进行性肌营养不良症(DMD)基因检测

第三次实验内容

进行性肌营养不良症（DMD）基因检测

一、实验目的：

掌握进行性肌营养不良症基因检测的一种简便方法。

二、实验原理：

PCR技术具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对待检原始材料质量要求低等特点，而多重PCR（multiplex PCR）则是用几对引物在同一个PCR反应体系中进行扩增。这样可以同时扩增出几个不同专一靶区域的片段。

进行性肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是一组原发于肌肉组织的遗传病，特点是进行性加重的肌肉萎缩和无力，本病呈X连锁隐性遗传，一般男性儿童发病。临床表现腿的假性肥大，血清酶学明显升高。

DMD基因定位于Xq21.2-21.3之间，全长2.4kb左右，有79个外显子组成，编码1个3685个氨基酸、分子量为427 kD的蛋白质一抗肌营养不良蛋白(dystrophin)，这种蛋白具有稳定细胞膜和细胞内钙调节的功能。

抗肌营养不良蛋白的编码基因有多种突变形式，60％是外显子缺失突变，5％是重复突变，另35％可能是很小的DNA片段缺失或点突变。通常选择DMD基因中9个缺失热点的外显子扩增，可检出缺失突变中的90%。

本实验设计为扩增DMD基因中4个外显子（8,19,45,48），其中外显子45 和48在中国患者中的检出率分别为26%和48%。

三、实验准备：

实验材料：正常对照和DMD患者外周血DNA样本。

实验器材：

实验试剂：

四、实验步骤：

1、正常对照外周血DNA样本、DMD患者外周血DNA样本分别进行PCR扩增（第二次课上已经做好）。

2、琼脂糖凝胶电泳。

①配制2%的琼脂糖凝胶

②取PCR扩增样品10μl加入3μl的6×载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内。

④ 140V，电泳2小时左右。

⑤卸胶，紫外仪上观察电泳条带，判断扩增产物的有无及片段大小。

五、实验结果：

正常对照样本有4条带，从负极往正极分别为外显子45、48、19和8。

DMD患者缺失不同的外显子。

六、注意事项：

1、引物设计时长度 15～30个碱基为宜，G+C含量一般为40%～60%。

2、退火温度决定PCR反应的特异性，退火温度高PCR反应的特异性好；温度低，有时会

有非特异性条带。

3、Mg2+浓度对扩增产物的特异性及产量有显著影响，Mg2+浓度低，扩增产物的特异性

好，但有时产量低；Mg2+浓度高，扩增产物的特异性差，有非特异性条带。

4、PCR循环的次数主要取决于模板DNA的浓度。在满足产物得率的前提下，应尽量减

少循环次数。

人类染色体核型分析

1）实验目的：

通过实验掌握染色体核型分析的常用方法以及Ｇ分带的带型特征，初步会识别Ｇ分带人类染色体。

2）实验原理：

将一个细胞内的染色体按照一定的顺序（如染色体的大小、着丝粒的位置，带型等），排列起来构成的图象就称之为该细胞的核型(Karyotype)。７０年代初出现了染色体显带技术，不仅解决了染色体识别困难的问题，而且为深入研究染色体异常及基因定位创造了条件。本次课将用Ｇ带染色体的显微相片，让同学识别不同的染色体，并进行剪贴及分析核型。

3）实验准备：

显微相片1份2张。实验器材：镊子、剪刀、胶水等。

4）实验步骤：

A、将相片上的染色体逐个剪下，按丹佛一伦敦体制排列编号。

B、粘贴时短臂向上，长臂向下。

C、写出该细胞的核型式，注明性染色体。

带型识别口诀：

一秃二蛇三蝶飘四象鞭炮五黑腰六号1、4小白脸

七上八下九苗条十号q 肩带好十一低来十二高

十三、十四、十五号（3.2.1）十六q缢痕大十七q带脚镣

十八人小大肚泡十九是黑腰二十头重脚底浅

二十一象个葫芦瓢二十二头小，身子大X扁担，两头挑

作业：

剪贴染色体显微相片一张。

人类染色体核型分析实验报告

班级------------

姓名-------------标本编号：

分析结果：

1 2 3 4 5

——————A ————————— B ———

6 7 8 9 10 11 12

————————————C —————————————

13 14 15 16 17 18 19 20

———— D —————— E —————— F —

21 22

— G —性染色体

基因工程在医学上的应用

基因工程及其在医学中的应用 摘要: 作为生物工程技术的核心，及新工程的发展与应用，在医学方面有着非 同凡响的影响。本文首先回顾了基因工程的发展简史，然后在基因工程制药，抗病毒疫苗，疾病治疗及基因诊病等方面综述了基因工程在医学中的应用。基因工程将给医药方面带来更美好的前景。 关键词:基因工程医学应用 1 前言： 分子生物学主要是从分子水平上阐述生命现象和本质的科学，是现代生命科学的“共同语言”。分子生物学又是生命科学中进展迅速的前沿学科，它的理论和技术已经渗透到其他基础生物学科的各个领域，它的主要核心内容是通过生物的物质基础---核酸、蛋白、酶等生物大分子的结构、功能及其相互作用的运动规律的研究来阐明生命分子基础，从而探讨生命的奥秘。这门课与基因工程关系很大，主要讲了核酸、蛋白、酶等生物大分子的结构、功能以及它们之间的相互作用。近年来，随着生物技术的飞速发展，分子生物学在较多领域得以应用。其中在核酸，基因方面医学中的发展迅猛。基因工程在制药，抗病菌疫苗发展前景较广，在疾病治疗及诊断对人们生活影响较大。本文将对基因工程的发展及其在医学中的应用作简单的阐述。 2 基因工程的发展 基因工程又叫遗传工程，是分子遗传学和工程技术相结合的产物，是生物技术的主体。基因工程是指用酶学方法将异源基因与载体DNA在体外进行重组，将形成的重组因子转入受体细胞，使异源基因在其中复制并表达，从而改造生物特性，生产出目标产物的高新技术。 1857年至1864年，孟德尔通过豌豆杂交试验，提出了生物体的性状是由遗传基因子控制的。1909年，丹麦生物学家约翰生首先提出基因一词代替孟德尔的遗传因子。1910年至1915年，美国遗传学家摩尔根通过果蝇实验，首次将代表某一性状的基因同特定的染色体联系起来，创建了基因学说。直到1944年，美国微生物学家埃弗里等通过细菌转化研究，证明基因的载体是DNA而不是蛋白质，从而确立了遗传的物质基础。1953年，美国的遗传学家华生和英国的生物学家克里克揭示了DNA分子双螺旋模型和半保留复制机理，解决了积阴德自我复制和传递问题。开辟了分子生物学的研究时代。之后，1958年克里克确立了中心法则。1961年雅各和莫诺德提出的操纵子学说以及说有64种密码子的破译，成功的揭示了遗传信息的流向和表达问题，为基因工程的发展奠定了坚实的基础。 DNA分子的切除与连接，基因的转化技术，还有诸如核酸分子杂交，凝胶电泳，DNA序列结构分析等分子生物学试验方法的进步为基因的创立和发展奠定了强有力的技术基础。 1972年，美国斯坦福大学的P.Berg构建了世界上第一个重组分子，发展了DNA重组技术，并因此获得了1980年的诺贝尔学奖。1983年，美国斯坦福大

