8000g，常温离心10min，取上清待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆，静置30min，8000g，常温离心10min，取上清待测。 3、血清（浆）样品：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积(mL)为1：5~10的

比例（建议取0.1mL血清（浆）加入1mL提取液），进行冰浴匀浆，静置30min，8000g，常温离心10min，取上清待测。 二、测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至520nm，蒸馏水调零。 2、取300μL样本+100μL试剂一于1.5mL EP管中，混匀，静置2min，加入500 μL试剂二，混匀，于520nm波长处测定管吸光值A。 三、丙酮酸含量计算： 1、标准条件下测定回归方程为y=0.0466x+0.0675；x为丙酮酸钠含量（μg/mL）， y为吸光值。 2、按照血清（浆）体积计算 丙酮酸含量（μg/mL）=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷（V3×V1÷V2）=214.6× (A-0.0675) 3、按照蛋白浓度计算 丙酮酸含量（μg/mg prot）=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(V1×Cpr)=21.46× (A-0.0675)÷Cpr 4、按照样品质量计算 丙酮酸含量（μg/g鲜重）=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(W×V1÷V2）=21.46×(A-0.0675)÷W 5、按照细菌或细胞密度计算 丙酮酸含量（μg/104cell）＝[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷（500×V1÷V2）=0.043×(A-0.0675) V1：加入反应体系中样本体积，0.3mL；V2：加入提取液体积，1mL；V3：加入血清（浆）

丙酮酸含量测定

丙酮酸含量测定 一、目的：丙酮酸是一种重要的中间代谢物。通过本实验掌握测定植物组织中丙酮酸含量的原理和方法，增加对代谢的感性认识。 二、原理：植物样品组织液用三氯乙酸除去蛋白质后，其中所含的丙酮酸可与 2,4- 二硝基苯阱反应，生成丙酮酸一 2 ， 4 一二硝基苯踪，后者在碱性溶液中呈樱红色，其颜色深度可用分光光度计测量。与同样处理的丙酮酸标准曲线进行比较，即可求得样品中丙酮酸的含量。 三、仪器、试剂、材料 1、1.5 mol/L NaOH 2、 8% 三氯乙酸 3、 0.1% 2,4 一二硝基苯肼 4 、丙酮酸标准液 5、.材料大蒜的鳞茎。 四、操作步骤 1、.植物材料提取液的制备 称取 0.5—1g大蒜于研钵内加适量 8% 三氯乙酸，仔细研成匀浆，再用 8% 三氯乙酸洗入 25ml 容量瓶，定容至刻度。塞紧瓶塞，振摇提取，静置 30min 。取约 10ml 匀浆液离心（ 4000 r/min ） 10min ，上清液备用。 2、标准曲线制作（略） 3、.组织液中丙酮酸的测定 取 1. 0ml 上清液于一刻度试管中，加 2ml 8 ％三氯乙酸，加 1.0ml 0.1％2.4 －二硝基苯肼液，摇匀，再加 5.0 ml 1.5mol/L, NaOH 溶液，摇匀显色，10min 后在 520 nm 波长下比色，记录吸光度，在标准曲线上查得测定管的丙酮酸含量。 五、结果处理

丙酮酸含量（mg/g鲜重）=A*V*稀释倍数/样品重(g)*1000

式中， A 为在标准曲线上查得的丙酮酸的微克数。 V为提取液体积。 六、注意事项 1. 所加试剂的顺序不可颠倒，先加丙酮酸标准液或待测液，再加 8% 三氯乙酸，最后加 1.5mol/ L NaOH 。 2 .应反应 10min 后再比色。

生物化学三大代谢重点总结

第八章生物氧化 1.生物氧化：物质在生物体内进行氧化称生物氧化，主要指糖、脂肪、蛋白质等在体内彻底分解时逐步释放能量，最终生成CO2 和 H2O的过程。 2.生物氧化中的主要氧化方式：加氧、脱氢、失电子 3.CO2的生成方式：体内有机酸脱羧 4.呼吸链：代谢物脱下的成对氢原子通过位于线粒体内膜上的多种酶和辅酶所催化的连锁反应逐步传递，最终与氧结合生成水，这一系列酶和辅酶称为呼吸链，又称电子传递链。 NADH →复合物I→ CoQ →复合物III →Cyt c →复合物IV →O 产2.5个ATP (2)琥珀酸氧化呼吸链:3-磷酸甘油穿梭 琥珀酸→复合物II→ CoQ →复合物III → Cyt c →复合物IV →O 产1.5个ATP 含血红素的辅基：血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素、过氧化物酶、过氧化氢酶 5.细胞质NADH的氧化:胞液中NADH必须经一定转运机制进入线粒体，再经呼吸链进行氧化磷酸化。 转运机制 （1）3-磷酸甘油穿梭：主要存在于脑和骨骼肌的快肌，产生1.5个ATP （2）苹果酸-天冬氨酸穿梭：主要存在于肝、心和肾细胞；产生2.5个ATP 6.ATP的合成方式： （1）氧化磷酸化：是指在呼吸链电子传递过程中偶联ADP磷酸化，生成ATP，又称为偶联磷酸化。 偶联部位：复合体Ⅰ、III、IV （2）底物磷酸化：是底物分子内部能量重新分布，通过高能基团转移合成ATP。 磷/氧比：氧化磷酸化过程中每消耗1摩尔氧原子（0.5摩尔氧分子）所消耗磷酸的摩尔数或合成ATP的摩尔数。 7.磷酸肌酸作为肌肉中能量的一种贮存形式 第九章糖代谢 一、糖的生理功能：（1）氧化供能 （2）提供合成体内其它物质的原料 （3）作为机体组织细胞的组成成分 吸收速率最快的为-半乳糖 二、血糖

