膜片钳实验技术入门---基本原理与操作

膜片钳实验技术入门------基本原理与操作

关兵才 李国华 刘理望

按：本文乃于2003年根据较旧型号的仪器写成，后被《机能实验科学》 （郑先科主编，北大医学版，2006）收入。因新旧仪器基本原理和操作步骤大同小异，现对原文略作修改和标注，供同学们参考。

【实验目的】

1. 了解膜片钳技术的基本原理和操作。

2. 初步学习电压依赖性离子通道电流的基本记录方法。

【实验原理】

一、膜片钳技术原理简介

膜片钳(patch clamp)是一种主要用于检测细胞膜离子通道活动的电生理技术，按工作方式可区分为电压钳(voltage clamp)和电流钳是最基本的工作方式，即对细胞膜电位进行人为控制，如将膜电位钳制于某一固定水平，或在此基础上再施以阶跃(step)式或斜坡式(ramp)电压刺激，同时记录跨膜电流，从而分析细胞膜通道的活动。电流钳即人为控制经微电极对细胞进行注射的电流（等于离子通道电流与细胞膜电容电流之和），同时记录膜电位及其变化。若注射电流为零即常用的零位钳流，用于测量细胞膜静息电位，若注射方波脉冲刺激电流，用于诱发、观测动作电位。另外，膜片钳技术还常用于观测细胞膜电容, 从而推测分泌细胞的活动情况。下面主要介绍其电压钳工作方式的基本原理。（注：在电生理资料中，因通常将细胞外液和记录系统的“地”点相连作为参考点即零电位点，所以电位和电压两个概念经常混用。）

根据膜片钳实验中受检细胞膜的型式（configuration）不同，又可将膜片钳分为全细胞式(whole-cell)、细胞贴附式(cell-attached 或on-cell)、内面朝外式(inside-out)、外面朝外式(outside-out)等四种模式。

(一)全细胞式

1．电压钳制和电流记录的实现

图9-9为全细胞式膜片钳工作原理示意图。

图9-9 全细胞膜片钳实验原理示意图

A1：运算放大器；A2：单倍增益差动放大器；R f：反馈电阻；V p：电极电位（A1反向输入端电位）；

V c：A1同向输入端电位；C in：输入端杂散电容；C p：电极电容；Rs：串联电阻；C m：细胞膜电容；R m：细胞膜电阻；E m：细胞膜内在电位(指钳压时的细胞膜诸通道状态决定的内在Goldman-Hodgkin-Katz平衡电位)；V o：A2输出端电位；V-offset：偏移电位补偿电位；C c：用于电容补偿的电容；V c(app)：表观钳制

电压即欲施加于受试膜片的电压；图中⊕和表示求和电路

将充有电解质溶液的玻璃微电极（glass microelectrode或 recording pipette）利用负压紧密吸附于细胞表面，形成吉欧即千兆欧（109Ω）级高阻封接，进一步对微电极内施加负压、将

放大器（以下简称运放）A1在深度负反馈工作状态下的“虚短路（virtual short circuit）”原理实现，即只要A1工作于线性范围内，其反向输入端的电位V p总是等于同向输入端的电位V c，这两个输入端之间虽非短路却类似于短路。因此，只要人为对V c予以控制，则V p总是“跟随”V c而变，使V p=V c(严格讲并不一定完全相等，多数情况下二者十分接近，其差异对于研究细胞膜电生理而言完全可以忽略)。该“虚短路”现象，实质是由于A1对两个输入端间出现的电位差高度敏感，V p和V c之间欲出现明显差异时（如跨膜离子流动引起V p变化时，或人为改变V c时），通过负反馈电阻R f迅速对反相输入端“补充”或“卸除”电荷来调节V p，使之总与V c十分接近或相等。图中A2为单倍增益差动放大器，其输出端电位V o等于两输入端电位之差。结合运放A1的“虚短路”原理和单倍增益差动放大器A2的工作特点，可得：

V1 = V p-IR f = V c-IR f

V o = (V1-V c) ×1= (V c-IR f )-V c = -IR f

其中I为流经反馈电阻R f的电流，另据运放的“虚断路(virtual open circuit)”原理，即通过其两个输入端进入或流出运放的电流极小，类似断路，若各种补偿调节完成后，则跨膜电流基本上等于流经R f的电流I。可见，A1、R f和A2构成一个“电流-电压转换器(current-voltage converter)”，将跨膜电流在A2的输出端以电位V o（= -IR f）的形式测得。

2．参数的补偿

为了使膜电位的钳制准确而快速地实现，并使输出信号较好地反映离子通道的电流，需进行多种参数补偿，下面只介绍和实验操作密切相关的几种：

(1) 电容补偿(capacitance compensation)：在监视细胞封接、破膜过程以及研究电压门控离子通道的特性时，须在V c端施加阶跃电压刺激，如常用的方波电压刺激，即先后施加两个方向相反的阶跃刺激。只要有电位的阶跃，由于微电极、放大器输入端及其间的连接等均可造成对地“杂散电容(stray capacitance)”而产生时间常数短的“快电容充放电电流”；在全细胞模式又因细胞膜电容(membrane capacitance)的存在而出现时间常数较大的“慢电容充放电电流”（有些放大器在参数设计名称上有异，详见下面的注释）。这些电容电流既非我们欲记录的信号，且其作为电流伪迹会对一些快电流信号（如钠电流）的记录产生干扰，此外还有可能使放大器饱和（即超出放大器的线性工作范围使记录结果失真），故需将其从放大器输出端信号中消除。补偿的原理为在运放A1的反向输入端接一电容C c，电容另一端接由方波刺激电压驱动的指数电位发生电路（exponential voltage generator），调节此电路的增益和时间常数，使其向C c注射的电流和欲消除的电容电流同步性对等补偿，这相当于将电容电流“引流”到C c支路，从而不再因流经R f而在输出端体现。

(2) 串联电阻补偿(series resistance compensation)：因为电极尖端直径小，而且在全细胞模式时有细胞膜残片阻挡在电极口处，故有数兆乃至十余兆的电阻值，因此电阻与全细胞

膜片相串联，故称为“串联电阻（series resistance , Rs）”【不少资料将串联电阻称为入口电阻（access

resistance, Ra）, 而将封接电阻称为Rs (seal resistance)，请注意区别】。若跨膜离子电流流经R s，会造成细胞膜钳压偏移；若电容电流流经Rs，会造成对细胞膜钳压的速度降低。对于前者，可用图中的正反馈“校正电路(correction circuit)”予以补偿，即根据跨膜电流大小确定自输出端V o向同向输入端V c的反馈补偿量，从而使V m和V c尽管不等，但和欲施加的钳位水平（图中用V c(app)即表观钳位值表示）尽量接近。对于后者，可用“增压电路(supercharge circuit)”予以补偿，因为电容电流被补偿之后不再于输出端V o中体现，故无法再用上述校正电路反馈补偿钳压速度。增压电路的作用为使电位阶跃初始幅度加大，其后再返回正常阶跃欲达到的水平，从而使膜电位能迅速地改变。

(3) 偏移电位补偿(offset voltage compensation)：由于电化学效应在金属/金属难溶盐电极与电解质溶液间、不同的电解质溶液之间存在着相界电位（其中后者称为液接电位，也有人将二者均称为液接电位），放大器输入端本身也有偏移电位。微电极进入浴液后，这些相界电位使运放两输入端的电位明显失衡，使放大器饱和。“偏移电位补偿”即在V c端叠加一个直流电位，从而使钳压实验之前两个输入端的电位平衡、放大器输出值为零。钳压实验中施于细胞膜的钳制电压实际上是叠加于此直流补偿电位之上的。

(4) 漏电流减除(leak subtraction)：若用阶跃电压刺激细胞膜，会引起相应的背景线性漏电流响应（即假定膜电阻不变时，和阶跃刺激电压成正比的电流），若该刺激引起了通道的活动，则通道活动电流会叠加于此漏电流之上。为了更清楚地观察通道活动电流，通常用电路或程序将此背景漏电流减除，简称“漏减”。值得注意的是，“漏电流”指背景线性电流，并非仅指细胞与微电极之间封接间隙泄漏的电流，还包括背景状态的离子通道以及膜电容所介导的线性电流响应。是否需要做漏减，须根据通道活动电流（常称作主动电流）和背景漏电流（常称作被动电流）的相对大小而定。

(二)细胞贴附式

将充有电解质溶液的玻璃微电极紧密吸附于细胞表面形成吉欧封接后，不吸破电极下

的膜片，而是在一定的钳压条件下记录该膜片所含通道（可含有一个或数个通道）活动电流，

即为细胞贴附式膜片钳（图9-10）。

图9-10 细胞贴附式膜片钳实验示意图

PCA：膜片钳放大器；RP：静息电位；Vp：电极电位（膜片钳放大器输入端电位）

1．静息电位影响的消除

由于外侧大膜片的存在，受试小膜片两侧的电压为V m=RP-V p，所以必须考虑静息电位RP的影响。消除其影响的方法有：（１）通过对一定样本的此种细胞用全细胞电流钳方式测得其平均静息电位，根据V m=RP-V p，确定若欲施加于受试膜片两侧电压V m所对应的V p值。但若仪器的钳压显示值不是V m，会使钳压操作欠直观、不方便。故往往将RP作为一种“偏移电位”补偿掉，即将RP视为零水平，从而令仪器的钳压显示值仍为V m。另外，由于细胞贴附式实验时受试膜片内、外面和全细胞式相反，通常电路设计或软件处理考虑到习惯问题，

