蛋白酪氨酸激酶小分子抑制剂的研究新进展
2011年第31卷
有 机 化 学
V ol. 31, 2011 * E-mail: yqlong@https://www.wendangku.net/doc/8c1827638.html,
Received December 29, 2010; revised February 28, 2011; accepted March 28, 2011. 国家自然科学基金(No. 81021062)资助项目.
·综述与进展·
蛋白酪氨酸激酶小分子抑制剂的研究新进展
王 勇 龙亚秋*
(中国科学院上海药物研究所新药研究国家重点实验室 上海 201203)
摘要 酪氨酸激酶在细胞的恶性生长和增殖中起着非常重要的作用, 发展选择性的蛋白激酶抑制剂来阻断或调控由于这些信号通路异常产生的疾病已被广泛认为是抗肿瘤药物开发的一个富有前景和有效的研究策略. 近年来科学家在蛋白酪氨酸激酶抑制剂这一领域进行了大量的工作, 合成了数百个受体型或者非受体型酪氨酸激酶抑制剂, 其中8个小分子抑制剂被美国食品药品管理局(FDA)批准作为抗肿瘤药物进入临床使用. 随着肿瘤多重耐药性的出现, 新机理的小分子酪氨酸激酶抑制剂被不断探索. 以小分子抑制剂与酪氨酸激酶不同的作用模式来进行分类, 系统地阐述了小分子酪氨酸激酶抑制剂的研究进展和发展趋势, 并对代表性化合物的合成进行了介绍.
关键词 酪氨酸激酶; 抑制剂; 肿瘤; DFG motif (天冬氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸模段); 分子靶向药物
Advances in Small-Molecule Inhibitors of Protein Tyrosine Kinases
Wang, Yong Long, Yaqiu *
(State Key Laboratory of Drug Research , Shanghai Institute of Materia Medica , Chinese Academy of Sciences ,
Shanghai 201203)
Abstract Protein tyrosine kinases (PTKs) play a pivotal role in the signal transduction pathways, and their deregulation is highly related with the oncology including bladder, breast, colon, and lung cancers. Com-pounds that inhibit the kinase activity of PTKs are potential chemotherapeutics to treat tumors. With the emergence of the multiple drug resistance of tumor cells against the existing PTK inhibitors, new mecha-nism PTK inhibitors are designed and developed. This review is focused on the recent advance of the dis-covery and development of the small molecular PTK inhibitors, categorized according to the mode of action. Furthermore, the synthesis of the typical structures is described.
Keywords tyrosine kinases; inhibitors; cancer; DFG motif; molecular targeted therapy
恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病, 其特点是细胞或变异细胞异常增殖. 目前人类因恶性肿瘤引起的死亡占所有疾病死亡率的第二位, 仅次于心脑血管疾病. 由于现有抗肿瘤药物存在毒性大、易产生耐药性等缺点, 所以研制靶向性抗肿瘤药物一直是全球药业公司和各国政府重点关注和发展的领域.
人类基因组测序工作的完成以及分子生物学对疾病机理的不断了解和阐述, 使得药物发现从传统的动物模型筛选发展到针对致病机理中关键酶或受体来精确设计靶向性药物, 通过小分子抑制剂特异性结合到靶蛋
白上, 选择性地阻断肿瘤细胞的过度增生, 从而有效控制和治疗疾病. 在分子靶向药物中, 蛋白酪氨酸激酶抑制剂的开发尤为引人注目, 其成功范例如格列卫(Gleevec)、易瑞莎(Iressa)和埃罗替尼(Erlotinib)先后被美国食品药品管理局(FDA)批准上市, 充分证明了蛋白酪氨酸激酶是一个非常富有前景的抗肿瘤药物靶标.
1 蛋白酪氨酸激酶的结构和功能
蛋白酪氨酸激酶(PTK)是信号传递过程中的重要因
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子, 参与一系列细胞功能, 与细胞生长、分化、增殖密切相关[1
～3]
, 它催化ATP 的γ磷酸基转移到许多重要蛋
白质的酪氨酸残基上, 使酚羟基磷酸化, 从而传递信号.
酪氨酸激酶属于蛋白激酶家族, 按其结构可以分为两大类: 受体酪氨酸蛋白激酶(Receptor PTKs)和非受体酪氨酸蛋白激酶(Non-receptor PTKs), 这两类酪氨酸蛋白激酶按结构同源性可进一步分为多个酶属. 人类基因组数据的分析表明, 人体共有518种激酶基因[4], 其中90种PTKs 已被发现, 包括受体型的酪氨酸激酶58种和非受体型的酪氨酸激酶32种[5]. 受体型的酪氨酸激酶包括血小板生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor, PDGFR)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)、成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor, FGFR)等成员, 它们通常具有一个细胞外结构域、一个跨膜区以及一个细胞内激酶域. 癌症临床研究表明, 这些受体及其配体与很多肿瘤都有重要联系, 很多癌症出现了相关生长因子的过量表达, 导致过量的酪氨酸磷酸化信号传入细胞. 非受体型的酪氨酸激酶(nrPTKs)一般没有细胞外结构, 它们通常与细胞膜耦联或存在于胞质中, 包括Abl 激酶、Src 激酶、C-端Src 激酶等成员. 在肿瘤组织中nrPTKs 常被激活, 再激活下游的信号传导途径, 促进细胞增殖、抵抗细胞凋亡, 促使肿瘤发生和发展[6
～8]
.
正因为酪氨酸激酶在细胞的恶性生长和增殖中起着非常重要的作用, 所以酪氨酸激酶抑制剂可能对恶性
肿瘤有预防和治疗作用. 目前主要有两种途径可以终止酪氨酸激酶所介导的增殖信号, 一类是单克隆抗体, 另一类是小分子药物. 单克隆抗体药物通过与诸如EGFR 的膜外配体结合域作用[9], 使EGF 等内源性配体无法与EGFR 结合, 从而阻止信号传入细胞. 小分子药物则通过与胞内酪氨酸激酶催化区结合, 抑制其催化活性, 从而阻断细胞增殖信号. 近年来科学家在蛋白酪氨酸激酶抑制剂这一领域进行了大量的工作[10
～15]
, 设计合成了
数百个受体型或者非受体型酪氨酸激酶抑制剂. 1998年, Genetech 公司首个靶向HER2的人源化单克隆抗体Herceptin 被FDA 批准用于治疗转移性乳腺癌, 2001年首个小分子Bcr/Abl 酪氨酸激酶抑制剂Gleevec 上市用于慢性髓细胞白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)的治疗, 标志着新一代靶向性抗肿瘤药物的研发成功. 目前已有bevacizumab (Avastin), panitumumab (Vectibix), dasatinib (Sprycel), lapatinib (Tykerb)和nilotinib (Tasigna)等5个单抗和8个小分子抑制剂先后上市, 超过100个药物正在进行临床研究.
2 已经上市的蛋白酪氨酸激酶小分子抑制剂
目前, 已经上市的蛋白酪氨酸激酶小分子抑制剂作为抗肿瘤药物有8个, 其分子结构见图1, 药物相关信息如表1所列
.
图1 已经上市的蛋白酪氨酸激酶小分子抑制剂
Figure 1 PTKs inhibitors launched on market
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表1已经上市的蛋白酪氨酸激酶小分子抑制剂
Table 1PTKs inhibitors launched on market
抑制剂上市时间开发公司靶点激酶构象应用疾病Imatinib (1) 2001 Novartis Abl, Kit, PDGFR Inactive (DFG-out) CML, GIST
Gefitinib (2) 2003 AstraZeneca EFGR Active
(DFG-in) NSCLC
Erlotinib (3) 2004 Genentech, OSIP EGFR Active (DFG-in) NSCLC
Sunitinib (4) 2006 Pfizer Kit, VEGFR, PDGFR Active (DFG-in) GIST resistant to imatinib, Advanced RCC
Sorafenib (5) 2005 Bayer, Onyx Raf, KDR, Kit, PDGFR Inactive (DFG-out) Advanced RCC Dasatinib (6) 2006 BMS Abl, Kit, PDGFR, Src Active (DFG-in) CML resistant to imatinib Nilotinib (7) 2007 Novartis Abl, Kit, PDGFR, Src Inactive (DFG-out) CML resistant to imatinib Lapatinib (8) 2007 GSK EGFR, Her-2 Inactive (DFG-out) Breast cancer
3 四大类蛋白酪氨酸激酶小分子抑制剂的结构及其作用机理
3.1 蛋白酪氨酸激酶小分子抑制剂的作用机制
酪氨酸激酶细胞内的激酶结合域为一个高度保守的催化核心区域[16～19], 12个亚基折叠成通过一个“铰链”来连接的“双叶”结构[20](图2). ATP的腺嘌呤环通过形成氢键与激酶“铰链”区域结合, 核糖和磷酸基通过一个亲水通道延伸到溶剂中. 而且, 所有酪氨酸激酶均含有一个起始端为DFG(Asp-Phe-Gly)序列、终止端为APE(Ala-Pro-Glu)序列的环状活化区域, 它对调节酪氨酸激酶的催化活性非常重要. 这个环状活化区域有多种构象, 当DFG序列中的Asp和Phe朝向ATP结合位点时, 即“DFG-in”, 为激酶的活化构象. 目前所开发的大部分酪氨酸激酶抑制剂均是深入到激酶ATP结
图2 Dasatinib (6)与Abl激酶复合物的晶体结构
Figure 2 Crystal structure of Abl bound to Dasatinib (6)
合位点[21], 激酶处于活化构象, 称为Type I抑制剂, 如己经成功上市的靶向c-Src, Bcr-Abl激酶的Sunitinib (4), Dasatinib (6), 靶向EGFR激酶的Gefitinib (2), Erlotinib (3)均为Type I抑制剂. 相反, 当DFG序列中的Phe朝向ATP的结合位点, 阻挡了ATP与激酶的结合时, 即“DFG-out”, 激酶处于非活化构象. 正是环状活化区域的运动, 使得处于“DFG-out”构象的激酶暴露出一个额外的疏水口袋, 可以作为设计小分子酪氨酸激酶抑制剂的一个新的结合位点, 起到调节激酶选择性的作用. 这类新设计思路的小分子抑制剂称为Type II抑制剂. 接下来, 我们就按照小分子抑制剂与酪氨酸激酶的作用模式来进行分类, 对近期小分子酪氨酸激酶抑制剂的研究进展进行介绍.