丙酮酸检测试剂盒(乳酸脱氢酶微板法)

丙酮酸检测试剂盒(乳酸脱氢酶微板法) 简介： 丙酮酸(Pyruvic acid)又称2-氧代丙酸，是参与整个生物体基本代谢的中间产物之一，可通过乙酰CoA 和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸间的互相转化，丙酮酸在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用。 丙酮酸是糖无氧代谢的产物，科研工作者常将丙酮酸和乳酸一起研究，并用二者的比值推算循环衰竭的程度。丙酮酸检测可采用酶催化法，该发是使用乳酸脱氢酶(LDH)催化丙酮酸氧化，生成乳酸和NAD +，通过分光光度法或荧光光度法测定NADH 的减少量，进而计算出丙酮酸含量。 通过分光光度比色法(酶标仪)测定340nm 处吸光度的下降速率，据此通过比色分析就可以计算出PA 水平。该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清等样品中内源性的丙酮酸含量。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 准备样品： ① 血浆、血清、尿液及其他体液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于 本试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，-20℃冻存。 ② 细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要需进行适当匀浆，低速离 心取上清，-20℃冻存，用于PA 的检测。 ③ 高浓度样品：如果样品中含有较高浓度的PA ，可以使用原有的裂解液或PBS 等进 行稀释，如鸡血清、血浆可稀释5～10倍后检测。 2、 配制标准品工作液：取丙酮酸标准(25mmol/L)稀释液，使浓度达到0.5mmol/L ，即为 标准品工作液-丙酮酸标准(0.5mmol/L)。4℃避光保存24h 有效。 编号 名称 TC0754 120T Storage 试剂(A): 丙酮酸标准(25mmol/L) 1ml 4℃ 避光 试剂(B): 丙酮酸标准稀释液 1ml RT 试剂(C): PA 显色液 C1: PA Assay buffer 30ml 4℃ 避光 C2: NADH 3支 -20℃ 避光 临用前，按C1:C2=10ml:1支的比例混合，即为PA 显色液。 试剂(D): LDH solution 0.2ml -20℃ 避光 使用说明书 1份

丙酮酸检测试剂盒(乳酸脱氢酶比色法)

丙酮酸检测试剂盒(乳酸脱氢酶比色法) 简介： 丙酮酸(Pyruvic acid)又称2-氧代丙酸，是参与整个生物体基本代谢的中间产物之一，可通过乙酰CoA 和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸间的互相转化，丙酮酸在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用。 丙酮酸是糖无氧代谢的产物，科研工作者常将丙酮酸和乳酸一起研究，并用二者的比值推算循环衰竭的程度。丙酮酸检测可采用酶催化法，该发是使用乳酸脱氢酶(LDH)催化丙酮酸氧化，生成乳酸和NAD +，通过分光光度法或荧光光度法测定NADH 的减少量，进而计算出丙酮酸含量。 通过分光光度比色法(自动分析仪或分光光度计)测定340nm 处吸光度的下降速率，据此通过比色分析就可以计算出PA 水平。该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清等样品中内源性的丙酮酸含量。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 准备样品： ① 血浆、血清、尿液及其他体液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于 本试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，-20℃冻存。 ② 细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要需进行适当匀浆，低速离 心取上清，-20℃冻存，用于PA 的检测。 ③ 高浓度样品：如果样品中含有较高浓度的PA ，可以使用原有的裂解液或PBS 等进 行稀释，如鸡血清、血浆可稀释5～10倍后检测。 2、 配制标准品工作液：，即为标准品工作液-丙酮酸标准(0.5mmol/L)。4℃避光保存24h 编号 名称 TC0755 50T Storage 试剂(A): 丙酮酸标准(25mmol/L) 1ml 4℃ 避光 试剂(B): 丙酮酸标准稀释液 5ml RT 试剂(C): PA 显色液 C1: PA Assay buffer 90ml 4℃ 避光 临用前，按C1:C2=30ml:1支的比例混合，即为PA 显色液。 试剂(D): LDH solution 0.4ml -20℃ 避光 使用说明书 1份