使V m的显示值为-V p。（２）令浴液中钾离子的浓度和细胞内液钾离子浓度尽量接近，使RP 接近于零。

受试膜片通道活动不足以使RP明显变化而影响钳压。但若有药物作用于外面的大膜片而使其上的通道有明显活动，则会使大膜片两侧的电压明显变化而影响受试膜片的钳压，这一点在细胞贴附式实验设计中应注意避免。

2．外侧大膜片的电阻和电容的影响简析

由于外侧膜片的面积远较内侧受试膜片为大，所以前者的直流电阻远小于后者，当外加电压V p或ΔV p时，主要作用于受试膜片。膜电容的影响勿需考虑，因为内侧受试膜片和外侧大膜片各自等效于一个RC并联电路，从Vp点和零电位点之间看进去，这两个RC电路又相互串联，且其RC值大致相等，故二者的电容效应在电压阶跃过程中恰好能够相互补偿。(注：有兴趣的同志可参见秦曾煌主编《电工学》第五版上册208-209页)

另外，细胞贴附式实验中需调节快电容补偿，也可于小补偿范围档调节慢电容补偿，进一步消除用快电容补偿不能消除的电容电流。因单通道电流很小，串联电阻亦较小，故不必使用串联电阻补偿。为了便于数据分析最好使用漏减功能，尽管单通道活动电流和漏电流有时不难鉴别。

(三)内面朝外式和外面朝外式

在细胞贴附式基础上可经进一步处理使被吸附的小膜片撕下，置于与细胞内液相似的浴液中测该小膜片的通道信号，即为内面朝外式；在全细胞式基础上可进一步处理使电极周围的膜片与细胞其余部分断开，进而融合成一小膜片，置于与细胞外液相似的浴液中测该小膜片的通道信号，即为外面朝外式。只要理解了全细胞式和细胞贴附式的基本原理，这两种膜片钳模式则容易理解，不再赘述。

除全细胞式之外的其它三种模式均属单通道记录，因记录的电流(pA级)与全细胞记录的电流（nA级）相比小得多，因此，反馈电阻R f的值也相应地要由全细胞的0.5GΩ切换为10或50GΩ。另外，单通道记录对系统低噪声的要求很高，须做好接地、布线方式、屏蔽等降噪措施。

二、颈上神经节细胞膜钙通道电流

以全细胞模式对颈上神经节细胞进行膜片钳记录，于胞外用TTX阻断其钠通道，于胞内兼胞外用Cs阻断其钾通道，胞外用Ba2+作为钙通道电流的载流子*，给予去极化方波刺激可观察激活的钙通道电流，以及随复极化阶跃出现的尾电流(tail current)。这是由于去极化阶跃刺激引起钙通道开放，复极化阶跃又使膜电位和钙通道通透离子的综合平衡电位的距离加大所致。去极化引起的电流由N型钙通道和L型钙通道共同介导，但以前者为主。尾电流的峰值处亦由此二型钙通道介导，但其后的慢成分完全由L型钙通到介导，观察之需要使用L-型钙通道激动剂(如(+)-202-791或FPL)并使膜电位保持一定的去极化水平。

用细胞贴附式膜片钳技术记录单通道电流，在使用L型钙通道激动剂时，于不同的膜片可分别观察到去极化激活的长时程(数毫秒)开放的L通道电流和短时程开放(往往不足1毫秒)的N通道电流，且只有记录L通道时可能随复极化阶跃出现时程较长的单通道尾电流。

结合使用选择性通道激动剂，并比较全细胞和单通道记录的结果，可判断全细胞的去极化激活电流及其尾电流的慢成分各有何型通道介导。

*注：在细胞电生理实验中Ba2+常用作钙通道电流的载流子，原因是：(1)钙通道对Ba2+的通透性高于对Ca2+的通透性；(2)Ba2+能阻断钾通道；(3)使用Ba2+可防止L型钙通道的钙离子依赖性失活；(4)使用Ba2+可防止某些钙依赖性信号系统的激活。

【材料与方法】

一、实验动物新生SD大鼠（1~3天龄），雌雄不拘。

二、实验仪器设备：

哺乳动物手术器械一套，电子天平，35mm培养皿，盖玻片，CO2培养箱，微电极拉制仪，微电极抛光仪，微操纵器，膜片钳放大器及附件，微机，膜片钳实验软件，数据采集卡。

三、药品与试剂：

1.药品：

poly-L-lysine，calf serum，fetal bovine serum，glutamine，penicillin，streptomycin，nerve growth factor ，barium acetate ，N-methyl-D-glucamine ，tetrodotoxin，cesium aspartate，BaCl2, tetraethylammonium hydroxide，potassium aspartate，MgCl2，HEPES，EGTA，ATP，DMEM，CsOH，KOH，(+)-202-791

2.细胞浴液、电极内液(mM，另有注明者除外)

l) 全细胞记录：

细胞浴液：barium acetate 20，N-methyl-D-glucamine (NMDG) 125，HEPES 10，tetrodotoxin (TTX) 0.001，pH值用CsOH调至7.50

电极内液：cesium aspartate 123，EGTA l0，HEPES l0，MgCl25，ATP 4，pH值用CsOH 调至7.5。

2) 细胞贴附式单通道记录：

细胞浴液：potassium aspartate 140，HEPES 10，EGTA 5，(+)-202-791，500 nM，pH值用KOH调至7.5。

电极内液：BaCl2 110，HEPES 10，pH值用tetraethylammonium hydroxide调至7.5。

四、方法与步骤

(一) Ag/AgC1电极的制备和玻璃微电极的拉制：

1.Ag/AgCl电极的制备（参见第五章第一节），即将直径0.2 mm的银丝的一端接直流电源（如废电池）的正极在含Cl-的溶液中进行电镀，电流越小，形成的AgCl 越致密，但需要的时间越长。另外，也可以将银丝插于漂水中通过电化学反应形成AgCl。

2.用微电极拉制仪对玻璃毛胚两步拉制，形成尖端直径约1μm左右的玻璃微电极。用于全细胞记录的微电极抛光与否均可，以进行抛光为佳，充灌后电极电阻2~4 MΩ；用于细胞贴附式记录的微电极须抛光，并在电极尖端涂一层硅酮树脂(sylgard)以减小噪声，充灌后电阻3~6 MΩ。

(二)细胞标本制备：

将l~3天龄的新生SD大鼠断头，取颈上神经节，去除其周围的结缔组织，用眼科剪将其剪成3~4小段，然后用1ml的注射器将碎片抽吸数次使细胞分离，再铺于培养皿内用多聚赖氨酸处理过的盖玻片上。往培养皿中加DMEM培养液(其中含calf serum 7.5%，fetal bovine serum 7.5%，glutamine 4 mM，penicillin 100 IU ml-1，streptomycin 100μg ml-1，nerve growth factor 0.2μg ml-1)。将培养皿置于含5%CO2的培养箱中37.5℃下孵育。用于全细胞记录的神经元孵育不超过24h，以避免有突起长出；用于贴附式单通道记录的神经元孵育24~48h。

(三)膜片钳实验操作程序

鉴于实验操作因膜片钳放大器的型号、所用软件及个人操作习惯不同而有差异，在此不针对具体某一套实验系统作过细的论述，另外，某些型号的膜片钳放大器(如EPC-7，Axopatch-1系列，PC-II等)和软件配合使用时，有的参数调节既可通过使用仪器面板上的旋钮、电键进行，也可通过软件控制进行，但一定要注意放大器和软件参数设置的匹配。在新型的膜片钳放大器(如EPC-9)参数调节完全由软件控制操作。

1.全细胞模式：

实验在室温(20~25℃)下进行。

(1)仔细检查实验系统各仪器间的线路连接。

(2)打开总电源开关，打开各仪器的电源开关和实验软件，检查各参数的初始设置，令：偏移电压补偿5mV左右，工作方式search（或track），快电容补偿，C-fast零，τ-fast零，慢电容补偿C-slow零，Rs零，串联电阻补偿0%，保持电压0mV，漏减关闭，∝MΩ，滤波5KHz。

(3)将盛有贴壁细胞的培养皿置于倒置显微镜的载物台上。

(4)电极安装：将浸于细胞浴液的Ag/AgCl参比电极与探头的信号地端相连接；以电极内液充灌玻璃微电极，将其装于微电极夹持器上并旋紧使之密闭，微电极中的电解液通过Ag/AgCl电极和探头的信号端相连接。

