胚胎干细胞

1. 干细胞(stem cell)：

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。

2.干细胞分类

(1)胚胎干细胞：指胚胎早期的干细胞。这类干细胞分化潜能宽，具有分化为机体任何组织细胞的能力。如囊胚期内细胞团的细胞。

(2)成体干细胞：指成体各组织器官中的干细胞，成体干细胞具有自我更新能力，但分化潜能窄，只能分化为相应(或相邻)组织器官组成的细胞。如神经干细胞，表皮干细胞。

第一节干细胞生物学

1. 组织自体稳定性：

特定组织通过使自身细胞死亡和增生的方式保持组织细胞数量动态平衡的特征称组织自稳定性。

2. 干细胞是个体发育和组织再生的基础。

一、干细胞的形态和生化特征

1．干细胞的形态特征

①干细胞形态共性：细胞呈圆形或卵圆形，体积小，核质比大，增殖力强。

②干细胞的固定组织位置：有的干细胞有固定存在部位与方式。如表皮干细胞与其周围的子细胞形成增殖结构单元。但许多组织的干细胞没有这种分布特点。

2．干细胞的生化特性

①端粒酶活性高：如造血干细胞具癌细胞的端粒酶活性，增殖能力强。随着增殖与分化，端粒酶活性下降。

②蛋白标志分子：不同干细胞有各异的蛋白质标志分子，可作为确定干细胞位置、分离提纯干细胞的标志。如：巢素蛋白—神经干细胞；角蛋白15—表皮干细胞。

二、干细胞的增殖特征

（一）增殖缓慢性

1．干细胞增殖速度慢：细胞动力学研究表明，干细胞的增殖速度较慢，组织中快速分裂的细胞是过渡放大细胞。

如小肠干细胞的分裂速度(Tc=11小时)比过渡放大细胞(Tc≥24小时)慢一倍。

2．过渡放大细胞：

过渡放大细胞是介于干细胞和分化细胞之间的过渡细胞，过渡放大细胞经若干次分裂产生分化细胞。

通过这种方式，机体可用较少干细胞获得较多分化细胞。

3．干细胞增殖缓慢的意义：

(1)利于干细胞对外界信号作出反应，以决定细胞的发展方向—增殖或分化。

(2)减少基因突变的危险。增殖缓慢使干细胞有时间发现并纠正处于增殖周期过程中的错误。（二）干细胞的自稳定性

1．自稳定性：

自稳定性是干细胞的基本特征之一。指干细胞可在个体生命过程中自我更新并维持其自身数目恒定。

干细胞的自稳定性是区别肿瘤细胞的本质特征。

干细胞通过其特有的分裂方式维持自稳定性。

2．干细胞的分裂方式

①干细胞有对称与不对称两种分裂方式。

不对称分裂的结果使两个子细胞一个成为功能专一的分化细胞；另一个保持干细胞的特征。

3. 不对称分裂发生原因：

①系列基因调控。

②细胞质物质不均等分配。

4．无脊椎动物通过不对称分裂维持自稳定性。

如：果蝇的Insc基因是感官前体细胞的不对称分裂的调控基因之一，通过三个途径进行调控：

不对称分配质膜上的细胞定向决定因子。

不对称分配细胞内的mRNA。

决定细胞分裂时纺锤体的取向。

5．哺乳动物的种群不对称分裂。

(1)种群不对称分裂：

哺乳动物有几种不同的干细胞群，分裂后产生不同细胞。

(2)哺乳动物种群不对称分裂的意义：

①使机体对干细胞的调控更灵活，以适应机体的生理变化。

②要求机体对干细胞分裂的调控更精确，以保持干细胞数目恒定。

如：正常肠腺有250个细胞组成，如果额外多一个干细胞，则可能多产生64~128个子代细胞。

(3)哺乳动物种群不对称分裂的调控。

哺乳动物通过多层次多角度调控，保持自稳定性。

正调控：促进与细胞增殖、生存有关的基因表达。

负调控：促进与细胞凋亡有关的基因表达。

如转基因小鼠长期造血干细胞高表达Bcl-2后，使长期造血干细胞的数目显著增加。说明细胞凋亡也是干细胞的调控方式。

三、干细胞的分化特征

（一）干细胞的分化潜能

根据其分化潜能大小，干细胞可分为三类。

1．全能性干细胞(胚胎干细胞)：

具有形成完整个体的分化潜能。

如胚胎干细胞(ES)具有很强的分化能力，可无限增殖并分化为全身200多种细胞类型，及机体的各种组织、器官。

(图全能干细胞)