3.2 Type I抑制剂
Type I抑制剂模拟ATP的腺嘌呤环, 通过与激酶“铰链”区域ATP结合位点形成1～3个氢键来识别激酶的“DFG-in”构象[22]. Type I抑制剂所占据的激酶区域可分为三个亚区(如图3a所示): 疏水口袋I、疏水口袋II及腺嘌呤环结合位点. 由于酶测试手段的限制, 早期所开发的大部分酪氨酸激酶抑制剂均是Type I抑制剂.
Erlotinib (3)是Genentech开发的靶向EGFR的4-苯胺基喹唑啉类小分子酪氨酸激酶抑制剂, 2004年被美国FDA批准上市, 用于晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗. 其复合物晶体结构表明(图4)[23,24], Erlotinib (3)是与EGFR的活性构象相结合的, 取代苯胺结合疏水区域II, 喹唑啉双环体系相当于ATP的腺苷片段与“铰链”区形成氢键, 喹唑啉的N(1)和EGFR的Met769残基形成氢键, N(3)和Thr766残基的距离不足以形成氢键, 要通过一个水分子“搭桥”, 6位和7位的长链延伸到溶剂中, 激酶处于活性构象状态.
4-苯胺基喹唑啉衍生物是非常典型的小分子酪氨酸激酶抑制剂, 我们以Erlotinib (3)为例介绍其合成路
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T315gatekeeper
II
图3 小分子酪氨酸激酶抑制剂的作用模式 Figure 3 Kinase inhibitor binding modes
图4 Erlotinib (3)与EGFR 复合物晶体结构
Figure 4 Crystal structure of EGFR complexed with Erlotinib (3)
线[25]. 如Scheme 1所示, 从3,4-二羟基苯甲酸乙酯出发, 烷基化反应引入2-甲氧基乙氧基, 然后在2位硝化引入硝基, 催化还原得邻氨基苯甲酸酯化合物12, 再和甲酸
铵进行关环反应得喹唑啉结构13, 4-位氯代后再通过亲核取代反应引进苯胺基即生成Erlotinib (3).
上市药物中的Sunitinib (4), Gefitinib (2)和Dasatinib (6), 以及很多处于研发阶段的小分子酪氨酸激酶抑制剂, 都属于Type I 抑制剂. 由于这类抑制剂是模拟ATP 去竞争结合激酶的“铰链”区域, 而这个ATP 结合位点是高度保守的氨基酸序列, 因此此类抑制剂的可改造空间越来越小, 寻找新结构的母核也越来越困难. 另一方面, Type I 抑制剂均要和细胞内高浓度的ATP 去竞争结合激酶“铰链”区域, 这就使得对化合物酶水平IC 50的测试和细胞水平IC 50的测试经常出现不一致的情况, 不能真实反映出化合物对肿瘤细胞生长的抑制作用. 而
且, 由于酪氨酸激酶均具有相同的ATP 结合位点, 各种激酶之间的“交叉活性”使得Type I 抑制剂激酶选择性不高.
3.3 Type II 抑制剂
与Type I 抑制剂不同, Type II 抑制剂是识别激酶的非活化构象, 即“DFG-out ”构象. 由于环状活化区域的运动, 使得处于“DFG-out ”构象的激酶暴露出一个额
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Reagents and conditions: (a) K2CO3, TBAI, acetone, reflux; (b) HNO3, HOAc, 5 ; (c) P tO
℃2, H2, HCl/ethanol, r.t.; (d) HCOONH4, formamide, 165 ; (e) (COCl)
℃2, CHCl3, reflux; (f) isopropanol, reflux
Scheme 1
外的疏水区域, 这个额外的疏水区域也称为“变构位点”[26]. 早在1994年, Hubbard等[27]就第一次在胰岛素生长因子(IGF)的晶体结构中观察到了激酶的这种构象, 但直到2000年Schindler[28]报道了Imatinib (1)与Abl激酶复合物晶体结构以后, 这个新的构象才被用来设计酪氨酸激酶小分子抑制剂. 由于“变构位点”上的氨基酸序列不及ATP结合位点的保守, 在此位点上可以设计一些新的具有选择性的酪氨酸激酶小分子抑制剂.
Type II抑制剂为双重位点抑制剂, 即不但可以像Type I抑制剂那样伸展到ATP活性位点和“铰链”区域形成氢键, 还可以同变构位点的疏水区域相互作用. 根据已经报道的Type II抑制剂和其激酶的复合物晶体结构, Type II抑制剂的药效团模型可归结为通过一个“linker”连接“铰链”结合区和变构位点结合区. 值得注意的是, 这个变构位点在激酶以“DFG-out”构象和配体相互作用时与配体形成一对氢键[21], 通常是变构抑制剂分子中的脲或者酰胺键分别与激酶α-螺旋上的谷氨酸羰基氧和DFG序列上的天冬氨酸氨基氢形成氢键. 前者要求一个氢键给体, 后者要求一个氢键受体. 紧挨着氢键, Type II抑制剂均有一个疏水基团通过范德华力与变构位点的疏水口袋相互作用.
Imatinib (1)是诺华公司开发的第一个成功上市的小分子酪氨酸激酶抑制剂, 为2-苯基氨基嘧啶类化合物, 它可以选择性地作用于Bcr-Abl, c-Kit, PDGFR等酪氨酸激酶[29]. 该类结构骨架的合成以Imatinib (1)为例进行介绍. 如Scheme 2所示[30], 化合物15和16进行缩合反应得前体化合物19, 化合物17和18反应得另一个砌块20, 19和20在异丙醇中回流关环得化合物21, 21再经催化氢化得相应的氨基化合物22, 然后与化合物23缩合即可得到Imatinib (1
).
Reagents and conditions: (a) CH3ONa, toluene, r.t.; (b) ethanol, reflux; (c) NaOH, isopropanol, reflux; (d) P d/C, H2, THF, r.t.; (e) pyridine, r.t.
Scheme 2
比较戏剧性的是, Imatinib (1)最初是作为Type I抑
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制剂被药物化学家来进行结构改造和构效关系研究的. 随后的结构研究证实了Imatinib (1)为Type II抑制剂[28,31], Imatinib (1)以一种“三明治”的形式夹在Abl激酶催化区域“两叶”结构之中, 分子中的吡啶环和嘧啶环深入到激酶“铰链”区形成氢键, 其余部分伸出激酶的疏水区域, 直至外部的变构结合位点, 使激酶处于非活化构象(如图3b所示). 不同于Type I抑制剂在激酶“铰链”区形成两个氢键, Imatinib (1)缺少喹唑啉环N(3)通过“水桥”形成的氢键, 这也使得Imatinib (1)更容易透出激酶的“两叶”结构. Imatinib (1)分子中朝外的酰胺键通过与变构结合位点上的Glu残基和DFG序列中的Asp残基形成氢键来增强了与激酶的结合力. 诺华公司根据Imatinib (1)与激酶的作用模式, 从Imatinib (1)出发进一步结构优化得到化合物Nilotinib (7), 于2007年通过美国FDA批准上市, 用于治疗Imatinib (1)耐受的慢性髓细胞白血病(CML), 其对Abl-Bcr高表达的肿瘤细胞株的抑制作用比Imatinib (1)高了近20倍[32,33]. 与Imatinib (1)相比, Nilotinib (7)在苯环的3', 5'位置进行了结构改造, 引入了疏水性更强的CF3, 提高了其与激酶变构位点疏水口袋的亲合力.
Sorafenib (5)是由Bayer和Onyx公司联合开发的双芳基脲类化合物, 2005年被FDA批准用于晚期肾癌(Advanced RCC)的治疗, 也属于type II抑制剂, 而且对多个激酶有抑制作用. Sorafenib (5)是第一个靶向Raf (IC50＝6 nmol?L－1)的口服多靶点酪氨酸激酶抑制剂, 它可以通过靶向Raf信号通路阻断肿瘤细胞的增殖, 可作用于VEFGR-1, VEFGR-2, c-Kit, PDGFR, FGFR等多种酪氨酸激酶[34].
这类双芳基脲化合物的合成[35]见Scheme 3. 吡啶2-甲酸23氯代得化合物24, 再与冷的甲胺反应得化合物26, 或者4-氯吡啶25直接通过Minisci反应引入酰胺键得化合物26. 26经一个亲核取代反应得化合物28, 28再与3-CF3-4-Cl苯基异氰酸酯29缩合即可得到Sorafenib (5).
Sorafenib (5)与B-Raf激酶的复合物晶体结构表明[36], 其右侧的酰胺键深入到ATP结合位点, 与“铰链”形成氢键结合; 脲基团上的NH作为氢键供体与变构结合位点上的Glu500上的羰基氧形成氢键, 脲基团上的羰基作为氢键受体与反侧“DFG”序列上的Asp593形成氢键; 芳香环上Cl, CF3可增强其与变构结合位点上的疏水口袋之间的相互作用. 以脲作为分子中的关键取代基, Abbott公司相继开发了一系列的双芳基脲结构的多靶点酪氨酸激酶抑制剂[37～39](图5). 以末端为N原子的各种杂芳香环A替代Sorafenib (5)中的吡啶, 同时对芳香环C引入各种亲脂性取代基增强其与变构位点上的疏水口袋之间的相互作用. 这类抑制剂显示了对VEGFR-2(KDR)激酶的强效抑制作用. 如C环上R基团为m-CH3取代的化合物对KDR激酶酶水平和细胞水平的IC50分别为3和1 nmol?L－1, 并且具有良好的药动学性质. 在这类结构中三个关键药效团是必需的: 芳香环C间位脂溶性取代基, 引入CH3或CF3可以提高对激酶的抑制活性; 脲基团, 以硫脲或者酰胺键替代则化合物丧失活性; 模拟ATP腺嘌呤的杂芳香环A, 末端杂原子的取代对于保持活性是必需的.
