动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择

大规模细胞培养技术

大规模细胞培养技术简介 大规模培养技术应用简介通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。上世纪60-70 年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织获取生物制品已远远不能满足这一需求。随着细胞培养的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培养技术趋于成熟。 所谓动物细胞大规模培养技术( large-scale culture technology )是指在人工条件下(设定ph、温度、溶氧等) ，在细胞培养工厂 (Cosmo Cat.No. 1101-400 or 1101-800 )或生物反应器( bioreactor )中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho(中华仓鼠卵巢) 细胞、BHK-21( 仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。 在过去几十年来，该技术经有了很大发展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube 等贴壁细胞培养，发展为一次性细胞培养工厂( Made by Cosmo )或生物反应器 (Bioreactor )进行大规模细胞培养。第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。 随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，特别是培养表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。因而必须为工业化生产开创一种新的技术方法。自70 年代以来，细胞培养用生物

动物细胞培养基本操作

实验一动物细胞培养 细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。 细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。 细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等 为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。 本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。 Ⅰ清洗与灭菌 一、实验目的 能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。 二、实验原理 清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。 三、实验材料、用品

制药工艺学期末试卷及答案

《制药工艺学》试卷 班级：学号：姓名： 得分： 一、单选题。（每题2分，共30分）是（）。 A.药品生产质量管理规范 B.药品经营质量管理规范 C.新药审批办法 D.标准操作规程 2.药品是特殊商品，特殊性在于 （）。 A.按等次定价 B.根据质量分为一、二、三等 C.只有合格品和不合格品 D.清仓在甩卖 3.终点控制方法不包括（）。 A.显色法 B. 计算收率法 C.比重 法 D. 沉淀法 4.温度对催化剂活性的影响是（）。 A.温度升高，活性增大 B.温度升高，活性降低 C.温度降低，活性增大 D.开始温度升高，活性增大，到最高速度后，温度升高，活性降低 5.中试一般比小试放大的位数是 （）倍。 ~10 ~30 C.30~50 ~100 6.利用小分子物质在溶液中可通过半 透膜，而大分子物质不能通过的性质，借以达到分离的一种方法是（）。 A.透析法 B.盐析法 C.离心法 D.萃取法 7.液体在一个大气压下进行的浓缩称 为（）A. 高压浓缩 B.减压浓缩 C. 常压浓缩 D.真空浓缩 8.下列不属于氨基酸类药物的是 （） A.天冬氨酸 B.多肽 C.半胱氨酸 D.赖氨酸 9.下列不属于多肽、蛋白质含量测定方法的是（） A.抽提法 B.凯氏定氮法 C.紫外分光光度法 D.福林-酚试剂法 10.下列属于脂类药物的是（）。 A.多肽 B. 胆酸类 C.胰脂酶 D 亮氨酸 11.（）抗生素的急性毒性很低，但副作用较多，另外，对胎儿有致畸作用。 A.四环素类 B.大环内酯类 C.氨基糖苷类 D. β-内酰胺类 12.生产抗生素类药物发酵条件不包括（）。 A.培养基及种子 B.培养温度及时间及通气量 D.萃取及过滤 13.下列不属于动物细胞培养方法的是（）。 A.贴壁培养 B.悬浮培养 C.直接培养 D.固定化培养 14.抗生素类药物生产菌种的主要来源是（）。 A.细菌 B.放线菌 C.霉菌 D.酵母菌 15.将霉菌或放线菌接种到灭菌后的大米或小米颗粒上，恒温培养一定时间后产生的分生孢子称为（）。 A. 米孢子 B.种子罐 C.发酵 D. 试管斜面

高中生物 动物细胞培养和核移植技术教案 新人教版选修3

动物细胞培养和核移植技术 备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课 教学目标 知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。 过程与方法 情感态度 与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激 发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯 物主义观念。 教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景 教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。 教学用具多媒体课件 课时安排1课时 教学内容设计与反思 板书设计:

教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。 （1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养 植物体细胞杂交 （2）植物体细胞杂交的结果是产生了？ （3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？ 二、讲授新课: （一）动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段 动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 （二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形 成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问 题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的 脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神 经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验 不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后， 在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物 细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关 的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的 培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程： 引导学生阅读课文44--46面相关内容。

动物细胞大规模培养技术研究进展

仲恺农业技术学院学报,18(3):64~70,2005 Jou r na l o f Zhongkai University o f Agriculture an d Technology 文章编号:1006-0774(2005)03-0064-07 动物细胞大规模培养技术研究进展 吴方丽1,金伟波2,王保莉2,3,张涌3 (1.西北农林科技大学植物保护学院; 2.西北农林科技大学生命科学学院; 3.西北农林科技大学生物工程研究所,陕西杨凌712100) 摘要:利用动物细胞大规模培养技术可生产多种生物制品,为提高细胞活力和细胞生长密度,采用有多种添加成分的无血清培养基培养细胞,选择既有利于细胞生长又可提高培养细胞密度的微载体和条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器,在线监控细胞生存环境和生理活动,减少培养过程中培养基的抑制因素,从而给细胞提供更好的生存环境;另外通过向细胞中导入抗凋亡基因,可减缓细胞凋亡的发生,提高细胞活性和蛋白产量;此外,在动物细胞大规模培养过程中,利用多孔微载体能高效、大量地增殖细胞,具有良好的应用前景. 关键词:动物细胞;培养环境;生物反应器;微载体 中图分类号:Q251文献标识码:A Research advance in large-scale culture of animal cells W U Fang-li1,JIN We-i bo2,W ANG Bao-li2.3,ZHANG Yong3 (1.College of Plant Protection; 2.College of Life Sciences; 3.Institute of Bio-Eng i neering, Northwest A&F University,Yangling712100,China) Abstract:Many biological products were manufactured by means of large-scale culture of animal cells.To increase cell-specific productivity and cell density,serum-free media supplemented with several nutriments were used for cell culture,and microcarriers were chosen in favor of cell growth and high cell density.Biore-ac tors with simple manipulation,good qualification and aeration were adopted.More suitable conditions for cell gro wth could be given through on-line supervising the environment for cell gro wth and restraint factors in cell culturing.Furthermore,the anti-apoptosis genes using recombinant DNA technology can increase cell viability and productivity.Porous microcarriers was emphasized in large-scale culture of animal cells. Key words:animal cell;culture environment;bioreac tor;microcarrier 组织培养技术是19世纪末由胚胎学技术衍生而来.近一个世纪以来,从能维持组织存活到生长出新细胞,从少数组织到各种组织细胞的培养,从精细的实验室培养技术到大规模的生产工艺,组织培养技术已成为生物制品生产以及基因工程等领域必不可少的工具之一.目前,动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、细胞培养环境的优化、生物反应器的改良、改变细胞特性、提高产品的产出率与保证其质量上. 在动物细胞大规模培养的过程中,最根本的是使细胞的培养条件达到最优化,尽可能消除或减轻环境对细胞的影响,维持细胞高存活力和高效表达.若以生产蛋白为目的的体外细胞培养,同时还要充分考虑细胞表达产物的后续纯化. 收稿日期:2005-04-18 基金项目:国家高技术研究发展计划(863)计划资助项目(2001AA21308);西北农林科技大学重点专题基金资助项目. 作者简介:吴方丽(1979-),女,河南睢县人,助教,博士.

