不同分子量蛋白质的分离—凝胶过滤层析法

不同分子量蛋白质的分离—凝胶过滤层析法

一、实验目的

1. 了解凝胶柱层析的原理及应用。

2. 掌握凝胶柱层析的基本操作技术。

二、实验原理

凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。

凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：

Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)

在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav 值增大。

通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或

260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。

本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过Sephadex G－25层析后达到分离。

三、试剂和器材

1. 材料

血红蛋白溶液（Hb）：取抗凝血（肝素）2mL，离心弃去上层血浆。用0.9％NaCl洗血细胞数次（颠倒混匀，离心，弃去上清液），使离心后上清液几乎无淡黄色为止。于洗净的红细胞中加入5倍体积的蒸馏水摇匀，离心去沉淀（破碎的细胞膜等）即为Hb稀释液备用。

DNP－鱼精蛋白溶液：取鱼精蛋白0.15g溶于10％NaHCO3溶液1.5mL中（此时该蛋白质溶液pH应在8.5～9.0左右）。另取二硝基氟苯0.15g，溶于微热的95％乙醇3mL中，待其充分溶解后立即倾入上述蛋白质溶液中。将此管置于沸水浴中煮沸5分钟，注意防止乙醇沸腾溢出。冷却后加2倍体积的95％乙醇，可见黄色的DNP－鱼精蛋白沉淀。离心（300r/m）5分钟，弃去上清液，沉淀用95％乙醇洗2次，所得沉淀用1mL蒸馏水溶解，即为DNP－鱼精蛋白溶液，备用。

2. 试剂

0.9％ NaCl；10％ NaHCO3）；95％乙醇。

pH 7.0凝酸缓冲液（20mM磷酸二氢钠：20mM磷酸氢二钠＝31mL：69mL）

3. 器材

层析柱（1′15cm）；吸管1mL(′1)；滴管；搅棒试管

四、实验步骤

1. 凝胶溶胀

取3克葡聚糖凝胶（Sephadex G-25）干粉，浸泡于蒸馏水中充分溶胀（室温6小时），或者于沸水浴中煮沸1小时后冷却。充分溶胀后的凝胶以倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，如此反复洗涤2～3次，最后加入等体积pH7.0磷酸缓冲液备用。

2. 装柱

取直径1cm，长15cm的玻璃层析柱，垂直固定在铁架台上，将层析柱下端的止水螺丝旋紧，向柱中加入约5-7cm高的磷酸缓冲液，调节流速1滴/10秒；待柱中剩下约0.5cm磷酸缓冲液时，关掉恒流泵，把溶胀好的糊状凝胶一次性倒入柱中，自然沉降20分钟，在此过程中可以看到凝胶均匀地沉降到柱的底部并不断地上升。20分钟后，用镊子小心在胶面上放置圆片滤纸，用滴管补加缓冲液（注意随时添加缓冲液，防止柱床干裂）。同时开启恒流泵，控制一定的流速，使柱中的凝胶一直处在溶液中。若分次装入凝胶，需用玻璃棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面分层。装柱长度至少10cm。

3. 平衡

用磷酸缓冲液冲洗洗脱，平衡20分钟。注意在任何时候不要使液面低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动。

4. 样品制备

取DNP－鱼精蛋白溶液3滴和Hb溶液1滴混合，即为上柱样品。

5. 上样

待层析柱上缓冲液几乎全部进入凝胶时，关掉恒流泵，用滴管将上述样品沿柱内壁小心加到床表面，注意尽量不使平整的床表面搅动，然后打开恒流泵，让样品进入柱床。待其将进入柱床时，关掉恒流泵，用滴管小心加入磷酸缓冲液至柱顶。

6. 洗脱

旋紧柱顶，将进液管接入洗脱液瓶中，用缓冲液进行洗脱，控制缓冲液在约每10秒一滴的流速，观察并记录Hb和DNP－鱼精蛋白在层析柱中的位置，并解释之。

待所有有色条带完全流出柱子后，继续洗柱5 min。停止恒流泵，卸下柱子，旋下柱顶螺旋，将凝胶倒回小烧杯中并取出滤纸片。

7. 注意事项

（1）根据层析柱的容积和所选用的凝胶溶胀后柱床容积，计算所需凝胶干粉的重量，用洗脱缓冲液使其充分溶胀。

（2）层析柱粗细必须均匀，柱管大小可根据试剂需要选择。一般来说，细长的柱分离效果较好。若样品量多，最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径太小时，会发生“管壁效应”，即柱管中心部分的组份移动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好。

（3）各接头不漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。

（4）装柱要均匀，不要过松也不要过紧，最好也在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。但也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降。

（5）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。

五、思考题

1. 凝胶过滤法除了可以进行不同分子量蛋白质的分离，还可以进行未知蛋白质分子量的测定，简述后者的实验原理。

2. 影响凝胶过滤层析实验结果的因素有哪些？

生物化学实验报告：蛋白质分子量的测定——凝胶层析法

生物化学实验报告：蛋白质分子量的测定— —凝胶层析法 实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法 一、实验目的 1.掌握凝胶层析的基本原理。 2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。二、实验原理 凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗

入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。 将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是Vo，Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi 上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液通过实际测量求得；Vi可g×Wr求得。因此，对一层析柱胶床来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积就可算出它的Kd值。

实验报告血红蛋白doc

实验报告血红蛋白 篇一：生化实验报告实验5 血红蛋白凝胶过滤 实验报告 课程名称：生化实验B实验日期： 班级：姓名学号： 血红蛋白凝胶过滤 一、背景及目的 血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。存在于脊椎动物、某些无脊椎动物血液和豆科植物根瘤中。人体内的血红蛋白由两个α亚基和两个β亚基组成。每个亚基均成球状，内部有一个血红素。血红素上的亚铁离子可以可逆的与氧分子结合，起到运输氧气的作用。当携带氧气时，血红蛋白呈鲜红色，无氧时为暗红色。 凝胶过滤法又称凝胶排阻层析或分子筛层析，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的

分离效果。 影响分离效果的因素主要有以下几点：1.基质的(本文来自：小草范文网:实验报告血红蛋白)颗粒大小、均匀度 2.筛孔直径和床体积的大小 3.洗脱液的流速 4.样品的种类等， 5.缓冲液的pH 6.而最直接的影响是 Kav 值的差异性， Kav 值差异性大，分离效果好； Kav 值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。 影响凝胶过滤的因素主要有： 1、层析柱的选择：长的层析柱分辨率要比短的高，但层析柱长度不能过长。 2、加样量：加样过多，会造成洗脱峰的重叠；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低。 3、凝胶柱的鉴定：凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。 4、洗脱速度：洗脱速度应保持适中。 目前凝胶过滤技术的应用主要是以下几点： 1、脱盐 2、用于分离提纯 3、测定高分子物质的分子量 4、高分子溶液的浓缩 5、蛋白质的复性 二、实验原理 层析法是基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相(液体或气体)

常见蛋白质分子量参考值

常见蛋白质分子量参考值（单位：dalton） 蛋白质分子量 肌球蛋白[myosin] 甲状腺球蛋白[thyroglobulin] β-半乳糖苷酶[β-galactosidase] 副肌球蛋白[paramyosin] 磷酸化酶a[phosphorylase a] 血清白蛋白[serum albumin] L-氨基酸氧化酶[L-amino acid oxidase] 地氧化氢酶[catalase] 丙酮酸激活酶[pyruvate kinase] 谷氨酸脱氢酶[glutamate dehydrogenase] 亮氨酸氨肽酶[glutamae dehydrogenase] γ-球蛋白，H链[γ-globulin, H chain] 延胡索酸酶（反丁烯二酸酶）[fumarase] 卵白蛋白[ovalbumin] 醇脱氢酶（肝）[alcohol dehydrogenase (liver)]烯醇酶[enolase] 醛缩酶[aldolase] 肌酸激酶[creatine kinase]220,000 165,000 130,000 100,000 94,000 68,000 63,000 60,000 57,000 53,000 53,000 50,000 49,000 43,000 41,000 41,000 40,000 40,000

胃蛋白酶原[pepsinogen] D-氨基酸氧化酶[D-amino acid oxidase] 醇脱氢酶（酵母）[alcohol dehydrogenase (yeast)] 甘油醛磷酸脱氢酶[dlyceraldehyde phosphate dehydrogenase] 原肌球蛋白[tropomyosin] 乳酸脱氢酶[lactate dehydrgenase] 胃蛋白酶[pepsin] 转磷酸核糖基酶[phosphoribosyl transferase] 天冬氨酸氨甲酰转移酶，C链[aspertate transcarbamylase, C chain] 羧肽酶A[carboxypeptidase A] 碳酸酐酶[carbonic anhydrase] 枯草杆菌蛋白酶[subtilisin] γ-球蛋白，L链γ-blobulin,L chain[] 糜蛋白酶原（胰凝乳蛋白酶原）[chymotrypsinogen 胰蛋白酶[trypsin] 木瓜蛋白酶（羧甲基）[papain (carboxymethyl)] β-乳球蛋白[β-lactoglobulin] 烟草花叶病毒外壳蛋白（TWV外壳蛋白）[TWV coat protein 肌红蛋白[myoglobin] 天门冬氨酸氨甲酰转移酶，R链[aspartate transcarbamylase, R chain] 血红蛋白[h(a)emoglobin]40,000 37,000 37,000 36,000 36,000 36,000 35,000 35,000 34,000 34,000 29,000 27,600 23,500 25,700 23,300 23,000 18,400 17,500 17,200 17,000