丙酮酸合成工艺的研究进展

科技专论 丙酮酸合成工艺的研究进展 陕西国际商贸学院（陕西咸阳） 王飞娟 张爽 王燕 【摘 要】丙酮酸是药物合成与有机合成的重要中间体。本文本要阐述其化学合成法和生物技术法合成的现状、研究进展及其发展前景，并将各种方法进行对比，目的为以后的生产、研究提供参考。 【关键词】丙酮酸；化学合成；生物技术；酶催化法；生物工程；微生物发酵法 丙酮酸[1]，又称ａ-氧代丙酸，结构为CH 3 COCOOH，是所有生物细胞糖代谢及体内多种物质相互转化的重要中间体，因分子中包含活化酮和羧基基团，所以作为一种基本化工原料广泛应用于化学、制药、食品、农业及环保等各个领域中[2]。丙酮酸可通过化学合成和生物技术多种方法制备。 1、化学合成法 1.1 酒石酸脱水脱羧法 此法工艺简单易行：将酒石酸与硫酸氢钾混合物在220℃下蒸馏，馏出物再经真空精馏即得丙酮酸。此法的特点是加入导热油之后，在一个均匀体系中进行反应，降低了反应温度，减少氧化程度，可操作性大幅度提高，适合继续反应生成丙酮酸系列产品。其缺点是丙酮酸产率较底，得1g丙酮酸需消耗5g硫酸氢钾。仅原料成本就达8万元每吨，因成本过高而无法为大多数厂家所接受。 1.2 乳酸氧化法 以乳酸为原料，氧化脱氢一步法生产丙酮酸[3]。但乳酸直接制取丙酮酸非常困难,根据工艺不同必须选用合适的催化剂。可以选择的催化剂有磷酸铁、钼酸碲盐、银、钒等[4]。此法酒石酸的氧化脱羧法相比，具有能耗低、污染小、产率高等优点，适合工业化生产。其缺点是成本也较高，约6万元每吨。 2、生物技术法 生物技术法生产丙酮酸，由于成本较低、产品质量较高、对环境污染小而得到发展，主要有酶催化法和微生物发酵法。 2.1 酶催化法 用酶或微生物细胞作催化剂,使葡萄糖或三羧酸循环的某些中间代谢产物,在一定条件下,转化为丙酮酸的技术,称为酶催化法。其主要过程是先进行小规模的微生物培养,菌体收集,直接转化或用载体包埋成固定化酶,然后转化生成丙酮酸[5]。酶催化法设备投资小,能耗低,转化率高,但底物来源较窄、成本比较高约5万元每吨，因此其进一步推广受到限制。 2.2 基因工程技术 利用基因重组技术构建高表达乙醇酸氧化酶、过氧化氢酶等的基因工程菌，用于生产丙酮酸的技术。这些酶能催化乳酸与氧反应生成丙酮酸。其技术是先将乙醇酸氧化酶基因和过氧化氢酶基因分别与DNA载体重组，构成重组子，并分别转入宿主细胞，分别获得两种酶高表达的基因工程酵母，按0.713mol/LL-乳酸钠溶液每100ml加湿重转化体5g,同时加一定量渗透剂,在5个大气压下,以70psig氧压通入氧气,5℃搅拌转化4小时，丙酮酸产率大97.7%[6]。本技术底物转化率高，但技术难度大。 2.3 微生物发酵法 微生物代谢过程中,利用葡萄糖积累丙酮酸的过程称为微生物发酵法。微生物发酵法生产丙酮酸研究已有50年历史，但因丙酮酸高产菌株选育十分困难，虽有一些微生物能够积累丙酮酸，但其产量无法达到工业化要求[7]。该法生产丙酮酸真正取得突破，是在1988年时,日本东丽工业株式会社的研究人员宫田令子和米原辙选育出一系列丙酮酸产量超过50g/L的球拟酵母菌株,使微生物发酵法生产丙酮酸的工业化成为可能。1992年,日本开始采用微生物发酵法生产丙酮酸[8]。产量为400吨每年,成本约为2-3万元每吨。 与化学合成法和酶转化法相比,微生物发酵法因原料来源广,能耗低,污染少,成本低而更具有优越性[9]。但微生物发酵法缺点是转化率比较低,这是因为丙酮酸是糖酵解途径的关键中间产物,在细胞中,丙酮酸作为一种重要的中间代谢产物连接了EMP和TCA中心代谢途径，又与多条分支代谢途径相关联，可转化为多种发酵产物而无法在体内积累。因此需要切断或弱化其进一步代谢,才能使其在细胞中大量积累。即加快葡萄糖向丙酮酸的转化率，减弱向TCA循环的通量，切断或减弱其分支代谢途径，促进分泌，减弱丙酮酸的再利用，最终实现丙酮酸的大量积累。为达此目的，就必须对微生物发酵法生产丙酮酸的影响因素进行研究。 微生物发酵法生产丙酮酸的影响因素有：菌种选育，营养条件，维生素水平，供氧模式，葡萄糖的质量浓度等等,其最关键的是菌种选育和营养条件[10]。 为了提高微生物发酵法生产丙酮酸的竞争力，对微生物发酵生产丙酮酸的工业化在发酵部分还需要：①进一步改善丙酮酸生产菌的产酸能力和遗传稳定性，提高糖酸转化率，缩短发酵时间；②提高生产菌对高浓度丙酮酸的耐受性，以期进一步提高丙酮酸浓度，便于下游处理；③目前原料成本中葡萄糖的费用占了很大的比例，因此，要提高生产菌株对廉价底物(如糖蜜、淀粉糖)等的利用能力。 今后的研究工作应集中在：①在保证细胞正常代谢的前提下，尽可能减少丙酮酸的降解或转化，这是获得丙酮酸高产量和高产率的必要条件；②加快从葡萄糖到丙酮酸的代谢速度，以确保获得丙酮酸的高生产强度。 随着人民生活水平的不断提高，丙酮酸的应用范围日渐扩大，需求不断增长，但丙酮酸系列产品大多需要进口且价位较高。其生产工艺的改革并实现工业化势在必行。传统工艺生产的产品质量差、成本高且对环境污染大。而生物技术法的工艺更为绿色，更为对环境友好，生物技术法新工艺取代传统工艺指日可待，前景广阔，值得进一步研究。 参考文献 [1] 胡兵，龙化云，黄光斗．丙酮酸的合成研究进展[J]．化工时刊，2003,17:18-20 [2] 刘立明，李寅，陈坚．光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸[J]．精细与专用化学品，2003,23:15-18 [3] 顾劲松，许平，李铁林，等．乳酸氧化酶转化乳酸产丙酮酸[J]．应用与环境生物学报，2001(6): 617-620 [4] 杨辉琼，易翔，郭贤烙．乳酸氧气氧化法制备丙酮酸[J]．化工世界，2002,6:307-309 [5] 穆晓清．酶促生物转化丙酮酸生产的研究[J]．工业微生物，2004,34(4),38-41 [6] Davad L A，Robert D，Vincent G W．US5,538,875[J]．1996 [7] 牟弈，诸葛健．发酵法生产丙酮酸[J]．中国酿造，2000(5): 1-3 [8] 占桂荣，高年发．不利用丙酮酸的丙酮酸生产菌的选育[J]．生物加工过程，2006,4(4): 32-36 [9] 李寅，陈坚，伦世仪．维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用[J]．微生物学报，2000,40(5): 528-534 [10] 袁辉，华子春．丙酮酸野生酵母菌的筛选及其生理生化特性研究[J]．微生物学杂志，2001,21: 12-14 192 《科技与企业》杂志 2012年1月（下）