百时美-施贵宝(BMS)公司最近报道了吡啶酮类化合物41对c-Met激酶有显著的抑制作用(见图6, Scheme 4)[40], 酶水平的抑制活性IC50为3.9 nmol/L, 对c-Met介导的人胃癌细胞株GTL-16 IC50为100 nmol/L.
其与Reagents and conditions: (a) SOCl2, DMF, 72 ; (b)
℃ MeNH2, CH3OH, 3 ; (c) HCOONHCH
℃3, H2O2, FeSO4, H2SO4, 60 ; (d) K
℃2CO3, DMF, 80 ; (e) DCM, r.t.
℃
Scheme 3
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图5 双芳基脲类化合物 Figure 5 Diaryl urea compounds
c-Met 激酶复合物晶体结构表明化合物41与激酶的“DFG-out ”构象结合, 为Type II 抑制剂. 2-氨基吡啶通过与Met1160形成两个氢键锚定在“铰链”上, 3-Cl 朝向ATP 结合位点的疏水口袋I; 中间的芳香环通过“π-π stack ”与DFG 序列上的Phe1223相互作用; 吡啶酮上的羰基与DFG 序列上的Asp1222 NH 形成氢键, 末端芳香环则占据了由变构结合位点上Phe1134, Leu1195, Phe1200形成的疏水口袋
.
图6 化合物41与c-Met 激酶复合物晶体结构 Figure 6 Crystal structure of c-Met with compound 41
化合物41的合成
[40]
见Scheme 4. 3,4-二氯吡啶33
在LiTMP 作用下脱质子引入羧基得化合物34, 再胺解为化合物36, 36再经过一个亲核取代反应得中间体化合物38. 化合物35在TMSI 作用下脱去甲基再烷基化得到吡啶酮化合物37, 37的醛基先氧化成相应的羧酸再氯代为酰氯得化合物39, 39与中间体38偶联后再与乙醇钠反应得到化合物40, 40再经过Hoffman 重排即可得到化合物41.
David 等[41]报道的三取代的嘌呤化合物可以选择性地作用于c-Src 激酶, 其代表性化合物AP23464 (47
)
Reagents and conditions: (a) LiTMP, ether, -78 , then CO ℃2; (b) SOCl 2, 80 , then NH ℃4OH, 0 ; (c) TMSI, CH ℃3CN; (d) 4-fluoro- phenylboronic acid, Cu(OAc)2, 2,6-lutidine, myristic acid, toluene; (e) 4-amino-2-fluorophenol, KO-t -Bu, DMF, 50 ; (f) NaOCl, ℃2-methyl-2-butene, NaH 2PO 4, THF/t -BuOH/H 2O; (g) SOCl 2, tolu-ene; (h) DIP EA, THF/DMF; (i) NaOEt, EtOH, THF; (j) P hI(OAc)2, EtOAc/CH 3CN/H 2O
Scheme 4
对c-Src 激酶的IC 50为0.45 nmol?L －
1. 作为Type II 抑制
剂, AP23464 (47)与c-Src 的作用模式比较特殊(图7). 和典型的Type II 抑制剂相似, 化合物的嘌呤环深入到激酶“铰链”区形成两个氢键, 7位上的N 作为氢键受体和“铰链”上的Met341 NH 形成氢键, 6位苯胺上的NH 作为氢键供体和Met341 羰基形成氢键. N(9)上的3-OH-苯乙基深入到变构位点上M et314, Ile336, Thr338所形成的疏水口袋, 3-OH 既作为氢键受体又作为氢键供体分别与DFG 序列上的Asp404 NH 和变构位点上的Glu310羰基形成氢键.
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图7化合物AP23464 (47)与c-Src激酶形成的复合物晶体结构
Figure 7 Crystal structure of c-Met with AP23464 (47)
AP23464 (47)的合成[42]见Scheme 5. 化合物42与原甲酸三乙酯在乙腈中回流, 冷却后加入苯乙胺衍生物继续回流可成环为咪唑类化合物43, 43与环戊基甲酰氯偶联后再关环得到化合物44, 44再氯代得6-氯嘌呤化合物45, 45与相应的苯胺进行亲核取代反应再脱去甲基即可得到化合物AP23464 (47).
前期小分子酪氨酸激酶抑制剂的构效关系的积累, 尤其是结构生物学对抑制剂与酪氨酸激酶作用模式的精确揭示, 近年来药物化学家开始利用Type I和Type II 抑制剂的结构特点和结合模式, 合理地、有针对性地设计新一代酪氨酸激酶小分子抑制剂[20,43], 即将Type I抑制剂的“铰链”区域的药效团模块通过一个合适的“linker”与Type II抑制剂的变构位点上的关键取代基有机地结合在一起, 这样既可以利用Type I抑制剂与“铰链”的强效结合力, 又能根据Type II抑制剂变构结合位点上的关键取代基来提高对不同激酶的选择性. 通过基于结构和药效团的合理设计, Amgen公司[44～46]发现了一类萘酰胺类化合物, 可以高效地选择性作用于KDR激酶. 代表性化合物48对KDR激酶的IC50为0.48 nmol? L－1, 对VEGFR介导的HUVEC细胞增殖的抑制活性IC50为8 nmol?L－1, 而且化合物48可以选择性地作用于KDR激酶, 对Tie-2, c-M et激酶的IC50为0.5 μmol? L－1. 类似物49对KDR激酶的IC50为0.6 nmol?L－1, 对VEGF介导的HUVEC增殖的IC50为0.91 nmol?L－1, 显示了更强效的肿瘤细胞生长抑制作用, 同时激酶的选择性也更好, 其对Tie-2, c-M et激酶的IC50下降到了20 μmol?L－1(图8).
化合物与KDR激酶复合物的晶体结构[45]表明, 化合物48, 49均有一个Type I抑制剂药效团, 二甲氧基喹啉的N原子作为氢键受体与“铰链”区上Cys919上的NH形成氢键, 8位的氢作为氢键供体与Cys919上的羰基形成一个额外的氢键, 增强了抑制剂与激酶的结合
Reagents and conditions: (a) CH(OEt)3, reflux, then phenethyl-amine, reflux; (b) DMAP, pyridine, THF, reflux, then K2CO3, EtOH, H2O, reflux; (c) P OCl3, reflux; (d) 2-(Dicyclohexylphosphino)- biphenyl, tris(dibenzylideneacetone)dipalladium, K3PO4, CH3CN, reflux; (e) BBr3, DCM, 0 ℃→r.t.
Scheme 5
力; 萘环占据朝外的疏水口袋, 将酰胺键插入变构结合位点, 如同典型的Type II抑制剂, 酰胺键也与变构结合位点上的Glu885及DFG序列上的Asp1046形成两个氢键. 化合物48与49不同的地方在于, 化合物48是以对氯苯基插入变构结合位点上的疏水口袋, 而化合物49是以更小的环丙基插入变构结合位点上的疏水口袋. 对于不同的酪氨酸激酶, 其处于非活化构象时, 环状活化区域运动所形成的疏水口袋大小是不一样的, 这就使得抑制剂上疏水取代基的大小不同, 其对激酶的选择性也是不一样的.
这类化合物的制备非常方便[46] (Scheme 6), 首先化合物50和51发生一个亲核取代反应, 再与不同的胺进行偶联反应即可得到目标化合物.
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图8 化合物48(上), 49(下)与KDR 激酶形成的复合物晶体结构
Figure 8 Crystal structures of KDR with compounds 48 (top) and 49
(bottom)
Reagents and conditions: (a) Cs 2CO 3, DMSO, 140 ℃; (b) SOCl 2, benzene, 65 ℃, then base, RNH 2, DCM
Scheme 6
3.4 变构抑制剂
变构抑制剂是指不与激酶ATP 结合位点相互作用, 只特异性地与激酶构象变化所暴露的“变构位点”相结合的小分子化合物, 为非ATP 竞争性抑制剂. 在已报道的小分子酪氨酸激酶中, 这类抑制剂对激酶的选择性是最高的[47]; 而且, 这个具有全新作用模式的抑制剂可以有助于解决目前不断加剧的抗肿瘤药物耐药性的问题. 迄今为止, 只有为数不多的几类化合物为酪氨酸激酶变构抑制剂(见图9), 如GNF-2 (54)[48], 选择性地作用于Bcr-Abl 激酶(严格意义上讲, GNF-2是作用于激酶C 端肉豆蔻酰位点上, 非变构位点), 其类似物GNF-5与Imatinib (1)联合用药, 对Bcr-Abl 介导的Imatinib (1)耐药的肿瘤细胞株有良好的抑制作用[49]; ON012380 (55)[50], 为Bcr-Abl 底物竞争性抑制剂, 在小于10 nmol? L －
1浓度下, ON012380 (55)几乎能够让所有Imatinib (1)
耐药的突变体细胞全部凋亡; Jeffrey 等[51]报道了一类吡咯脲结构的c-Src 激酶抑制剂, 是第一个通过变构抑制剂与激酶的复合物晶体结构来证实的酪氨酸激酶变构抑制剂. 化合物56与c-Src 激酶复合物的晶体结构表明, 激酶DFG 序列中的Phe405因激酶构象的改变朝向ATP 结合位点, 脲基团与变构位点上的Glu310及DFG 序列中的Asp404形成两个氢键, 吡咯环上的叔丁基深入到变构位点上的疏水口袋
.
图9 代表性变构抑制剂的结构
Figure 9 Structures of representative allosteric inhibitors
1604
有 机 化 学 V ol. 31, 2011
3.5 共价抑制剂
第四类酪氨酸激酶小分子抑制剂为共价抑制剂, 它可以和ATP 结合位点上亲电性的Cys 残基形成共价键结合, 使激酶失活, 不可逆地抑制酪氨酸激酶的活性. 目前已经有5个EGFR 共价抑制剂进入临床研究[52
～54]
.
