酶联免疫(ELISA)使用试剂盒检测过程中值得关注的问题

酶联免疫（ELISA）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题

1、仪器质控

为使仪器保持最佳工作状态，应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器（加样枪）、温箱、洗板机和酶标仪。

◎移液器：ELISA加样量小（20-200μl），其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：低、中、高三个刻度分别吸取指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在±5%以内；

◎恒温箱：经常检查恒温箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃的误差；◎洗板机：每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定，一般不超过2μl；人工扣板时，垫纸不湿；定期检查管孔是否堵塞；

◎酶标仪：经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。

2、试剂盒选择

◎应尽量选择正规厂家，产品经相应政府部门审核认可，试剂应从灵敏度、特异性、精密度、稳定性、简便性、安全性及经济性全面评价。

◎灵敏度：有二层含义，1）为试剂检出被检物质的最低量的能力；2）为试剂对大量样品中阳性检出的能力。

◎特异性：常用交叉反应率表示。含有与待测物相近结构部份的物质可能存在交叉反应，使测定结果升高，可能导致假阳性，所以交叉反应是评价其质量的关键指标。

◎精密度：ELISA试剂一般指其批内CV%，其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性范围。

◎准确度：通过添加回收实验进行评价。

◎简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性实验中结果判断简

单明了，定量试验结果计算也应简单。

◎安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。

◎经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本，而市场价格比较合理。

◎试剂评价：需要有权威的确证方法和确证的样品进行检测。

3、样本前处理注意事项

3.1 均质

组织样本:肉、肝食品类切细，用绞肉机反复绞碎，混合均匀。

水产样本：去除样品的非食用部分，食用部分切细，用均质器均浆；原料表面较脏时,需适当用蒸馏水清洗。蛋类：鲜蛋去壳，蛋黄和蛋白充分混匀。

水果、蔬菜类：先用水洗去泥沙，然后除去表面的水分，取食用部分。

3.2 振荡提取

将提取溶剂加入到装有样品的具塞容器中，振荡，使提取溶剂与容器内的样品充分接触以深入到样本组织内部，提取待测组分。

3.2.1振荡方式：振荡器上进行上下、往返式振荡、手摇式上下振荡。

3.2.2 在组织样本中加入有机溶剂之间提取时，应边加边振荡，防止组织凝结成团，不利于提取。

3.3. 在用有机溶剂提取过程中，如果出现乳化现象，解决的方法有：①用细头轻轻的搅拌，破坏乳化后，再重复离心。②再加入适量的提取剂，重新振荡。注意离心后要保证样本的稀释倍数不变。

3.4 浓缩

由于净化过程中引入的溶剂，可能会降低待测组分的浓度或者不适宜直接分析，需要去除全部有机溶剂。即试剂盒前处理步骤中把样本在60℃氮气下吹干，再用复溶液溶解干燥残留物。

浓缩方式：

氮气吹干除杂、压缩空气吹干除杂。

注意：

3.4.1在吹干样本之前，用甲醇清洗针头，防止杂质干扰。

3.4.2在吹样本时，针头应在液面上空，避免与样本接触，防止产生交叉污染。

3.4.3样本吹干后应立即取下，避免吹的时间过长，影响最终检测结果。

3.4.4不同的药物，吹干后样本的保质期不同，提倡待样本回到室温后立即复溶。

3.5 净化

经过提取的待测组分中通常含有一些会干扰试剂盒中抗原抗体反应的杂质或者是含有与待测物结构相似

的杂质。将待测组分与杂质分离的过程，我们称为试剂盒中样本的净化。在我们现有的试剂盒前处理方法中涉及到的最常见的净化是：液液分配法。

比如：用复溶液溶解干燥残留物之前先加入适量的正己烷，在加入正己烷和复溶液涡动后如果出现乳化现象，可以60℃水浴加热，至乳化现象消失或减弱后，加大离心转速进行离心。