实验一可溶性糖含量的测定——蒽酮法

实验十二胰岛素、肾上腺素对血糖浓度的影响 血糖是指血液中糖，由于正常人血液中糖主要是葡萄糖，所以一般认为，血糖是指血液中的葡萄糖。正常人空腹血糖浓度为4.4～6.7mmol/L（80～ 120mg/100ml）。 血糖是糖在体内的运输形式。全身各组织都从血液中摄取葡萄糖以氧化供能，特别是脑、肾、红细胞、视网膜等组织合成糖原能力极低，几乎没有糖原贮存，必须不断由血液供应葡萄糖。当血糖下降到一定程度时，就会严重妨碍脑等组织的能量代射，从而影响它们的功能。所以维持血糖浓度的相对恒定有着重要的临床意义。 血糖浓度的调节 血糖浓度能维持相对恒定是由于机体内存在一整套高效率的调节机制，精细地控制着血糖的来源与去路，使之达到动态平衡。 神经系统的调节作用 神经系统对血糖浓度的调节作用主要通过下丘脑和自主神经系统对所控制激素的分泌，后者再通过影响血糖来源与去路关键酶的活性来实现。神经系统的调节最终通过细胞水平的调节来达到目的。 下丘脑一方面通过内脏神经作用于肾上腺髓质，刺激肾上腺素的分泌；另

一方面也作用于胰岛α-细胞，使其分泌胰高血糖素；同时还可以直接作用于肝。三方面共同作用的结果是使肝细胞的磷酸化酶活化，使糖原分解加速；糖异生关键酶的活性增加，糖异生作用增加，从而使血糖浓度升高。 下丘脑还可通过兴奋迷走神经，使胰腺β-细胞分泌胰岛素，同时还可直接作用于肝，使肝细胞内糖原合成酶活化，促进肝糖原的合成；此外还抑制糖异生途径，促进糖的氧化和转化，总体上使血糖的去路增加，来源减少，最终达到使血糖浓度降低的目的。 激素 使血糖浓度降低的激素 :胰岛素 使血糖浓度升高的激素:胰高血糖素、肾上腺素、肾上腺皮质激素、生长素、甲状腺素 它们对血糖的调节主要是通过对糖代谢各主要途径的影响来实现的。 在激素发挥调节血糖浓度的作用中，最重要的是胰岛素和胰高血糖素。肾上腺素在应激时发挥作用，而肾上腺皮质激素、生长激素、甲状腺素等都可影响血糖水平，但在生理性调节中仅居次要地位。 胰岛素 使肌肉和脂肪组织细胞膜对葡萄糖的通透性增加，利于血糖进入这些组织进行代谢。 诱导葡萄糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的合成，加速细胞内葡萄糖的分解利用。 通过使细胞内cAMP含量减少，激活糖原合成酶和丙酮酸脱氢酶系，抑制磷酸化酶和糖异生关键酶等，使糖原合成增加，糖的氧化利用、糖转变为脂肪的反应增加，血糖去路增快；使糖原分解和糖异生减少或受抑制，使血糖来源减少，最终使血糖浓度降低。 胰高血糖素 主要通过提高靶细胞内cAMP含量达到调节血糖浓度的目的。细胞内的cAMP 可激活依赖cAMP的蛋白激酶，后者通过酶蛋白的共价修饰改变细胞内酶的活性，即激活糖原分解和糖异生的关键酶，抑制糖原合成和糖氧化的关键酶，使血糖升高。 肾上腺素