如Pfizer 公司开发的CI-1033 (57), Boehringer Ingelheim 公司开发的BIBW-2992 (58), Wyeth 公司开发的EKB-569 (59), HKI-272 (60) (图10). 其主要设计思路均是将Michael 受体引入到4-苯胺基喹唑啉或者3-氰基-4-苯胺基喹唑啉母核, 喹唑啉母核深入到ATP 结合位点与“铰链”区形成氢键, Michael 受体与合适位置的Cys 残基通过一个Michael 加成共价结合. 其中化合物CI-1033 (57)因为单独给药临床数据不佳及皮肤毒性问题[55,56], 其对转移性乳腺癌、晚期非小细胞肺癌的II 期临床研究已经终止; 化合物EKB-569 (59)也因为II 期临床数据不佳[57], 其对乳腺癌的临床研究也已终止
.
图10 典型共价抑制剂的结构
Figure 10 Structures of typical covalent inhibitors
Edgar 等[58]报道了一类噻吩并嘧啶结构的化合物, 将炔烃引入噻吩环中, 这类化合物对ErbB 家族中的EGFR, ErbB2, ErbB 均有良好的抑制作用. 构效关系研究表明, 61系列的化合物活性要优于62系列(图11); 炔烃末端R 取代基为碱性较强的脂肪胺时活性要优于弱碱性的芳香胺. 复合物晶体结构表明, 嘧啶环深入ATP 结合位点与“铰链”区形成氢键, 化合物的炔烃基团和溶剂腔中的巯基(EGFR 激酶上的Cys797, ErbB4激酶上
的Cys803)发生Michael 加成共价结合; 炔烃末端上的R 脂肪胺有一个“邻位效应”, 碱性的胺取代基通过和附近的Asp800相互作用促进了炔烃对SH 的Michael 加成
.
图11 噻吩并嘧啶化合物 Figure 11 Thienopyrimidine derivatives
Caterina 等[59]开发了一类新作用方式的共价抑制剂, 将环氧化合物(亲核加成)、苯氧基乙酰胺(亲核取代)、氨基甲酸酯(氨基甲酰化)、氰基(Pinner 反应)、含S 杂环(形成二硫键)等各种能够“捕获”Cys SH 的取代基引入到4-苯胺基喹唑啉的母核中(图12). 构效关系表明, 在化合物63的R 位置引入取代基64～66, 70～73等取代基时保持了对EGFR 激酶的强效抑制作用; 引入取代基67～69的化合物IC 50略有降低, 但也保持在nmol?L
－1
级别; 引入取代基74后化合物活性大幅下降. 并且引入取代基66的化合物对EGFR 介导的Gefitinib (2)耐药的H1975肿瘤细胞株的增殖有良好的抑制作用. 引入取代基66的化合物的分子对接实验表明, 喹唑啉环上的N(1)与EGFR 激酶“铰链”区域上的Met793 NH 形成氢键, N(3)通过一个“水桥”与Thr790形成氢键, 哌嗪环与Asp800形成一个盐桥, Cys797距环氧基上最近的碳原子4.13 ?, 使得环氧基易于接受SH 的亲核进攻.
一些具有细胞毒性的天然产物也可以共价结合激酶上的Cys 残基, 为不可逆的酪氨酸激酶小分子抑制剂.
寄端霉素(75)是一个二羟基苯甲酸内酯类的化合物(Eq. 1), 是从Hypothemycin subiculosus 菌中提取出来的. 环内有一个顺式烯酮, 可以作为Michael 受体与激酶ATP 活性位点附近的Cys 残基共价结合. 寄端霉素(75)对测试的19个含有保守Cys 残基的激酶中的18个有明显的共价抑制作用[60], 其中包括PDGFR, c-Kit, VEGFR 等酪氨酸激酶, 抑制PDGFR, VEGFR 自动磷酸化的IC 50在1～5 nmol?L －
1, 对Flt-3和αPDGFR 高表达的肿瘤细胞
株的IC50也分别为6和0.4 nmol?L －
1. 寄端霉素(75)与
ERK-2激酶复合物晶体显示, 8'位的碳原子与激酶Cys166上的发生Michael 加成共价结合.
No. 10
王勇等：蛋白酪氨酸激酶小分子抑制剂的研究新进展
1605
图12 4-苯胺基喹唑啉类共价抑制剂 Figure 12 4-Anilinoquinazoline covalent
inhibitors
人类激酶基因组的生物信息学研究发现, 46个激酶具有这种特异的Cys 残基[60], 而且近200种激酶均具有位于ATP 活性位点附近的Cys 残基, 说明大量的激酶可以作为不可逆抑制剂的治疗靶点. 但因为化合物对激酶
不可逆抑制所引起的细胞毒性问题, 这类共价抑制剂的
开发前景尚在研究中.
4 小结与展望
在过去的10年中, 酪氨酸激酶小分子抑制剂的开发取得了巨大的成功, 有8个小分子抑制剂先后上市; 也建立了很多行之有效的方法来开发高效、选择性好的小分子化合物, 如Me-too 策略, 基于配体(结构信息)的药物设计, 基于片段的小分子抑制剂的设计; 晶体学的发展也大大提高了酪氨酸激酶小分子抑制剂的开发效率, 可以更清楚地解释化合物和激酶的构象变化及总结构效关系.
虽然酪氨酸激酶小分子抑制剂的开发取得了上述的很多进展, 但也面临着诸多挑战. 肿瘤细胞基因突变所造成的激酶抑制剂耐药问题越来越严重; 如何在多靶点酪氨酸激酶抑制剂和提高激酶选择性的问题上找到一个平衡点; 如何在进入临床前对化合物毒性、药动学性质等有比较准确的预测, 以提高新药开发的速率和避免重复浪费. 因此, 全面有效地开发抗肿瘤药物需要化学、分子生物学、蛋白晶体学等各领域的学者通力协作, 可以预见, 设计合成酪氨酸激酶小分子抑制剂治疗肿瘤疾病必将走入一个新的时代.
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酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物研究方法进展
现代生物医学进展https://www.wendangku.net/doc/8c1827638.html, Progress in Modern Biomedicine Vol.10NO.16AUG.2010 酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物研究方法进展* 刘振凯1艾 菁2耿美玉1,2△ （1中国海洋大学医药学院山东青岛266003；2中国科学院上海药物研究所上海201203） 摘要：酪氨酸激酶（protein tyrosine kinases,PTKs ）在肿瘤细胞的增殖、分化、迁移、侵袭等相关信号通路中起到了关键的调控作用，已经成为肿瘤靶向性治疗的重要靶点。本文对靶向酪氨酸激酶的小分子抑制剂的筛选和评价方法进行综述，以期促进酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物的研究。 关键词：酪氨酸激酶；抗肿瘤药物；小分子抑制剂；抑制剂筛选 中图分类号： R730.5，R915文献标识码：B 文章编号：1673-6273（2010）16-3134-04Advances in Research of Protein-tyrosine Kinases Inhibitors as Anticancer Drug* LIU Zhen-kai 1,AI Jing 2,GENG Mei-yu 1,2△ （1Marine drug and food Institute,Ocean university of China,Qingdao,266003,China;2Shanghai Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Sciences,Shanghai,201203,China ） ABSTRACT:Protein tyrosine kinases (PTKs)have long been recognized as promosing therapeutic targets involved in a variety of human diseases and in particular several types of cancer.They play important roles in regulating intracellular signal transduction path-ways closely associated with the invasion,metastasis and angiogenesis of many tumors.An effort towards the development of new and more effective PTK inhibitors represents an attractive therapeutic strategy for cancer therapy.In this paper,we review the screening and evaluation methods of small-molecule inhibitors of PTKs with a view to promote the study of PTKs. Key words:Protein-tyrosine kinases;Antitumordrugs;Small-molecule inhibitors;Inhibitors screening Chinese Library Classification （CLC ）:R730.5R915Document code:B Article ID:1673-6273(2010)16-3134-04 *基金项目：国家杰出青年科学基金资助（No 30725046） 作者简介：刘振凯（1983-），男，硕士。研究方向：分子药理学。E-mail ：lzkai111@https://www.wendangku.net/doc/8c1827638.html, △通讯作者：耿美玉（1963-），研究员、博士生导师。E-mail ：mygeng@https://www.wendangku.net/doc/8c1827638.html, (收稿日期:2010-05-07接受日期：2010-06-01) 恶性肿瘤是严重威胁人类生命和健康的疾病。目前，临床上常用的抗肿瘤药物主要是细胞毒类药物，这类药物大多存在难以避免的选择性差、毒副作用强、易产生耐药等缺点[1]。近年来，随着生命科学研究的飞速发展，恶性肿瘤细胞内的信号转导、 细胞周期的调控、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正在被逐步阐明，给抗肿瘤药物的研发理念带来了巨大转变。