单细胞蛋白饲料的开发与利用

单细胞蛋白饲料的开发与利用 摘要文章概述了单细胞蛋白生产原理,生产单细胞蛋白的微生物种类,以及单细胞蛋白的营养成分,介绍了单细胞蛋白生产的一般工艺,探讨了单细胞蛋白饲料的应用效果及应用中存在的问题及解决办法,最后展望了单细胞蛋白在饲料加工中的应用前景。 关键词单细胞蛋白饲料加工开发与利用 单细胞蛋白( single cell protein) 亦称微生物蛋白、菌体蛋白,是指细菌、真菌和微藻在其生长过程中利用各种基质,在适宜的培养条件下培养细胞或丝状微生物的个体而获得的菌体蛋白(microbial pro2tein) 。随着经济的发展,人民生活水平的提高,人类对蛋白质尤其是营养价值高的动物蛋白质的需求愈来愈多。大量的需求刺激了畜牧业和养殖业的发展,而依靠传统方式提供饲料已不能满足迅猛增长的饲料市场。单细胞蛋白营养物质丰富,菌体中蛋白质含量高达40 %～80 % ,其中氨基酸组分齐全,赖氨酸等必需氨基酸含量较高,同时富含维生素,可作为维生素的替代品。与豆粉相比,单细胞蛋白的蛋白质含量高出 10 %～20 % ,可利用的氮比大豆高20 % , 在有蛋氨酸添加时可利用氮甚至能超过95 %。因此,利用非食用资源和废弃资源(如农副产品下脚料和工业废液等) 开发和推广微生物生产单细胞蛋白成为补充饲料蛋白 质来源不足的重要途径,意义十分重大。 1 单细胞蛋白的种类和来源 目前,可用于单细胞蛋白生产的微生物的种类很多,在选择时从安 全性、实用性、生产效率和培养条件等方面考虑,目前用于生产单细胞蛋白的微生物主要包括4 大类群,即非致病和非产毒的酵母菌、细菌、真菌和微藻。 1. 1 酵母菌 酵母菌是当前生产单细胞蛋白的微生物类群中,最受关注的一类, 也是应用最为广泛的一类。酵母菌蛋白含量高达60 % ,几乎含所有的氨基酸,尤其是赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等必需氨基酸的含量高,而且维生素含量也比较丰富。常用的酵母菌有啤酒酵母和假丝酵母。其中假丝酵母能够同化六碳糖和五碳糖,能忍耐高浓度的SO2 ,菌体中含有高量的蛋白质,并含有大量的赖氨酸和较多的维生素及许多微量元素。 1. 2 细菌 用于生产单细胞蛋白的细菌较多,包括光合细菌和氢细菌。其原料主要为植物性纤维及石油衍生物(如甲醇和乙醇等) 。与其他菌株相比,

(完整word版)2015 动物细胞培养技术实验报告

一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工

动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择

动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择 3 米力陈志南 33 (第四军医大学细胞工程中心国家863西安细胞工程基地西安710032 摘要目前全世界蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求已远远超过了现有生产能力。动物细胞 规模化生产重组蛋白和抗体的工艺选择可考虑使用当前较成熟的工业化支持技术平台,以缩短产品工艺研发的时间,加快工业化进程。当前被FDA 批准的生物技术产品以及公开发表的生产工艺占有主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养,工艺设计是流加或灌流培养。其大规模细胞培养生产所面临的挑战是获得最大生产力的同时注重维持产品的质量;去除所有培养环境中外源因子的污染,更为精确有效的工艺控制手段,规模化培养中氧气的限定与溶解C O 2浓度累积的控制等。关键词动物细胞大规模培养生产蛋白收稿日期:2003204210 3国家重大科技专项(2002AA2Z 3441 33通讯作者,电子信箱:chcerc2@https://www.wendangku.net/doc/7e14397044.html, 动物细胞大规模培养已成为生物制药领域最重要的关键技术之一,并以其研究的深入和进展推动生物技术产业的迅速发展。专家预言:蛋白治疗药物如糖蛋白,抗体和多肽药物仅仅只是开始进入市场,预计在下一个10年或20年会有一个更为快速的发展。蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求 已远远超过目前全世界的生产能力[1] 。