丙酮酸(PA)含量检测试剂盒说明书 可见分光光度法

丙酮酸（PA）含量检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号：BC2200 规格：50T/48S 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体9mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：液体50mL×1瓶，4℃保存； 丙酮酸钠标准液，1mg/mL：液体1mL×1瓶，4℃保存。 产品说明： 丙酮酸通过乙酰CoA连接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代谢，起着重要的枢纽作用。 丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，在碱性溶液中呈樱红色。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水。 操作步骤： 一、丙酮酸提取： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提 取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），静置30min，8000g，常温离心10min，取上清待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取 液），进行冰浴匀浆，静置30min，8000g，常温离心10min，取上清待测。 3、血清（浆）样品：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议取0.1mL血清 （浆）加入1mL提取液），进行冰浴匀浆，静置30min，8000g，常温离心10min，取上清待测。 4、标准品的准备：将标准品用蒸馏水稀释至100、50、2 5、12.5、6.25、3.125、1.5625、0g/ml。

丙酮酸发酵整理

一、丙酮酸的用途及制备方法 丙酮酸（Pyruvic acid），又称2-氧代丙酸（2-oxopropanoic acid）、α-酮基丙酸（α-ke topropionic acid）或乙酰基甲酸（Acetylformic acid），为无色至淡黄色液体，呈醋酸香气和愉快酸味，是最重要的α-氧代羧酸之一。丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且是多种有用化合物的前体，因此，它在化工、制药和农用化学品等工业及科学研究中有着广泛的用途，如表1所示。 表1 丙酮酸的主要用途 用途实例用途实例 制药工业 酶法合成L- 色氨酸、L- 酪 氨酸、L- 多巴；合成L- 半胱氨 酸、L- 亮氨酸、维生素 B 6 和 B 12 等。 生化 研究 用于伯醇及仲醇的检定；转氨酶 的测定；是脂肪族胺的显色剂等。 农用化学品 是合成乙烯系聚合物、氢化阿 托酸、古物保护剂等多种农药的起 始原料。 细胞 培养 与乳酸组成抗氧化剂，降低对细 胞的伤害；是动物细胞培养的重要底 物。 食品工业 GB2760-1996 规定为酸味 添加剂。近年来由于在减肥上有特 效而受到西方消费者青睐。 传感 器 与乳酸、锂构成人工胰脏，作为 体外传感器测定葡萄糖的含量。 虽然作为一种化工产品，丙酮酸早已实现了工业化生产，但是，直到20世纪90年代，工业上生产丙酮酸还都在沿用Howard and Fraser(1932)开发的酒石酸脱水脱羧法，没有什么大的改进。这种工艺简单易行：将酒石酸与硫酸氢钾混合物在220℃下蒸馏，馏出物再经真空精馏即可得到丙酮酸。其主要缺点是：（1）丙酮酸产率较低（对酒石酸质量产率为0.29~0.30g/g）；（2）得到1g丙酮酸需要消耗5g硫酸氢钾。以目前酒石酸（1.5万元/吨）和硫酸氢钾（0.6万元/吨）的市场价格计算，仅原料成本就至少需要8万元/吨，为此，在很长一段时间内，丙酮酸的价格居高不下，推广应用自然也受到限制。以丙酮酸在食品工业中的应用为例，尽管它是一种很有潜力的酸味剂，但由于其在价格上与其它有机酸相比过于昂贵，因此，几乎没有厂家愿意在饮料或食品中添加丙酮酸来改善风味。 一个昂贵的产品在生产过剩的时候，其价格必然下降。1995年，国外一些研究机构发表了关于丙酮酸钙在减肥保健上具有独特疗效的报道后，国外（主要是美国）对丙酮酸钙的需求量激增。国内一些中小型化工厂得到这一信息后，一拥而上，一时间，国内丙酮酸（化学法）的生产能力达到2000吨/年左右（估算数据）。丙酮酸及其盐的市场价格也由当时的28万元/吨跌至目前的不到9万元/吨。已经有许多采用化学法生产丙酮酸的小型化工厂因不能承受这一价格而被迫停产。目前，只有试剂级丙酮酸的价格还比较高，保持在30~32元/ 100ml。 如何解决丙酮酸的市场需求在不断扩大，但其价格却无法进一步下降这一矛盾呢？显然，开发成本更低的丙酮酸生产技术，如直接发酵法或生物转化法，是解决这一问题的根本出路。其实，早在20世纪50年代，在丙酮酸的化学法生产工艺尚未遭遇成本危机的时候，学术界已经开始对发酵法生产丙酮酸进行研究了。然而，由于丙酮酸高产菌株的选育十分困难，因此，尽管有一些微生物能够积累丙酮酸，但其产量（质量浓度）无法达到工业化的要求。发酵法生产丙酮酸真正取得突破，是在1988年。当时，日本东丽工业株式会社（Tora y Industries Inc.）的研究人员宫田令子（Miyata Reiko）和米原辙（Yonehara Tets u）选育出一系列丙酮酸产量超过50g/l的球拟酵母（Torulopsis）菌株，使得发酵法生产