以一些与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路的关键酶/蛋白作为药物靶点，筛选发现选择性强、高效、低毒的新型抗癌药物已成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向[2]。 蛋白酪氨酸激酶是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白质，它们能催化ATP 分子上的γ-磷酸基转移到底物蛋白的酪氨酸残基上，使其发生磷酸化。酪氨酸激酶分为受体型和非受体型两种。受体酪氨酸激酶是一种单次跨膜蛋白，目前至少已有近六十种分属20个家族的受体酪氨酸激酶被识别。不同的受体酪氨酸激酶和配体结合后，受体自身发生二聚化或结构重排，并进一步使受体胞内区特异的酪氨酸残基发生自身磷酸化或交叉磷酸化，从而激活下游的信号转导通路[3]。它们在信号由胞外转导至胞内的过程中发挥重要的作用。而非受体酪氨酸激酶是一种胞浆蛋白，现已经确认的有约30种，分为10大家族。蛋白酪氨酸激酶在细胞信号转导通路中占据了十分重要的地位， 调节细胞生长、分化、死亡等一系列生理生化过程。蛋白酪氨酸激酶功能失调则引发生物体内一系列疾病。大量资料表明，超过50%的原癌基因和癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，它们的异常激活或过度表达将导致细胞无限增殖，周期紊乱，最终导致肿瘤的发生发展[4]。 同时，酪氨酸激酶调控异常还与肿瘤的侵袭、 转移，肿瘤新生血管生成，肿瘤化疗抗性等密切相关。事实上，以酪氨酸激酶为靶点进行抗肿瘤药物的开发已成为国际研究的前沿。 1酪氨酸激酶抑制剂的开发策略 目前酪氨酸激酶抑制剂的开发策略主要分为胞外、胞浆和核内三个层面：细胞外策略主要是针对于受体型，配体与受体的生物拮抗剂以及特异性抗体，通过拮抗配体和受体的相互作用，抑制酪氨酸激酶的激活[5]；胞浆内策略主要分为抑制激酶区的激酶活性和拮抗酪氨酸激酶与其下游信号分子的相互作用两个方面[6]；核内策略主要是利用miRNA 降解或者干扰酪氨酸激酶的mRNA ，抑制激酶的蛋白表达而达到抑制激酶活性的目的[7,8]。其中研究最多的是抑制激酶区激酶活性的小分子抑制剂，而本文也主要是针对这部分抑制剂的研究方法进行探讨。酪氨酸激酶的自磷酸化过程和催化下游信号分子磷酸化的过程都涉及到ATP 上磷酸基团的转移，这一反应过程是酪氨酸 3134··
蛋白酪氨酸激酶综述
蛋白酪氨酸激酶综述 目前至少已有近六十种分属20个家族的受体酪氨酸激酶被子识别。所有受体酷氨酸激酶都属于I型膜蛋白，其分子具有相似的拓朴结构：糖基化的胞外配体结合区，疏水的单次跨膜区，以及胞内的酪氨酸激酶催化结构域及调控序列。不同受体酪氨酸激酶结合，将导致受体发生三聚化，并进一步使受体胞内区特异的受体酪氨酸残基发生自身磷酸化或交叉磷酸化，从而激活下游的信号转导通路。许多肿瘤的发生、发展都与酪氨酸激酶的异常表达有着极其密切的联系，下面将对几类与肿瘤的发生发展最为密切的受体酪氨酸激酶的研究迸展做一简介。 一、表皮生长因子受体（Epidermal grovth factor receptor, EGFR）家族 EGFRPE包括EGFR、ErbB2、ErbB4等4个成员，其家族受体酪氨酸激酶（RTK）以 单体形式存在，在结构上由胞外区、跨膜区、胞内区3个部分组成，胞外区具有2个半氨酸丰富区，胞内区有典型的ATP结合位点和酪氨酸激酶区，其酪氨酸激酶活性在调节细胞增殖及分化中起着至关重要的作用。 人的egfr基因定位于第7号染色体的短臂（7p12.3-p12.1），它编码的产物EGFR由1210个氨基酸组成，蛋白分子量约为170kDa，其中，712-979位属于酪氨酸激酶区。EGFR的专一配体有EGF、TGF、amphiregulin,与其他EGFR家庭成员共有的配体有（cellulin(BTC)、heparin-binding EGF(HB-EGF)、Epiregulin(EPR) ）等。 EGFR在许多上皮业源的肿瘤细胞中表达，如非小细胞性肺癌，乳腺癌、头颈癌，膀胱癌，胃癌，前列腺癌，卵巢癌、胶质细胞瘤等。另外，在一些肿瘤如恶性胶质瘤、非小细胞性肺癌、乳腺癌、儿童胶质瘤、成神经管细胞瘤及卵巢癌等中还可检测到EGFR缺失。最为常见的EGFR缺失突变型是EGFRⅧ，EGFR Ⅷ失去了配体结合区，但是可自身活化酪氨酸激酶，刺激下游信号通路的激活，而不依赖于与其配全结合。EGFR在许多肿瘤中的过表达和/或突变，借助信号转导至细胞生长失控和恶性化。另外，EGFR的异常表达还与新生血管生成，肿瘤的侵袭和转移，肿瘤的化疗抗性及预后密切相关。EGFR高表达的肿瘤患者，肿瘤恶性程度高，易发生转移，复发间期短，复发率高，患者的存活期短。 ErbB2，又名HER-2/neu，是EGFR家族的第二号成员，ErbB2通过与EGFR家族中其它三位成员构成异源二聚体，而发挥生物学作用，尚未发现能与其直接结合的配体。编码ErbB2的基因neu最早从大鼠神经母细胞瘤中分离得到，人类体细胞内neu基因的同源基因，又称为HER-2或erbB2，位于人第17号染色体的长臂（17q21.1），它编码的产物ErbB2由1255个氨基酸组成，蛋白分子量约为185Kda，其中，720-987位属于酪氨酸激酶区。 ErbB2通常只在胎儿时期表达，成年以后只在极少数组织内低水平表达。然而在多种人类肿瘤中却过度表达，如乳腺癌（25-30%）、卵巢癌（25-32%、肺静癌（30-35%）、原发性肾细胞癌（30-40%）等。过度表达的原因主要是ErbB2基因扩增（95%）或转录增多（5%）。 1987年，Slamon等人首行先报道了ErbB2扩增和乳腺癌临床预后不良之间的显著关系，其显著性高于雌激素、孕激素等指标，并在以后的研究中得到大量证实。随后，ErbB2表达水平和乳腺癌治疗效果间的关系得到广泛研究，人们发现ErbB2高表达乳腺癌患者对他莫昔芬（tamoxifen）治疗、单独的激素疗法、以及环磷酰胺、甲氨喋呤、5-氟脲嘧啶联合化疗产生耐受。研究还表明，ErbB2在细胞的恶性转化中发挥重要作用，并能促进恶性肿瘤转移。ErbB2受体过度表达往往提示乳腺癌恶性程度高，转移潜力强，进展迅速，化疗缓解期短，易产生化疗和激素治疗抗性，生存率和生存期短，复发率高。 和ErbB4对肿瘤的作用目前尚不清楚，但在肿瘤形成模型的临床前研究发现，ErbB3、Erb3与EGFR、ErbB2共表达后会使肿瘤恶性程度明显增加。 二、血管内皮细胞生长因子受体（Vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR）家族VEGFR家族的成员包括：VEGFR1（Flt-1）、VEGFR2（KDR/Flk-1）、VEGFR3（Flt-4）,这一家族的受体在细胞外存在着7个免疫球蛋白样的结构域，在胞内酪氨酸激酶区则含有一段亲水手插入序列。
酪氨酸激酶异常活化在恶性血液病发病中的作用(1)(精)
酪氨酸激酶异常活化在恶性血液病发病 中的作用(1) 】蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase, PTK）在调节细胞生长、活化和分化的信号转导中起着重的作用。基因突变（多半由染色体移位）或者激酶的过度表达可使PTK活力异常增高，并介导异常的信号转导途径，在多种恶性血液病的发生发展中起着主的作用。在慢性骨髓增殖性疾病（CMPD）、急性髓性白血病（AML）和间变性大细胞淋巴瘤的发病中，均存在着PTK的异常活化。进一步研究PTK相关的恶性血液病的发病机理，可以加快特异性的分子靶向治疗的研究进展。 【关键词】酪氨酸激酶恶性血液病；基因突变 Abnormal Activation of Tyrosine Kinases and Its Role in the Pathogenesis of Hematological Malignancies ——Review Abstract Protein tyrosine kinases are key participants in signal transduction pathways that regulate cellular growth, activation and differentiation. Aberrant PTK activity resulting from gene mutation (often accompanying chromosome translocation) or overexpression of these enzymes plays an etiologic role in several clonal hematopoietic malignancies. Other than the causative effect of PTK product of the bcr/abl fusion gene on chronic myelogenous leukemia (CML), more evidence suggests that mutated tyrosine kinases are pivotal in the pathogenesis of most of other chronic myeloproliferative disorders, such as chronic myelomonocytic leukemia (CMML) and hypereosinophilic syndrome (HES). And the exciting results in several dependent groups in 2005 showed that a single nucleotide JAK2 somatic mutation (JAK2V617F mutation) was found to be involved in the pathogenesis of polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and chronic idiopathic myelofibrosis (CIMF). In the leukogenesis of acute myeloid leukemias (AML), the losing of the control of the proliferation of hematopoietic progenitor cells was principally the results of the aberrant PTK activity, such as FLT3 and C kit overexpression. It works together with the loss of function mutation genes in promoting progenitor cell differentiation to confer AML's phenotypes. These upregulated PTK molecules represent attractive disease specific