2．多能性干细胞：

多能干细胞具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力。

如骨髓多能造血干细胞，它可分化出至少十二种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它细胞。(图多能干细胞)

3．专能性干细胞(成体干细胞)：

专能干细胞(也称单能、偏能干细胞)，这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。

如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞(卫星细胞)。(图，表皮干细胞)

(二)干细胞的转分化和去分化

1．干细胞的转分化：

一种组织类型的干细胞在适当条件下分化为另一种组织类型的细胞的过程称干细胞的转分化。

实验：C57BL/6J♂成年小鼠造血干细胞WBB6F/J-KitW/KitW-V♀鼠(亚致死剂量同位素照射) 在♀鼠的神经胶质细胞中检测到Y染色体.

即♂鼠的造血干细胞移植到♀鼠中分化为脑星形胶质细胞。

2．干细胞去分化：

一种干细胞向其前体细胞的逆向转化称干细胞去分化。

实验：

成体鼠造血干细胞鼠卵泡的内细胞团表达胎鼠的珠蛋白基因→参与胚胎造血系统的发育。

3. 干细胞的可塑性

(1)干细胞的横向分化：

在干细胞移植时，供体干细胞在受体中通常分化为与其组织来源一致的细胞。但有时供体干细胞会分化出与其组织来源不一致的其它细胞，这种现象称干细胞横向分化(trans-differentiation)。

干细胞横向分化表明成体干细胞被移植入受体中具有很强的可塑性。为干细胞治疗提供了可能。

(2)实验：

小鼠肌肉干细胞→体外培养5天＋少量骨髓间质细胞接受致死量辐射的小鼠中各种血细胞系。

(3)横向分化的调控机制：

与干细胞的微环境有关。

干细胞进入新的微环境后，对分化信号的反应受到周围正在进行分化细胞的影响，从而对新的微环境中的调节信号做出反应。

四、干细胞增殖与分化的微环境

干细胞巢(stem cell nich)：干细胞在组织中的居所。

干细胞生存的微环境：

指干细胞巢中控制干细胞增殖与分化的外部信号。

如：

这些物质可以介导干细胞-干细胞的相互作用，以及细胞与细胞外基质的作用，影响干细胞的增殖和分化。

（一）分泌因子

分泌因子是由细胞自分泌或旁分泌的生长因子，有的分泌因子对维持干细胞的增殖，分化和存活具有调节作用。

如转化生长因子-β和Wnt家族的成员，在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用。1．转化生长因子β

TGFβ(transforming growth factorβ)是TGFβ超家族的成员之一，具有调节细胞生长和分化的作用。

因为TGFβ能使正常成纤维细胞的表型发生转化，即在EGF同时存在时，改变成纤维细胞贴壁生长特性而获得在琼脂中生长的能力，并失去密度依赖的抑制作用，故命名。

TGFβ的作用：

TGF-β对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用。一般对间充质起源的细胞起刺激作用，而对上皮或神经外胚层来源的细胞起抑制作用。

如TGF-β家族成员Dpp可维持果蝇雌性生殖干细胞的增殖。

2．Wnt家族的分泌信号分子

(1)Wnt基因：

Wnt基因最初是在小鼠乳腺癌克隆出来的原癌基因，因病毒基因在其旁边插入可激活该基因，称为Int基因，后发现其与果蝇的无翅基因(Wingless,wg)高度同源，故合称为Wnt基因。

(2)Wnt信号分子：

是Wnt基因编码的长度为350~400个氨基酸的分泌型糖蛋白。它与细胞表面及细胞外基质有联系，在小范围内(几个细胞直径)起信使的作用。

(3)Wnt信号途径：

是由Wnt参与的将信号由细胞表面传至细胞核内的信号传导途径。

主要包括Wnt信号蛋白，跨膜受体(Frizzled)，辅受体LRP(低密度脂蛋白受体有关的跨膜蛋白)、Dishevelled、糖原合成酶激酶3(GSK3)、APC、Axin、β-连环蛋白及T细胞因子/淋巴结增强因子(TCF/LEF)家族转录调节因子等。