强直性肌营养不良诊疗指南【2019版】

77. 强直性肌营养不良 概述 强直性肌营养不良（myotonic dystrophy ，DM ）是以肌强直现象（主动或被动肌肉收缩后无法及时放松）和肌肉进行性无力萎缩为主要特点的进行性肌营养不良类型。除肌肉受累外，强直性肌营养不良累及全身多个器官系统，包括眼、心脏、内分泌系统和中枢神经系统。强直性肌营养不良分为 1 型和 2 型，1 型 （DM1）由 DMPK 基因 3’端非编码区 CTG 三核苷酸重复序列异常增多所致，2 型（DM2）由 ZNF9（CNBP ）基因 1 号内含子 CCTG 四核苷酸重复序列异常增多所致。1 型较为常见，2 型相对少见且病情较轻，患者间差异较小。 病因和流行病学 强直性肌营养不良 1 型、2 型的异常增多重复序列均位于非编码区。目前认为发病机制为异常 RNA 毒性理论。当重复序列异常增多后，在基因转录为 RNA 后，不再进一步翻译为蛋白质，而是形成发卡结构留存在细胞核内。这些异常 R N A 占 据了与 剪切 密 切相关 的重要 R N A 结 合 蛋 白 家 族和 CUG-BP and ETR-3-like-factors （CELF ），使其不能行使正常功能，从而引起多种下游蛋白剪切异常、功能受损，最终造成多系统受累表现。 强直性肌营养不良是成年起病的最常见肌营养不良类型。估计患病率约为1/8000。D M1 较DM2 多见，但也有部分国家流行病学调查显示 DM2 患者与DM1 患者相当，甚至更多。 临床表现 强直性肌营养不良因 RNA 毒性作用导致多系统受累，主要临床表现如下： 1. 肌肉 四肢远端起始并逐渐向近端进展的无力萎缩，影响手部精细动作， 造成垂足。面肌亦可受累。同时有明显肌强直现象，累及肢体肌、咽喉肌等。查体可发现大力握拳后手指不能立即展开，用力闭目后不能立即睁开。叩击手部大鱼际肌、舌肌等，可引出肌强直，称为叩击性肌强直或“肌球”现象。肌强直存在“热身”现象，反复活动后，肌强直减轻。下肢肌痛和全身疲乏感也是常见临

基因诊断与基因治疗

第二十一章基因诊断与基因治疗 基因诊断与基因治疗能够在比较短的时间从理论设想变为现实，主要是由于分子生物学的理论及技术方法，特别是重组DNA技术的迅速发展，使人们可以在实验室构建各种载体、克隆及分析目标基因。所以对疾病能够深入至分子水平的研究，并已取得了重大的进展。因此在20世纪70年代末诞生了基因诊断(gene diagnosis)；随后于1990年美国实施了第一个基因治疗(gene therapy)的临床试验方案。可见，基因诊断和基因治疗是现代分子生物学的理论和技术与医学相结合的范例。 第一节基因诊断 一. 基因诊断的含义 传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据，如患者的症状、血尿各项指标的变化，或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，而且是在疾病发生的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断。现知各种表型的改变是由基因异常造成的，也就是说基因的改变是引起疾病的根本原因。基因诊断是指采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA水平）或功能（RNA水平）是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。基因诊断有时也称为分子诊断或DNA诊断(DNA diagnosis)。基因诊断是病因的诊断，既特异又灵敏，可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态，从而可以对表型正常的携带者及某种疾病的易感者作出诊断和预测，特别对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义。 二. 基因诊断的原理及方法

（一）基因诊断的原理 疾病的发生不仅与基因结构的变异有关，而且与其表达功能异常有关。基因诊断的基本原理就是检测相关基因的结构及其表达功能特别是RNA产物是否正常。由于DNA的突变、缺失、插入、倒位和基因融合等均可造成相关基因结构变异，因此，可以直接检测上述的变化或利用连锁方法进行分析，这就是DNA诊断。 对表达产物mRNA质和量变化的分析为RNA诊断(RNA diagnosis)。 （二）基因诊断的方法 基因诊断是以核酸分子杂交(nucleic acid molecular hybridization)和聚合酶链反应（PCR）为核心发展起来的多种方法，同时配合DNA序列分析，近年新兴的基因芯片可能会发展成为一种很有用的基因诊断方法。 1.DNA诊断 常用检测致病基因结构异常的方法有下列几种。 ⑴斑点杂交：根据待测DNA 样本与标记的DNA探针杂交的图谱，可以判断目标基因或相关的DNA片段是否存在，根据杂交点的强度可以了解待测基因的数量。 ⑵等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide probe, ASO probe）杂交：是一种检测基因点突变的方法，根据点突变位点上下游核苷酸序列，人工合成约19个核苷酸长度的片段，突变的碱基位于当中，经放射性核素或地高辛标记后可作为探针，在严格杂交条件下，只有该点突变的DNA样本，才出现杂交点，即使只有一个碱基不配对，也不可能形成杂交点。一般尚合成正常基因同一序列，同一大小的寡核苷酸片段作为正常探针。如果受检的DNA样本只能与突变ASO探针，不与正常ASO探针杂交，说明受检二条染色体上的基因都发生这种突变，为突变纯合子；如果既能与突变ASO探针又能与正常ASO探针杂交，