蛋白酪氨酸激酶简介
蛋白酪氨酸激酶简介 癌症极大威胁人类健康，抗肿瘤研究是当今生命科学中极富挑战性且意义重大的领域。目前，临床上常用的抗肿瘤药物主要是细胞毒类药物，这类抗癌药具有难以避免的选择性差、毒副作用强、易产生耐药等缺点。近年来，随着生命科学研究的飞速进展，恶性肿瘤细胞内的信号转导、细胞周期的调、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正在被逐步阐明。以一些与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路的关键酶作为药物筛选靶点，发现选择性作用于特定靶点的高效、低毒、特异性强的新型抗癌药物已成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向。 蛋白酪氨酸激酶是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白质，可分为受体型和非受体型两种，它们能催化ATP上的磷酸基转移到许多重要蛋白质的酪氨酸残基上，使其发生磷酸化。蛋白酪氨酸激酶在细胞内的信号转导通路中占据了十分重要的地位，调节着细胞体内生长、分化、死亡等一系列生理化过程。 蛋白酪氨酸激酶功能的失调则会引发生物体内的一系列疾病。已有的资料表明，超过50%的原癌基因和癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，它们的异常表达将导致细胞增殖调节发生紊乱，进而导致肿瘤发生。此外，酪氨酸基酶的异常表达还与肿瘤的侵袭和转移，肿瘤新生血管的生成，肿瘤的化疗抗性密切相关。因此，以酪氨酸激酶为靶点进行药物研发成为国际上抗肿瘤药物研究的热点，为此投入的研究经费也是其它任何一个非传统的肿瘤靶点所无法匹敌的。 目前为止，已有十多种蛋白酪氨酸激酶抑制剂和抗体进入I-Ⅱ期临床试验阶段，个别的已经上市，并取得了令人鼓舞的治疗结果。基中，Genentech公司和罗氏药厂联合研究和生产的HerceptinTM(Trastuzumab)是一种抗酪氨酸激酶受体HER2/neu的人源化的单克隆抗体。1998年，美国食品的药物管理局（Food and Drug Administration, FDA）正式批准Herceptin用于治疗某些HER2阳性的转移性乳腺癌。2001年5月，N ovartis公司研发的针对酪氨酸激酶Bcr-Abl的抑制剂GleevecTM (imatinib mesylate)由于对治疗慢性髓样白血病（chronic myelogenous leukemia,CML）具有非常好的疗效，尚未完成Ⅲ期临床就被FDA批准提前上市，用于治疗费城染色体呈阳性（Philadelphia chromosome – positive, Ph+）的慢性髓样白血病患者，引起了巨大的轰动。GleevecTM是第一个在了解癌症的病因后鸽是设计开发，并取得了显著成效和的肿瘤治疗药物，它的研发成功可以说是癌症治疗的一个里程碑。这一重大成就被美国《科学》杂志列入2001年度十大科技新闻。纽约《时代》杂志将其作为杂志的封面，称GleevecTM 开创了药物研发的新时代。2002年2月，美国FDA又批准GleevecTM 用于胃肠基质瘤（gastrointestinal stromal tumors, GLST）的治疗。2002年7月，AstraZeneca公司研发的IressaTM (ZD1839又被美国FDA批准用于治疗经过标准含铂类方案和紫杉萜化疗后仍然继续恶化的终未期非小细胞肺癌患者，这也是第一种用于实体瘤治疗的针对特定靶点挑战分子酪氨酸激酶抑制剂。Herceptin，Gleevec以及Iressa的上市进一步证明了以特定靶点尤其是以酪氨酸激酶为靶点进行抗肿瘤药物的研发是21世纪最有可能获得突破性进展的抗肿瘤药物领域，具有十分广阔的前景。
非小细胞肺癌酪氨酸激酶抑制剂的耐药
非小细胞肺癌酪氨酸激酶抑制剂的耐药 肺癌的靶向治疗耐药主要有两大类，上皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）耐药和间变性淋巴瘤激酶（ALK）酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）耐药。 1. EGFR 酪氨酸激酶抑制剂 埃罗替尼（Erlotinib）、吉非替尼（Gefitinib）、阿法替尼（Afatinib）是首批进入非小细胞肺癌临床治疗的EGFR 酪氨酸激酶抑制剂，EGFR 突变表型患者对这类药物的响应很好。但是，获得性耐药是EGFR 酪氨酸激酶抑制剂所面临的一大难题，什么措施可以延迟或克服这种耐药。 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂的耐药的一个原因是EGFR 靶点修饰，EGFR 酪氨酸激酶结构域出现二点突变（T790M）。接近60% 的埃罗替尼、吉非替尼、阿法替尼耐药肺癌患者样本均有这种突变，该突变是第一代和第二代EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药的主要原因。 突变特异性EGFR 酪氨酸激酶抑制剂是一类新型的针对EGFR 突变的不可逆抑制剂。埃罗替尼、吉非替尼、阿法替尼主要靶向野生型EGFR，突变特异性EGFR 酪氨酸激酶抑制剂主要靶向激活性突变，例如T790M 突变。目前已经有两种突变特异性抑制剂已经接近进入临床，分别是CO-1686（Rociletinib）和AZD9291。 近期NEJM 刊登了一项研究，该临床试验纳入了46 位埃罗替尼、吉非替尼、阿法替尼耐药的肺癌患者。研究结果显示，T790M 阳性患者对Rociletinib的响应率为59%。有趣的是，对接受过一线治疗的肺癌患者来说，用靶向T790M 的药物进行二线治疗，其响应率接近60%、疾病控制率高达90%。相反，如果肺癌患者在一线治疗中没有出现T790M 突变，其响应率非常低。 AZD9291 是另一种第三代不可逆突变特异性EGFR 抑制剂。有研究报道，T790M 阳性癌症患者对AZD9291 的响应率接近60%，而T790M 阴性癌症患者对AZD9291 的响应率非常低，这与上述Rociletinib的效果相同。 2014 年有团队评估了不可逆二代抑制剂联合阿法替尼（野生型EGFR 靶向抑制剂）和西妥昔单抗（EGFR 单克隆抗体）对肺癌患者的治疗效果。该研究患者均为EGFR 突变肺癌患者，在对第一代EGFR 抑制剂产生获得性耐药后，开始接受阿法替尼和西妥昔单抗治疗。 结果显示，肺癌患者的总体响应率为29%，包括T790M 阳性和阴性患者。该研究表明突变特异性EGFR 抑制剂有希望成为EGFR 突变肺癌患者的一线治疗药物，但是它们对进展期的T790M 阴性患者并无效果。然而，将突变特异性EGFR 抑制剂与阿法替尼与西妥昔单抗联合可能是该难题的解决方案之一。 如果第三代EGFR 酪氨酸激酶抑制剂失败了，该怎么办？通常认为靶向治疗是有效的，但是即使是第三代EGFR 酪氨酸激酶抑制剂，也要考虑耐药问题。
蛋白酪氨酸激酶
蛋白酪氨酸激酶(PTK)是多种肿瘤最常见的生长因子受体，抑制其活性可破坏肿瘤细胞的信号传导，抑制肿瘤细胞增殖和新生血管形成，而对正常细胞影响较小。常见的受体型包括表皮生长因子受体(EGFR)家族、胰岛素受体(IGFR)家族、血小板衍化生长因子受体(PDGFR)家族、VEGFR家族、纤维细胞生长因子受体(。FGFR)家族等。非受体型包括SRC、ABL、JAK、ACK、CSK、FAK、FES、FRK、TEC、SYK家族等。以PTK为靶点的单克隆抗体、小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是近年抗肿瘤药研究的热点。2005年之前，美国FDA批准以PTK为靶点的单克隆抗体曲妥珠单抗(1998年)、贝伐单抗(2004年)和西妥昔珠单抗(2004年)和小分子酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(2001年)、吉非替尼(2003年)、埃罗替尼(2004年)等靶向药物应用于临床。2005年后TKI制剂不断上市，且多靶点药已成为新的研究方向。 Neratinib 伯舒替尼(Bosutinib，惠氏公司)是强效Src和Abl激酶双重抑制剂，既能抑制多种人肿瘤细胞中Src蛋白的自主磷酸化，也能抑制Src和Ab底物的磷酸化过程，具有高效的抗增殖活性，可抑制CMI。细胞的增殖和存活，对伊马替尼、达沙替尼和尼罗替尼等已产生耐药的CML，或ALL患者也取得了较好的疗效。目前，正在进行CML的Ⅲ期临床研究。 Motesanib(安进公司)能选择性地作用于VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR和c-kit受体，可致内皮细胞程序性死亡增加和血管面积减少，抑制肿瘤血管生成并诱导肿瘤消退。目前，本品NSCLC的Ⅲ期临床研究正在进行中；其GIST、甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌等适应证的研究也处于Ⅱ期临床研究阶段。 凡德他尼(Vandetanib，阿斯利康公司)是口服小分子EGFR、VEGFR、RET多靶点酪氨酸激酶抑制剂。Ⅱ期临床显示，单用或与多西他赛联合用药，其在NSCLC患者的二线／三线治疗中均有效。 Vatalanib(拜耳／诺华)是经高通量筛选出的VEGF、PDGF、c-kit多靶点小分子TKl，对VEGFR-2作用最强。与FOLFOX方案联合治疗转移性结直肠癌的2个Ⅲ期研究正在进行中。目前，发现体内乳酸脱氢酶水平较高的患者疾病PFS显著提高。 BIBtr 1120(勃林格殷格翰公司)是一种新的口服抗血管生成药，抑制VEGF、PDGF、FGF等的作用，目前分别开展了治疗晚期卵巢癌和NSCLC的Ⅲ期临床研究。