蛋白质分子量测定：凝胶过滤层析法

蛋白质分子量测定：凝胶过滤层析法 一、目的： （1）初步掌握利用凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理。 （2）学习用标准蛋白质混合液制作Ve，Kav对1gMr的“选择曲线”以及测定未知蛋白质样品分子量的方法。 二、原理： 凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又叫做分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。分离过程中的示意见图17-1。 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶，后者的商品名称为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它是个有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水，其化学结构式如图17-2所示。 这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。 为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt（total volume）表示。实际上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，即： Vt=Vo+Vi+Vg Vo称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体 积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相应于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；Vg为凝胶本身的体积，因此Vt—Vo等于Vi+Vg 。它们之间的关系可用图17-3表示。洗脱体积（Ve，elution Volume）与Vo及Vi之间的关系可用下式表示： Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。 它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可改写成： 上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（最好有颜色以便于观察，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等）通过实际测量求出；Vi可由g·WR求得（g为干凝胶重，单位为克；WR为凝胶的“吸水量”，以毫升/克表示）。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实验得知某一物质的洗脱体积Ve，就可算出它的

蛋白质的分离纯化方法(参考资料)

蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最

001凝胶过滤层析实验中Sephadex的溶胀与回收保存

凝胶过滤层析实验中Sephadex 的溶胀与回收保存 王　璞,林　红,朱　滨 (北京大学基础医学院生物化学与分子生物学系,北京　100083) 摘　要:Sephadex (交联葡聚糖凝胶)是多糖类物质,尽管其结构、性能较稳定,但在压力、强酸、氧化 剂存在情况下,也会发生部分糖苷键水解,或凝胶交联结构受损。在使用过程中,或使用后处理、保存过程中,可能会因上述原因或情况发生而影响凝胶层析的分离效果。该文根据作者自己的工作经验,着重介绍了回收后的交联葡聚糖的干燥保存法,以提高交联葡聚糖的稳定性和重复使用率。关键词:交联葡聚糖凝胶;溶胀;脱水;干燥中图分类号:Q5233 文献标识码:B 文章编号:100224956(2006)022******* Methods About S welling,Recovery and Preservati on of Sephadex in Gel Filtrati on Chr o mat ography WANG Pu,L I N Hong,ZHU B in (Depart m ent of B i oche m istry and Molecular B i ol ogy,School of BasicM edical Sciences,Peking Uni 2 versity,Beijing 10083,China ) Abstract:Sephadex is a gr oup of highly s pecialized gelfiltrati on and chr omat ographic media which composed of mac 2r oscop ic beads synthetically derived fr om the polysaccharide,dextran .A lthough their structures and characters are relatively stable,the hydr olysis of glucosidic bond or structures failure of gel cr oss 2linkage will happen when Sepha 2dex is exposed in great p ressure,str ong acid and oxidants in the p r ocess of use,recovery and p reservati on .The effects of gel filtrati on will be decreased just on these conditi ons .I n this paper,the authors intr oduced a kind of avail 2able Sephadex recovery and p reservati on method 22dehydrating/drying method that could greatly i m p r ove the stability and repeat utilizati on of Sephadex . Key words:Sephadex;s welling;dehydrati on;drying 收稿日期:2005206202 作者简介:王　璞(1976—),北京市人,大专,实验技师1 凝胶过滤层析因其操作简便、操作条件温和, 不易引起生物样品变性失活,分离效果好而广泛应用于蛋白质、酶、核酸的分离纯化。具有分子筛效应的多孔性网状凝胶都可用作凝胶过滤层析的支持物。我们在本科生生化实验中选用了人工合成的SephadexG 250(交联葡聚糖凝胶)作为层析支持物来分离血红蛋白与DNP 2鱼精蛋白的混合物。交联葡聚糖是由多聚葡萄糖与环氧化氯丙烷通过交联反应制成的多孔网状凝胶,成品为细小的白色颗粒状粉末,由于含有大量羟基,使其具有很强的亲水性,能迅速在水或电解质溶液中溶胀,因此使用非常方便。但由于操作过程溶胀处理,层析时有一定压力洗脱,或偶有pH 变化,或接触氧化剂,使2OH 发生氧化,都会影响凝胶的结构、性能。针对 上述可能影响凝胶分离效果的几个环节,我们在实 际工作中,对凝胶的溶胀、回收和保存几个环节进行了部分改进,尤其是回收后的干燥保存法经济实用、应用效果好。 1　Sephadex G 250的溶胀 Sephadex 能耐受0.2mol/LNa OH 长时间处理和pH 中性下高压蒸煮。Sephadex 为干粉状,使用前 必须使其在水中充分溶胀,溶胀是否彻底会直接影 响蛋白质分离效果。 (1)室温溶胀法　取Sephadex G 250凝胶10g,置于烧杯中,加入新鲜的超纯水300m l,用玻璃搅棒轻轻搅匀,用封口膜密封,室温放置过夜,使其充分溶胀,第2天进行倾斜浮选,除去漂浮于水面的细小颗粒,备用。处理过程中应避免剧烈搅拌,以防止破坏凝胶结构。此法较温和,不易造成凝胶结构的改变,推荐使用。 (2)加热溶胀法　取Sephadex G 250凝胶10g,置于烧杯中,加入新鲜的超纯水300m l,于沸水浴 中国科技论文统计源期刊(中国科技核心期刊) 实　验　技　术　与　管　理EXPER I M ENT AL TECHNOLOGY AND MANAGE MENT Vol .23　No .2 FEB. 2006