(完整版)高中生物选修3第一章基因工程习题及答案

高中生物选修3第一章基因工程习题 1. SARS 病毒能引起非典型肺炎，医生在治疗实践中发现，非典病人治愈后，其血清可用于 治疗其他非典病人。有三位科学家分别从三个不同的方面进行了研究，其研究的方向如下图 所示。请根据下图回答： SARS 病毒 [丙的研究] 抽取血清 蛋白质X [乙的研究] 注射 注射 灭活或 培养 非典病人B 治愈的病人B 非典病人D 减毒处理 动物实验 健康人C 健康人C 健康人C 治愈的病人D （1）从免疫学的角度看，SARS 病毒对于人来讲属于 ，治愈的病人A 的血清中因 为含有 ，所以可用来治疗“非典”病人B 。 （2）甲的研究中，所合成或生产的蛋白质X 是 ，它可以通过化学的方法合成，也 可以通过生物学方法—— 技术生产。 （3）乙的研究目的主要是制造出 以保护易感人群。图中使健康人C 获 得抵抗“非典”病毒能力的过程，属于免疫学应用中的 免疫。 （4）图中丙主要研究不同国家和地区SARS 病毒的异同，再按照免疫学原理，为研究一种 或多种 提供科学依据。 2. 聚合酶链式反应(PCR 技术)是在实验室中以少量样品DNA 制备大量DNA 的生化技术， 反应系统中包括微量样品DNA 、DNA 聚合酶、引物、足量的4种脱氧核苷酸及ATP 等。 反应中新合成的DNA 又可以作为下一轮反应的模板，故DNA 数以指数方式扩增，其简要 过程如右图所示。 （1）某个DNA 样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A:G:T:C=1:2:3:4，则 经过PCR 仪五次循环后，将产生 个DNA 分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的 数量至少是 个。 （2）分别以不同生物的DNA 样品为模板合成的各个新DNA 之间存在差异，这些差异是 。 （3）请指出PCR 技术与转录过程的三个不同之处： ① 。 ② 。 ③ 。 3. 逆转录病毒的遗传物质RNA 能逆转录生成DNA ，并进一步整合到宿主细胞的某条染色 体中。用逆转录病毒作为运载体可用于基因治疗和培育转基因动物等。 （1）病毒在无生命培养基上不能生长，必须依靠活细胞提供 循环重复 [甲的研究] 用激素等治疗 非典病人A 治愈的病人A 健康人合成或生产 其他辅助治疗 接种 提纯、

基因治疗

基因治疗（gene therapy） ?经典的基因治疗：指正常的基因整合入细胞基因组以校正或置换致病基因的一种治疗方法。 ?广义的基因治疗：将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。 基因治疗与常规治疗方法的不同：一般意义上疾病的治疗针对的是因基因异常而导致的各种症状，而基因治疗针对的是疾病的根源--异常的基因本身。 基因治疗目前主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病，包括：遗传病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病（如艾滋病、类风湿等）。 基因治疗发展简史 1990年9月14日：第一例正式批准的基因治疗实验开始进行1991年美国批准了人类第一个对遗传病进行体细胞基因治疗的方案，即将腺苷脱氨酶（ADA）导入一个4岁患有严重复合免疫缺陷综合征（SCID）的女孩。 1991年7月中国开始进行基因治疗试验 第一个基因临床治疗的实例

其他实例

1993年法国将Ad-RSVmDys（腺病毒－罗斯病毒小肌营养不良蛋白基因重组体）注入小鼠肌内成功。即用腺病毒为载体，与小肌营养不良蛋白（minidystrophin）基因的cDNA重组，在RSV启动子启动下，作肌肉注射，证明可在mdy小鼠肌肉表达。 在中国 1991年,我国科学家进行了世界上首例血友病B的基因治疗临床试验,目前已有4名血友病患者接受了基因治疗,治疗后体内IX因子浓度上升,出血症状减轻,取得了安全有效的治疗效果。随后,我国科学家利用胸腺激酶基因治疗恶性脑胶质瘤基因治疗方案获准进入1期临床试验,初步的观察表明,生存期超过1年以上者占55%,其中1例已超过三年半,至今仍未见肿瘤复发。此外,采用血管内皮生长因子基因治疗外周梗塞性下肢血管病基因治疗方案也已获准进入临床试验。目前,我国已有6个基因治疗方案进入或即将进入临床试验。 总的来看,我国基因治疗产业比美国落后了约4年,正处于成长阶段, 绝大部分还处于实验室研究阶段,仅有大约5个项目通过审批进入特批临床试验或I、Ⅱ期临床试验。 基因治疗的基本程序 (一)治疗性基因的获得 (二)基因载体的选择

基因工程在疾病治疗方面的应用

浅谈基因工程药物 基因工程药物是指用现代基因重组高科技对基因进行克隆，通过重组DNA导入大肠杆菌、酵母或动物细胞成功构建工程菌株或细胞株，在工程菌株、细胞中所表达生产的新型药物包括细胞因子、多肽类激素、溶血栓药物、疫苗、抗体、反义RNA及基因治疗药物等等多种难治疾病的基因工程药物. 基因工程药物因其疗效好、应用范围广泛、副作用小的特点成为新药研究开发的新宠。也是发展最迅速和最活跃的领域。自1982年美国Lilly公司上市了第一个基因工程产品——人胰岛素以来，至今已有基因工程药物大约140多种上市，尚处于临床试验或申报阶段的基因工程药物有500多种。当传统制药业的增长速度减慢时，基因工程制药正在加速发展，全世界基因工程药物持续6年销售额增长率都在l5％～33％，基因工程制药已成为制药业的一个新亮点[1-2]。 一.目前药物治疗的主要类型 1.胰岛素至今仍是临床上治疗糖尿病最有效的方法。 过去，胰岛素主要从猪等大家畜胰腺中提取。从一头猪的胰腺中只能提取出300单位胰岛素，而一个病人每天就需要40单位胰岛素，因此远远不能满足需要。 基因工程技术一问世，科学家就想到利用该技术来解决胰岛素药源不足的问题。他们首先要找到胰岛素基因，在人的胰岛细胞里有一段特定结构的DNA分子指挥着胰岛素的合成，然后又找到在人的大肠里存在对人体无害的大肠杆菌。把人的胰岛素基因转入到大肠杆菌的细胞中，随着大肠杆菌的繁殖，胰岛素基因

也一代代的遗传下去。大肠杆菌繁殖速度相当快，大约20分钟就能繁殖一代，把它放到大型的发酵罐里进行人工培养，就可以大量繁殖，并且生产出大量人的胰岛素。 1981年，基因重组人胰岛素产品正式投入市场，大肠杆菌成了名副其实的生产胰岛素的“活工厂”，胰岛素供不应求的问题彻底解决了 胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素!大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题 2.干扰素： 是哺乳动物细胞在诱导下产生的一种淋巴因子，能够加强巨噬细胞的吞噬作用和对癌细胞的杀伤作用，抑制病毒在细胞内的增殖，用于肿瘤和其他病毒病的治疗。基因工程干扰素干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”!过去从人血中提取，300L血才提取1mg!其“珍贵”程度自不用多说。基因工程人干扰素α-2b(安达芬)是我国第一个全国产化基因工程人干扰素α-2b，具有抗病毒，抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用，广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物。 生长激素人体生长激素能够治疗侏儒症和促进伤口愈合，动物生长激素能够加速畜禽生长发育。目前，人和动物的生长激素基因都已经在大肠杆菌中成功表达．在医学和畜牧业领域取得了很好的应用效果。

