环介导等温扩增法鉴定检测冬虫夏草_李奎

环介导等温扩增法鉴定检测冬虫夏草

李奎1，李琦1，袁媛2，陈江源1，黄璐琦2，刘志国1*

1. 武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉 430023

2. 中国中医科学院中药研究所，北京 100700

摘 要：目的建立冬虫夏草的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）方法，实现对冬虫夏草的快速检测。方法针对冬虫夏草的CS2 serine protease (csp2)基因设计LAMP内外引物对；利用CTAB法提取冬虫夏草DNA；优化扩增反应条件；采用包括冬虫夏草在内的6种不同虫草进行LAMP扩增，并对阳性产物酶切鉴定以检测其特异性，通过对模板DNA的10倍梯度稀释检测其灵敏度；紫外灯下观察凝胶电泳或加入荧光染料SYBR Green I的扩增产物。结果设计的LAMP引物可以特异地针对冬虫夏草的csp2基因进行LAMP扩增，产物可被限制性内切酶Taq1酶切，且有较高的灵敏度，检出限达6 pg/mL。结论LAMP法可以实现对冬虫夏草的快速鉴定检测，在中药鉴定中有着广阔的应用前景。

关键词：冬虫夏草；环介导等温扩增；鉴定；检测；检出限

中图分类号：R282.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)08 - 1605 - 04

Identification and detection of Cordyceps sinensis with LAMP

LI Kui1, LI Qi1, YUAN Yuan2, CHEN Jiang-yuan1, HUANG Lu-qi2, LIU Zhi-guo1

1. School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China

2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100700, China

Abstract: Objective The method of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) was employed to detect and identify Cordyceps sinensis rapidly. Methods Specific LAMP primers were designed according to the CS2 serine protease (csp2) gene of Cordyceps sinensis. C. sinensis DNA was extracted using CTAB method. The reaction conditions of LAMP were optimized. Specificity of LAMP reaction was validated by six different strains and using restriction enzyme Taq1 digested the LAMP products. Sensitivity of LAMP was tested with diluted C. sinensis solution with 10-fold gradient. LAMP products were shown by gel electrophoresis or adding SYBR Green I. Results The method of LAMP for detecting C. sinensis was effective and specific. The detection limit of LAMP assay was up to 6 pg/mL. Conclusion LAMP protocol is a promising method for the identification and detection of C. sinensis and Chinese materia medica as well.

Key words:Cordyceps sinensis (Berk.)Sacc.; loop-mediated isothermal amplification (LAMP); identification; detection; detection limit

冬虫夏草是我国名贵中药材，因其经济价值高，常有伪冒品扰乱市场，因此冬虫夏草的快速鉴定检测具有重要意义。目前，冬虫夏草检测方法包括分离培养、子囊孢子微循环产孢、子实体人工诱发、菌丝蛋白酶谱检测、PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析、随机扩增多态性DNA（RAPD）分析等[1-3]。这些方法由于周期长，特异性及灵敏度不够，操作繁杂，检测成本高等原因而不适于推广应用。环介导等温扩增[4]（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种快速的核酸扩增技术，利用特异引物及链置换DNA聚合酶在恒温条件下自循环几十分钟，就可完成核酸扩增反应。该方法具有高特异性、高灵敏性、简便、快速、低成本等特点，已在诸多领域应用。本研究拟采用LAMP方法，实现冬虫夏草的快速检测与鉴定。

1材料

冬虫夏草Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. 子实

收稿日期：2011-03-29

基金项目：湖北省楚天学者计划项目；武汉市科技局对外科技合作与交流计划项目（201070934341）

作者简介：李奎（1986—），男，湖北宜昌人，硕士研究生，研究方向为中药材鉴定。Tel: 132******** E-mail: lk87282240@https://www.wendangku.net/doc/8213018882.html, *通讯作者 刘志国 Tel: (027) 83956899 E-mail: zhiguo_l@https://www.wendangku.net/doc/8213018882.html,

体、虫体由北京同仁堂提供，亚香棒虫草Cordyceps hawkesii Gray、分枝虫草Cordyceps ramosa Teng、新疆虫草Cordyceps gracilis (Grev.) Dur. et Mont.、蛹虫草Cordyceps militaris（L.）Link 购自青海玉树尼达大药房。

Bst DNA聚合酶购自纽英伦生物技术有限公司；LAMP引物由上海生工生物工程有限公司合成；SYBR Green I、dNTPs、DNA Marker DL2000、DL1000购自上海捷瑞公司。