分子生物学第二章习题

第2章蛋白质结构 一、名词解释 1．两性离子（dipolarion） 2．必需氨基酸（essential amino acid） 3．等电点(isoelectric point,pI) 4．稀有氨基酸(rare amino acid) 5．非蛋白质氨基酸(nonprotein amino acid) 6．构型(configuration) 7．蛋白质的一级结构(protein primary structure) 8．构象(conformation) 9．蛋白质的二级结构(protein secondary structure) 10．结构域(domain) 11．蛋白质的三级结构(protein tertiary structure) 12．氢键(hydrogen bond) 13．蛋白质的四级结构(protein quaternary structure) 14．离子键(ionic bond) 15．超二级结构(super-secondary structure) 16．疏水键(hydrophobic bond) 17．范德华力( van der Waals force) 18．盐析(salting out) 19．盐溶(salting in) 20．蛋白质的变性(denaturation) 21．蛋白质的复性(renaturation) 22．蛋白质的沉淀作用(precipitation) 23．凝胶电泳（gel electrophoresis） 24．层析（chromatography） 25．标准折叠单位 26．模体 二、填空 1．蛋白质多肽链中的肽键是通过一个氨基酸的_____基和另一氨基酸的_____基连接而形成的。 2．大多数蛋白质中氮的含量较恒定，平均为___%，如测得1克样品含氮量为10mg,则蛋白质含量为____%。3．在20种氨基酸中，酸性氨基酸有_________和________2种，具有羟基的氨基酸是________和_________，能形成二硫键的氨基酸是__________. 4．蛋白质中的_________、___________和__________3种氨基酸具有紫外吸收特性，因而使蛋白质在280nm

生化习题 汇总

第一章 一、单选题 1、现有一混合的蛋白质溶液，各种蛋白质的pI分别为4.,5，5.0,5.2,6.5,7.4。预使该混合蛋 白质电泳时有3种蛋白质向正极移动，缓冲液的pH应该是（） A、4.0 B、5.0 C、6.0 D、7.0 E、8.0 2、下列测定蛋白质含量的方法中哪一种方法需要完整的肽键？（） A、凯氏定氮法 B、紫外吸收法 C、茚三酮反应 D、双缩脲法 E、考马斯亮蓝法 3、具有四级结构蛋白质的特征是（） A、分子中必须含有辅基； B、含有两条或两条以上的肽链； C、每条多肽链都有独立的生物学功能； D、依赖肽键维系蛋白质分子的稳定； E、以上都不对。 4、下列哪一种关于蛋白质结构的说法描述是错误的（） A、都有一级结构 B、都有二级结构 C、都有三级结构 D、都有四级结构 E、二级及三级以上的结构称为空间结构 5、下列关于蛋白质变性的描述中错误的是（） A、分子量变小 B、氢键断裂 C、亚基解聚 D、生物学活性丧失 E、疏水作用的破坏 6、蛋白质的氧结合曲线是（） A、双曲线 B、抛物线 C、S型曲线 D、直线 E、不能确定 7、丝心蛋白的主要构象形式是（） A、α-螺旋 B、β-折叠 C、β-转角 D、无规卷曲 E、以上都有 8、维持蛋白质二级结构的主要化学键是（） A、疏水相互作用 B、氢键 C、盐键 D、二硫键 E、范德华力 9、依据蛋白质元素组成的特点测定蛋白质含量的方法是（） A、凯氏定氮法 B、紫外吸收法 C、茚三酮反应 D、双缩脲法 E、考马斯亮蓝法 10、下列哪一种氨基酸属于酸性氨基酸（） A、赖氨酸 B、甘氨酸 C、半胱氨酸 D、丝氨酸 E、天冬氨酸 11、下列不属于二级结构主要形式的是（） A、α-螺旋 B、β-折叠 C、结构域 D、无规卷曲 E、β-转角 12、在一个肽平面中含有的原子数为（） A、3 B、4 C、5 D、6 E、7 13、从根本上来说镰刀型细胞贫血症是蛋白质（）改变的结果。 A、一级结构； B、二级结构； C、三级结构； D、四级结构； E、以上都不对。 14、下列关于蛋白质结构叙述中,不正确的是（） A、α-螺旋是二级结构的一种； B、.无规卷曲是在一级结构基础上形成的； C、只有二、三级结构才能决定四级结构； D、一级结构决定二、三级结构； E、三级结构即具有空间构象。 15、利用不同蛋白质所带电荷不同来分离混合蛋白质的层析技术是（） A、吸附层析； B、离子交换层析； C.凝胶过滤层析； D、亲和层析； E、分配层析。 16、关于蛋白质变构效应的描述,下列哪一项是错误的?（） A、氧对血红蛋白的作用属于正协同效应； B、氧对血红蛋白的作用属于负协同效应； C、氧与血红蛋白结合呈S型曲线； D、蛋白质变构是生物体内重要的代谢调节方式之一； E、氧是血红蛋白的变构剂。