基因工程在医药工业中的的应用

基因工程及其在医学中的应用基因工程及其在医学中的应用基因工程及其在医学中的应用基因工程及其在医学中的应用 摘要: 作为生物工程技术的核心，及新工程的发展与应用，在医学方面有着非同凡响的影响。本文首先回顾了基因工程的发展简史，然后在基因工程制药，抗病毒疫苗，疾病治疗及基因诊病等方面综述了基因工程在医学中的应用。基因工程将给医药方面带来更美好的前景。关键词关键词关键词关键词: 基因工程医学应用1 前言前言前言前言：分子生物学主要是从分子水平上阐述生命现象和本质的科学，是现代生命科学的“共同语言”。分子生物学又是生命科学中进展迅速的前沿学科，它的理论和技术已经渗透到其他基础生物学科的各个领域，它的主要核心内容是通过生物的物质基础---核酸、蛋白、酶等生物大分子的结构、功能及其相互作用的运动规律的研究来阐明生命分子基础，从而探讨生命的奥秘。这门课与基因工程关系很大，主要讲了核酸、蛋白、酶等生物大分子的结构、功能以及它们之间的相互作用。近年来，随着生物技术的飞速发展，分子生物学在较多领域得以应用。其中在核酸，基因方面医学中的发展迅猛。基因工程在制药，抗病菌疫苗发展前景较广，在疾病治疗及诊断对人们生活影响较大。本文将对基因工程的发展及其在医学中的应用作简单的阐述。2 基因工程的发展基因工程的发展基因工程的发展基因工程的发展基因工程又叫遗传工程，是分子遗传学和工程技术相结合的产物，是生物技术的主体。基因工程是指用酶学方法将异源基因与载体DNA在体外进行重组，将形成的重组因子转入受体细胞，使异源基因在其中复制并表达，从而改造生物特性，生产出目标产物的高新技术。1857年至1864年，孟德尔通过豌豆杂交试验，提出了生物体的性状是由遗传基因子控制的。1909年，丹麦生物学家约翰生首先提出基因一词代替孟德尔的遗传因子。1910年至1915年，美国遗传学家摩尔根通过果蝇实验，首次将代表某一性状的基因同特定的染色体联系起来，创建了基因学说。直到1944年，美国微生物学家埃弗里等通过细菌转化研究，证明基因的载体是DNA 而不是蛋白质，从而确立了遗传的物质基础。1953年，美国的遗传学家华生和英国的生物学家克里克揭示了DNA分子双螺旋模型和半保留复制机理，解决了积阴德自我复制和传递问题。开辟了分子生物学的研究时代。之后，1958年克里克确立了中心法则。1961年雅各和莫诺德提出的操纵子学说以及说有64种密码子的破译，成功的揭示了遗传信息的流向和表达问题，为基因工程的发展奠定了坚实的基础。DNA分子的切除与连接，基因的转化技术，还有诸如核酸分子杂交，凝胶电泳，DNA序列结构分析等分子生物学试验方法的进步为基因的创立和发展奠定了强有力的技术基础。1972年，美国斯坦福大学的P.Berg构建了世界上第一个重组分子，发展了DNA重组技术，并因此获得了1980年的诺贝尔学奖。1983年，美国斯坦福大学的S.Chen等人也成功的进行了另一个体外DNA重组试验并发现了细菌间性状的转移。这是基因工程发展史上第一次成功实现重组转化成功的例子，基因工程从此诞生了。基因工程问世近30年，不论是基因理论研究领域，还是在生产实践中的应用，均已取得了惊人的成绩。给国民经济的发展和人类社会的发展带来了深远而广泛的影响。3 基因工程在药学方面的应用基因工程在药学方面的应用基因工程在药学方面的应用基因工程在药学方面的应用运用基因工程技术对基因的转导和整合来获取新的抗体，及新药的制取及研究都具有较高效益；基因技术在诊断疾病及刑事案件的侦破方面发挥着不可小觑的力量，因此基因工程在药学发展有着深远影响。 3.1 基因工程制药基因工程制药基因工程制药基因工程制药基因工程制药开创了制药工业的新纪元，解决了过去不能生产或者不能经济生产的药物问题。现在，人类已经可以按照需要，通过基因工程生产出大量廉价优质的新药物和诊断试剂，诸如人生长激素、人的胰岛素、尿激酶、红细胞生成素、白细胞介素、干扰素、细胞集落刺激因子、表皮生长因子等。令人振奋的是，具有高度特异性和针对性的基因工程蛋白质多肽药物的问世，不仅改变了制药工业的产品结构，而且为治疗各种疾病如糖尿病、肾衰竭、肿瘤、侏儒症等提供了有效的药物。 3.2 基因工程抗病毒疫苗基因工程抗

基因工程之基因治疗

基因治疗 摘要: 生物技术在生命科学领域扮演者重要得角色,基因治疗在治疗方面,将新得遗传物质转移到某个个体得体细胞内使其获得治疗效果;在基因工程方面,将正常得有功能得基因置换或增补缺陷基因。近些年来,已对若干人类单基因遗传病与肿瘤开展了临床得基因治疗。基因治疗作为治疗疾病得一种新手段,正愈来愈受到人们得重视与关注。 关键词:基因工程基因治疗基因 一、基因治疗得历史 随着DNA双螺旋结构得发现与以DNA重组技术为代表得现代分子生物学技术得发展以及人类对疾病认识得不断深入,越来越多得证据证明,多种疾病与基因得结构或功能改变有关,因而萌生了从基因水平治疗疾病得念头与梦想。 早在1968年,美国科学家发表了“改变基因缺损:医疗美好前景”得文章,首次在医学界提出了基因疗法得概念。1989年美国批准了世界上第一个基因治疗临床试验方案。1990年美国NIH得Frenuch Anderson博士开始了世界上第一个基因治疗临床试验,用腺苷酸脱氨酶基因治疗了一位ADA基因缺陷导致得严重免疫缺损得四岁女孩,并获得成功[1]。 1994年美国科学家利用经过修饰得腺病毒为载体,成功地将治疗遗传性囊性纤维化病得正常基因cfdr 转入患者肺组织中。2000年,法国巴黎内克尔儿童医院利用基因治疗,使数名有免疫缺陷得婴儿恢复了正常得免疫功能,取得了基因治疗开展近十年最大得成功[2]。 2004年1月,深圳赛百诺基因技术有限公司将世界第一个基因治疗产品重组人p53抗癌注射液正式推向市场,这就是全球基因治疗产业化发展得里程碑[3]。迄今报道已有数千例基因治疗患者,病种主要就是恶性肿瘤、艾滋病、血友病B、病毒性肝炎等等。 二、基因治疗得概念 基因治疗就是指向有功能缺陷得细胞补充相应得基因,以纠正或补偿其基因缺陷,从而达到治疗得目得。 广义得说,基因治疗就就是应用基因或基因产物治疗疾病得一种方法。狭义得说,基因治疗就是把外界得正常基因或治疗基因,通过载体转移到人体得靶细胞,进行基因修饰与表达,治疗疾病得一种手段。