由于动物细胞表达产品需求的紧迫性和生产工艺的复杂性,大大促进了该技术的深入研究与发展。80年代初首先兴起了生物反应器研究,许多形式的生物反应器被用于哺乳动物细胞培养工艺的研究,如中置搅拌系统,固定单层培养和中空纤维系统等。近10年的研究在解决动物细胞大规模培养的关键屏障技术,如限制性氧气的提供,消耗产物的积累,成熟精确的过程控制,剪切力的敏感性,和贴壁细胞培养规模化放大等问题都取得可喜 的进展[2] 。目前动物细胞工业化生产中主要致力于提高单位细胞的生产力,确保产品质量和过程工艺设计的一致性,减少工业化生产中的污染与自动 化控制等[3] 。以转基因动物和转基因植物为载体的重组蛋白生产在生物制药领域仍具有重要的地位,特别对于每年100kg 的超大规模需求量生产。 目前被美国FDA 批准的生物技术产品和已公开发表的生产工艺,都是较为成熟的工艺,并不代表当前动物细胞研究发展的趋势。因此动物细胞大规模培养生产蛋白或抗体的工艺选择,应综合考虑产品特点、工艺难度与工艺研发时间,以加速其产品产业化的进程。 以下就目前动物细胞大规模培养成熟工艺与当前研究的问题、对策作一简述。 1目前美国FDA 批准的产品与生产工艺 1996年1月至2002年12月美国获得成功批 准的不同的治疗剂和诊断剂产品共31种,其中用哺乳动物细胞培养生产的就有21种(美国FDA 网页http :ΠΠw w w.fda.g ov 。蛋白治疗药物有单克隆抗体治疗乳腺癌的Herceptin ,免疫球蛋白肿瘤坏死因子(T NF 受体融合蛋白治疗类风湿性关节炎的Enbrel 和灭活的甲肝疫苗Vaqta 等。动物细胞培养技术已经成为一个受到普遍信任的产业化生产技术,并逐步形成商业化操作水平。按技术应用专利的分类,我

单细胞蛋白生产.doc

目录 1 前言. ................................... 错误 ! 未定义书签。单细胞蛋白饲料的优点 . .............................. 错误 ! 未定义书签。蛋白质含量丰富 . .................................... 错误 ! 未定义书签。原材料来源广泛 . .................................... 错误 ! 未定义书签。生长速度快 . ........................................ 错误 ! 未定义书签。不受季节和气候等条件的影响 . ........................ 错误 ! 未定义书签。细胞蛋白生产的菌种类型 . ............................ 错误 ! 未定义书签。单细胞蛋白的生产工艺的类型 . ........................ 错误 ! 未定义书签。液体深层发酵法[4] ................................... 错误 ! 未定义书签。固体发酵法 . ........................................ 错误 ! 未定义书签。单细胞蛋白饲料的应用 . .............................. 错误 ! 未定义书签。 2 菌种的选育. .............................. 错误 ! 未定义书签。菌种的选取及筛选 . .................................. 错误 ! 未定义书签。菌种的选取 . ........................................ 错误 ! 未定义书签。菌种的采集 . ........................................ 错误 ! 未定义书签。培养菌 . ............................................. 错误 ! 未定义书签。菌种的初筛 . ......................................... 错误 ! 未定义书签。菌种的复筛[11] . ....................................... 错误 ! 未定义书签。诱变育种 . .......................................... 错误 ! 未定义书签。菌种的保藏 . ......................................... 错误 ! 未定义书签。 3 培养基的配制............................. 错误 ! 未定义书签。配置培养基的原则 . .................................. 错误 ! 未定义书签。培养基类型 . ......................................... 错误 ! 未定义书签。孢子培养基 . ........................................ 错误 ! 未定义书签。种子培养基 . ........................................ 错误 ! 未定义书签。发酵培养基 . ......................................... 错误 ! 未定义书签。热带假丝酵母菌的培养基及培养条件 . .................. 错误 ! 未定义书签。培养基的设计 . ....................................... 错误 ! 未定义书签。