10、凝胶层析(分子筛层析)分离蛋白质

实验十一凝胶层析法测定蛋白质分子量 实验目的：了解凝胶层析的原理及其操作，分离血红蛋白和胰蛋白酶（或蓝葡聚糖2000）。 实验原理： 凝胶层析也成凝胶过滤法，排阻层析、分子筛层析或渗透层析等是20世纪60年代发展起来的一种简便有效的生物化学分离分析方法。这种方法的基本原理是用一般的柱层析方法使相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使物质分离。 用作凝胶的材料有多种，如交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯和多孔玻璃珠等。以交联葡聚糖分离物质和测定相对分子量为例说明凝胶层析法的基本原理和应用。 交联葡聚糖（Sephadex）是由细菌葡聚糖（以右旋葡萄糖为残基的多糖）用交联剂环氧氯丙烷交联形成的有三维空间的网状结构物。控制葡聚糖和交联剂的配比及反应条件就可决定其交联度的大小（交联度大，“网眼”就小），从而得到各种规格的交联葡聚糖，即不同型号的凝胶。“G”表示交联度，G越小，交联度越大，吸水量也就越小，见表3-3（P.41.）。G值越小，颗粒比较硬，G值越大，颗粒相比较软些（可以以手感触）。G值也对应凝胶的工作范围。 凝胶层析广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等，而测定蛋白质的分子量也是它的重要应用之一。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近于球形）具有不同的排阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，洗脱时，此类物质沿着颗粒间隙下移，最先流出层析柱（板书：图3-14，3-15A）。而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，在凝胶颗粒的网孔内滞留的时间越长，结果是小分子的蛋白质洗脱速度较慢，即洗脱体积较大，最后流出柱外。不同一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。不同分子质量蛋白质的洗脱体积也不相同，通过部分收集器可以将它们收集在不同的洗脱组分中。Spladex G-10到G-50通常用于分离肽或脱盐。G-75到G-200可用于分离相对分子质量大于10000的蛋白质。

凝胶过滤层析分离纯化蛋白质

凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质 一、实验目的 1. 了解凝胶层析的原理及其应用。 2. 掌握利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能 二、实验原理 凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。 凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo) 在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。 Ve（洗脱体积）为某一成分从加入样品算起，到组分的最大浓度（峰）出现时所流出的体积。Ve随溶质的相对分子质量的大小和对凝胶的吸附等因素而不同。一般相对分子质量较小的溶质，它的Ve值比相对分子量较大的溶质要大。通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。Vo为层析柱内凝胶颗粒之间隙的总容积，称外水体积。Vi为层析柱内凝胶内部微孔的总容积，称内水体积，Vi=Vt-Vo。测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。 K av是判断分离效果的一个重要参数。当某种成分的K av=0时，意味着这一成分完全被排阻于凝胶颗粒的微孔之外而最先被洗脱出来，即Ve=Vo。当某种成分的K av=1时，意味着这一成分完全不被排阻，它可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，而最后被洗脱出来，即Ve=Vt。介于两者分子量之间的物质，其0﹤K av﹤1，在中间位置被洗脱。可见，K av 的大小顺序决定了被分离物质流出层析柱的顺序。 本实验采用葡聚糖凝胶G－75作固相载体，可分离分子量范围在2000～70000之间的多肽与蛋白质。上样样品为牛血清蛋白（M.W.=67000）和溶菌酶(M.W.=14300)的混合溶液。当混合液流经层析柱时，两种物质因K av值不同而被分离。 三、仪器与试剂 1.器材：层析柱、恒流泵、自动部分收集器、紫外检测器、记录仪、量筒、烧杯、试管、吸管、玻璃棒等。 2.试剂 （1）标准蛋白 a.牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所） b.溶菌酶：Mw =14,300 （2）洗脱液：0.9% NaCl溶液