(5)相界电位补偿和电极电阻的测量：在“搜索”方式下对电极施以小幅值(5mV)的方波电压脉冲，此时只看到零位电流基线上叠加有小的电容电流尖波；通过和微电极夹持器内部相通的塑料管对微电极内轻施一正压，在微操纵器控制下使微电极进入浴液，电流基线将马上漂离零位，但由于搜索状态的负反馈调节作用又会逐渐漂回，基线上叠加有响应电流方波。调节相界电位补偿，令输出电流为零【若不使用Search/Track方式，而使用V oltage clamp (VC)方式，则令电流基线为零】；并根据脉冲电压方波引起的电流响应幅值测量微电极电阻。

(6)细胞封接：调节微操纵器使微电极尖端接近细胞表面并轻轻压紧细胞，当方波电流幅值下降至原来的2/3左右时【对不同细胞类型下降程度不同，需摸索】，将微电极内正压释放，方波幅度会明显压低（有时甚至可以直接形成吉欧封接），再轻轻施以负压，使封接电阻达吉欧级，此时方波电流缩至基线。

(7)快电容补偿：将电流放大倍数调高，调节C-fast和τ-fast进行快电容电流补偿，使输出电流信号中的快电容电流成分消失。

(8)吸破细胞膜：将工作方式切换到“钳压”档【若在钳压(VC)状态下封接，则不需此切换】，并将保持电位调至 -90mV(若无特殊要求，一般以调至受试细胞静息电位平均值为原则)，再加大微电极内的负压将细胞膜吸破，此时可见慢电容电流的出现，以及方波电流的轻微加大。

(9)慢电容补偿：根据细胞大小选择电容补偿范围，调节C-slow和Rs进行慢电容电流补偿，使输出电流信号中慢电容电流成分消失。

【对holder内部施加正、负压，可根据tubing的长度和内径选用1~10ml的注射器，一般用2~5ml的为宜】

（注意：a. 不同型号的放大器用于快、慢电容补偿的参数设计有差异。有的放大器将电极电容补偿称为快电容补偿，将细胞膜电容补偿称为慢电容补偿，本文所述以此种设计为例。也有的放大器如Axopatch-1D, Axopatch-200B，multiclamp-700B等将电极电容的补偿分为快、慢补偿，故不将细胞膜电容的补偿称作慢电容补偿而直接称为膜电容补偿。

b. 需要说明的是：根据电路设计，调节细胞膜电容补偿的过程即测量串联电阻和细胞膜电容的过程，且只有调好了慢电容补偿，下一步调节串联电阻补偿才有意义。）

(10)串联电阻补偿：打开串联电阻补偿键，调节串联电阻补偿至不产生震荡为度。

(11)正式进入标本细胞的检测。

2.细胞贴附式：同全细胞记录的第(l)至(7)步，只是滤波调为lkHz，并注意反馈电阻的切换，和放大倍数的调整。（在做单通道记录实验前要将记录系统的噪声降至最低，具体方法请见https://www.wendangku.net/doc/8b2378920.html,中的technical support部分。）

【实验观察与结果处理和分析】

1.全细胞模式：

细胞膜保持电位置于-90mV，在此基础上给予去极化到 +l0mV的方波电压刺激，波宽40ms，然后复极化阶跃至-50mV并保持50ms的可观察时段。扫描频率0.25次/秒。观测去极化剌激激活的电流及其后的尾电流。以去阶化阶跃后15ms处的电流幅值作为去极化方波

引起的电流记录值，以复极化阶跃后12ms处的电流幅值作为尾电流慢成分的记录值。结果用平均值±标准误(mean±SE)表示(下同)。

浴液中加入L通道激动剂(+)-202-791，观察对去极化电流和尾电流各有何影响。

漏减用软件控制实现，以不引起通道活动的超极化(至-110mV)方波诱发漏电流，取10次的平均值，以此漏电流和测试方波电压的比例关系，算得去极化刺激对应的漏电流，并将其从记录结果中减除。

观察结果如图9-11所示。

图9-11 全细胞模式记录的颈上神经节细胞电压依赖性Ba2+电流波形 a为未使用L通道激动剂(+)-202-791时，b为使用(+)-202-791时。由图可见(+)-202-791对-90mV至+10mV的去极化阶跃刺激引起的电流幅值影响不大，但可使由+10mV至-50mV的复极化阶跃引起的尾电流出现慢成分。

2.细胞贴附式：

细胞膜保持电位置于-90mV，在此基础上给予去极化到+30mV的方波电压剌激，波宽700ms，扫描频率0.25次/秒。观测去极化方波激活的不同的钙通道的活动形式，微机采样记录。

对5~15次方波刺激不引起通道活动的电流记录结果进行平均，将此平均值作为漏电流，并将其从其它记录结果中减除。分析单通道活动，要至少分析40个连续的、进行过漏减处理的扫描记录结果。计算方波刺激不引起通道活动的扫数百分比。计算方波剌激引起通道活动的扫描中的通道平均开放次数、平均单通道电流的幅值，平均每次开放的时程。

浴液中加入L通道激动剂(+)-202-791，观察对不同的单通道电流的影响。观察结果如图9-12所示。

图9-12 使用L通道激动剂(+)-202-791时，细胞贴附式膜片钳记录的颈上神经节细胞单通道Ba2+电流

左侧为L型单通道电流，右侧为N型单通道电流。注意L单通道电流开放时程较长(常大于8ms)，且有时可观察到尾电流。

【注意事项】

1. 为减小微电极电容电流及防止电解液污染电极夹持器内部产生噪声，微电极充灌至其容积的l/3左右即可，不宜过满。若电极尾部或外表面有液体，必须用滤纸吸净后再安装。

2. 安装玻璃微电极之前，要先用手背接触屏蔽笼，消除身体所带的静电。

3．电极在夹持器上的固定既要牢靠，以免漏气影响电极内施加正、负压力，又不能旋得过紧而损坏夹持器。注意安装电极时，要用一只手将夹持器中部捏住，另一只手将帽旋紧，两手用力均要适度，不可过大。

4. 在全细胞实验中，必须在形成吉欧封接后调节好电极电容补偿。破膜后再调节好细胞膜电容补偿，然后才能调节串联电阻补偿。进行串联电阻补偿时要小心，因为其中的校正电路为正反馈连接方式，应注意避免过补偿造成振荡而破坏封接状态和细胞活性。

【有时需要在实验过程中经常用小幅值电压方波刺激来监测串联电阻、细胞膜电阻、细胞膜电容等参数，可以只补偿好电极电容而不做膜电容补偿和串联电阻补偿。但应进行钳压误差估算，若误差较大则需要进行offline correction。】

5. 考虑到电极入浴液并补偿偏移电压后，再形成全细胞模式或细胞贴附式记录状态，会有液接电位的消失或改变，为准确起见，最好自有关手册中查阅此液接电位的变化值，补偿偏移电压时将其一并考虑进去。

6. 做细胞贴附式膜片钳实验时，一定要注意补偿静息膜电位。

7．做膜片钳实验，无论是实验前的准备工作，还是封接、记录，一定要细致、有耐心，不可有急躁情绪和侥幸心理，否则会欲速不达或前功尽弃。

【思考题】

1. 电容补偿和串联电阻补偿有什么意义?

2. 细胞贴附式膜片钳实验中，外侧大膜片的存在对电极尖端下的受试小膜片的钳压及电流测试有何影响?如何消除之?

3. 对同一种细胞，在其它实验条件相同的情况下，全细胞和单通道记录所得的实验结果有什么相互关系?

4. 为什么记录电压依赖性通道电流时，通常要使用漏减功能?