进行性肌肉营养不良

进行性肌肉营养不良 杜兴氏肌肉营养不良症 遗传性的肌肉萎缩病可分为 进行性的营养不良症，临床特征为进行性加重的肌肉萎缩和无力，这属遗传性疾病，是基因缺肌所引起，无有效的治疗措施，防治方法主要是做好遗传咨询，产前检查，携带者家谱分析和检查，是预防本病在下一代发生的重要措施。 杜兴氏肌肉营养不良症（Duchenne Muscular Dystrophy ，DMD ），乃遗传性肌肉萎缩病。它的基因（Dystrophin gene ）存在于X 性染色体中（Xp21 ），因此它是透过性连锁式隐性遗传型态传播的。男性只有一个x性染色体，因此病患者大多为男性；若女性的一对x性染色体中其一个携有异变的Dystrophin 基因，她便成为一个DMD 的携带者，她的儿子有二分一的机会成为病患者，她的女儿则有二分一机会成为DMD 基因携带者。 Dystrophin 基因乃现时所知人类基因中体积较大的一种，它的制成品Dystroph in ，与其他相关的蛋白质，是稳定肌肉细胞膜的一个重要部份。它最重要的功能是维持肌肉细胞的稳定性，使它在肌肉收缩的过程中，不会受到破坏，杜兴氏病患者因肌肉中缺少了Dystrophin ，令到肌肉自出生后，便不断受到破坏和萎缩。Dystrop hin 基因亦会受到另一种较轻微的突变所影响，导致病情较轻的碧加氏肌肉营养不良症（Becker's Muscular Dystrophy ，BMD ）。 进行性肌营养不良的六种检查办法 来源：时间：2010-5-5 10:37:56 进行性肌营养不良（假肥大型）是一种由位于X染色体上隐性致病基因控制的一种遗传病,特点为骨骼肌进行性萎缩，肌力逐渐减退，最后完全丧失运动能力。主要发生于男孩；女性则为遗传基因携带者，有明显的家族发病史。 （一）血清酶测定： 1、血清肌酸磷酸激酶（CPK）：CPK增高是诊断本病重要而敏感的指标，可在出生后或出现临床症状之前已有增高，当病程迁延时活力逐渐下降。亦可用于检查基因携带者，阳性率为60-80%。 血清中肌酸磷酸激酶CPK含量增高，在活动性肌病中，尤其是假肥大型肌营养不良病人中，可显著升高达1000至数千单位。 2、血清肌红蛋白（MB）：在本病早期及基因携带者中也多显著增高。 3、血清丙酮酸酶（PK）：也很敏感， 20岁以下正常男女血清PK值为119.00，20岁以上男性为84.30，女性为77.50，以上三项血清酶中CRK，PK的阳性率

关于基因工程在医药领域发展以及前景的若干思考

关于基因工程在医药领域双重性的若干思考 （政法1102班111070043 黄光志序号3）【摘要】基因工程作为一门理论性与实践性的较强的学科，其方法与技术已经渗透到现代生命科学的各个分支领域，成为生命科学的一门核心技术。基因工程包含许多独特的实验方法和技术，不仅内容丰富，涉及面广，实用性也强。基因工程技术广泛应用于农业、医学、食品工业等。本文主要阐述基因工程在制药领域的应用，包括生物制药、基因诊断、基因治疗的应用及其前景，同时事物具有双重性，认识基因工程的一些问题，趋利避害，让基因工程能带给我们更多福音。 【关键词】基因工程；医药领域；生物制药；基因诊断；基因治疗 [Abstract] Emphasizing both on practice and theory, genetic engineering has been applied to various fields of life science in terms of its methods and technologies and becomes the core technology of life science. Genetic engineering consists of many unique experiment methods and technologies and is highly and widely practiced in agriculture, medical science, and food industry and so on. This thesis will focus on its applications in pharmacy, including biopharming, genetic diagnose and gene therapy as well their prospects. As each coin has two sides, it is important to realize the deficiencies of genetic engineering. Only if the genetic engineering is made use of in the right way will it truly benefit us. [Key words] Genetic engineering; Medical field; Biological pharmaceutical; Gene diagnosis; Gene therapy 基因为DNA中的一部分，虽然只占整个DNA质量的2%～4%,却主宰着人类由生到死的整个生命旅程。基因工程是指人工使某特定基因（目的基因）经载体携带，进入某生物细胞并重组入其DNA分子中，经筛选、纯化、扩增，并使之表达出人类所需要的蛋白质或对人类有益的生物性状的技术。伴随“人类基因组序列”分析工作的完成，基因工程会在各领域给人类带来福音，目前基因工程已经应用在医学、农业生产、环境科学等诸多领域。本文主要探究基因工程在医学领域方面的发展以及其前景，面对其出现的一些问题，展望其未来，希望随着科学技术的发展，基因工程能给我们带来更多的福音。 一、基因工程的概况 基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术或DNA重组技术，是在在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，按照人们的想法，以分子遗传学为理论基础，以分子生物学

最新高中生物(人教版)同步习题：1-2基因诊断与基因治疗(选修2)及答案解析

第2节基因诊断与基因治疗 (时间：30分钟满分：50分) 难度及题号 考查知识点及角度 基础中档稍难 基因诊断 2 1 基因芯片3、7 4 基因治疗5、6 8 一、选择题(共6小题，每小题4分，共24分) 1．用DNA探针诊断疾病的具体方法是()。 A．与被测样品的DNA碱基序列做比较 B．与被测样品的DNA分子重组 C．与被测样品的DNA分子杂交 D．A、B、C三种方法均可 解析基因诊断是指用标记的DNA分子做探针，利用DNA分子杂交原理， 与待测样品DNA杂交，从而推测待测DNA序列。 答案 C 2．对某些传染性疾病(例如SARS)的诊断的困难在于病原体数量在初期极少，因此稳定、可靠而快捷的检测手段是()。 A．病毒的大量培养B．患者体内相关抗体的检测 C．PCR技术扩增D．临床症状确诊 解析对于病原体数量极少的待测样本，可利用PCR技术，对待测核酸进行 PCR技术扩增，获得大量核酸。 答案 C 3．基因芯片()。 A．是计算机上的微处理器 B．只能少量地对DNA分子的碱基序列进行测定和定量分析 C．是将少量DNA片段有序地固定在尼龙膜、玻片或硅片上 D．是一种高密度的DNA阵列 解析基因芯片是将大量特定序列的DNA片段(探针)有序地固定在尼龙膜、