电热恒温水浴箱（武汉市琴台医疗器械厂）；超净工作台（YJ—1450）（江苏苏州净化设备公司）；聚合酶链式反应仪Biometre UNO Ⅱ；核酸电泳仪（北京六一厂）；UV—2000 GIS紫外分析仪（日本HITACHI）。

2方法

2.1DNA提取

按文献采用CTAB法[5]提取冬虫夏草DNA，测定DNA量，作扩增模板用。

2.2 LAMP反应

通过Genebank Blast比对，选择冬虫夏草特异性基因CS2 serine protease（csp2）上的保守序列作为模板靶序列，利用PrimerExplorer V4软件设计LAMP内外引物对（表1）。

25 μL LAMP反应体系含1.6 μmol/L FIP、1.6

表1冬虫夏草csp2基因的LAMP引物

Table 1 LAMP primers for csp2 gene of C. sinensis

名称序列

F3 GGAGTAGTTGCACCACCAC

B3 TAGCGAGGTATGTGGCGG

FIP TCGCATCGCAAGCCTTCGTC-CTCGCTCGAGAAGGTCAAG

BIP AGAAGTTGCGAAACTCGAGCCG-AGTGCCCAGTTGAGTGAATG

μmol/L BIP、0.2 μmol/L F3、0.2 μmol/L B3、20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、10 mmol/L KCl、2 mmol/L MgSO4、10 mmol/L（NH4）2SO4、0.1% Triton X-100、1.4 mmol/L dNTPs、8 U Bst DNA聚合酶、1.0～4.0 μL模板DNA。在EP管中先加入除Bst DNA聚合酶以外的所有反应物，在95 ℃水浴5 min，然后迅速放在冰上冷却，冷却后加入Bst DNA聚合酶，63 ℃反应60 min，80 ℃孵育10 min终止酶活性即完成LAMP反应。扩增产物在含0.5 μg/mL溴化乙锭（EB）的1.5%琼脂糖凝胶上电泳，紫外观察结果；由于荧光染料SYBR Green I分子可嵌入核苷酸链中，可产生绿色荧光，因而加入0.5 μL SYBR-Green I于紫外光下观察扩增产物。

2.3LAMP反应条件的确定

分别设定反应温度为60、63、65 ℃，反应时间为40、60、80 min等不同条件下进行LAMP扩增，根据扩增结果确定最佳反应温度和反应时间。

2.4LAMP特异性检测

分别对包括冬虫夏草在内的6种不同虫草扩增，由于LAMP阳性扩增产物是由若干茎环结构和类似花椰菜结构的DNA组成的混合物，电泳后凝胶上会呈现出梯状条带。利用靶序列中含有的Taq1限制性酶切位点，对电泳呈阳性的LAMP产物与

Taq1混合，37 ℃酶切过夜，电泳，进一步检测冬虫夏草LAMP扩增的特异性。

2.5LAMP灵敏度检测

利用A260值，测定冬虫夏草DNA模板浓度，用三蒸水对模板进行10倍梯度稀释，最低稀释至109倍，对每一质量浓度梯度DNA模板进行LAMP 扩增，扩增产物电泳分析，确定检测限。

以LAMP外引物F3和B3对冬虫夏草各稀释模板进行PCR，条件为94 ℃变性45 s；53 ℃退火45 s；72 ℃延伸45 s，35个循环。扩增产物进行电泳分析，确定检出限。

3结果

3.1LAMP反应条件的确定

结果显示LAMP反应最佳反应温度为63 ℃（图1），最佳反应时间为60 min（图2），阳性结果电泳呈典型梯状条带。

3.2LAMP的特异性

对6种虫草DNA模板分别进行LAMP扩增，结果除冬虫夏草扩增产物呈阳性梯状条带外，其他均为阴性（图3），表明针对冬虫夏草的LAMP引物具有高特异性。对冬虫夏草LAMP扩增阳性产物经Taq1酶切过夜，梯状条带消失（图4），表明LAMP 产物为特异性扩增。

M-DNA Marker（DL1 000） 1-60 ℃ 2-63 ℃ 3-65 ℃4-空白对照M-DNA Marker (DL1000) 1-60 ℃ 2-63 ℃3-65 ℃