动物细胞培养技术 思考题

《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果 器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。 你认为精确配制各种溶液？ 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。

单细胞蛋白及其发酵生产与工艺流程

单细胞蛋白及其发酵生产与工艺流程 一、单细胞蛋白 1、单细胞概述 单细胞生物产生的细胞蛋白质称为单细胞蛋白(single cell protein简称SCP)，这一词是1966年在美国麻省理工学院命名的。它所包含的产品有饲用酵母，食用酵母和药用酵母三大类。单细胞蛋白是解决世界蛋白质不足的一个重要途径。与用农牧业生产的蛋白质相比，它的生产占用土地甚少，投资较省。它的营养丰富．售价亦较适宜，是良好的饲用和食用蛋白资源。对于人多地少的我国来说，建立单细胞蛋白产业对改善人民食物构成和生物技术的开发，都具有重要的意义。 2、单细胞蛋白的含义及氨基酸组成 单细胞蛋白（Single—Cell—Protein，简称SCP）是从酵母或细菌等微生物菌体中获取的蛋白质。微生物细胞中含有丰富的蛋白质，例如酵母菌蛋白质含量占细胞干物质的45%～55%；细菌蛋白质占干物质的60%～80%；霉菌丝体蛋白质占干物质的30%～50%；单细胞 藻类如小球藻等蛋白质占干物质的55%～60%，而作物中含蛋白质最高的是大豆，其蛋白质含量也不过是35%～40%。单细胞蛋白的氨基酸组成不亚于动物蛋白质，如酵母菌体蛋白，其营养十分丰富，人体必需的8种氨基酸，除蛋氨酸外，它具备7 种，故有“人造肉”之称。一般成人每天吃干酵母10～15g，蛋白质的需要量就足够了。微生物细胞中除含有蛋白质外，还含有丰富的碳水化合物以及脂类、维生素、矿物质，因此单细胞蛋白营养价值很高。 3、生产单细胞蛋白的原料 生产单细胞蛋白的原料种类很多，大体分为3类。 （1）工业废液类 包括造纸废液、酒精废液、味精废液、淀粉废液、生产柠檬酸废液、糖蜜废液、木材水解废液、豆制品废液等。 （2）工农业糟渣类 包括白酒糟、啤酒糟、果酒渣、醋糟、酱油糟、豆渣、粉渣、玉米淀粉渣、药渣、甜菜渣、甘蔗渣、果渣、饴糖渣等。 （3）化工产品类 包括石油、石蜡、柴油、天然气、正烷烃、甲醇、乙醇、醋酸等。 除以上所介绍的外，农作物秸秆、批壳、饼粕类、畜禽粪便、有机垃圾、风化煤等也可作为原料生产单细胞蛋白。 4、单细胞蛋白的生产特点