生化选择题汇总

第一章1、现有一混合的蛋白质溶液，各种蛋白质的pI分别为4.,5，5.0,5.2,6.5,7.4。预使该混合蛋白质电泳时有3种蛋白质向正极移动，缓冲液的pH应该是（） A、4.0 B、5.0 C、6.0 D、7.0 E、8.0 2、下列测定蛋白质含量的方法中哪一种方法需要完整的肽键？（） A、凯氏定氮法 B、紫外吸收法 C、茚三酮反应 D、双缩脲法 E、考马斯亮蓝法 3、具有四级结构蛋白质的特征是（） A、分子中必须含有辅基； B、含有两条或两条以上的肽链； C、每条多肽链都有独立的生物学功能； D、依赖肽键维系蛋白质分子的稳定； E、以上都不对。 4、下列哪一种关于蛋白质结构的说法描述是错误的（） A、都有一级结构 B、都有二级结构 C、都有三级结构 D、都有四级结构 E、二级及三级以上的结构称为空间结构 5、下列关于蛋白质变性的描述中错误的是（） A、分子量变小 B、氢键断裂 C、亚基解聚 D、生物学活性丧失 E、疏水作用的破坏 6、蛋白质的氧结合曲线是（） A、双曲线 B、抛物线 C、S型曲线 D、直线 E、不能确定 7、丝心蛋白的主要构象形式是（） A、α-螺旋 B、β-折叠 C、β-转角 D、无规卷曲 E、以上都有 8、维持蛋白质二级结构的主要化学键是（） A、疏水相互作用 B、氢键 C、盐键 D、二硫键 E、范德华力 9、依据蛋白质元素组成的特点测定蛋白质含量的方法是（） A、凯氏定氮法 B、紫外吸收法 C、茚三酮反应 D、双缩脲法 E、考马斯亮蓝法 10、下列哪一种氨基酸属于酸性氨基酸（） A、赖氨酸 B、甘氨酸 C、半胱氨酸 D、丝氨酸 E、天冬氨酸 11、下列不属于二级结构主要形式的是（） A、α-螺旋 B、β-折叠 C、结构域 D、无规卷曲 E、β-转角 12、在一个肽平面中含有的原子数为（） A、3 B、4 C、5 D、6 E、7 13、从根本上来说镰刀型细胞贫血症是蛋白质（）改变的结果。 A、一级结构； B、二级结构； C、三级结构； D、四级结构； E、以上都不对。 14、下列关于蛋白质结构叙述中,不正确的是（） A、α-螺旋是二级结构的一种； B、.无规卷曲是在一级结构基础上形成的； C、只有二、三级结构才能决定四级结构； D、一级结构决定二、三级结构； E、三级结构即具有空间构象。 15、利用不同蛋白质所带电荷不同来分离混合蛋白质的层析技术是（） A、吸附层析； B、离子交换层析； C.凝胶过滤层析； D、亲和层析； E、分配层析。 16、关于蛋白质变构效应的描述,下列哪一项是错误的?（） A、氧对血红蛋白的作用属于正协同效应； B、氧对血红蛋白的作用属于负协同效应； C、氧与血红蛋白结合呈S型曲线； D、蛋白质变构是生物体内重要的代谢调节方式之一； E、氧是血红蛋白的变构剂。 17、关于β-折叠的叙述哪项是正确的？（） A、β-角蛋白具有典型的β-折叠结构； B、两个相邻的肽键平面呈摺扇式折叠； C、β-折叠是一种较伸展的肽链结构； D、肽链间肽键平面上的N-H与C=O形成氢键；

蛋白纯化方法—凝胶过滤色谱

活性蛋白整体方案 凝胶过滤色谱 摘要：本文主要讲解了凝胶过滤色谱法（分子筛）在蛋白纯化实验中的应用，包括纯化原理、实验方案设计、技术操作以及相关案例介绍和问题分析。 基本原理 凝胶过滤色谱蛋白纯化法，又称为空间排阻色谱，分子筛等。其原理是应用蛋白质分子量或分子形状的差异来分离。当样品从色谱柱的顶端向下运动时，大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒从而被迅速洗脱；而较小的蛋白质分子能够进入凝胶颗粒中，且进入凝胶的蛋白在凝胶中保留时间也不同，分子量越大，流出时间就越早，最终分离分子大小不同的蛋白质。 凝胶过滤色谱原理 通常，多数凝胶基质是化学交联的聚合物分子制备的，交联程度决定凝胶颗粒的孔径。常用的色谱基质有：葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖凝胶（Sepharose）、聚丙烯酰氨凝胶（Bio-Gel P）等。高度交联的基质可用来分离蛋白质和其他分子量更小的分子，或是除去低分子量缓冲液成分和盐，而较大孔径的凝胶可用于蛋白质分子之间的分离。选用合适孔径的凝胶很大程度取决于目标蛋白的分子量和杂蛋白的分子量。 实验方案设计 1.凝胶介质的选择 凝胶介质的选择主要是根据待分离的蛋白和杂蛋白的分子量选择具有相应分离范围的凝胶，同时还需要考虑到分辨率和稳定性的因素。比如，如果是要将目的蛋白和小分子物质分开，可以根据他们分配系数的差异，选用Sephadex G-25和G-50；对于小肽和低分子量物质的脱盐，则可以选用Sephadex G-10、G-15以及Bio-Gel P-2或P-4；如果