（Guan BC, Li GH and Liu LW）

膜片钳原理

膜片钳技术原理 可兴奋膜的电学模型 细胞膜由脂类双分子层和和蛋白质构成。脂质层的电导很低，由于双分子层的结构特点，形成了细胞的膜电容，通道蛋白的开闭状况主要决定了膜电导的数值。在细胞膜的电学模型中，膜电容和膜电导构成了一个并联回路。在细胞膜的电兴奋过程中，脂质层膜电容的反应是被动的，其电流电压曲线是线性的；而由通道蛋白介导的膜电导构成了膜反应的主动成分，它的电流电压关系是非线性的。 当改变跨膜电位时，膜电容和膜电导分别引发被动和主动电流：Im=Ii＋CdV/dt，其中Im是流过膜的总电流，Ii是通道电流，CdV/dt是由膜电容介导的电容电流。为了考察通道电流就必须消除电容电流的影响，此时可以令dV/dt＝0，即将膜电位钳制在一固定数值，使其不随时间变化，这就是电压钳技术的实质所在。 电压钳技术 离子通道的近代观念源于Hodgkin、Huxley、Katz等人在20世纪30—50年代的开创性研究。在1902年，Bernstein创造性地将Nernst的理论应用到生物膜上，提出了“膜学说”。他认为在静息状态下，细胞膜只对钾离子具有通透性；而当细胞兴奋的瞬间，膜的破裂使其丧失了选择通透性，所有的离子都可以自由通过。Cole等人在1939年进行的高频交变电流测量实验表明，当动作电位被触发时，虽然细胞的膜电导大为增加，但膜电容却只略有下降，这个事实表明膜学说所宣称的膜破裂的观点是不可靠的。1949年Cole在玻璃微电极技术的基础上发明了电压钳位（voltage clamp technique）技术，基本原理如下： 电压钳技术的核心在于将膜电位固定在指令电压的水平，这样才能研究在给定膜电位下膜电流随时间的变化关系。在上图中，膜电位Vm由高输入阻抗的电压跟随器所测量。钳制放大器在比较了膜电位和指令电位E之后，通过电阻Ra将电流注入膜内以控制膜电位。钳制放大器的输出：Vo=A（E－Vm），因为这个输出由电阻Ra和膜所分压，所以输出电流：I=（Vo－Vm）/Ra。由这两个关系可推出：Vm=EA/(1+A)-RaI/（1+A）。因此若钳制放大器的增益A极大，膜电位Vm和指令电位E之间的差别就可以忽略，即实现了电压钳制。 Hodgkin、Huxley和Katz应用电压钳技术研究枪乌贼巨轴突，结合同位素示踪和胞内灌流等技术发现：动作电位的初期，细胞膜主要对钠离子的通透性发生改变，胞外的钠离子迅速内流，并产生所谓的“超射”现象（overshoot）；随后对钠的通透性的急剧减少并且对钾离子的通透性增加。兴奋期的膜电位存在“超射”现象也是膜学说所不能解释的。 根据这些实验，Hodgkin、Huxley和Katz在其1949—1952年的一系列论文中提出了“离子学说”或“钠学说”。认为当膜的去极化超过一个临界值时，就会触发动作电位的产生。在此期间，钠电导迅速上升，钠离子大量内流，使得膜电位接近钠的平衡电位；随后钠电导迅速失活，钾电导逐渐增加，引起膜电位的复极化。 Hodgkin和Huxley通过对电压钳位实验数据的分析，给出了所谓的Hodgkin—Huxley方程。他们将膜电位钳制在不同的水平，观察钾电导或钠电导随时间的变化，然后用一个常微分方程去逼近所得到的实验曲线，而这些微分方程中的参数则假定跟离子通道上的“粒子”相关。根据H—H方程，能够推导出动作电位的阈值、形状、幅度等性质。并且在去除电压钳制的条件下，可以得到一个以电压和时间为变量的偏微分方程，由它可以给出和真实状况相符合的神经冲动的传导。 膜噪声和噪声分析 Katz等人在1970年代初期研究了蛙神经肌肉接头处肌纤维膜电位的波动。他们根据对这种膜电位“噪声”的分析，提出了量子释放的概念，认为神经递质是以囊泡的形式从突触前膜释放到突触间隙中。并且Katz等人借助这种新的“噪声分析”方法（fluctuation analysis），能从突触后膜电位的“噪声”中推测出单位事件的幅度和时程。Anderson、Stevens、Colquhoun和Sigworth等人进一步发展了“噪声分析”。 “噪声分析”的实质在于二项分布期望和方差之间的关系。假定通道只有开和关两个状态，并且各个通道的开关是独立的。若N是通道的总数，p是通道的开放概率，i是单通道电流，I是膜电流的期望值。则有：I=Npi，var(I)=Np(1-p)i2,即：var(I)=iI-I2/N。用var(I)对I作图，这显然是一个开口朝下的抛物线。微分这个二次方程得到曲线的斜率：dvar(I)/dI=i-2I/N,当I=0时的斜率就是单通道电流，根据钳制电位和反转电位之间的差就可以算出单通道电导；在抛物线的顶点即当：dvar(I)/dI=0时，I=Ni/2，由此可算出

膜片钳技术的发展和应用

膜片钳的发展和应用 1．背景 细胞是生物的基本组成单元，细胞外围有一层薄膜，彼此分离又互相联系，细胞间与细胞内的通信、信号传递依靠其膜上的离子通道来进行，离子和离子通道是细胞兴奋性的基础，亦是产生生物电的基础。生物电信号通常是用电学或电子学的方法进行测量。早期多采用双电极电压钳技术作胞内记录，近年来逐渐被膜片钳所取代，这项技术为从细胞和分子水平了解生物膜离子单通道“开启”和“关闭”的门控动力学及各种不同离子通道的通透性和选择性等膜信息提供了最直接的手段。 膜片钳记录(patch clamp recording)是利用玻璃微电极吸引封接面积仅为几个um2的细胞膜片，在10-12A水平，记录单个或几个通道的离子电流，已达到当今电子测量的极限。此技术广泛用于细胞膜离子通道电流的测量和细胞分泌、药理学、病理生理学、神经科学、脑科学、植物细胞的生殖生理等领域的研究。从而点燃了细胞和分子水平的生理学研究的生命之火，并取得了丰硕的成果。 2．膜片钳技术简介 2.1 基本原理和记录方法 电压钳(V oltage-clamp)是由英国学者Huxley和Katz最先应用的[1]。其实质是通过负反馈微电流放大器在兴奋性细胞膜上外加电流，保持细胞跨膜电位不变，并迅速控制其数值，以观察在不同膜电位条件下膜电流的情况。膜电流的改变反映了膜电阻和膜电容的变化，因此电压钳可用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道的活动，但该技术由于在细胞内插人两根电扳，对细胞损伤很大，在小细胞中难以实现，又因细胞形态复杂，很难保持细胞膜各处生物特性的一致，而逐渐被膜片钳所取代。 膜片钳技术(patch-clamp)是在电压钳基础上发展起来一种新技术，与电压钳的主要区别有二：一是钳制膜电位的方法不同；二是电位固定的细胞膜面积不同，即所研究的离子通道数目不同。与电压钳一样，膜片钳也是利用负反馈电子线路，将微电板尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜电位固定在一定水平，观察流过通道的离子电流。其实现膜电位固定的关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻封接，使电极尖开口处与相接的细胞膜小区域(膜片)形成无论是从机械上还是电学上都极为紧密地封接，从而可反映细胞上单一(或多数)离子通道的分子活动[2]。1976年，德国科学家Neher和Sakmann首先用此技术对蛙胸皮肌细胞膜上的己酰胆碱受体通道进行了研究，记录出了量值在皮安级(10-12 A)的微弱电流[3,4]。1981年，经Hamill等[5]后人的进一步完善，其电流测量灵敏度已达1pA，时间和空间分辨率达10 us和1 um。 随着膜片钳技术的出现，目前有几种不同的记录方式： (1)细胞吸附式(cell-attached patch)将两次拉制后，经热抛光的微管电极置于清洁的细胞膜表面, 形成高阻封接，在细胞膜表面隔离出一小片膜，即通过微管电极对膜片进行电压钳制，从而测量膜电流。 (2)内面向外模式(inside-out patch)高阻封接形成后，将微管电极轻轻提起，使其与细胞分离，电极端形成密封小泡，在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再回到溶液中，使小泡的外半部分破裂即得。

大数据技术原理与应用课程建设经验分享

摘要：大数据专业人才的培养是世界各国新一轮科技较量的基础，高等院校承担着大数据人才培养的重任。大数据专业作为典型的“新工科”专业，在课程体系建设方面还处于摸索阶段。首先剖析了大数据课程建设的难点，然后介绍了厦门大学建设的大数据课程体系，包括入门级课程、进阶级课程和实训课程，最后分享了大数据技术原理与应用课程建设的经验与方法，包括课程定位、培养目标、预备知识、大数据与云计算课程之间的知识切割、课程内容与学时安排、课程教材、实验环境搭建、配套资源建设、在线服务平台、线下培训与交流等。 关键词：课程体系；MOOC；公共服务平台 1 引言 大数据带来了信息技术的巨大变革，对社会生产和人们生活的各个领域都产生着深刻的影响，所到之处，或是颠覆，或是提升，让人们深切感受到了大数据实实在在的威力。对于一个国家而言，能否紧紧抓住大数据发展机遇，快速形成核心技术和应用并参与新一轮的全球化竞争，将直接决定未来若干年世界范围内各国科技力量博弈的格局。大数据专业人才的培养是新一轮科技较量的基础，高等院校承担着大数据人才培养的重任，因此，各高等院校非常重视大数据课程的开设，大数据课程已经成为信息相关专业的重要核心课程。北京大学、厦门大学、中国人民大学等一批高校在国内率先开设大数据课程。2016年，北京大学、中南大学、对外经贸大学3所高校成为国内首批获得教育部批准设立“数据科学与大数据技术”专业的本科院校，此后，教育部又于2017年和2018年分别批准32所和248所本科院校设立数据科学与大数据技术专业。与此同时，根据教育部公布的“大数据技术与应用”专业