玻片或硅片上，从而能大量、快速、平行地对DNA分子的碱基序列进行测 定和定量分析。基因芯片实际上是一种高密度的DNA阵列。 答案 D 4．下列对基因芯片的叙述中，错误的是()。 A．基因芯片可直接检测样品DNA和RNA B．基因芯片技术依据DNA分子杂交原理 C．基因芯片技术有助于发现不同个体对疾病易感性的差异 D．基因芯片技术不会造成社会负面效应 解析基因芯片技术也会造成负面效应，如基因歧视所引发的社会问题；婚姻、就业、保险等方面受到不公平的待遇；侵犯隐私权；对自己的心理、生活带来许多压力等。 答案 D 5．基因治疗的步骤是()。 ①治疗基因的表达②选择治疗基因③将治疗基因转入患者体内④选择 运输治疗基因的载体 A．②③①④B．②③④① C．③④②①D．②④③① 解析基因治疗的步骤包括选择治疗基因、选择运输治疗基因的载体、将治疗基因转入患者体内、治疗基因的表达。 答案 D 6．对基因治疗安全性的问题叙述不当的是()。 A．基因治疗中最常用的载体是病毒，它们能自我复制 B．在基因治疗中，科学家抑制逆转录病毒的某种活动防止它们引起疾病，使之能被安全地使用 C．使用病毒载体运载基因，它们可能更多地改变目标细胞 D．目的基因插入载体DNA的位置可能出现错误，导致癌症和其他损伤的产生解析基因治疗中最常用的载体为病毒，大多数基因治疗临床实验用小鼠逆转录病毒运送目的基因，其他病毒载体还包括腺病毒、痘病毒和疱疹病毒等。

除了CRISPR,你还应该知道的基因编辑方法

除了CRISPR，你还应该知道的基因编辑方法 图片：Argonaute蛋白（模型如图）是潜在的CRISPR–Cas9基因编辑系统替代品之一 CRISPR–Cas9系统让科学家可以按自己的想法改造基因，由于比先前的技术更简单、成本更低、更万能，CRISPR–Cas9几乎席卷了全世界的实验室，为基础研究和医药领域寻找更多有应用价值的发现。但与贡献相对应的是，CRISPR–Cas9也有其局限性。今年中国的研究人员韩春雨发布了一套新的基因编辑系统NgAgo，让全世界的研究人员都燃起了极大的热情，因为它有望替代CRISPR–Cas9，但正如哈佛医学院的遗传学者George Church所言：这也同时提醒我们每一个新技术都很脆弱。 NgAgo也只是越来越多的基因编辑工具之一，它们有些是在CRISPR的基础上进行改变，

有些是寻找新的基因组编辑方法。本文总结了目前主流的基因剪辑技术研究方向。 1、mini-me 或许未来CRISPR-Cas9会被用来改写遗传疾病的基因，但一条RNA链和一个Cas9酶的组合太过庞大，并不适合用于目前最常用的疾病治疗——将外源基因整合到病毒上再转入人体细胞这一过程。目前的解决方案是采用一种从金黄色葡萄球菌里提取的mini-Cas9[1]，它足够小能够进入目前市场上用于基因疗法的病毒内部。去年12月，有两个研究组用mini-meCas9来修正了小鼠的杜氏肌营养不良基因[2,3]。 2、扩大剪辑范围 Cas9并不是随意剪辑基因，而是只能在有特定DNA序列的位点进行剪辑，很多基因组都能满足这个需求，但对于另一些实验就是很痛苦的限制。研究人员正在寻找能够提供剪辑不同序列的酶的微生物，这样才能扩大能够修饰的基因的范围。其中一种叫做Cpf1的酶可能会成为一种有吸引力的选择，它比Cas9小，有不同的序列要求并且高度特异[4,5]。另外一种酶C2c2，它的靶序列是RNA而不是DNA，它的潜力在于可以通过研究RNA基因组来对抗病毒[6]。 3、真正的基因编辑 很多实验室用CRISPR–Cas9都只是删除部分基因来废除某种功能，正如Church所言：“人们希望听到胜利的消息，但是烧掉一页书并不算是编辑一本书。”那些想要交换序列的研究面临的困难更大。当Cas切掉基因后，细胞通常会把断裂的序列链接起来，这就是做基因切除的研究人员们想要的。但对于想要改写基因的研究人员，他们依赖的的是另一种可以插入序列的细胞修复机制，这当然比普通的连接修复机制频率低得多。明尼苏达大学的植物学研

基因工程之基因治疗

基因治疗 摘要： 生物技术在生命科学领域扮演者重要的角色，基因治疗在治疗方面，将新的遗传物质转移到某个个体的体细胞内使其获得治疗效果；在基因工程方面，将正常的有功能的基因置换或增补缺陷基因。近些年来，已对若干人类单基因遗传病和肿瘤开展了临床的基因治疗。基因治疗作为治疗疾病的一种新手段，正愈来愈受到人们的重视和关注。 关键词：基因工程基因治疗基因 一、基因治疗的历史 随着DNA双螺旋结构的发现和以DNA重组技术为代表的现代分子生物学技术的发展以及人类对疾病认识的不断深入，越来越多的证据证明，多种疾病与基因的结构或功能改变有关，因而萌生了从基因水平治疗疾病的念头和梦想。 早在1968年，美国科学家发表了“改变基因缺损：医疗美好前景”的文章，首次在医学界提出了基因疗法的概念。1989年美国批准了世界上第一个基因治疗临床试验方案。1990年美国NIH的Frenuch Anderson博士开始了世界上第一个基因治疗临床试验，用腺苷酸脱氨酶基因治疗了一位ADA基因缺陷导致的严重免疫缺损的四岁女孩，并获得成功[1]。 1994年美国科学家利用经过修饰的腺病毒为载体，成功地将治疗遗传性囊性纤维化病的正常基因cfdr 转入患者肺组织中。2000年，法国巴黎内克尔儿童医院利用基因治疗，使数名有免疫缺陷的婴儿恢复了正常的免疫功能，取得了基因治疗开展近十年最大的成功[2]。 2004年1月，深圳赛百诺基因技术有限公司将世界第一个基因治疗产品重组人p53抗癌注射液正式推向市场，这是全球基因治疗产业化发展的里程碑[3]。迄今报道已有数千例基因治疗患者，病种主要是恶性肿瘤、艾滋病、血友病B、病毒性肝炎等等。 二、基因治疗的概念 基因治疗是指向有功能缺陷的细胞补充相应的基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。 广义的说，基因治疗就是应用基因或基因产物治疗疾病的一种方法。狭义的说，基因治疗是把外界的正常基因或治疗基因，通过载体转移到人体的靶细胞，进行基因修饰和表达，治疗疾病的一种手段。