实验十二：丙酮酸含量的测定

实验十二：植物组织中丙酮酸含量的测定 （2,4 一二硝基苯肼法） 一、目的 丙酮酸是一种重要的中间代谢物。通过本实验掌握测定植物组织中丙酮酸含量的原理和方法，增加对代谢的感性认识。 二、原理 植物样品组织液用三氯乙酸除去蛋白质后，其中所含的丙酮酸可与 2,4- 二硝基苯肼反应，生成丙酮酸－2，4 －二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈樱红色，其颜色深度可用分光光度计测量。与同样处理的丙酮酸标准曲线进行比较，即可求得样品中丙酮酸的含量。 三、仪器、试剂和材料 1 .仪器 分光光度计、离心机、容量瓶（ 25 ml ）、研钵、试管、刻度吸管、电子天平 2 .试剂 （ 1 ） 1.5 mol/L NaOH （ 2 ） 8% 三氯乙酸（当日配制置冰箱中备用） （ 3 ） 0.1% 2,4 一二硝基苯肼：称取 2，4 －二硝基苯肼 100mg, 溶于 2mol/L HCl 中使成 100ml ，盛入棕色试剂瓶，保存于冰箱内。 （ 4 ）丙酮酸标准液（ 60ug/ml ）：精确称取 7.5 mg 丙酮酸钠，用 8 ％三氯乙酸溶解并定容至 l00ml 保存于冰箱内。 3 .材料 大葱、洋葱或大蒜的鳞茎。 四、操作步骤 1. 植物材料提取液的制备 称取约1.5g 植物材料（记录实际重量）于研钵内，加适量 8% 三氯乙酸研磨成匀浆，再用 8% 三氯乙酸全部洗入到 25ml 容量瓶并定容到刻度。塞紧瓶塞，振摇提取，静置 30min 。过滤或离心（3000r/mim.5分钟），滤液（上清液）备用。

2. 丙酮酸标准曲线的制作及样品液的测定 取 8 支试管，按下表依次加入试剂及提取液： 在上述各管中摇匀，显色10min 后，以1号试管调零，在 520nm 波长下比色，记录各管的吸光度值。以1-6号试管内的丙酮酸含量为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标，作标准曲线。根据样品液吸光度值的平均值，在标准曲线上查得丙酮酸含量（也可以用EXCEL 处理数据，用公式计算），并根据下列公式计算100克样品组织中丙酮酸的含量。 样品中丙酮酸含量（mg / g 鲜重）= ──────────────── 式中， A 为在标准曲线上查得的丙酮酸的微克数。 五、注意事项 1. 所加试剂的顺序不可颠倒，先加丙酮酸标准液或待测液，再加 8% 三氯乙酸，然后加0.1％的 2.4 —二硝基苯肼液，最后加 1.5mol/L NaOH 。 2 .需要反应 10min 后再比色。 A × 提取液的总体积 ──────── 测定时取用的体积 样品重（g ）× 1000

丙酮酸测定试剂盒(酶法)产品技术要求haomai

丙酮酸测定试剂盒（酶法） 适用范围：本试剂盒用于体外定量测定人血清中丙酮酸（PYR）的浓度。 1.1包装规格 1.2主要组成成分 本试剂由试剂1（R1）和试剂2（R2）组成 试剂1（R1）： Tris 100mmo l/L LDH 500U/ L

TritonX-100 0.5g/L BSA 2g/L 叠氮钠 0.5g/L 试剂2（R2）： TRIS 100mmo l/L NADH 0.8g/L 叠氮钠 0.5g/L 2.1 外观 试剂盒各组分应齐全、完整、液体无渗漏；外包装完好、无破损，标签完好、字迹清晰；R1试剂应为无色澄清液体，R2试剂应为无色或淡黄色澄清液体。液体试剂不得有沉淀和絮状物。 2.2 净含量 用通用量具测量，液体试剂的净含量应不少于标示值。 2.3 试剂空白 在340nm处测定试剂空白吸光度，应≥0.5A。 2.4 分析灵敏度 测试300umol/L的被测物时，吸光度变化（ΔA）应不低于0.04A。 2.5 准确性 参照EP9-A2的方法，用比对试剂盒同时测试40例线性范围内的不同浓度的血清样本，其相关系数（r）不小于0.990；每个浓度点在[30,100)umol/L范围内绝对偏差不超过±10umol/L；[100,1000]umol/L范围内相对偏差不超过±10%。

2.6 重复性 用两个水平的样本检测，检测结果批内变异系数（CV）应不超过5％。 2.7 线性 2.7.1在[30,1000]umol/L范围内，线性相关系数r应不低于0.990； 2.7.2 在[30,100)umol/L范围内绝对偏差不超过±10umol/L； [100,1000]umol/L范围内相对偏差不超过±10%。 2.8 批间差 对同一份样品进行重复测定，相对极差≤10％。 2.9 稳定性 该产品在2℃～8℃条件下贮存有效期为12个月，取到效期后的产品进行检测，应符合2.1、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7的要求。