(4)Wnt信号途径的作用：

在生物的正常发育中起重要作用，是组织发育、分化所必需的关键信号通路。

(5)Wnt信号途径的作用机理：

通过TCF/LEF和β-cat对C-myc的表达进行调控，即Wnt通路的靶基因为c-myc。

TCF/LEF是Wnt信号通路的中间介质，可与β-连环蛋白(β-catenin，β-cat)结合成复合物，将β-catenin由胞浆→核内。

β-cat是Wnt信号通路中最重要的信号分子。β-cat具有两种功能：细胞粘附及信号转导，其C-端参入信号转导，N-端参入细胞粘附。

正常情况下，APC、GSK-3β、Axin等调节下，胞浆内β-catenin处于平衡状态；

当Wnt因子与其受体结合，Wnt信号传导使GSK3被抑制，使β-catenin不能正常水解而积累，过量的β-catenin与Lef/Tcf结合并入核，与DNA结合蛋白Tcf3结合，激活c-myc、cyclinD1等基因转录，促进细胞增殖分化。

如Tcf/Lef转录因子家族对上皮干细胞的分化：

Tcf/Lef与β-Catenin形成转录复合物后，促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。（二）受体介导的细胞-细胞

相互作用

如果蝇的Notch基因产物Notch受体。Notch的配体为Delta基因产物，两者均为细胞表面跨膜蛋白。两者结合后在果蝇刚毛器的发育中起调节作用的蛋白质。(图，果蝇刚毛) Notch受体

果蝇的每个刚毛器由一个神经前体细胞发育成，而神经前体细胞又是从含多个神经原细胞的细胞群分化出来的，这种有选择地发育过程，依赖于Notch和Delta的基因调节。

Notch与其配体Delta结合后，通过细胞间相互作用，向细胞核传递抑制信号，对相邻细胞侧向抑制，只使某个神经原细胞获得较强的竞争能力，被选择发育为神经前体细胞。

即当Notch与其配体结合时，干细胞进行非分化性增殖；当Notch活性被抑制时，干细胞进入分化程序，发育为功能细胞。

(三) 胞间基质和整合素

1.胞间基质：即细胞外基质，指分布于细胞外空间，由细胞分泌蛋白和多糖构成的网络结构。

2.作用：细胞外基质可以将细胞粘连在一起，同时还提供一个细胞外网架维持组织结构，通过结合与传递信号分子对细胞存活、增殖、分化、迁移等具有重要影响。

3.细胞外基质的种类：

(1) 胶原

胶原是细胞外基质中的主要框架结构。

目前发现的胶原至少19种。每种胶原的结构特性均与其特定功能相适应。可形成胶原纤维(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型)、三维网络结构(Ⅳ型)的片层胶原。

胶原是构成基底膜的主要成分之一，并与细胞基质中的其它成分一起构成结构与功能的统一体。为干细胞生存及生命活动提供微环境。

(2) 层粘连蛋白(laminin，LN)

层粘连蛋白是基膜的主要功能成分。也是胚胎发育中出现最早的细胞基质成分。

在成体，它存在于上皮下和内皮下紧靠细胞的基底，以及肌细胞和脂肪细胞周围等。

层粘连蛋白的功能：

作为基膜的主要结构成分，促进基膜组装，介导细胞粘着胶原进而铺展，促进生长增殖；诱导细胞分化，是个体发生中出现最早的细胞基质。如成肌细胞分化为肌细胞、间质细胞分化为肾细胞、上皮细胞等。

(3)纤粘连蛋白(fibronectin，FN)

纤粘连蛋白分血浆FN和细胞FN。

血浆FN存在于血浆及各种体液中；

细胞FN存在于细胞外基质(包括某些基膜)及细胞表面。

细胞FN为多聚体，有20种以上。是同一基因的编码产物，转录后由于RNA拼接不同形成多种异型分子，拼接方式依细胞类型及发育状态而定，从而使细胞产生适合组织需要的FN 形式。