4-blank control

图1LAMP反应温度的确定

Fig. 1 Optimal reaction temperature of LAMP

M-DNA Marker （DL1 000）1～3-分别是在63 ℃时扩增40、

60、80 min后电泳结果4-空白对照

M-DNA Marker (DL1 000) 1－3-LAMP amplicons for 40, 60,

and 80 min, respectively 4-blank control

图2LAMP反应时间的确定

Fig. 2 Optimal reaction time conditions of LAMP

M-DNA Marker （DL2000）1-空白对照2-冬虫夏草子实体

3-冬虫夏草虫体4-亚香棒虫草5-分枝虫草

6-新疆虫草7-蛹虫草

M-DNA Marker (DL2000) 1-blank control 2-C. sinensis

fruiting bodies 3-C. sinensis larvae 4-C. hawkesii

5-C. ramose 6-C. grsacilis 7-C. militaris

图3不同虫草的LAMP扩增

Fig. 3 Specificity of LAMP for different species in C. sinensis

M-DNA Marker (DL1000) 1-LAMP阳性产物2-LAMP阳性产

物经Taq1酶切3-LAMP阳性产物经EcoR1酶切

M-DNA Marker (DL1000) 1-LAMP products of C. sinensis csp2 2-C. sinensis csp2 LAMP products carried out digestion with Taq l 3-C. sinensis csp2 LAMP products carried out digestion with EcoR1 图4冬虫夏草LAMP阳性扩增产物的酶切Fig. 4 Restriction analysis of C. sinensis csp2 LAMP

positive products

3.3LAMP的灵敏度

通过测定A260数值，计算得到0.1 g冬虫夏草所提的DNA的量为600 μg/mL，模板梯度稀释后，各取1 μL进行LAMP扩增，结果见图5。当模板DNA样品稀释至10?5倍时，依然可检出，检出限为6 pg/mL。以F3和B3引物对冬虫夏草进行PCR，得到预期片段（图6），而检出限为6 ng/mL。可见，LAMP扩增比普通PCR扩增灵敏度高约1 000倍。

3.4LAMP产物的荧光染色

LAMP扩增产物中加入SYBR Green I后在紫外灯下观察，空白管无荧光反应，阳性结果管呈明

M-DNA Marker (DL1000) 1～9-分别是模板稀释至10?1～10?9倍后

的LAMP扩增 10-空白对照

M-DNA marker (DL1000) 1－9-LAMP reaction carried out with C. sinensis DNA template diluted by 10?1－10?9-fold 10-blank control

图5冬虫夏草DNA梯度稀释后的LAMP扩增

Fig. 5 LAMP products with serial dilution

of C. sinensis DNA template

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

M 1 2 3 4

M 1 2 3 4

M 1 2 3 4 5 6 7

M 1 2 3

M-DNA Marker (DL2000) 1～4-分别为模板稀释至10?1～10?4 倍

后的PCR 5-空白对照

M-DNA Marker (DL2000) 1—4-PCR-reaction carried out with C.

sinensis DNA template diluted by 10?1－10?4-fold 5- blank control

图6冬虫夏草DNA 10倍系列稀释后的PCR扩增

Fig. 6 PCR products with 10-fold serial dilution

of C. sinensis DNA template

显的绿色荧光反应。SYBR Green I可用于LAMP 结果的快速检测。

4讨论

冬虫夏草是十分珍贵的中药材，在实物检测中，LAMP法只需要约为0.05 g子实体样品就可对样品做出检测和鉴定，耗材极少；且LAMP法操作简便，只需恒温水浴锅等简单设备便可完成反应。目前核酸探针、Real time PCR、RAPD、RFLP等分子生物学检测手段，虽然有较高灵敏度，但是操作较LAMP 复杂，都需要特殊的仪器[6-10]。本实验通过特异靶序列的LAMP引物实现冬虫夏草特异性扩增，对其他虫草无交叉反应，模板DNA检出限达6 pg/mL，比普通PCR灵敏度高约1 000倍。整个反应在数十分钟即可完成，而且LAMP扩增产物检测方便多样，可肉眼观察沉淀物，或电泳检测，或加入荧光染料紫外观察颜色变化。可见冬虫夏草的LAMP检测快速、便捷，适于基层推广应用。

自从LAMP技术被发明之后，凭借其高灵敏度、简便、快速的特性，迅速在食品安全检测、疫病检测、性别鉴定等多个方面得到了广泛应用[11-12]。此外，通过LAMP法与其他技术联合，开发出多种检测方法，例如环介导逆转录等温扩增技术（RT-LAMP）[13]、原位LAMP（in-situ LAMP）[14]等，使LAMP技术不断深化，应用领域更广阔。参考文献

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