酪氨酸激酶小分子抑制剂及其抗瘤作用研究进展
酪氨酸激酶小分子抑制剂抗瘤作用研究进展 小分子抑制剂作为生命科学领域和干细胞研究、药物研究等诸多领域的有效研究工具，其作用越来越被人们认可。现在介绍对抗肿瘤的络氨酸激酶小分子抑制剂的相关研究进展。 与肿瘤相关的酪氨酸激酶主要有位于细胞膜的受体酪氨酸激酶和位于胞浆的非受体酪氨酸激酶，酪氨酸激酶的过度激活与肿瘤发生、发展、预后与转归密切相关。其过度激活，导致其下游信号途径的激活，最终导致细胞的转化、增殖和抵抗细胞凋亡、促进细胞生存。因此，现在科研人员努力致力于酪氨酸激酶抑制剂尤其是从特异性酪氨酸激酶抑制剂角度来研究新的抗肿瘤药物，并且已取得了巨大的突破，如针对Bcr-Abl的Gleevec、针对EGFR 受体酪氨酸激酶Iressa，已被美国FDA批准分别用于慢性粒细胞性白血病和晚期非小细胞肺癌的治疗，效果显著。另外还有许多小分子抑制剂正在临床试验中，有些在HER2/neu和VEGFR受体酪氨酸激酶小分子抑制剂方面进行的一些研究，也取得一些有意义的结果。（在附件中我们已经为您整理出来相关的信息） 不断的反复的实验才能得到需要的结果，陶素生化现可提供诸多不同信号通路的抑制剂、调节剂以及小分子化合物，并附客户评价、产品相关参考文献、技术支持等助力您的实验研究，且保证产品的高纯度和高活性，交货及时并附带完整的谱图信息。 陶素生化能够提供的118种酪氨酸激酶抑制剂的独特集合，可用于高通量筛选和高内涵筛选 ? 通过前期临床研究和临床实验，生物活性和安全性得到验证 ? 其中一些抑制剂已经得到FDA批准 ? 作用于酪氨酸激酶，如EGFR，VEGFR，SRC，c-Met和JAK ? 结构多样，药效显著，可渗透细胞 ? 具有充分详细的结构说明，IC50值，及客户反馈资料 ? NMR和HPLC技术保证产品高纯度 酪氨酸激酶过度激活，从而导致其下游信号的激活，这在肿瘤的发生、发展、转移、治疗和转归等中起着重要的作用。因此，针对其信号转导途径寻找新的抗肿瘤药物具有重要意义。目前，针对Bcr-Abl的STI571、EGFR的ZD1839已被美国FDA批准在临床应用，分别用于治疗慢性粒细胞性白血病和非小细胞肺癌。从而使得科学工作者对研究针对肿瘤特异性癌基因的药物研究更具信心，并已有许多药物在临床试验阶段，如针对VEGFR的SU666，PTK787等。从目前的各方面收集的科研结果来看，这些抑制剂可能还不能将肿瘤完成治愈，但这些抑制剂与常规化疗相结合，会明显地提高肿瘤的治疗效果。以受体酪氨酸激酶信号通路为靶点的抗肿瘤药物，通常只有在该信号通路发生异常的肿瘤细胞上才能取得较好的疗效。但在肿瘤的治疗过程中，仅仅抑制了某些发生异常的信号转导，则其他一些信号通路仍可能会产生代偿而上调，从而影响治疗效果。因此，抑制信号转导的抗肿瘤治疗还应联合其他作用途径的药物以取得更好的疗效。无论如何，这些针对肿瘤特异性基因改变的药物是消除肿瘤而又无系统毒性的希望。 关键词：酪氨酸激酶；抗肿瘤药物；信号通路；小分子抑制剂库 下面整理了络氨酸酶小分子抑制剂的药物研发最热门靶点相关信息供您参考 2000年后肿瘤信号网络被逐渐阐释、完善，大量的分子靶向药物进入临床研究、走上市场，近年针对受体酪氨酸激酶靶点如Bcr-Abl(见1.1)、VEGF/VEGFRs(见1.2)、PDGF/PDGFRs(见1.3)、EGFR/HER2(见1.4)、ALk(见1.5)已有多个药物上市，me-too品种的研发逐渐放缓，但扩展适应症、克服耐药性、优化治疗方案的研究还没有结束。 1.1.Bcr-Abl抑制剂
酪氨酸激酶体系顺口溜
酪氨酸激酶体系：胰岛素，生长激素，促红细胞生成素 记忆：为了生计老暗算别人一刀，简直是个畜生 血沉ESR加快：纤维蛋白质，球蛋白，胆固醇 记忆：单纯（胆固醇）少女求（球蛋白）签（纤维蛋白）问红尘（红细胞血沉） 单核细胞：3-8%,中性粒50-70%,淋巴20-40% 记忆：单身三八，中年无（5）妻（7），聆听儿诗 红细胞生成素调节：BPA(爆式促进激活物)，促红细胞生成素，性激素，生长激素，甲状腺素 记忆：一个畜生（促红细胞生成素）居然对生（生长激素）怀六甲（甲状腺素）的女人实施性（性激素）暴力， 性激素：雄激素是正性，雌激素负性 铅中毒：动力性肠梗阻，卟啉症 记忆：铅可抑制ALA脱水酶和亚铁鳌合酶的活性 蛋白质大部分是由肝脏合成的，除了Y-球蛋白是由浆细胞合成的 记忆：将（浆）在外（Y）,君令有所不受 失读症：角回受损-->独角戏（歌名）
感觉性失语症：颞上回受损-->驱赶余孽 运动性失语症：Broca区-->洞与B联系起来，或Bro像brother,brother爱运动啊 快痛-->传入纤维是A*纤维，慢痛C纤维， 记忆：形状像豆芽，豆芽长的快，C纤维-->chronic是慢的意思 凝血因子：IV->钙离子，V->易变因子 记忆：武艺盖世 凝血辅因子：IV，V，III，VIII 记忆：我师傅三八 被消耗的因子：II，V，VII，VIII 记忆：浩霸占我妻儿 内源性凝血：启动因子12,慢，单独凝血因子12,11,9,8,4， 外源性凝血：启动因子3,快，单独凝血因子，3,4,7 记忆：123,3+4=7
生理性抗凝血酶III：丝氨酸酶抑制物-->9-12因子 记忆：3+9=12 VitA的活性形式：视黄醇，视黄醛，视黄酸 记忆：看（视）黄色的电影是看A片 几乎所有的血浆蛋白均为糖蛋白，除了清蛋白，清蛋白与胆红素结合 记忆：因为清蛋白清高，不愿与糖为伍， 清蛋白-->清扫有毒物质-->与胆红素结合-->肝脏-->胆红素与Y,Z蛋白结合 对凝血酶敏感的凝血因子：I,V,VIII,XIII 蛋白质C系统：蛋白质C(PC),凝血酶调节蛋白，蛋白质S,蛋白C抑制物 蛋白质C (PC):灭活Va,VIIIa，抑制Fx及凝血酶原激活 记忆：我爸（5,8）嫖娼（P,C） 蛋白C抑制物与PC形成APC 肝脏是储存维生素A,E,B12,K的主要场所 记忆：干(肝)脆罢课（BAKE） 氨基酸的记忆： 中性氨基酸：中性氨基酸：谷氨酰胺，天冬酰胺，酪氨酸，丝氨酸，色氨酸，苏氨酸，胱氨酸，蛋氨酸 记忆：(中)国(股东老实)好(色输)成穷(光蛋)
蛋白酪氨酸激酶活性测定
Protein Tyrosine Kinase Assay Kit Cat. No. 539700 Introduction 3URWHLQ W\URVLQH NLQDVH 37. FDWDO\]HV WKH WUDQVIHU RI 32P-ATP followed by separation of the 323 SHSWLGH SURGXFW IURP WKH XQUHDFWHG 32P-ATP via the streptavidin membrane still demands an intensive and inconvenient washing procedure. CALBIOCHEM?’s Protein Tyrosine Kinase Assay Kit is based on a process that combines affinity binding and ultrafiltration separation to analyze a mixture sample. 7KH 37. DVVD\ EHJLQV ZLWK D UHDFWLRQ RI WKH HQ]\PH VDPSOH ZLWK D ELRWLQ\ODWHG SHSWLGH VXEVWUDWH DQG 32P-ATP. Separation by such affinity ultrafiltration process is easy, gentle, and efficient. Separation occurs in solution relatively free of nonspecific background. In addition, the ultrafiltration separation is performed in a contained and compact system that eases the handling of the radioactive sample and minimizes the radioactive waste. The sample reservoir of the centrifugal ultrafiltration unit containing the 32P-peptide product as retentate can be directly placed into a liquid scintillation vial for counting. CALBIOCHEM?’s Protein Tyrosine Kinase Assay Kit has been carefully formatted to ensure its assay performance and user-friendliness. This kit uses biotinylated EGF receptor peptide (RENAEYLRVAP) as a substrate (Pearson, et al. 1991, Methods in Enzymology200, 62-81). The Protein Tyrosine Kinase Assay Kit should be used to assay activity of EGF receptor or related PTKs that can phosphorylate the peptide substrate, or potency of an activator or inhibitor of the PTKs. Users who wish to assay other PTKs or other protein kinases with specific peptide substrates and kinase reaction buffers should choose our Universal Protein Kinase Assay Kit (Cat. No. 539551). FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR HUMAN OR DRUG USE. MSDS AVAILABLE UPON REQUEST.