实例：

A、氟喹诺酮类药物试剂盒现有的水产样本前处理方法中，用二氯甲烷作为提取剂。

注意：

(a)二氯甲烷的密度比水大，离心完后，二氯甲烷在下层，须先用加样器吸尽上层废液后，再按要求取适量的下层吹干。

(b)在用加样器吸取下层的有机相时，正常操作往往取量不准确，此时最好用带有刻度，且刻度较准确的玻璃管来定量。

(c)上诉情况对有经验的试验员还可以通过灵活控制加样器来控制取样的准确性。

(d)在振荡过程中要注意安全。二氯甲烷在振荡的过程中，如果离心管密封性不是很好，往往容易爆开；在进行振荡时，不要让离心管口对准自己或者其他人，避免溅到自己或者他人身上。

(e)试剂盒在使用前充分回温很必要，如回温不充分该项目曲线受影响较明显。

B、硝基呋喃代谢物检测过程中常见问题

硝基呋喃代谢物有四种：3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)和1-氨基-2-内酰脲(AHD)在检测过程中也需要同其它项目一样进行添加回收测评，其中需要注意以下几个问题。

代谢物在组织中是与蛋白呈结合状态，采用普通的有机溶剂或缓冲液，是无法提取该代谢物的。需要用盐酸水解后才能使呋喃类代谢物游离，所以在加入去离子水、盐酸和2-硝基苯甲醛(2-NBA)混合均匀后，其pH应在1-3之间，否则不利用水解代谢物。

在衍生化过程中，温度和时间决定其衍生化产率，衍生化后在加入氢氧化钠和磷酸氢二钾时，其pH应在中性左右。由于部分样本的缓冲能力不同，所以需对其pH进行测定，因为在酸性或碱性环境中，不利于呋喃类代谢物的提取回收，同时也容易出现假阳性。

添加回收的几种误区：

呋喃类代谢物提取过程通常分三个关键步骤：

水解-----衍生化-----提取

(1)采用标准曲线的最大标准浓度进行添加回收。如德国拜发和我公司AOZ试剂盒中的第6个标准点

4.05ppb，AMOZ试剂盒中的第6个标准点8.1ppb。因为这些标准品是已经过衍生化后的标准品，不能代表样本前处理实验中的加酸水解和加衍生化试剂衍生这两个步骤，所以就算回收率很高，但失去了实际参考价值。

（2）完全依赖未衍生的代谢物标准品进行添加回收。因部分未衍生的代谢物在配制成标准品后有一定的有效期，会存在潜在的不稳定因素，而且添加回收仅能考证衍生化和提取两个关键点，不能验证从组织蛋白中水解呋喃类代谢物的过程，因此也有一定的局限性。

最好的评价方案：采用经LC-MS-MS确证的阴阳性样品，留作质控样品，对检测的样本和试剂盒进行质量评价。这也是实验室所出数据可信度最具说服力的关键点。

4、酶标分析过程中的注意事项

样本的检测是基于抗原抗体的反应，根据标准曲线，判定样本最终的药物含量。它要求加样的准确性和洗板的一致性。在整个加样的过程中注意实验室温度的恒定，保证反应在试剂盒所示的温度下进行。