固定化动物细胞大规模培养技术研究进展

固定化动物细胞大规模培养技术研究进展 石　凯1 　熊晓辉1 　许建生 2 (1南京工业大学制药与生命科学学院,南京,210009;2苏州农业职业技术学院,苏州,215008) 摘　要　介绍了固定化动物细胞培养过程中主要的技术及其进展,包括吸附、包埋、中空纤维、微囊化等。并在此基础上探讨了固定化动物细胞培养中尚存在的问题以及未来的发展方向。关键词　固定化,动物细胞培养,吸附,微载体,包埋,中空纤维,微囊化 中图分类号　Q 813.1+1 文献标识码　A 文章编号　1000-6613(2002)08-0556-04 固定化技术作为实现动物细胞大规模培养的重要途径,相对悬浮培养而言具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强、产物易于收集和分离纯化、对贴壁型和非贴壁型细胞都适用的优点,因此在动物细胞的大规模培养上得到越来越广泛的应用,相继出现了微载体、中空纤维及微囊化等多种固定化培养技术。本文作者将结合动物细胞的培养特性,介绍目前动物细胞大规模培养中的固定化技术。 1　动物细胞的特点及生长特性 动物细胞虽可像微生物细胞一样,在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养,但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比,有显著差别[1]:①动物细胞比微生物细胞大得多,无细胞壁,机械强度低,对剪切力敏感,适应环境能力差;②倍增时间长,生长缓慢,易受微生物污染,培养时须用 抗生素;③培养过程需氧量少(氧传质系数k L a 大于10h -1即可满足每毫升107个细胞的生长);④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在;⑤原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡;⑥代谢产物具有生物活性,生产成本高,但附加值也高。 动物细胞根据其在体外培养时对生长基质的依赖性差异,分为锚地依赖性和非锚地依赖性。大多数分泌药用蛋白的动物细胞属于锚地依赖性细胞,即要有足够地支持细胞贴壁的表面,又要保持均匀悬浮状态。固定化技术就是解决这两个问题的有效途径。 2　固定化培养方法 在传统的固定化酶技术中,常采用戊二醛、聚丙烯酰胺、聚氨酯等作为固定化细胞载体。但在动物细胞培养中,培养细胞的目的不仅仅要求催化活 力,更重要的是利用细胞来合成和分泌蛋白,因此如何保持细胞的活性显得尤为重要。由于动物细胞的极度敏感性,上述这些固定化方法会对动物细胞 产生毒性,另外多糖(如卡拉胶等)由于具有很高的离子强度也会对细胞产生毒害。故在动物细胞培养中要考虑使用较温和的固定化方法,如吸附、包埋、中空纤维或胶囊化。2.1　吸附2.1.1　多孔陶瓷 KC.Biologicals (USA )公司开发了一种完全自 动化的细胞培养系统[2]。该系统的核心是陶质矩形蜂窝状生物反应器。反应器构型是一圆筒内装置有许多陶质矩形通道的蜂窝状圆柱体。通道长30cm ,截面积是长方形,约为1mm 2,壁厚0.12mm ,可提供4.25m 2的生长表面积。这种结 构的生物反应器,既可用于培养悬浮生长的细胞,又可用于培养贴壁依赖性细胞。 该系统可以连续化生产蛋白质。由于产物直接分泌到培养基中,给分离纯化带来方便。而且细胞不用从培养基中分离,所以不必考虑梯度问题;当培养基高速循环时,可以保持相对恒定的营养物和氧浓度。增加套数即可实现放大。2.1.2　微载体 微载体细胞培养法是一种用于培养锚地依赖性细胞的大规模培养技术,由Van Wezel [3]于1967年首创。这种培养技术是在生物反应器内加入培养 液和一种对细胞无毒害作用的材料支撑的颗粒(微载体),使细胞在微载体表面附着和生长,并通过不断搅拌使微载体保持悬浮状态。培养液中大量的 收稿日期　2001-12-07;修改稿日期　2002-03-05。 第一作者简介　石凯(1977—),男,硕士研究生。电话025-*******-3716。 ? 655? 2002年第21卷第8期　化 工 进 展 CHEMICAL INDUSTR Y AND EN GIN EERIN G PRO GRESS

动物细胞培养常用方法

一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G 1 期（DNA合成前期），S 期（DNA合成期），G 2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G 1 期为起点， 那么细胞增殖周期的各时期应循着G 1-S-G 2 -M的顺序进行，G 1 、S、G 2 三期合称为 细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G 1期+S期+G 2 期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度

动物细胞培养及应用发展史

细胞培养技术

细胞培养发展史及其应用 （一）前言 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。 由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。 （二）细胞培养技术及其历史 细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。 1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。