基因工程在医学上的发展

基因工程在医学上的发展 【摘要】 基因治疗是目前最具革命性的一项医疗技术。随着人类基因组计划的顺利实施，基因治疗有望成为治疗遗传病、肿瘤、心血管病、病毒感染及其它难治性疾病的有效手段。本文从基因治疗(基因治疗的现状、肿瘤的基因治疗)、基因预防、基因治疗技术、基因治疗存在的问题和未来发展等进行综述。 【关键词】基因治疗基因预防基因治疗技术现状、问题和未来发展 人类的疾病是由于其本身的基因的核苷酸发生变化有关。近年来，基因治疗作为一种安全的、新的疾病治疗手段，在一定程度上取得了重大进展。 基因治疗 基因疗法，就是利用健康的基因来填补或替代基因疾病中某些缺失或病变的基因，目前的基因疗法是先从患者身上取出一些细胞，然后利用对人体无害的逆转录病毒当载体，把正常的基因嫁接到病毒上，再用这些病毒去感染取出的人体细胞，让它们把正常基因插进细胞的染色体中，使人体细胞就可以“获得”正常的基因，以取代原有的异常基因。 一、基因治疗的现状 生物医学的深入研究表明，人类的各种疾病都直接或间接与基因有关。因此，可认为人类的一切疾病都是“基因病”。故人类疾病可分为三大类:一类是单基因病。这类疾病只需一个基因缺陷即可发生，如腺苷脱氨基酶(ADA)缺陷症。二是多基因病。此类疾病的病因大多比较复杂，不但涉及各个基因，往往还与环境因素有关,基因缺陷和疾病表型都具有明显的多样性。Ⅰ型糖尿病、肿瘤、心血管疾病等皆属此类。三是获得性基因病。此乃病原微生物入侵所致，如艾滋病、乙型肝炎等。因此，理论上，人类所有的疾病都可采用基因治疗。 二、肿瘤的基因治疗 目前治疗癌症的基因疗法种类颇多，主要集中在免疫基因治疗、药物敏感性基因治疗、肿瘤抑制基因治疗治疗三个方面。 1免疫基因治疗 常用方法有：①细胞因子基因治疗：将某些细胞因子基因如IL拟2、IL拟4、IL拟6、B7拟1，GM拟CSF等转染肿瘤细胞后，增强机体对肿瘤细胞的免疫反应。②肿瘤抗原基因免疫治疗：将某些肿瘤抗原基因如MHC基因等转染肿瘤细胞，增强肿瘤细胞免疫原性。③反义基因治疗：应用反义核酸在转录和翻译水平，

基因工程在医学上应用

基因工程在医学上应用 深圳晶美生物工程有限公司(518034)　李　梅 基因工程是指不同生物体的脱氧核糖核酸在体外经过酶切和连接,构成重组脱氧核糖核酸分子,然后转入受体细胞,使外源基因在受体细胞中表达。人类按照这个原理,根据需要,人为地转移和重组遗传基因。基因重组是由一个脱氧核糖核酸片段掺入到另一脱氧核糖核酸分子中,这种外源基因与生物染色体的整合,使此时的外源基因伴随细胞的分裂而增殖,并在体内表达出来。一个好的外源基因的表达载体最基本的条件是:能够自我复制,并能够带动插入的外源基因一起复制;具有合适的限制性内切酶位点,这些酶切位点能够带有相应酶切位点的外源目的基因插入到基因载体上;具有合适的筛选标记,以便重组体筛选;能够有效启动插入的外源目的基因的转录、翻译和表达;在受体细胞中具有稳定性和拷贝数,以便外源目的基因的扩增和表达。由此可知,基因工程能够按照人类的设计,改变生物的遗传特性,创作新的生物类型。从这个意义上说,基因工程具有巨大的应用价值。 基因工程在医学上已得到广泛应用,并且应用领域不断被拓宽,取得了令人惊喜的成就。 1　基因工程制药 基因工程制药开创了制药工业的新纪元,解决了过去不能生产或者不能经济生产的药物问题。现在,人类已经可以按照需要,通过基因工程生产出大量廉价优质的新药物和诊断试剂,诸如人生长激素、人的胰岛素、尿激酶、红细胞生成素、白细胞介素、干扰素、细胞集落刺激因子、表皮生长因子等。令人振奋的是,具有高度特异性和针对性的基因工程蛋白质多肽药物的问世,不仅改变了制药工业的产品结构,而且为治疗各种疾病如糖尿病、肾衰竭、肿瘤、侏儒症等提供了有效的药物。众所周知,医治侏儒症的良药是人生长激素,倘若从人的尸体中获取,治疗一个病人就需要600具尸体的脑下垂体才能获得足够的量;倘若运用基因工程生产,就可从每升基因工程菌液中得到2.4g。人们为此而石破天惊的兴奋!成本如此之低,又如此之高产,其巨大的经济效益和社会效益,由此可见。 2　基因工程抗病毒疫苗 为人类抵御病毒侵袭提供了用武之地。基因工程乙型肝炎疫苗、狂犬病疫苗、流行性出血热病毒疫苗、轮状病毒疫苗等应用于临床,提高了人类对各种病毒病的抵御能力。比如,乙型肝炎病毒疫苗的问世,使我国新生儿不再遭遇乙型肝炎病毒的侵袭,也降低了人群肝癌的发病率。又如,为治愈癌症正在研制的用单克隆抗体制成的“生物导弹”,就是按照人类的设计,把“生物导弹”发射出去,精确地命中癌细胞,并炸死癌细胞而不伤害健康的细胞。就单克隆细胞而言,单克隆细胞在肿癌的诊断检测、显示定位、监测病变、监测疗效等方面也有重要价值。人类还通过基因工程生产抵御各种病菌、血吸虫、虐原虫等疫苗,提高人体对各种传染病的免疫力。脱氧核糖核酸或者基因疫苗的问世,变革了机体的免疫方式。如今,人们翘首关注困扰人类的艾滋病病毒(人类免疫缺陷病毒)疫苗的早日问世。基因工程抗体技术的发展,为克服单克隆抗体生产细胞株在生产过程中的不稳定性,为生产大量高效抗病毒疫苗提供了先进的生产工艺。 3　基因工程治疗疾病 临床实践已经表明,基因治病已经变革了整个医学的预防和治疗领域。比如,不治之症——白痴病,用健康的基因更换或者矫正患者的有缺损的基因,就有可能根治这种疾病。现在已知的人类遗传疾病约有4000种,包括单基因缺陷和多基因综合征。运用基因工程技术或者基因打靶的手段,将病毒的基因杀灭,插入校正基因,得以治疗、校正和预防遗传疾病的目的。人类精心设计的基因工程操作,克服了不同个体甚至物种之间由于器官移植所产生的免疫排斥作用,实现人体之间的移植已获成功,成功的实体器官移植有肾、心、肝、胰、肺、肠,也有双器官和多器官的联合移植。而人体与动物之间的器官移植成为现实,临床应用已是指日可待的事了。脱氧核糖核酸化学合成的完善和自动化,脱氧核糖核酸扩增技术的优化,为合成基因“探针”,提高临床诊断的质量,是人类所殷切企盼的。基因治疗有两种途径,一是体细胞的基因治疗,二是生殖细胞的基因治疗。体细胞的基因治疗是将正常的遗传基因导入受精的卵细胞内,让这种遗传物质进入受精卵的基因组内,并随着受精卵分裂,分配到每一个子细胞中去,最终纠正未来个体的遗传缺陷。而生殖细胞的基因治疗是将人类设计的“目的基因”导入患有遗传病病人的生殖细胞内,此法操作技术异常复杂,又涉及伦理,缓行之理充足,故尚无人涉足。 4　基因工程诊病 运用基因手段诊病,从基因中寻找病根,旨在根治遗传性疾病和为癌症、艾滋病、白痴病之类的“不治之症”寻找新的诊断渠道。目前,聚合酶链反应的基因诊断技术是在基因水平上对人体疾病进行诊断的最新技术。从原理 190Anthology of Medicine,Apr.2004,Vol.23,N o.2