4.1常见加样方式

A、吸一打二

B、吸二打一

在实际操作过程中，提倡用“吸二打一”用这种方式，有如下几个好处：

a、加样过程中在板孔内不出现或者很少出现气泡

b、提高加样速度，缩短前后样本反应的时间差。

在加样的过程中还应细心注意避免出现下列现象：

A、加样的过程中漏加或者重加；

B、加样的过程中忘记更换吸头；

C、样本的重加或者漏加；

D、忘记记录样本的加样顺序。

4.2常见的洗板方式

A、洗板机洗板；

B、多道孔加样器洗板；

C、多孔吸头洗板；

在洗板的过程中，确保每孔所加洗涤液量的均一，按说明书操作，不可过多，避免溢出板孔，污染其它样本；过少，则达不到洗涤的效果，容易出现曲线不成线性，花板等情况。

4.3 甩板

快速甩尽板孔内的液体，防止板孔里的液体对流或反溅回板孔中产生交叉污染。

4.4拍板

轻轻的在吸水纸上扣干板孔内的液体，而且吸水纸只能使用一次。

4.5 显色

值得注意的是，并非试剂盒中所规定的显色时间是绝对的，因为试剂盒的吸光度值会受环境中的温度、湿度、酶标板反应时所接触到的物品的导热度等有关，实验操作人员在加完显色液后，可根据颜色的深浅适当的延长或者缩短显色时间。防止出现吸光值接近或高于酶标仪的最高检测灵敏度（OD值在2.5-3.0之间），这样会间接影响到检测结果，如出现曲线前半部份梯度不明显或颠倒数值等现象，也就造成了一些假阳性或部分检测结果偏低的现象。

酶联免疫法

酶联免疫吸附试验（又称酵素免疫分析法，Enzyme-linked immunoassay，简称ELISA）利用抗原抗体之间专一性键结之特性，对检体进行检测；由于结合于固体承载物(一般为塑胶孔盘)上之抗原或抗体仍可具有免疫活性，因此设计其键结机制后，配合酵素呈色反应，即可显示特定抗原或抗体是否存在，并可利用呈色之深浅进行定量分析。根据待测样品与键结机制的不同，ELISA可设计出各种不同类型的检测方式，主要以三明治法（sandwich）、间接法（indirect）、以及竞争法（Competitive）三种为主，以下为各种方法之介绍. 三明治法 常用于检测大分子抗原，一般之操作步骤为: 1.将具有专一性之抗体固著（coating）于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体 2.加入待测检体，检体中若含有待测之抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专 一性键结 3.洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一之一次抗体，与待测抗原进行键结 4.洗去多余未键结一次抗体，加入带有酵素之二次抗体，与一次抗体键结 5.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色 结果 三明治法分别以两种抗体对检体中的抗原进行两次专一性辨认，因此专一性相当高，但此待测抗原必须是多价抗原，如此才可获得两种以上的专一性抗体，以分别进行夹心；而且此法需要足够的表位空间以进行抗原抗体的夹心，所以并不适用于半抗原或小分子抗原等分子量较小之标的。 间接法 间接法常用于检测抗体，一般之操作步骤为： 1.将已知之抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余之抗原 2.加入待测检体，检体中若含有待测之一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进 行专一性键结 3.洗去多余待测检体，加入带有酵素之二次抗体，与待测之一次抗体键结 4.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，藉仪器（ELISA reader） 测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗原 的含量。 竞争法 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： 1.将具有专一性之抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体 2.加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结 3.加入带有酵素之抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于 塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酵素之