动物细胞培养技术实验

实验十五动物细胞培养技术及其应用 一．实验目的 通过本实验使学生掌握细胞培养、细胞检测和细胞表达等成套技术的原理和方法。 二. 实验内容 1.培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏等基本技术； 2.细胞生长曲线测定、细胞活性检测等常用技术； 3.细胞污染检测方法与技术； 4.病毒在细胞中的感染与增殖、重组病毒异源蛋白的细胞表达等实用技术。 三．实验用品 1. 材料：Sf 细胞、Hi5 细胞等 2. 器材：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、培养基抽滤装置、电泳仪、离心机、pH 计、液氮罐（含液氮）、水浴锅、温度计、培养瓶、血清瓶、5 ml和10 ml 移液 管、不锈钢移液管筒、大小不锈钢饭盒、酒精灯、吸耳球、血球计数板、96孔板、 24孔板、无菌冻存管、离心管、记号笔、一次性过滤器、微量加样器、精密pH 试纸、酒精棉球等 3. 试剂与药品：Grace培养基、胎牛血清、甘油、DMSO、双抗（青霉素、链霉素）100 u/ml、 Hank’s液、胰蛋白酶、台盼蓝、液氮、分析纯无水酒精、95%医用酒精、Tris 碱、硼酸、EDTA、琼脂糖粉（电泳用）、dNTPs、Taq酶、支原体检测试剂盒、 DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue kit （Qiagen）等。 四．实验方法与步骤 （一）培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏 1. 缓冲液及培养基配制 Hank’s液：KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml，高压灭菌。4℃下保存。 胰蛋白酶液： 称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s 液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。 4%台盼蓝染液：称取台盼蓝4克，加双蒸水至100 ml。 MTT溶液：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的Hank’s液中。4℃下保存。Grace培养基：取一份GIBCO公司的Grace培养基粉剂，按说明用量加入1000ml三蒸水100单位／毫升青、链霉素，充分混匀使溶解，调节pH值至6.8左右。 0.22 μm 滤膜抽滤除菌，4℃下保存。此为基础培养基。使用前加入10%胎牛 血清。 细胞冻存液：基础培养基加入10%DSMO，20%胎牛血清，用前配制。 PBS缓冲液：137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.1 mmol/L Na2HPO4, 1.5 mmol/L KH2PO4,

单细胞蛋白的生产

目录 1 前言 (2) 单细胞蛋白饲料的优点 (2) 1.1.1蛋白质含量丰富 (2) 1.1.2原材料来源广泛 (3) 1.1.3生长速度快 (3) 1.1.4不受季节和气候等条件的影响 (3) 细胞蛋白生产的菌种类型 (3) 单细胞蛋白的生产工艺的类型 (4) 1.3.1液体深层发酵法[4] (4) 1.3.2固体发酵法 (4) 单细胞蛋白饲料的应用 (4) 2 菌种的选育 (5) 菌种的选取及筛选 (5) 2.1.1菌种的选取 (5) 2.1.2菌种的采集 (6) 2.1.3培养菌 (6) 2.1.4菌种的初筛 (6) 2.1.5菌种的复筛[11] (6) 诱变育种 (7) 菌种的保藏 (7) 3 培养基的配制 (8) 配置培养基的原则 (8) 培养基类型 (8) 3.2.1孢子培养基 (8) 3.2.2种子培养基 (9) 3.2.3发酵培养基 (9) 热带假丝酵母菌的培养基及培养条件 (9) 培养基的设计 (10) 3.4.1碳源 (10) 3.4.2 氮源 (10) 3.4.3 水 (10) 3.4.3无机盐及微量元素 (10) 4 灭菌 (11) 仪器灭菌 (11) 培养基灭菌 (11) 4.2.1分批灭菌 (12) 4.2.2连续灭菌 (12) 空气除菌 (12) 发酵罐除菌 (12) 5 种子扩大培养 (13) 实验室种子的制备 (13)