基因工程在治疗1型糖尿病方面的研究进展与发展

基因工程在治疗1型糖尿病方面的研究进展与发展 【摘要】近年来, 随着人们对糖尿病本质的深层次揭示和现代分子生物学手段的发展, 糖尿病,尤其是1型糖尿病基因治疗的内容不断增加。本文总结了利用合适的启动子载送胰岛素原的cDNA, 刺激新的B细胞生成以达到恢复胰岛素的生理性分泌及改善或避免破坏B细胞免疫应答的1型糖尿病基因治疗进展，并展望其未来发展方向。 【关键词】 1型糖尿病；基因治疗；病毒载体；B细胞工程 自上个世纪以来, 胰岛素的发现和其类似物的不断发展挽救了无数1型糖尿病患者的生命。但外源性胰岛素及其类似物的补充治疗存在需要多次注射、严密监视血糖及无法按生理需求分泌等缺陷。随着新病毒载体的成熟运用, 载送方式的不断改进以及治疗思路的不断扩展, 科学家们开始尝试用基因治疗技术来治疗1 型糖尿病。1型糖尿病( Type 1 diabetesme llitus, T1DM )的主要病因与自身免疫对于机体胰岛B细胞的破坏有关。目前研究人员尝试通过以下三种策略来平稳控制血糖。首先是直接载送具有合适启动子的胰岛素原cDNA 到胰腺以外的部位(通常是肝), 通过异位分泌胰岛素来维持正常血糖水平。其次是通过刺激新的B细胞的生成来促使胰腺恢复原来的功能。第3种思路则是改善胰岛B细胞的自身免疫反应。下面就1 型糖尿病胰岛素基因治疗研究现状分别从上述3 个方面作一综述。 1.利用合适的启动子载送胰岛素原的cDNA 1型糖尿病最简单直接的基因治疗法是通过载送胰岛素原的cDNA来替代死亡B细胞的功能。通常选择肝细胞为基因送载的目的部位, 这是由于肝脏具有合成糖代谢相关酶及运载蛋白的功能。目前已用于此基因转移的载体有: ( 1) 逆转录病毒载体。( 2) 脂质体载体。( 3) 腺相关病毒载体等。 逆转录病毒载体由于构建简单, 宿主范围广, 可整合入宿主细胞基因组中获得稳定表达等优点, 而成为目前各种基因治疗实验中应用最广泛的载体。有研究显示, 将含有人胰岛素原基因的重组逆转录病毒载体注入大鼠门静脉后, 可在肝脏获得5% ~15% 的基因转移效率, 并可使其表达持续6 个月, 阻止大剂量STZ 诱导的糖尿病鼠高血糖、体重下降、酮症酸中毒以至死亡［1］。然而逆转录病毒载体也有其缺点, 它只能感染分裂期的细胞, 在体内直接基因转移时需要采取部分肝切除等方法促进细胞分裂增殖, 这使其在活体动物以及人的直接应用受到限制, 另外, 它缺乏靶向性, 随机整合, 不可避免的产生安全性问题。 传统的中性脂质体载体是将磷脂、胆固醇或其它脂类的乙醚溶液加入DNA 溶液中, 通过处理得到带DNA 的脂质体小泡, DNA 被包裹在脂质体膜内部, 可与细胞膜融合被细胞内吞 而实施基因转移。这种方法在胰岛素基因活体直接基因转移研究中应用较早。八十年代已有学者将含有胰岛素基因的质粒与中性脂质体作用后注入大鼠体内, 发现在肝组织中可检测 到转入基因的存在, 并获得一过性血糖下降和血浆胰岛素水平升高。1987 年起出现了一系列阳离子脂质体转染试剂, DNA 通过与阳离子之间的相互作用形成DNA－脂质体复合物再被细胞捕获并最后表达, 这大大提高了脂质体的基因转染效率。目前认为, 影响脂质体活体 直接基因转移效率的因素有: ( 1) 启动子因素。有研究比较了巨细胞病毒( CMV) 启动子、SV40 启动子、腺病毒启动子及胸苷激酶( TK) 启动子引导氯霉素乙酰基转移酶基因在大鼠体内转移表达效率, 发现CMV 启动子最高, 而TK 启动子效率最低。还有研究发现, 在各种启动子引导荧光酶( luc) 基因表达的实验中, CMV启动子可在肌肉中获得最高表达效率。( 2) 脂质体的组成因素。研究发现在活体直接基因转移时,含有胆固醇的脂质体可获得最高转移效率。( 3) DNA 与脂质体的比例。Thierry 等认为经静脉基因转移时DNA 与脂质体的最佳 比例为0. 08(wt/wt) , 而Egilmez 等认为这个比例应在1 1~ 1 4( u g/nmol) 之间( 4)DNA 的