活性蛋白整体方案 是分子量相近的蛋白质，一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。具体凝胶过滤色谱介质应用如下： 常用凝胶过滤色谱介质的分离范围 凝胶介质蛋白质的分离范围/103凝胶介质蛋白质的分离范围/103 Sephadex G25 Sephadex G50 Sephadex G100 Sephadex G200 Sepharose6B Sepharose4B 1~5 1.5~30 4~150 5~600 10~4000 60~20000 Sepharose2B Bio-Gel P-4 Bio-Gel P-10 Bio-Gel P-60 Bio-Gel P-150 Bio-Gel P-300 70~40000 0.5~4 5~17 30~70 50~150 100~400 2.凝胶介质的预处理 凝胶在使用前应用水充分溶胀（胶：水=1：10），自然溶胀的耗时较长，可采用加热的方法使溶胀加速，即在沸水浴中将凝胶升温至沸，1~2h即可达到溶胀。在烧杯中将干燥凝胶加水或缓冲液，搅拌，静置，倾去上层混悬液，除去上清液中的凝胶碎块，重复数次，直到上清澄清为止。 3.色谱柱的选择 色谱柱的体积和高径比与色谱分离效果密切相关，凝胶柱床的体积、柱长和柱的直径以及柱比的选择必须根据样品的数量，性质和分离目的进行确定。组别分离时，大多采用2~30cm长的色谱柱，柱床体积为样品溶液体积的5倍以上，柱比一般在5~10之间；而分级分离一般需要100cm左右的色谱柱，并要求柱床体积大于样品体积25倍以上，柱比在20~100之间。 4.凝胶柱的填装 凝胶色谱柱与其它色谱方法不同，溶质分子与固定相之间没有力的作用，样品组分的分离完全依赖于他们各自的流速差异。装住时关住柱子下口，在柱内加入约1/3柱床体积的水或缓冲液，然后沿着柱子一侧将缓冲液中的凝胶搅拌均匀，缓慢并连续的一次性注入柱内。待凝胶沉积约5厘米左右时，打开柱子下口，控制流速在1ml/min。 5.样品的处理与上样 根据样品的类型和纯化分析，需要选择合适的缓冲液，为了达到良好的分析效果，上样量必须保持在较小的体积，一般为柱床体积的1%~5%，蛋白质样品上样前应进行浓缩，使样品浓度不大于4%（样品浓度与分配系数无关），但需要注意的是，较大分子量的物质，溶液粘度会随浓度增加而增大，使分子运动受限，影响流速。上样前，样品要经滤膜过滤或离心，除去可能堵塞色谱柱的杂质。 6.洗脱与收集 凝胶过滤色谱的缓冲液用单一缓冲液或含盐缓冲液作为洗脱液即可，主要考虑俩个方面的原因：蛋白的溶解性和稳

浅谈层析法分离蛋白质

浅谈凝胶柱层析分离蛋白质 根据对生物产物分离工程的学习及所做的相关实验，我对这方面的知识有了粗浅的认识。根据所学知识我发现生物产物分离的方法多种多样，不同产物其分离方法不同，同种产物又有多种分离方法。就所做的实验而言，我对层析法分离蛋白比较感兴趣。以下是我对这种方法的了解： 层析法是分离蛋白质通用的方法。其原理都是通过蛋白质在流动相和固定相之间的性质不同而达到分离的效果。层析法可分为纸层析法，凝胶过滤层析法，离子交换层析法等。凝胶过滤层析法最为常用，在分离蛋白质时只需要把蛋白质混合液加到凝胶珠的上部，并加少许洗脱液来产生一定的液压是蛋白质能向下运动，在凝胶柱底部用试管接流下来的蛋白质液体，进行比色。此种方法很简单，不需要贵重仪器，但分离的蛋白质不是很好，这些液体仍然是很多蛋白质的混合液，通过比色来确定目的蛋白含量的最高值。这种方法只能对蛋白质进行一些粗筛。 近期做了一个实验应用到了凝胶层析即凝胶柱层析分离蛋白质，这个实验主要是运用凝胶层析分离蓝色葡聚糖2000kb和牛徐清蛋白的。这个实验应注意：1、装柱时要注意凝胶的流速，不宜过快，同时要保证凝胶能充分的沉淀且分布的比较均匀; 2、凝胶溶胀所用的溶液应与洗脱用的溶液相同，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响分离效果; 3、样品的浓度和加样量的多少。是影响分离效果的重要因素。样品浓度应适当大，但大分子物质的浓度大时，溶液的黏度也随之变大，会影响分离效果，要兼顾浓度与黏度两方面。加样量和加样体积越少分离效果越好，加样量一般为柱床体积的1%-2%，制备用量一般为柱床体积的20%-30%；4、凝胶用完后可再加入防腐剂低温保存；5、叠氮钠属于