即细胞通过控制FN RNA的拼接方式，使其与不同细胞结合及产生特异效应。

FN的功能：主要是介导细胞粘着，以此调节细胞形状和细胞骨架的组装，促进细胞铺展、迁移，并可通过迁移途径决定细胞的分化方向。

如沿富含FN途径迁移的神经脊细胞最终分化为肾上素能神经元，形成神经节。。

4.整合素

(1)是一种通过识别并结合相邻细胞的粘附分子和细胞外基质成分，介导细胞-细胞以及细胞-细胞外基质间的相互作用的受体蛋白质。属于细胞粘连分子。

(2)整合素对干细胞的作用：是促进干细胞的非分化增殖。

(3) 作用机理：

①作为细胞外基质的受体，与配体结合后，启动胞内信号传递的连锁反应，最终影响基因表达，为促进干细胞的非分化增殖提供微环境。

②将干细胞置于组织中的正确位置，使干细胞维持非分化性增殖。

整合素是由α和β两个亚单位形成异二聚体。已发现有16种α和9种β亚单位，可组合成20余种整合素。

与细胞外基质成分结合的整合素主要以β1与9种α亚单位分别构成的异二聚体。

如当β1丧失功能时，上皮干细胞脱离微环境制约，分化成角质细胞。

即细胞外基质通过调节β1整合素的表达和激活，影响干细胞的分布和分化方向。

(4)整合素对干细胞的影响作用过程：

需2步：

一是整合素活化；

二是活化的整合素作用于干细胞。

①整合素活化：

整合素通常不与配体结合，需要经过活化。活化因素是外部信号的刺激，活化过程为胞内信号外传过程。

②整合素对细胞的作用：

作用过程为胞外信号内传：

整合素活化后与配体(如纤粘连蛋白)结合

细胞内→细胞发生反应。

如粘着斑蛋白与骨架系统的组装，激酶磷酸化等，使细胞发生分泌、增殖、分化、迁移等。活化的整合素又可失活，使粘附的细胞彼此脱离。

即整合素通过与细胞外基质的弱结合，使细胞在不脱离粘附的情况下根据微环境，通过可逆性的结合与解离进行细胞迁移。

第二节胚胎干细胞

1．胚胎干细胞：

从囊胚期(受精后5~7天)胚胎分离到的干细胞称胚胎干细胞。

2．胚胎干细胞的特性：

为全能性干细胞。有如下特性：

3．胚胎干细胞的研究价值：

是发育生物学基础研究的理想模型和有效工具。(图，胚胎干细胞的应用)

一、人胚胎干细胞的获得

要研究胚胎干细胞，首先要获得胚胎干细胞。

(一)获得途径：主要有：

1．从早期胚胎获得

美国Thompson研究小组是从囊胚期胚胎的内细胞团中获得胚胎干细胞：

体外受精卵囊胚期去除滋养层→内细胞团得5株干细胞系 32代(8个月)保持未分化状态。

2．从原始生殖细胞获得

gearhart小组：

流产胎儿性腺嵴原始生殖细胞

获得5个多能干细胞系 7个月不分化。

(图，干细胞获得)

思路：原始生殖细胞是未分化细胞。

3．体细胞移植

分化细胞核(乳腺、皮肤细胞) 去核卵细胞→杂合细胞发育成囊胚

胚胎干细胞成体(如多利羊)。

(图，体细胞获得干细胞)

二、胚胎干细胞的主要特征

（一）形态和生化特征

1.形态：细胞体积小，核大，1~多个核仁。离体培养可产生密集的多细胞克隆。

2.生化特征：端粒酶活性高。

3.干细胞物理特性：

如干细胞对Hoechst33324和Rhodamine

123染料不着色。

4. 干细胞表面免疫原性：一般表达胚胎早期的表面抗原，而且有种属差异。

如小鼠胚胎干细胞表达胚胎阶段性特异抗原-1(SSEA-1)，不表达SSEA-3或SSEA-4；

人胚胎干细胞表达SSEA-3或SSEA-4。

(二)干细胞的分离与纯化

1. 借助细胞的生化特征及物理特性，采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中即可分离纯化干细胞。