酶联免疫分析法

酶联免疫分析法 生工121 徐娜 酶联免疫分析法是目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，特别是在食品和饲料中有毒有害物质的检测应用极为广泛。 酶联免疫分析法是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种检测技术。该技术的原理主要有三点：第一、抗原或抗体能结合到固相载体的表面仍具有其免役活性；第二、抗体或抗原与酶结合所形成的结合物仍保持免疫活性和酶的活性；第三，结合物与相应的抗原或抗体反应后，结合的酶仍能催化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量抗体或抗原的含量。 酶联免疫法在医药、食品加工业、农牧渔业等领域有着广泛的应用：如乙型肝炎、莱姆病，急性心肌梗死的早期诊断，定量检测内毒素，HIV抗体初筛，SARS 病毒的快速检测；检测食品中的病毒，残留农药，微生物及其其它成分；检测香蕉有关病毒，小麦黄花叶病毒，检测水产品中氯霉素的残留量，禽脑脊髓抗体等。 一、医学临床中的应用 医学中，检测各种抗原和抗体，为临床疾病的辅助诊断和早期诊断提供了特异性、敏感性强的试验基础。 1、乙型肝炎、原发性肝癌的血清学检测：用血清学方法检测肝炎病毒的抗原或抗体，一直受到各级医疗卫生机构检验科室的高度重视。尤其是对乙型肝炎，甲型肝炎，丙型肝炎的血清学检测，更因为试剂盒的推出而得到广泛开展。上述各种肝炎病毒抗原或抗体的检测方法，绝大部分都是酶联免疫分析法。 2、简化莱姆病的诊断：由于在作出博氏疏螺旋体感染诊断前要进行双重测试，因此莱姆病的测试可能花费很长时间。采用由关键的疏螺旋体抗原决定簇构成的重组蛋白开发出一种新的酶联免疫测定方法。该测试比最常用的商业全细胞酶联免疫测定法特异，而敏感性相同，并且在20分钟就会产生结果。 3、急性心肌梗死的早期诊断：急性心肌梗死为一多发病，病情严重。目前对此病的策略是尽早的确诊并迅速积极的治疗。约有四分之一或更多的患者，在初诊时心电图并不显示典型心肌梗死心电图异常，无Q波。心肌坏死时释放出的Mb可直接快速血液循环。Mb是最早出现的心肌梗死生化标志物，但它在血中滞留时间短。为此，刘宏伟等研制出只需30分钟的酶联免疫快速法，为早期诊断心肌梗死提供了依据。 4、定量检测内毒素：临床上，细菌感染的患者常发生内毒素血症，死亡率高达20%——30%，检测标本中的LPS对早期诊断和防治有重要意义。用优化后的双抗体夹心法检测LPS敏感性为50ng/L,特异性与准确性均高于仪器比浊法和试验定性法。此为内毒素血症提供了一种简便，快速，准确，特异性的诊断参考。 5、快速检测SARS病毒：SARS病毒引起传染性非典型肺炎，发病快，传染性强。2003年4月，北京基因组研究所与军事医学科学院研制出诊断非典的酶联免疫分析法检测试剂，为控制疫情蔓延提供了新的诊断手段。 二、在食品分析中的应用 1、检测食品中的毒素：采用辣根过氧化氢酶标记高亲和力的黄曲霉素B1抗体，建立了直接竞争抑制酶联免疫快速筛选法。该法检测B1抗体的线性范围

植物NADPH酶联免疫分析(ELISA)

植物NADPH酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定植物组织，细胞及其它相关样本中植物NADPH含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物NADPH水平。用纯化的植物NADPH抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入植物NADPH，再与HRP标记的NADPH抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的植物NADPH呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中植物NADPH浓度。 标本要求： 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤： 1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标 准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，

混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为120U/L，80U/L ，40U/L，20U/L，10U/L）。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 注意事项： 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。 5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6．底物请避光保存。 7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9．本试剂不同批号组分不得混用。 10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。

酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附测定法（ELISA） 1.定义 (3) 2.原理 (3) 2.1抗原抗体反应 (3) 2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5) 3.ELISA的类型 (5) 3.1双抗体夹心法测抗原： (6) 3.2双抗原夹心法测抗体 (6) 3.3间接法测抗体 (6) 3.4竞争法测抗体 (7) 3.5竞争性测抗原 (7) 3.6捕获包被法测抗体 (7) 3.7ABS-ELISA法 (8) 4.ELISA试剂的组成 (9) 4.1固相载体： (9) 4.2包被的方式 (9) 4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。 (10) 4.4包被的条件： (10) 4.5洗涤液： (10) 4.7酶的催化性； (11) 4.8结合物的制备 (11) 4.9结合物的保存 (12) 4.10酶的底物 (12) 4.11酶反应终止液 (12) 4.12参考标准品 (13) 4.13加样： (13) 4.14保温 (13)

4.15保温方式： (13) 4.16室温温育的反应 (13) 4.17洗涤 (14) 4.18显色 (14) 4.19比色 (14) 4.20酶标比色仪 (15) 4.21结果判定 (15) 4.22定量测定 (16) 4.23ELISA的操作要点 (16)

1.定义 酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。 2.原理 采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。 2.1抗原抗体反应 2.1.1可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为： Ag+Ab→Ag·Ab 抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原和抗体均能保持原有的结构和活性。 2.1.2特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。因此，在很多时候，测定某一特定的物质不需分离待测物。2.1.3最适比例 只有当抗原抗体的浓度比例是当时，才出现可见反应。 以沉淀反应为例（Ab量固定，Ag量递增）