受体酪氨酸激酶RTK介绍
1、受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTKs) RTKs是最大的一类酶联受体，它既是受体，又是酶，能够同 配体结合，并将靶蛋白的酪氨酸残基磷酸化。所有的RTKs都是由三 个部分组成的：含有配体结合位点的细胞外结构域、单次跨膜的疏 水α螺旋区、含有酪氨酸蛋白激酶（RTK）活性的细胞内结构域。 已发现50多种不同的RTKs,主要的几种类型包括： ①表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）受体； ②血小板生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）受体和巨噬细胞集落刺激生长因子（macrophage colony stimulating factor, M-CSF）； ③胰岛素和胰岛素样生长因子-1 （insulin and insulin-like growth factor-1, IGF-1）受体； ④神经生长因子（nerve growth factor, NGF）受体； 各类受体酪氨酸激酶 ⑤成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF） 受体； ⑥血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor, VEGF）受体和肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）受体等。 受体酪氨酸激酶在没有同信号分子结合时是以单体存在的，并 且没有活性；一旦有信号分子与受体的细胞外结构域结合，两个单 体受体分子在膜上形成二聚体，两个受体的细胞内结构域的尾部相 互接触，激活它们的蛋白激酶的功能，结果使尾部的酪氨酸残基磷 酸化。磷酸化导致受体细胞内结构域的尾部装配成一个信号复合物（signaling complex）。刚刚磷酸化的酪氨酸部位立即成为细胞内 信号蛋白（signaling protein）的结合位点，可能有10～20种不 同的细胞内信号蛋白同受体尾部磷酸化部位结合后被激活。信号复 合物通过几种不同的信号转导途径，扩大信息，激活细胞内一系列
非小细胞肺癌EGFR酪氨酸激酶抑制剂的耐药机制及逆转
【摘要】晚期非小细胞肺癌（non-small-cell lung carcinoma，NSCLC）的治疗以含铂双药联合化疗为标准治疗方案，多项研究表明，化疗药物对于NSCLC的疗效已经进入平台期，因此，寻求新的治疗方式已迫在眉睫。表皮生长因子受体（EGFR）在40% 80%的NSCLC中过表达，通过干预EGFR酪氨酸激酶信号转导已成为治疗NSCLC的主要方式。临床应用的EGFR抑制剂主要有EGFR单克隆抗体（mon-oclonal antibody，MAb）及特异性小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）。目前已证实EGFR-TKI的疗效肯定，但其原发性及继发性耐药是一个不容忽视的问题，且耐药机制复杂。文章对EGFR-TKI在临床中的应用，EGFR突变与TKI敏感性的关系，EGFR-TKI的耐药机制及逆转耐药的方法进行综述。 【关键词】非小细胞肺癌；EGFR；EGFR酪氨酸激酶抑制剂；耐药；耐药逆转 doi：10．3969/j．issn．1674－4136．2012．03．012 文章编号：1674P4136（2012）03－0164－05 表皮生长因子受体（EGFR）信号通路参与控制细胞的存活、增殖、血管生成、细胞迁移、细胞侵袭及转移等过程［1］，因此通过干预EGFR酪氨酸激酶信号转导已成为近年来肿瘤治疗的研究热点。EGFR 特异性小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase in-hibitor，TKI）吉非替尼和厄洛替尼是治疗非小细胞肺癌（non-small-cell lung carcinoma，NSCLC）的小分子靶向药物。2004年，多个权威期刊发表了关于EGFR突变与TKI药物敏感性关系的研究，发现EGFR突变的患者对TKI药物有很好的反应性［2-3］，特别是具有19外显子密码子746 750的缺失突变，21外显子密码子858替代突变（L858）的患者对TKI高度敏感。尽管如此，原发性及继发性耐药仍是亟待解决的问题。到目前为止，很多关于耐药的机制被报道，如EGFR基因20外显子的插入突变及KRAS基因突变与原发性耐药有关；EGFR基因的二次突变，MET基因的扩增以及HGF基因的过表达与继发性耐药有关等。本文就EGFR靶向治疗药物的临床应用，耐药机制及相关解决方法进行综述。 1EGFR-TKI在NSCLC临床治疗中的应用 EGFR-TKI通过与细胞内酪氨酸激酶结构域上ATP位点竞争性结合，可逆性、选择性抑制与EGFR 相关的酪氨酸激酶活性及细胞内磷酸化过程，进而抑制EGFR下游的信号转导，从而阻断EGFR诱导的体外肿瘤细胞的生长，加速细胞凋亡、拮抗血管生成、抑制肿瘤转移、阻断肿瘤生长。 1．1吉非替尼 吉非替尼是最早用于治疗NSCLC的靶向药物之一，已有多项国际多中心临床研究证实吉非替尼治疗肺腺癌有效。IPASS研究是在东亚，对非吸烟或很少吸烟的患者进行吉非替尼与卡铂+紫杉醇联合化疗的对照实验，结果显示在所有患者中吉非替尼组比卡铂－紫杉醇组有更长的无疾病进展 · 461 ·中国肿瘤外科杂志2012年6月第4卷第3期Chin J Surg Onco，Jun．2012，Vol．4，No．3
受体酪氨酸激酶分类
受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTKs) 各类受体酪氨酸激酶 RTKs是最大的一类酶联受体，它既是受体，又是酶，能够同配体结合，并将靶蛋白的酪氨酸残基磷酸化。所有的RTKs都是由三个部分组成的：含有配体结合位点的细胞外结构域、单次跨膜的疏水α螺旋区、含有酪氨酸蛋白激酶（RTK）活性的细胞内结构域。 已发现50多种不同的RTKs,主要的几种类型包括： ①表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）受体； ②血小板生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）受体和巨噬细胞集落刺激生长因子（macrophage colony stimulating factor, M-CSF）； ③胰岛素和胰岛素样生长因子-1 （insulin and insulin-like growth factor-1, IGF-1）受体； ④神经生长因子（nerve growth factor, NGF）受体； ⑤成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF）受体； ⑥血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor, VEGF）受体和肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）受体等。 受体酪氨酸激酶在没有同信号分子结合时是以单体存在的，并且没有活性；一旦有信号分子与受体的细胞外结构域结合，两个单体受体分子在膜上形成二聚体，两个受体的细胞内结构域的尾部相互接触，激活它们的蛋白激酶的功能，结果使尾部的酪氨酸残基磷酸化。磷酸化导致受体细胞内结构域的尾部装配成一个信号复合物（signaling complex）。刚刚磷酸化的酪氨酸部位立即成为细胞内信号蛋白（signaling protein）的结合位点，可能有10～20种不同的细胞内信号蛋白同受体尾部磷酸化部位结合后被激活。信号复合物通过几种不同的信号转导途径，扩大信息，激活细胞内一系列的生化反应；或者将不同的信息综合起来引起细胞的综合性应答（如细胞增殖）。
非受体型酪氨酸激酶Syk蛋白的提取与纯化
论著 文章编号:1007-8738(2004)02-0230-04 非受体型酪氨酸激酶-Syk 蛋白的提取与纯化 单保恩1,董 青1,李宏芬1,陈 晶1,董金琢2,马 洪2 (1河北医科大学第四医院科研中心,河北石家庄050011;2美国MD 技术公司,Mo 63021,美国) 收稿日期:2003-06-07; 修回日期:2003-09-18基金项目:美国MD 技术公司合作课题基金资助(2002年)作者简介:单保恩(1962-),男,河北邯郸人,教授,博士生导师. Tel:(0311)6033941-290;Email:baoenshan@yahoo.c https://www.wendangku.net/doc/8c1827638.html, Extraction and purification of non -recep -tor type PTKs -Syk SHAN Bao -en 1,DO NG Qing 1,LI Hong -fen 1 ,C HE N Jing 1,DO NG Jin -zhuo 2,MA Hong 2 1 Research Center ,The Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China;2MD Technologies Inc.845Pheasant Woods Drive Manchester,Mo 63021,USA Abstract AIM:To extract and purify Syk protein from Sf 21cells transfec-t ed by syk gene.METHODS:Sf 21cells were transfected with recom bi nant syk gene.After 48h of incubation at 28 ,the transfected cells were collected and sonicated with Sonfier son-i cator on ice.Filtered cell extract was loaded onto a R eactive Yellow -3res i n column and Toyopearl AF -H eparin -650M colum n respectively.The character of Syk protein in the fractions were i dentified by SDS -PAGE,W estern blotting and IEF.RESULTS:225m g of protein containing Syk were obtained from Sf 21cells (2.5 109)extract.There were two subpopulations in the elu -tion of Reactive Yellow -3resin column with the same relative molecular mass (M r )72 103.The two subpopulations were then applied on Toyopearl AF -H eparin -650M column and two pure proteins were obtained.The results of SDS -PAGE,W es-t ern blotting,and IEF showed the two proteins having the sam e relative molecular mass (72 103),corresponding to Syk,but with different pI.CONCLUSION:The y ield of Syk was 8m g from 2.5billion cells and the purity was >95%.The two purified Syk proteins have the sam e M r and different pI.The purified Syk protein can be applied to study Syk s m echanism,produce ant -i Syk antibody and invent Syk diagnosis kit,etc .Keywords:Syk;purification;chromatography;Sf 21cells 摘要 目的:从转染syk 基因的Sf21细胞中提取、纯化免疫相关因子 Syk 蛋白。方法:将syk 基因转染Sf21细胞,于28 培养48h,收集细胞,用超声波破碎仪裂解细胞,提取裂解液中总蛋白,用Yellow -3凝胶和Toyopear-l AF -Heptin -650M 凝胶层析柱分离、纯化。层析液中的Syk 蛋白存在和性质,用SDS -PAGE 、免疫印迹实验和等电聚焦实验鉴定。结果:从25亿个Sf21细胞裂解液中提取了含有Syk 的225mg 蛋白质。经Yellow -3凝胶层析分离,得到两个亚种的Syk 蛋白,相对分子质量(M r )均为72 103。进一步用Toyopear-l AF -Heptin -650M 凝胶层析纯化后,得到两个纯的Syk 蛋白,SDS -PAGE 、免疫印迹实验结果显示,两种Syk 的M r 均为72 103,与Syk 的理论相对分子质量吻合。但等电聚焦实验显示,这两种Syk 蛋白成分具有不同的pI 值。结论:从25亿个转染syk 基因的Sf21细胞中纯化出8mg Syk 蛋白,纯度高于95%。这两种Syk 的M r 虽然相同,但具有不同的pI 值,是两个亚种。这些Syk 可用于研究Syk 的作用机制、抗Syk 抗体的制备和Syk 诊断试剂盒的制备等。关键词:Syk;分离纯化;凝胶层析;Sf21细胞中图分类号:R392.11 文献标识码:B 非受体型酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk),是一种B 细胞激活信号转导中最重要的激酶 [1] ,与T 细胞激活中的ZAP -70属于同一个PTK 家 族,M r 为72 103。Syk 在T 细胞和B 细胞的成熟和活化过程中起关键作用[2]。该酶除有激酶活性中心SH1之外,还有两个SH2结构域,因而成为磷酸化I -TAM 招募的首选对象。被招募的Syk 立即成为Src 作用的第二个靶目标,进而启动B 细胞活化信号转导的三条主要途径(磷脂酰肌醇途径、MAP 激酶相关途径和磷酸肌醇3激酶途径),激活各种转录因子转位进入细胞核,与基因启动子区域中各种顺式作用元件或DNA 小盒结合,使相应基因发生转录激活和产物表达,调整B 细胞等细胞克隆的蛋白质表达、细胞分化或凋亡。研究发现,Syk 不但是免疫调节因子,在肿瘤发生发展中也发挥着重要作用。但是,用于研究Syk 的蛋白标准品、抗体和诊断用试剂很难取得。我们介绍从转染s yk 基因的Sf21细胞中提取、纯化免疫相关因子Syk 蛋白。