备案和审批结果显示，截至目前，已经有累计208所职业院校获批“大数据技术与应用”专业。“数据科学与大数据技术”专业和“大数据技术与应用”专业一般被统称为“大数据专业”。随着大数据专业在国内众多高校中开设，大数据专业人才的培养迈入了全新的阶段。 大数据专业作为典型的“新工科”专业，在课程体系建设方面还处于摸索阶段，没有太多可供借鉴的现成经验，需要一大批热爱教学的高校教师积极投身课程体系和教材的建设工作中，共同推动全国高校大数据教学工作不断向前发展。厦门大学数据库实验室作为国内高校较早从事大数据教学资源建设的团队，从2013年开始，在大数据课程建设方面开展了很多有意义的尝试和探索，本文将分享笔者团队在这些方面的工作成果和经验做法。 2 大数据课程建设的难点 大数据专业课程涵盖范围较广，从学科角度而言，包括了数学（高等数学、线性代数、离散数学、数学建模等）、计算机（算法、数据结构、程序设计、数据库、操作系统、数据挖掘等）、统计（概率论与数理统计、多元统计分析等）等多学科知识。从数据分析流程角度而言，大数据专业课程包含了数据分析全流程的各种技术，包括数据采集、数据存储与管理、数据处理与分析、数据可视化等各个环节的技术。 本文探讨的大数据课程是指数据分析全流程涉及的大数据技术类课程。需要强调指出的是，在这些大数据技术类课程中，并非所有课程都是大数据时代新生的课程，比如，数据采集课程主要讲解网络爬虫技术，这些技术在大数据时代到来之前就已经存在很多年了，并非到了大数据时代才诞生。同理，数据可视化也是经历了多年发展的“老课程”，知识内容并没有因为大数据的出现而发生本质的变化。实际上，大数据技术之所以受到热捧，主要在于以Hadoop和Spark为代表的分布式框架解决了以较低的成本实现海量数据的存储和计算的

化学实验室基本操作

化学实验室基本操作 化学实验室基本操作2010-07-24 11：54一、常用仪器的主要用途和使用 方法 反应容器：试管、燃烧匙、烧杯、锥形瓶、集气瓶 存放容器：集气瓶(气体)、细口瓶(液体)、广口瓶(固体)、滴瓶(少量液体) 计量仪器：托盘天平(称固体质量)、量筒(量液体体积) 取用仪器：镊子(块状或较大颗粒)、药匙或纸槽(粉末或小颗粒)、胶头滴 管(少量液体) 夹持容器：试管夹、坩埚钳、铁架台(带铁圈、铁夹) 其它仪器：漏斗、长颈漏斗、分液漏斗、石棉网、玻璃棒、水槽、试管刷 可直接加热的：试管、蒸发皿、燃烧匙 能间接加热的(需垫石棉网)：烧杯、烧瓶、锥形瓶 加热仪器：酒精灯 1.烧杯圆柱状玻璃容器，杯口有便于倒出液体的嘴。 常用的有25mL、50mL、100 mL、250 mL、500 mL等 (1)用于大量物质的溶解和配制溶液或者进行化学反应的容器，也常用于接 过滤后的液体。 (2)实验时盛放液体的量不超过烧杯容积的1/2，以防搅拌时溅出。 (3)向烧杯中注入液体的时候，应沿烧杯内壁或玻璃棒引流。

(4)加热时要垫石棉网，也防受热不均而使其破裂。烧杯不能用作加热固体试剂。 2.试管 (1)用于少量物质的溶解或发生化学反应的仪器，也常用于制取或收集少量气体。 (2)振荡试管的方法：手持试管、手腕摆动。 3)实验时盛放液体量不能超过试管容积的1/3，以防振荡或加热时溅出。可直接加热。 (4)用试管夹或者铁夹固定时，要从试管底部向上套，夹持在试管的中上部(或离管口1/3的部位)。 3.蒸发皿 (1)用于溶液的蒸发、结晶 2)蒸发过程中需用玻璃棒不断搅拌，防止液体由于局部温度过高而飞溅 3)当溶液的量减少只有大量晶体析出时，停止加热并放至石棉网上，以防晶体飞溅 (4)取放蒸发皿，要用坩埚钳夹持 4.集气瓶 (1)用于收集气体、短时间贮存气体、用做物质在气体中的燃烧的反应器 (2)在收集气体或贮存气体时，要用毛玻璃片盖住瓶口。 5、试剂瓶 试剂瓶包括滴瓶、细口瓶、广口瓶等。分为无色和棕色两种。

林子雨大数据技术原理及应用第四章课后作业答案

大数据技术原理与应用第四章课后作业 黎狸 1.试述在Hadoop体系架构中HBase与其他组成部分的相互关系。 HBase利用Hadoop MapReduce来处理HBase中的海量数据，实现高性能计算；利用Zookeeper作为协同服务，实现稳定服务和失败恢复；使用HDFS作为高可靠的底层存储，利用廉价集群提供海量数据存储能力; Sqoop为HBase的底层数据导入功能，Pig 和Hive为HBase提供了高层语言支持，HBase是BigTable的开源实现。 2.请阐述HBase和BigTable的底层技术的对应关系。 3.请阐述HBase和传统关系数据库的区别。 4.HBase有哪些类型的访问接口？ HBase提供了Native Java API , HBase Shell , Thrift Gateway , REST GateWay , Pig , Hive 等访问接口。 5.请以实例说明HBase数据模型。

6.分别解释HBase中行键、列键和时间戳的概念。 ①行键标识行。行键可以是任意字符串，行键保存为字节数组。 ②列族。HBase的基本的访问控制单元，需在表创建时就定义好。 ③时间戳。每个单元格都保存着同一份数据的多个版本，这些版本采用时间戳进行索 引。 7.请举个实例来阐述HBase的概念视图和物理视图的不同。 8.试述HBase各功能组件及其作用。 ①库函数：链接到每个客户端； ②一个Master主服务器：主服务器Master主要负责表和Region的管理工作； ③③许多个Region服务器：Region服务器是HBase中最核心的模块，负责存储和 维护分配给自己的Region，并响应用户的读写请求

林子雨大数据技术原理与应用第二章课后题答案

大数据第二章课后题答案 黎狸 1.试述Hadoop和谷歌的MapReduce、GFS等技术之间的关系。 Hadoop是Apache软件基金会旗下的一-个开源分布式计算平台，为用户提供了系统底层细节透明的分布式基础架构。 ①Hadoop 的核心是分布式文件系统( Hadoop Ditributed File System,HDFS )和MapReduce。 ②HDFS是对谷歌文件系统( Google File System, GFS )的开源实现，是面 向普通硬件环境的分布式文件系统，具有较高的读写速度、很好的容错 性和可伸缩性，支持大规模数据的分布式存储，其冗余数据存储的方式 很好地保证了数据的安全性。 ③MapReduce 是针对谷歌MapReduce的开源实现，允许用户在不了 解分布式系统底层细节的情况下开发并行应用程序,采用MapReduce 来整合分布式文件系统上的数据，可保证分析和处理数据的高效性。2.试述Hadoop具有哪些特性。 Hadoop是一个能够对大量数据进行分布式处理的软件框架，并且是以一种可靠、高效、可伸缩的方式进行处理的，它具有以下几个方面的特性。 ①高可靠性。采用冗余数据存储方式，即使一个副本发生故障，其他副本 也可以保证正常对外提供服务。 ②高效性。作为并行分布式计算平台，Hadoop采用分布式存储和分布式 处理两大核心技术，能够高效地处理PB级数据。 ③高可扩展性。Hadoop的设计目标是可以高效稳定地运行在廉价的计算 机集群上，可以扩展到数以千计的计算机节点。

④高容错性。采用冗余数据存储方式，自动保存数据的多个副本，并且能 够自动将失败的任务进行重新分配。 ⑤成本低。Hadoop采用廉价的计算机集群，成本比较低，普通用户也很 容易用自己的PC搭建Hadoop运行环境。 ⑥运行在Linux平台上。Hadoop是基于Java语言开发的，可以较好地 运行在Linux平台上。 ⑦支持多种编程语言。Hadoop 上的应用程序也可以使用其他语言编写， 如C++。 3.试述Hadoop在各个领域的应用情况。 互联网领域是Hadoop应用的主要阵地。 ①雅虎将Hadoop主要用于支持广告系统与网页搜索。 ②Facebook主要将Hadoop平台用于日志处理、推荐系统和数据仓库等 方面。 ③淘宝Hadoop集群服务于阿里巴巴集团各部门，数据来源于各部门产品 的线上数据库( Oracle、MySQL)备份、系统日志以及爬虫数据，每天在 Hadoop集群运行各种MapReduce任务,如数据魔方、量子统计、推 荐系统、排行榜等。 ④百度选择Hadoop主要用于日志的存储和统计、网页数据的分析和挖掘、 商业分析、在线数据反馈、网页聚类等。 4.试述Hadoop的项目结构以及每个部分的具体功能。