丙酮酸的测定方法

实验七丙酮酸含量的测定 一、实验目的 掌握植物组织中丙酮酸含量测定的原理和方法。 二、实验原理 植物样品中的组织液，用三氯乙酸去蛋白质后，其中所含的丙酮酸可与2,4—二硝基苯肼作用，生成丙酮酸—2,4—二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈樱红色，其颜色可用分光光度计测量，与已知丙酮酸标准曲线进行比较，即可求得样品中丙酮酸的含量。 三、实验器材与试剂 1、.实验器材 分光光度计；研钵；具塞刻度试管：20mL×8；容量瓶：100mL×2；移液管：1mL×1 5mL×4； 量筒：10mL×1；离心机；天平； 大蒜、大葱或洋葱 2、试剂 （1）8%三氯乙酸(当日配制置冰箱中备用) （2）1.5mol/L氢氧化钠 （3）0.1%2,4—二硝基苯肼:称取2.4—二硝基苯肼100mL，溶于2mol/LHCl中配成100mL溶液，盛入棕色试剂瓶，保存于冰箱内。 （4）丙酮酸钠 四、实验操作步骤 1.丙酮酸标准曲线的制作： 称取丙酮酸钠7.5mg于烧杯中，用8%三氯乙酸溶解，转入100mL容量瓶中，并用8%三氯乙酸定容，此液为60μg /mL的丙酮酸原液。 取6支试管，按下表数据配制不同浓度的丙酮酸标准液： 在上述各试管中分别加入1.0mL0.1%的2,4—二硝基苯肼，摇匀，再加5mL 1.5mol/L的氢氧化钠溶液，摇匀显色，在520nm波长下比色。做标准曲线。 2.植物样品组织液的提取： 称取植物样品（大蒜、大葱或洋葱）5g，于研钵中加入少许石英沙及少量8%三氯乙酸，仔细研成匀浆，再用8%三氯乙酸洗入100mL容量瓶中（沙留在研钵内），定容至刻度。静置30 min，取10mL匀浆液离心（4000r/min）10min，取上清液备用。 3.组织液中丙酮酸的测定 取3mL上清液于一刻度试管中，加2mL8%三氯乙酸，加1.0mL0.1%的2,4—二硝基苯肼溶液，摇匀，再加5mL 1.5mol/L氢氧化钠溶液，摇匀显色。在520nm波长下比色，记录吸光度，在标准曲线上查得丙酮酸的含量。 五、结果处理

糖酵解产生的丙酮酸和NADH的去路

糖酵解产生的丙酮酸和NADH 的去路：有氧情况下丙酮酸从胞质进入线粒体，进行有氧代谢。而EMP 途径生成NADH 由于不能及时被氧化成NAD+而有可能导致EMP 途径第6步反应缺少辅酶NAD+而使反应速度下降（细胞中的辅酶分子是有限的，必须循环使用。NADH 须随时恢复其氧化状态NAD +，才能周而复始地参与此类酶的催化反应）。又由于NADH 不能直接进入线粒中进行氧化，所以它必须将氢转移给能穿过线粒体膜的受氢体，通过受氢体的转运而把氢从胞质带入线粒体内，这种作用称为穿梭作用。目前了解比较多的是苹果酸穿梭作用（见图8-2）和3-磷酸甘油穿梭作用（见图8-3）。这两种作用使胞质中的NADH 氧化为NAD +，使其浓度恢复到反应前的水平。氧化脱下的氢以穿梭分子的一 部分被带到线粒体内,并在呼吸链中氧化生成水且伴有氧化磷酸反应产生能量货币物质ATP 。 H 2 C OH H C OH H 22C OH C =O 2C-O-NDH + NADH+ H + H 2C OH H C OH H 2C-O-H 2C OH C =O H 2C-O-胞液 线粒体衬质 外膜 图8-3 3-磷酸甘油穿梭 FPG ：内膜3-磷酸甘油脱氢酶；Fpi ：（FPint ）：内NADH 脱氢酶 图8-2 苹果酸穿梭作用（Ⅰ.苹果酸-α酮戊二酸反向载体蛋白，Ⅱ.天冬氨酸-谷氨酸反向载体蛋白） 线粒体衬质 NAD + 2

生成乙酰辅酶A：丙酮酸在有氧气和线粒体存在时进入线粒体，经丙酮酸脱氢酶复合体（表5-1-2）催化氧化脱羧产生NADH、CO2和乙酰辅酶A，乙酰辅酶A进入三羧酸循环和氧化磷酸化彻底氧化为CO2和H2O，释放的能量在此过程中可产生大量ATP。这是糖的有氧氧化过程。糖的有氧氧化是机体获得ATP的主要途径。 表5-1-2 丙酮酸脱氢酶复合体的组成 丙酮酸生成乙酰辅酶A的反应是糖有氧氧化过程中重要的不可逆反应（图4-1-14）。丙酮酸脱氢产生NADH+H+，释放的自由能则贮于乙酰辅酶A中。乙酰辅酶A可参与多种代谢途径。 丙酮酸脱氢酶系的多种辅酶中均含有维生素，TPP中含有维生素B1，辅酶A（HSCoA）中含有泛酸，FAD含有维生素B2，NAD+含尼克酰胺（维生素PP）。所以，当这些维生素缺乏，特别是维生素B1缺乏时，丙酮酸及乳酸堆积，能量生成减少，可发生多发性末梢神经炎，严重时可引起典型脚气病。

丙酮酸测定试剂盒(乳酸脱氢酶法)产品技术要求baiding

丙酮酸测定试剂盒(乳酸脱氢酶法) 适用范围：用于体外定量测定人血清中丙酮酸的含量。1.1规格 校准品(选配)：1×1mL； 质控品(选配)：水平1：1×1mL，水平2：1×1mL。 1.2组成：