生产车间种子制备 (13) 6 发酵罐的工艺设计 (14) 发酵罐的结构 (14) 发酵罐的工艺尺寸 (15) h-底封头或顶封头高度 (15) 6.2.1发酵罐的工艺计算 (16) 6.2.2物料衡算 (17) 7 发酵工艺控制[16] (17) 发酵过程温度的影响及控制 (17) pH对假丝酵母生长的影响 (18) KH2P04含量对假丝酵母生长的影响 (18) 氧气对酵母菌生长的影响 (18) 染菌的控制 (19) 8下游加工 (19) 预处理和固液分离 (19) 提取和干燥 (20) 参考文献 (22) 20

制药工艺期末试卷带答案

《制药工艺学》试卷(A卷) 班级：学号：姓名：得分： 一、单选题。（每题2分，共30分） 1.GMP是（）。 A.药品生产质量管理规范 B.药品经营质量管理规范 C.新药审批办法 D.标准操作规程 2.药品是特殊商品，特殊性在于（）。 A.按等次定价 B.根据质量分为一、二、三等 C.只有合格品和不合格品 D.清仓在甩卖 3.终点控制方法不包括（）。 A.显色法 B. 计算收率法 C.比重法 D. 沉淀法 4.温度对催化剂活性的影响是（）。 A.温度升高，活性增大 B.温度升高，活性降低 C.温度降低，活性增大 D.开始温度升高，活性增大，到最高速度后，温度升高，活性降低 5.中试一般比小试放大的位数是（）倍。 A.5~10 B.10~30 C.30~50 D.50~100 6.利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过的性质，借以达到分离的一种方法是（）。 A.透析法 B.盐析法 C.离心法 D.萃取法 7.液体在一个大气压下进行的浓缩称为（） A. 高压浓缩 B.减压浓缩 C. 常压浓缩 D.真空浓缩 8.下列不属于氨基酸类药物的是（） A.天冬氨酸 B.多肽 C.半胱氨酸 D.赖氨酸 9.下列不属于多肽、蛋白质含量测定方法的是（） A.抽提法 B.凯氏定氮法 C.紫外分光光度法 D.福林-酚试剂法 10.下列属于脂类药物的是（）。 A.多肽 B. 胆酸类 C.胰脂酶 D 亮氨酸11.（）抗生素的急性毒性很低，但副作用较多，另外，对胎儿有致畸作用。 A.四环素类 B.大环内酯类 C.氨基糖苷类 D. β-内酰胺类 12.生产抗生素类药物发酵条件不包括（）。 A.培养基及种子 B.培养温度及时间 C.PH及通气量 D.萃取及过滤 13.下列不属于动物细胞培养方法的是（）。 A.贴壁培养 B.悬浮培养 C.直接培养 D.固定化培养 14.抗生素类药物生产菌种的主要来源是（）。 A.细菌 B.放线菌 C.霉菌 D.酵母菌 15.将霉菌或放线菌接种到灭菌后的大米或小米颗粒上，恒温培养一定时间后产生的分生孢子称为（）。 A. 米孢子 B.种子罐 C.发酵 D. 试管斜面 二、多选题（每题3分，共45分） 1.世界化学制药工业发展趋向为（） A.高技术 B.高投入和高效率 C.高产量 D.高质量 E.高速度 2.下列属于化学制药生产工艺路线改革的有（） A.原料的改革 B.寻找反应薄弱环节 C.反应后处理方法的影响 D.新技术的应用 3.下列哪些是搅拌的作用（） A.加速传质 B.加速传热 C.加速反应速度 D.增加副反应 4.中试放大的基本方法包括（） A.经验放大法 B.相似放大法 C.数学模拟法 D.理论计算法 5.化学灭菌法有（）灭菌法。 A.环氧乙烷 B.湿热 C.表面 D.热空气 6.常用的分离方法有（）。 A.离心法 B.沉淀法 C.回流法 D.过滤法 7.生物药物的主要来源有（） A.动物脏器和植物 B.血液、分泌物和其他代谢产物 C.海洋生物 D.微生物