检验实验室操作的基本知识

检验实验室操作的基本知识 （一）实验室的基本任务和工作准则 1、实验室的基本任务 实验室是组织中负责质量检验工作的专门技术机构，承担着各种检验测试任务。它是组织质量工作、质量控制、质量改进的重要技术手段，是重要的质量信息源。其基本任务是： （1）快速、准确的完成各项质量检验测试工作；出具检测数据（报告）。 （2）负责对购入的原材料、元器件、协作件、配套产品等物品，依据技术标准、合同和技术文件的有关规定，进行进货验收检验。 （3）负责对产品形成过程中，需在实验室进行检验测试的半成品、零部件的质量控制和产成品交付前的质量把关检验。 （4）负责产品的型式试验（例行试验）、可靠性试验和耐久试验。 （5）承担或参与产品质量问题的原因分析和技术验证工作。 （6）承担产品质量改进和新产品研制开发工作中的检验测试工作。 （7）及时反馈和报告产品质量信息，为纠正和预防质量问题，提出意见。 2、实验室的基本工作准则 由于实验室是生产组织进行质量把关的主要技术手段，是为质量控制、质量评价、改进和提高产品质量，开发新产品等项工作提供技术依据的重要的技术机构，其工作质量如何直接关系到产品信誉和组织自身的发展。只有为各项检验任务提供正确的、可靠的检测结果，才可能对质量作出正确的判断和结论，反之亦然。因此，实验室最基本的工作准则，应该是坚持公正性、科学性、及时性，做好检验测试工作。

（1）公正性。就是实验室的全体人员都能严格履行自己的职责，遵守工作纪律，坚持原则，认真按照检验工作程序和有关规定行事。在检测工作中，不受来自各个方面的干扰和影响，能独立的公正的做出判断，始终以客观的科学的检测数据说话。 （2）科学性。就是实验室应具有同检测任务相适应的技术能力和质量保证能力。人员的素质和数量的配备能满足检测工作任务的需要。检测仪器设备和试验环境条件符合检测的技术要求。对检测全过程可能影响检测工作质量的各个要素，都实行有效的控制和管理，能够持续稳定地提供准确可靠的检测结果。 （3）及时性。就是实验室的检测服务要快速及时。为了做到及时性，就要精心安排，严格执行检测计划，做好检测过程各项准备工作，使检测工作能高效有序地进行。试样的制备，仪器设备的校准，环境技术条件的监控，人员的培训以及规范操作等都应按照技术规范的要求正常地进行。检测过程不出和少出现差错、误时、仪器设备故障等影响检测顺利进行的现象，以保证检测工作的及时性。 （二）实验室质量管理体系 建立质量管理体系的基本要求包括： 1、明确质量形成过程 实验室是专门从事检验测试工作的实体。实验室工作的最终成果是检测报告。检测报告就是实验室的产品，同样有一个质量形成过程。为了确保检测数据的准确可靠，以确保检测报告的质量，就必须明确它的质量形成过程和过程的各个阶段可能影响检测报告质量的各项因素。从而对这些因素采取相应的措施，加以管理和控制，使其过程处于受控状态，以保证最终产品--检测报告的质量。由于生产组织的性质不同，产品特性不同，实验室的工作任务不同，因而，其质量形成过程也不尽相同。在建立质量管理体系时，应根据本实验室的工作特点，进行分析研究，以明确其质量形成过程及涉及的要素。比较典型的质量形成过程，大体上包括以下各阶段。

膜片钳记录和分析技术

膜片钳记录和分析技术 2010-12-15 16:41 来源：美国分子仪器点击次数：2186 关键词：膜片钳细胞信号 分享到： ?收藏夹 ?腾讯微博 ?新浪微博 ?开心网 细胞是动物和人体的基本组成单元，细胞与细胞内的通信,是依靠其膜上的离子通道进行的，离子和离子通道是细胞兴奋的基础，亦即产生生物电信号的基础，生物电信号通常用电学或电子学方法进行测量。由此形成了一门细胞学科-电生理学（electrophysiology），即是用电生理的方法来记录和分析细胞产生电的大小和规律的科学。 早期的研究多使用双电极电压钳技术作细胞内电活动的记录。现代膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的。 1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个的离子通道分子活动的技术）。以后由于吉欧姆阻抗封接(gigaohm seal, 109W)方法的确立和几种方法的创建。这种技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，它和基因克隆技术（gene cloning）并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。 一、膜片钳技术发展历史 1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位

的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。 1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GW10-100G?的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。 1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。 二、膜片钳技术原理 膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来（见下图），由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。 膜片钳技术的建立，对生物学科学特别是神经科学是一资有重大意义的变革。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个的离子通道分子活动的技术。些技术的出现自然将细胞水平和分子水平的生理学研究联系在一起，同时又将神经科学的不同分野必然地融汇在一起，改变了既往各个分野互不联系、互不渗透，阻碍人们全面认识能力的弊端。

膜片钳技术原理与基本操作

膜片钳技术原理与基本操作 1976 年Neher 和Sakmann 建立了膜片钳技术（Patch clamp technique），这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的或多数的离子通道分子活动的技术。1981 年Hamill, Neher 等人又对膜片钳实验方法和电子线路进行了改进，形成了当今广泛应用的膜片钳实验技术。该技术可应用于许多细胞系的研究，也是目前唯一可记录一个蛋白分子电活动的方法，膜片钳技术和克隆技术并驾齐驱给生命科学研究带来了巨大的前进动力，这一伟大的贡献，使Neher 和Sakmann 获得1991 年诺贝尔医学与生理学奖。 一、膜片钳技术的基本原理 用一个尖端直径在1.5~3.0μm 的玻璃微电极接触细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端与细胞膜之间形成千兆欧姆以上的阻抗封接，此时电极尖端下的细胞膜小区域（膜片，patch）与其周围在电学上分隔，在此基础上固定（钳制，Clamp）电位，对此膜片上的离子通道的离子电流进行监测及记录。 基本的仪器设备有膜片钳放大器、计算机、倒置显微镜、示波器、双步电极拉制器、三轴液压显微操纵器、屏蔽防震实验台、恒温标本灌流槽、玻璃微电极研磨器。膜片钳放大器是离子单通道测定和全细胞记录的关键设备，具有高灵敏度、高增益、低噪音及高输入阻抗。膜片钳放大器是通过单根电极对细胞或膜片进行钳制的同时记录离子流经通道所产生的电流。膜片钳放大器的核心部分是以运算放大器和反馈电阻构成的电流-电压（I-V）转换器，运算放大器作为电压控制器自动控制，使钳制电位稳定在一定的水平上。 二、操作步骤 1.膜片钳微电极制作 (1) 玻璃毛细管的选择：有二种玻璃类型，一是软质的苏打玻璃，另一是硬质的硼硅酸盐玻璃。软质玻璃在拉制和抛光成弹头形尖端时锥度陡直，可降低电极的串联电阻，对膜片钳的全细胞记录模式很有利；硬质玻璃的噪声低，在单通道记录时多选用。玻璃毛细管的直径应符合电极支架的规格，一般外部直径在 1.1~1.2mm。内径1mm。 (2) 电极的拉制：分二步拉制。第一部是使玻璃管中间拉长成一窄细状，第二次拉制窄细部位断成二根，其尖端直径一般在1~5μm，充入电极内液后电极电阻在1~5MΩ为宜。调节第一步和第二步拉制时加热线圈的电流强度，即可得到所需要的电极尖端直径。电极必须保持干净，应现用现拉制。 (3) 涂硅酮树酯：记录单通道电流时，为了克服热噪声、封接阻抗噪声及电极浸入溶液产生的浮游电容性噪声，需要在电极尖颈部（距离微电极尖端50mm）的表面薄薄地涂一层硅酮树酯（sylgard），它具有疏水性、与玻璃交融密切、非导

(完整版)大数据技术原理与应用林子雨版课后习题答案

第一章 1.试述信息技术发展史上的3次信息化浪潮及具体内容。 2.试述数据产生方式经历的几个阶段 答：运营式系统阶段，用户原创内容阶段，感知式系统阶段。 3.试述大数据的4个基本特征 答：数据量大、数据类型繁多、处理速度快和价值密度低。 4.试述大数据时代的“数据爆炸”的特性 答：大数据时代的“数据爆炸”的特性是，人类社会产生的数据一致都以每年50%的速度增长，也就是说，每两年增加一倍。 5.数据研究经历了哪4个阶段？

答：人类自古以来在科学研究上先后历经了实验、理论、计算、和数据四种范式。 6.试述大数据对思维方式的重要影响 答：大数据时代对思维方式的重要影响是三种思维的转变：全样而非抽样，效率而非精确，相关而非因果。 7.大数据决策与传统的基于数据仓库的决策有什么区别 答：数据仓库具备批量和周期性的数据加载以及数据变化的实时探测、传播和加载能力，能结合历史数据和实时数据实现查询分析和自动规则触发，从而提供对战略决策和战术决策。 大数据决策可以面向类型繁多的、非结构化的海量数据进行决策分析。 8.举例说明大数据的基本应用 答： 9.举例说明大数据的关键技术