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量

实验六报告： SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量 1.研究背景及目的 根据自然界中普遍存在的电泳现象，以及实践应用的需求，科学家不断完善了电泳技术，从移界电泳法、垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳、垂直柱型盘状电泳到水平板型电泳。电泳技术广泛地应用于样品的分析鉴定。蛋白质分子量的测定在理论和实践中具有很重要的意义，比如临床中对于尿液中蛋白质分子量的测定可以监测人体内的某些疾病（肾小管损坏、多发性骨髓瘤等）。这种需要促进了相关技术的发明。具体过程见原理。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。从活性电泳到变性电泳经过了很多思考。从活性如果加入一种试剂使电荷因素及分子的形状消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。 1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用[1] 。 通过向样品中添加入巯基乙醇和过量SDS，使蛋白质变性解聚，并让SDS与蛋白质结合成 带强负电荷的复合物，掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异。SDS与蛋白质分子结合，不仅 使蛋白质分子带上大量的负电荷，而且使蛋白质分子的形状都变成短棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有的电荷差异和分子形状的差异。因此蛋白质在SDS-PAGE中的时迁移率 主要取于其分子大小。由于SDS与蛋白质的结合，电泳迁移率在外界条件固定的情况下，只取决于蛋白质分子量大小这一因素，使得SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、重复性好等特性，因此广泛应用于未知蛋白质分子量测定。通过本次实验，学习和掌握垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法，进一步学习和应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量。 2.原理 由于技术的发展，理论上可以通过测序测出蛋白质分子量的真值，但是实际操作过于繁琐，且生物大分子的数量级是KDa，实际中往往不需要特别精确。所以转向寻求其它方法，如果两种性质具有相关性，就会有相关理论基础和技术，发现分子量与迁移速率有关，于是寻找相关方面的技术。通过沉降平衡法测定分子量，但是需要很大的转速，且要考虑安全性和造价，于是舍弃；分子筛层析主要以分子量差异进行分离，可以用来测定分子量，但是需要很长的分离柱，分离速度较慢，还要测定OD值，操作麻烦，浪费时间，而且带 来的经济效益也不是很大；与此同时，电泳技术也发展起来，电泳相对时间较短，造价低，可操作性强。电泳与分子量、分子形状以及所带电荷量有关，其中含有分子量，理论上就可行了，于是用电泳测定分子量。首要矛盾是消除电荷差异和分子形状差异，从数学上彻底消除电荷效应是不可能的，使带电量相同也不可能实现，只有使分子带上非常大的电荷量从而使分子间的电荷差异可以忽略。想到通过引入外来物形成复合物，定量引入，定量结合，且结合后分子间差异并未发生改变。关于引入负电还是引入正电的问题，蛋白大多为球状，若结合后仍未球状，静电结合不稳定；双亲性物质彻底结合后破坏空间结构，所以引入负电，结合稳定。于是开始筛选阴离子去污剂，在众多的物质试验中，发现十二烷基硫酸钠（SDS）具有很好的效果。SDS通常与蛋白质以1.4:1的重量比结合，所引入净电 荷量约为蛋白质本身静电荷 10倍的静电荷，从而形成具有均一电荷密度和相同荷质比的SDS-蛋白质复合物，该复合物所带的电荷远远超过蛋白质原有的净电荷，从而消除或大大降低不同蛋白质之间所带净电荷

生化实验报告 实验5 血红蛋白凝胶过滤

实验报告 课程名称：生化实验B 实验日期： 班级：姓名学号： 血红蛋白凝胶过滤 一、背景及目的 血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。存在于脊椎动物、某些无脊椎动物血液和豆科植物根瘤中。人体内的血红蛋白由两个α亚基和两个β亚基组成。每个亚基均成球状，内部有一个血红素。 血红素上的亚铁离子可以可逆的与氧分子结合，起到运输氧气的作用。当携带氧气时，血红蛋白呈鲜红色，无氧时为暗红色。 凝胶过滤法又称凝胶排阻层析或分子筛层析，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。1凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。 影响分离效果的因素主要有以下几点：1.基质的颗粒大小、均匀度 2.筛孔直径和床体积的大小 3.洗脱液的流速 4.样品的种类等， 5.缓冲液的pH 6.而最直接的影响是Kav 值的差异性，Kav 值差异性大，分离效果好；Kav 值差异性小，则分离效 果很差，或根本不能分开。 影响凝胶过滤的因素主要有： 1、层析柱的选择：长的层析柱分辨率要比短的高，但层析柱长度不能过长。 2、加样量：加样过多，会造成洗脱峰的重叠；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低。 3、凝胶柱的鉴定：凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。 4、洗脱速度：洗脱速度应保持适中。 目前凝胶过滤技术的应用主要是以下几点： 1、脱盐 2、用于分离提纯 3、测定高分子物质的分子量 4、高分子溶液的浓缩 5、蛋白质的复 性 二、实验原理 层析法是基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。按操作形式可以划分为：柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析等。按流动相与固定相的不同划分：气相层析、液相层析。按层析的机理可以划分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。2 凝胶过滤是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱，大分子不能进入凝胶颗粒的静止相中，只能在凝胶颗粒间随流动相移动，因而可以被较快洗出，而小分子则能够自由进出凝胶颗粒，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此需要花费较长时间流经柱床，从而使不同大小的分子得到分离。 本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入FeSO4溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即被还原为紫红色的亚铁血红蛋白。亚铁血红蛋白继续下移，与缓冲液溶解的O2结合，形成鲜红色的氧合血红蛋白。铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄色带远远地落在后边。这样，就可以形 1百度百科凝胶过滤层析https://www.wendangku.net/doc/8b15657992.html,/view/81744.htm 2百度百科层析https://www.wendangku.net/doc/8b15657992.html,/view/15375.htm#2