安培酶联免疫分析法

安培酶联免疫分析法 安培法是酶联免疫分析中另一种常用的电化学分析技术。它是将工作电极的电为控制在被测定物质能发生氧化/还原反应的某个确定电位上，当样品中含有该物质时，就会产生可以检测的电流，通过电流的大小就可以对该物质的浓度进行测定。由于该方法常应用在色谱和流动体系的电化学检测器上，所以又称为控制电位安培检测。当色谱和流动体系中分离流出的化合物经过该检测器时，可根据所产生的电流来判断吧被测物质流出的时间，根据电流峰的大小来判断化合物的浓度。由于电化学检测器的灵敏度高、死体积小，所以在色谱和流动分析中应用广泛。只要具有电话性的物质都可以进行测定，如苯酚类、硫醇类、硝基化合物、亚胺类、醌类、吩噻嗪类有机物，可以根据所测定的化合物的电化学性质选择相应的测定电位。 安培法中最简单、最常用的模式是在恒定的电位下测定待测物质的氧化还原电流，这种恒电位测量模式可以避免双电层充电和表面瞬变效应，因而信噪比高，可以达到很低的测定下限，还可以根据需要改变电位的各种参数，采用不同的电位脉冲检测模式如示差脉冲安培法、反向脉冲安培法、三脉冲安培法，或是采用双电极或多电极检测模式，以达到检测低浓度样品的要求。 安培酶联免疫分析常用的酶-底物体系 由于安培法可以检测有电化学活性的有机物，如苯酚类，所以理论上只要酶催化反应的产物含有有些电活性基因，均可用安培法进行测定。在酶免疫分析中应用较多的是碱性磷酸酶，其酶催化水解产物为相应的醇或酚，可以用安培法进行检测，特别是电化学氧化对其测定的报道较多，采用的工作电极有碳电极、金属电极、化学修饰电极等。美国Cincinati大学的Heine-man等人在这方面做了大量工作，他们采用不同的免疫分析模式，结合不同的工作电极，以及各种电化学测定技术，测定了多种临床样品和药物。他们最早用AP电化学酶免疫分析的底物是磷酸苯酯，在酶的催化作用下发生水解反应生成苯酚，可在电极上氧化而产生氧化电流，氧化电流的大小同酶的浓度有关系，进而可用于酶免疫分析。但是由于苯酚的电化学氧化过程为不可逆过程，测定时苯酚电氧化产物会吸附在电极表面而污染电极，导致测定灵敏度下降，同时氧化电位太高而造成检测时背景电流较大，所以采用其他底物的报道日益增多。已被研究的底物有对氨基磷酸苯酯、对甲氧基磷酸苯酯、a萘酚磷酸苯酯等，其酶催化水解产物均为酚类物质，可以用安培法测定其氧化电流的大小进而测定其酶的活力。 高效液相色谱安培酶联免疫分析 高效液相色谱（HPLC）具有非常的分离效率，是一种选择性好、灵敏度高的分离分析方法。HPLC的检测器有紫外吸收检测器、示差折光检测器、电化学检测器等。由于电化学检测器具有死体积小、响应速度且具有线性响应关系好、价格便宜等优点，所以近十几年来在HPLC方面的发展十分迅速。酶催化反应后的溶液通常是混合组分，将其与HPLC联用后利用色谱加以分离并除去相应干扰物，可以有效地提高待测物质的测定灵敏度。在高效液相色谱安培酶免疫分析操作中应注意以下几个问题。 流动相和样品 在HPLC中流动相的选择非常重要，一方面它起载体作用，将酶催化反应的产物同样品中的其他物质如未反应的底物、蛋白质等进行分离：另一方面它还要作为电化学检测的支持电解质起导电作用，所以一般选择用导电性溶液作为流动相。一般反相色谱的流动相具有有极性，可用于电化学检测器，而正相色谱可以通过加电解液后柱、采用大体积的壁喷式检测器等方法来改善电化学检测器的适应性。另外在待测物质的氧化还原反应中常常会消耗或