答：批处理计算，流计算，图计算，查询分析计算 10.大数据产业包含哪些关键技术。 答：IT基础设施层、数据源层、数据管理层、数据分析层、数据平台层、数据应用层。 11.定义并解释以下术语：云计算、物联网 答：云计算：云计算就是实现了通过网络提供可伸缩的、廉价的分布式计算机能力，用户只需要在具备网络接入条件的地方，就可以随时随地获得所需的各种IT资源。 物联网是物物相连的互联网，是互联网的延伸，它利用局部网络或互联网等通信技术把传感器、控制器、机器、人类和物等通过新的方式连在一起，形成人与物、物与物相连，实现信息化和远程管理控制。 12.详细阐述大数据、云计算和物联网三者之间的区别与联系。

膜片钳技术SOP

膜片钳技术SOP 关键词：膜片钳 目的： 研究膜片上几个甚至一个离子通道的电流，对单个离子通道在各种电位状态及每种电位状态下对产生电流的离子作出定性、定量的分析，来反映细胞膜上离子通道活动，为研究离子通道结构与功能关系提供关于生物电特性的新资料。基本原理： 膜片钳制技术（patch clamp technique)是对一块单独的细胞膜片（或整个细胞）的电位进行钳制的一项电生理技术。 通过对膜电位的钳制可以观察通过离子通道的电流，膜片钳放大器正是通过维持电压的恒定而测出这种电流。运用膜片钳技术记到的最小电流可达到pA级(10-12 A)。膜片钳的本质属于电压钳范畴，其基本工作原理是：采用经典的负反馈放大技术作电压固定，但改用细胞外微吸管作电极，将微电极管尖端与细胞膜表面接触，经负压抽吸，形成具极高阻抗的紧密封接，其电阻值高达10-100千欧（即GΩ=109Ω）。只有在这种封接存在时，通过膜电极引导记录的电流才是通过该膜的离子通道电流。 膜片钳技术原理示意图 Rs是膜片阻抗相串联的局部串联电阻（输入阻抗），Rseal是封接阻抗。Rs通常为1～5MΩ，如果Rseal高达10GΩ（1010Ω）以上时，IP/I=Rseal/(Rs+ Rseal)-1。此Ip可为在I－V转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻(Rf)的电压降而被检测出。

药品和试剂： 根据不同的实验设计选择不同的药品和试剂。 主要仪器设备与材料： ①屏蔽防震实验台(TMC 63-544) ②数字式超级恒渐浴槽（HSS-1 CHENDU INSTRUMENT China） ③微管电极拉制器（PP-83 NARISHIGE Japan） ④微管电极抛光仪（ME-83 NAEISHIFE Japan） ⑤电子刺激器（SEN-2030, NIHON KOHDEN, Japan） ⑥膜片钳放大器（AXOPATCH 200B Axon Instruments U.S.A） ⑦倒置相差显微镜（AXIOVERT 135 ZEISS Germany） ⑧计算机（PⅢ 800） ⑨A/D、D/A转换器（DIGIDATA-1200 Axon Instruments U.S.A） ⑩pClamp软件（10.0）Axon Instruments U.S.A ) 实验对象： 兔、大鼠、猪、和人的组织细胞（直径小于30μm的细胞），都可用于膜片钳实验。动物由泸州医学院（许可证号：SYXK（川）2008-063）提供；人体组织来源于临床手术丢弃物。本SOP以猪冠状动脉平滑肌细胞为例，选取体重约120～150 Kg的猪，雌雄不拘，猪心脏购自泸州市屠宰场。 实验环境： 常温（22o C）下进行, 湿度（70-80%） 操作步骤： 1.液体配制 主要根据研究通道的不同，所用细胞的不同，配制相应的液体，可参考相应的文献进行调整。包括：电极液；细胞外液等。基本原则是保持2个平衡，渗透压平衡和酸碱平衡。另外，所有液体在使用前必须过滤，以保持液体洁净。（详见细胞的分离与培养SOP：L Y-XJD-SYJS-014/015） 2.标本制备 膜片钳实验一般是在单个细胞上进行。实验用单细胞主要来自培养细胞或急性酶分离的细胞，也可来自脑片细胞中的原位细胞。常用的酶是胶原酶和蛋白酶，

大数据技术原理及应用

大数据技术原理及应用 (总10页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1 -CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除

大数据技术原理及应用 大数据处理架构—Hadoop简介 Hadoop项目包括了很多子项目，结构如下图 Common 原名：Core，包含HDFS, MapReduce和其他公共项目，从Hadoop 版本后，HDFS和MapReduce分离出去，其余部分内容构成Hadoop Common。Common为其他子项目提供支持的常用工具，主要包括文件系统、RPC(Remote procedure call) 和串行化库。 Avro Avro是用于数据序列化的系统。它提供了丰富的数据结构类型、快速可压缩的二进制数据格式、存储持久性数据的文件集、远程调用RPC的功能和简单的动态语言集成功能。其中，代码生成器既不需要读写文件数据，也不需要使用或实现RPC协议，它只是一个可选的对静态类型语言的实现。Avro系统依赖于模式（Schema），Avro数据的读和写是在模式之下完成的。这样就可以减少写入数据的开销，提高序列化的速度并缩减其大小。 Avro 可以将数据结构或对象转化成便于存储和传输的格式，节约数据存储空间和网络传输带宽，Hadoop 的其他子项目（如HBase和Hive）的客户端和服务端之间的数据传输。 HDFS HDFS：是一个分布式文件系统，为Hadoop项目两大核心之一，是Google file system（GFS）的开源实现。由于HDFS具有高容错性（fault-tolerant）的特点，所以可以设计部署在低廉（low-cost）的硬件上。它可以通过提供高吞吐率（high throughput）来访问应用程序的数据，适合那些有着超大数据集的应

实验室常用的基本操作

实验室常用的基本操作 玻璃仪器的基本操作 1、认领仪器按照仪器单领取和认识基础化学实验中的常用仪器。

2、玻璃仪器的洗涤

（1）震荡水洗 （2）内壁附有不易洗掉的物质，可用毛刷刷洗 倒废液——注入一半水——选好毛刷，确定手拿部位刷洗——如是反复 （3）刷洗后，再用水连续振荡数次，必要时还应用蒸馏水淋洗三次洗净状态下，水均匀分布不挂水珠（如左图所示）； 未洗净状态下，器壁挂着水珠（如右图所示）。玻璃仪器里如附有不溶于水的碱、碳酸盐、碱性氧化物等可先加盐酸溶解，再用水冲洗；附有油脂等污物可先用热的纯碱液洗，然后用毛刷刷洗，也可用毛刷蘸少量洗衣粉刷洗；对于口小、管细的仪器，不便用刷子洗，可用少量王水或重铬酸盐洗液涮洗；用以上方法清洗不掉的污物可用较多王水或洗液浸泡，然后用水涮洗。（ (1)不要未倒废液就注水 (2)不要几支试管一起刷） 3、仪器的干燥 （1）晾干（左图）与烤干（右图）

（2）吹干（左图）与烘干（右图） （3）气流烘干（左图）与快干（右图） 4、常见玻璃仪器的使用 （1）量筒与量杯 （2）移液管 移液管使用注意事项： 应根据不同的需要选用大小合适的移液管，如取1.5ml的溶液，显然选用2ml移液管要比选用5ml移液管误差小；吸取溶液时要把移液管插入溶液，避免吸入空气而将溶液从上端

溢出；移液管从液体中移出后必须用滤纸将管的外壁擦干，再行放液；不可用移液管直接从瓶中移取溶剂或溶液，剩余溶剂或溶液不可倒回贮液瓶，应作废弃物处理。 （2）滴定管 操作步骤：洗涤——涂凡士林——检漏——装入操作液——滴定管排气——滴定操作 （3）容量瓶 容量瓶使用前应检查容量瓶的瓶塞是否漏水，合格的瓶塞应系在瓶颈上，不得任意更换。容量瓶刻度以上的内壁挂有水珠会影响准确度，所以应该洗得很干净。称量的任何固体物质必须先在小烧杯中溶解或加热溶解，冷却至室温后才能转移到容量瓶中。容量瓶绝不应加热或烘干。容量瓶定容完再翻转摇匀，若翻转摇匀后定容，会因加的水或溶剂过多，导致溶液浓度偏小。