注：校准品靶值、质控品质控范围详见包装标签。 2.1 外观 2.1.1试剂1：无色液体，无浑浊，无不溶物。 2.1.2试剂2：无色液体。 2.1.3校准品：无色至淡黄色液体。 2.1.4质控品：无色至淡黄色液体。 2.1.5包装外观应整洁，标签字迹清晰，不易脱落。 2.2 净含量 液体试剂的净含量不低于标示体积。

2.3 试剂空白吸光度 试剂空白吸光度≥0.5。 2.4 分析灵敏度 样本浓度为200 μmol/L时，△A≥0.02。 2.5 线性区间 在[30，1000] μmol/L范围内，线性相关系数r≥0.990；测试浓度在[30，100] μmol/L时，绝对偏差不超过±10 μmol/L，测试浓度在（100，1000] μmol/L时，相对偏差应不超过±10%。 2.6 精密度 2.6.1 批內精密度 用高、中、低3个浓度的样本测试试剂盒，各重复测试10次，其变异系数（CV）应不大于10%。 2.6.2批间差 用样本分别测试3个不同批次的试剂盒，每个批次测试3次，其相对极差（R）应不大于10%。 2.7 准确度 回收率在85%-115%范围内。 2.8 质控品赋值有效性 测试结果在质控范围内。 2.9 瓶内均匀性 校准品和质控品瓶内均匀性（CV）应不大于10%。 2.10 量值溯源

校准品量值溯源至公司内部工作校准品，并与北京九强生物技术股份有限公司生产的丙酮酸测定试剂盒(乳酸脱氢酶法)比对验证。 2.11 稳定性 2.11.1校准品开瓶稳定性 校准品开瓶后2℃～8℃避光保存可稳定3天。稳定期过后4小时内进行测试，测试结果与靶值的相对偏差不超过±10%。 2.11.2质控品开瓶稳定性 质控品开瓶后2℃～8℃避光保存可稳定3天。稳定期过后4小时内进行测试，应满足 2.8的要求。 2.11.3效期稳定性 原包装试剂盒在2℃～8℃避光保存条件下有效期为12个月。有效期满后3个月内测试，应满足2.3、2.4、2.5、2.6.1、2.7和2.8的要求。

丙酮酸含量的测定

实验八丙酮酸含量的测定 一、目的 丙酮酸是一种重要的中间代谢物。通过本实验掌握测定植物组织中丙酮酸含量的原理和方法，增加对代谢的感性认识。 二、原理 植物样品组织液用三氯乙酸除去蛋白质后，其中所含的丙酮酸可与 2,4- 二硝基苯阱反应，生成丙酮酸一 2 ， 4 一二硝基苯踪，后者在碱性溶液中呈樱红色，其颜色深度可用分光光度计测量。与同样处理的丙酮酸标准曲线进行比较，即可求得样品中丙酮酸的含量。 三、仪器、试剂和材料 1 .仪器 （ 1 ）分光光度计 （ 2 ）离心机（ 4000r/min) （ 3 ）容量瓶（ 25 ml ） （ 4 ）研钵 （ 5 ）具塞刻度试管（ 15 ml ) （ 6 ）刻度吸管（ 1ml ， 5 ml ) （ 7 ）电子顶载天平 2 .试剂 （ 1 ） 1.5 mol/L NaOH （ 2 ） 8% 三氯乙酸（当日配制置冰箱中备用） （ 3 ） 0.1% 2,4 一二硝基苯肼：称取 2 ， 4 一二硝基苯肼 100mg, 溶于 2mol/L HCl 中使成 100ml ，盛入棕色试剂瓶，保存于冰箱内。 （ 4 ）丙酮酸标准液（ 60ug/ml ）：精确称取 7 . smg 丙酮酸钠，用 8 ％三氯乙酸溶解并定容至 l00ml 保存于冰箱内。 3 .材料 大葱、洋葱或大蒜的鳞茎。 四、操作步骤 1 .丙酮酸标准曲线的制作 取 6 支试管，按下表加入试剂： 管号 1 2 3 4 5 6 丙酮酸标准液（ ml ）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 8% 三氯乙酸（ ml ） 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 丙酮酸含量（ ug ）0 12 24 36 48 60 在上述各管中分别加入 1.0ml 0.1 ％的 2 ， 4 —二硝基苯肼液，摇匀，再加入5ml1.5mol/LNaOH 溶液，摇匀显色，在 520nm 波长下比色。作标准曲线。 2 .植物材料提取液的制备 称取 1g 植物材料（大葱、洋葱或大蒜）于研钵内加适量 8% 三氯乙酸，仔细研成匀浆，再用 8% 三氯乙酸洗入 25ml 容量瓶，定容至刻度。塞紧瓶塞，振摇提取，静置 30min 。取约 10ml 匀浆液离心（ 4000 r/min ） 10min ，上清液备用。 3 .组织液中丙酮酸的测定 取 1. 0ml 上清液于一刻度试管中，加 2ml 8 ％三氯乙酸，加 1.0ml 0 . 1 ％ 2 ， 4 －