膜片钳技术

2008级硕士研究生膜片钳技术试题 请用A4纸书面手写，严禁抄袭。下学期开学后两周内交于先知楼2002室陆巍老师处，过期不侯！ 问答题（共100分） 1、什么是膜片钳技术？它的基本工作原理是什么？ 答：膜片钳技术是以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞上单一的（或多个的）离子通道分子活动的技术，具体说来就是利用微玻管（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以吉欧姆（GΩ）以上的阻抗使之封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）(10-12A)进行监测记录的方法。 膜片箝的基本原理是：用一个尖端光洁、直径约0.5-3um的玻璃微电极同神经或肌细胞的膜接触而不刺入，然后在微电极的另一段开口施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸入电极尖端的纤细开口，这样在小片膜周边与微电极开口的玻璃之间形成紧密封接，在理想状态下电阻可达数十兆欧。实际上把吸附在微电极尖端开口的那小片膜同其余部分的膜在电学上完全分开，如果这小片膜上只含一个或几个通道分子，那么微电极就可以测量出单一开放的离子电流或电导，对离子通道的其他功能进行研究。 2、膜片钳记录方法分为四类？各有何特点？ 答：膜片箝有四种分类： （1）单通道记录法-细胞吸附模式（Cell-attached Mode） 微电极在显微镜下贴近细胞后，给微电极施加一负压，形成高阻抗封接。此时可看到背景噪音明显减少，通常选取电极下仅有一个通道的膜片进行分析，即单通道记录，以利于不失真的观察一个通道的活动状态。该方法的优点是对细胞膜结构和调制系统干扰最小，能准确反映通道的活动状态并对此进行客观分析。但缺点是电流小，分辨率地，对技术要求高，难度较大，且工作量大而成功率又较低。 (2)全细胞记录法(Whole-cell recording) 在高阻抗封接做好后，再给一个很小的负压，将电极覆盖的膜吸破，使电极内与整个细胞内相通，用这个方法可记录进出整个细胞的电流。该方法的优点是电流大，信噪比好，既可以做电流钳制又可以做电压钳制，且可以改变细胞内容物。但此法只能用于直径小于3μ的细胞，且仅能观察膜电流的变化，不能分析变化的产生机制。 (3)膜内面向外式（Inside-out） 按照细胞密着式将电极封接好之后，再将电极拉开，使之与胞体脱离即可，也是用以记录封在电极尖端口下的膜片中的离子通道电流。是在细胞吸附式的基础上改进而成。其优点是可以观察化学因素对细胞膜内侧面结构的影响，但其操作难度较高。 (4)膜外面向外（Outside-out）在全息胞记录式的基础上，拉开电极使之与胞体脱离，这是附在电极尖端的膜片又可自动地将电极尖端口封住。此膜片的外侧面向外其是在全细胞记录的基础上改进而成，优点是可以分别观察化学因素对细胞膜外侧面结构的影响。 3、膜片钳技术的应用范围有哪些？ 答：应用膜片钳技术可以直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程、区分离子通道的离子选择性,同时可发现新的离子通道及亚型,并能在记录单细胞电流和全细胞电流

膜片钳技术资料汇编

丁香园膜片钳技术讨论区 资料汇编 整理人：xiaoxuanzi 发起人：tianx775 2006年6月

目录 第一节膜片钳技术介绍 (1) 应用 (1) 基本概念 (2) 第二节仪器操作和维护 (3) 仪器的使用 (3) 噪声 (4) 玻璃微电极的制备 (5) 第三节 实验操作 (7) 1.细胞的分离、培养 (7) (1)心肌细胞 (7) (2)平滑肌细胞 (17) (3)其他细胞 (19) 2.电极的拉制与电镀 (23) 3.电极内外液与渗透压 (25) 4.串联、封接、电极电阻 (28) 5.补偿 (37) 6.刺激方案 (40) 7.动作电位记录 (42) 8.电流记录 (42) (1)钙电流 (42) (2)钾电流 (45) (3)钠电流 (47) (4)其他电流 (48) 9.穿孔 (50) 10.单通道记录 (51) 11.脑片 (54) 12.数据分析与处理 (55) 第四节 相关电子文献及书籍 (61)

第一节 膜片钳技术介绍 一、应用 1.全细胞记录技术的应用 [Cactuswzw]（1）离子通道宏观性质的分析，例如，离子通道的性质和分类(电压门控通道、膜受体激活通道、配体门控通道、胞内第二信使激活通道等) （2）离子通道微观性质分析，例如单一离子通道活动的测定的测定，离子通道的构造，分布和机能的分析等。 （3）膜电容的测量及其对细胞分泌活动的研究。 （4）胞内钙离子浓度和钙通道电流的同时定量检测。 （5）组织切片的全细胞记录。 (6)植物细胞的电生理研究。 二、基本概念 1.刚刚接触patch，有些概念都很模糊 holding potential与command potential？ Axon200B的放大器控制面板上有ext. command，又是什么东东？ 都分别什么时候给予？ 在我理解，pipette capacity compesation就是快电容补偿，而Cm补 偿为慢电容补偿，那为何Axon200B的面板上在pipette capacitance compensation下面列了FAST和SLOW的magnitude以及时间常数的调节 扭？ [baxiansheng]Holding potential 是钳制电压，这是实验中从头至尾 通过电极用于钳制细胞的一个电压，和膜电位的关系取决于采用的实验 模式。而command voltage是在holding potential基础上施加的刺激 方案，比如全细胞实验中可以设置Holding potential在-80mV，然后 去极化至+10mV 400ms，那么这个去极化至+10mV的方波就是command voltage，当然command voltage的设置可以根据实验设置得更复杂。 Axon200B放大器控制面板的ext. command是用于接外接刺激器的，通 过外接刺激器来施加command voltage，当然现在完全由计算机代替了。 pipette capacity是电极电容，因为时间常数小，所以称快电容，而 Cm是膜电容，因为时间常数大，所以称为慢电容。Axon200B的面板上 在pipette capacitance compensation下面列了FAST和SLOW的 magnitude以及时间常数的调节扭，那是对电极电容的补偿方式。实际 上电极电容中也有一些时间常数较大的成分，单纯补偿FAST效果并不 完美，需要再稍稍调节一下SLOW。 2.我的课题是关于心血管系统中离子通道方面的研究。离子通道一般有备 用关闭状态（close），激活状态（active）和失活状态（inavtive）。但 最近我看文献有去激活状态,英文为deactivation,我想跟失活肯定不是 一个概念，但又找不到确切的含义，有谁能帮我解释一下这几种通道状 态个代表什么含义？ [coolworm]C<----->O<------->I

实验室基础操作步骤

基础操作步骤参考 1.仪器的洗涤 玻璃仪器洗净的标准是：内壁上附着的水膜均匀，既不聚成水滴，也不成股流下。 2.试纸的使用 常用的有红色石蕊试纸、蓝色石蕊试纸、pH试纸、淀粉碘化钾试纸和品红试纸等。 （1）在使用试纸检验溶液的性质时，一般先把一小块试纸放在表面皿或玻璃片上，用蘸有待测溶液的玻璃棒点试纸的中部，观察试纸颜色的变化，判断溶液的性质。 （2）在使用试纸检验气体的性质时，一般先用蒸馏水把试纸润湿，粘在玻璃棒的一端，用玻璃棒把试纸放到盛有待测气体的导管口或集气瓶口（注意不要接触），观察试纸颜色的变化情况来判断气体的性质。 注意：使用pH试纸不能用蒸馏水润湿。 3.药品的取用和保存 （1）实验室里所用的药品，很多是易燃、易爆、有腐蚀性或有毒的。因此在使用时一定要严格遵照有关规定，保证安全。不能用手接触药品，不要把鼻孔凑到容器口去闻药品（特别是气体）的气味，不得尝任何药品的味道。注意节约药品，严格按照实验规定的用量取用药品。如果没有说明用量，一般应按最少量取用：液体1～2mL，固体只需要盖满试管底部。实验剩余的药品既不能放回原瓶，也不要随意丢弃，更不要拿出实验室，要放入指定容器内或交由负责人处理。 （2）固体药品的取用：取用固体药品一般用药匙。往试管里装入固体粉末时，为避免药品沾在管口和管壁上，先使试管倾斜，用盛有药品的药匙（或用小纸条折叠成的纸槽）小心地送入试管底部，然后使试管直立起来，让药品全部落到底部。有些块状的药品可用镊子夹取。 （3）液体药品的取用取用很少量液体时可用胶头滴管吸取；取用较多量液体时可用直接倾注法。取用细口瓶里的药液时，先拿下瓶塞，倒放在桌上，然后拿起瓶子（标签对着手心），瓶口要紧挨着试管口，使液体缓缓地倒入试管。注意防止残留在瓶口的药液流下来，腐蚀标签。一般往大口容器或容量瓶、漏斗里倾注液体时，应用玻璃棒引流。 （4）几种特殊试剂的存放 A.钾、钙、钠在空气中极易氧化，遇水发生剧烈反应，应放在盛有煤油的广口瓶中以隔绝空气。 B.白磷着火点低（40℃），在空气中能缓慢氧化而自燃，通常保存在冷水中。 C.液溴有毒且易挥发，需盛放在磨口的细口瓶里，并加些水（水覆盖在液溴上面），起水封作用。 D.碘易升华且具有强烈刺激性气味，盛放在磨口的广口瓶里。 E.浓硝酸、硝酸银见光易分解，应保存在棕色瓶中，贮放在阴凉处。 F.氢氧化钠固体易潮解且易在空气中变质，应密封保存；其溶液盛放在无色细口瓶里，瓶口用橡皮塞塞紧，不能用玻璃塞。 4.过滤 过滤是除去溶液里混有不溶于溶剂的杂质的方法。 过滤时应注意：