2. 干细胞的理化特征与其分化调控有关，如上皮干细胞高表达β1整合素，介导干细胞与细胞外基质粘附，抑制干细胞分化。

(三)干细胞的体外培养

由于干细胞数目少，应用时需先在体外进行非分化性增殖，再进行诱导分化。

不同组织来源的干细胞的培养条件不尽相同。

1·培养条件：

需要许多生长因子和间质细胞的共培养。

如Brustle等在体外培养了鼠的ES细胞。

分离ES细胞培养培养

生长增殖保持分化潜能。

停止供给生长因子，ES细胞分化为寡树突细胞或星状细胞。

2·分化诱导

在应用前还需依据靶组织类型对培养干细胞进行定向分化诱导。

分化诱导需了解：

①干细胞发育有关的信号调节；

②干细胞发育的微环境。

（四）胚胎干细胞的分化潜能

胚胎干细胞是全能(多能)性干细胞，具有分化为各种组织细胞的潜能。

实验1：移植实验

人胚胎干细胞小鼠体内畸胎瘤(良性)→有三个胚层产生的组织：

三、胚胎干细胞研究的

伦理挑战

胚胎干细胞研究在伦理、道德和宗教方面遇到很大的障碍。

避孕、流产和体外授精在西方国家引起很大争议。

(一)存在的问题

1. 胚胎干细胞的来源是否符合法律与道德？

2.胚胎干细胞的应用是否会引起伦理及法律问题？

3.该项研究是否会导致人流泛滥？或导致医生刻意造成胚胎流产？

4.如何看待克隆人的研究？

（二）反对人的观点

1.认为胚胎干细胞研究破坏人类生命，其观念基于人类生命起始于早期胚胎。

2.天主教派极力反对胚胎干细胞研究，认为用人类胚胎干细胞进行研究是一种“邪恶”。

(三)支持者的观点

科学界和病人组织强烈呼吁政府支持这项研究。

2001年4月，James Watson博士(DNA双螺旋结构发明人、冷泉港实验室主任)倡导发起了由80位诺贝尔奖获得者参加的签名运动，呼吁政府支持干细胞研究。

(四)西方政府的态度

1．美国总统布什

(1)当选总统前反对，当选后出于政治目的，同意政府有限支持。

2001年8月9日，布什作出决定，美国政府资助对2001年8月9日前得到的人体胚胎干细胞研究，但不支持从新的胚胎中获取干细胞的研究。

(2)同时，布什提出成立一个由科学家、医生、伦理学家、律师、神学家等组成的总统生物伦理专家委员会，指导干细胞的研究和管理。由芝加哥大学生物伦理学教授Leon Kass担任主席。

2．美国国立卫生研究院(NIH)

(1)美国国立卫生研究院是美国联邦政府支持干细胞研究的主要机构。

(2)NIH的年度经费为204亿美元，2000年投入干细胞研究2.26亿美元，其中用于人体成年干细胞研究为1.41亿美元。

(3)根据布什的决定，NIH对现存人体胚胎干细胞系进行登记，认定世界上有64个人体胚胎

干细胞系符合联邦政府资助的标准。

(4)64个人体胚胎干细胞系分布在6个国家的10个机构中：瑞典24个，美国20个，印度10个，澳大利亚6个，以色列4个。

NIH试图用这些人体胚胎干细胞系完成有关人体胚胎干细胞的基础研究工作。

3．其他国家的态度

(1)德国禁止利用人体胚胎干细胞进行研究。

(2)澳大利亚开始仿效美国的作法，有限支持人体胚胎干细胞的研究。

(3)法国、英国、日本允许利用多余的胚胎和SCNT技术创造的胚胎进行干细胞研究。

第五节干细胞应用研究重点

一、移植研究—恢复器官功能

1．细胞治疗。

干细胞可恢复因重大疾病而损害的细胞，这是干细胞潜在的最大优势。

由于丧失正常细胞功能的疾病都可以通过移植由胚胎干细胞分化来的特异组织细胞来治疗。(图，干细胞及其应用)

如用神经细胞治疗神经变性疾病(帕金森氏综合征、享廷顿舞蹈症、老年痴呆症等)；

用胰岛细胞治疗糖尿病；

用心肌细胞修复坏死的心肌等。

因为成年人的心脏和胰岛几乎没有干细胞，无法靠自身得到修复。可以用人体胚胎干细胞能直接分化成相应细胞进行移植。

2．基因治疗。即通过胚胎干细胞和基因工程技术，矫正缺陷基因。

因干细胞能自我复制更新，是基因治疗的理想靶细胞。将治疗基因整合到干细胞，再将干细胞移植入人体中，能够持久地发挥作用，而不担心像分化的细胞那样，在细胞更新中可能丢失治疗基因的结果。

例如，对囊性纤维化病的治疗。

囊性纤维化病是一种基因缺陷遗传病，30岁以前致死。若在胚胎早期干细胞中将缺陷基因修正，再将修复后的胚胎干细胞嵌入胚胎中，将会生出一个健康的婴儿。

由于伦理和某些技术问题，现在还未展开此类实验。

二、基础研究

1．利用干细胞研究解释先天缺陷的产生原因和防治方法。

2．将发育生物学与干细胞生物学相关联，研究干细胞生长与分化的遗传控制与环境条件等，便于在实验室中进行干细胞的培养和分化。

三、癌症治疗

研究人员正试图设计多种方法，使特定细胞能击中特定癌细胞，直接破坏或改变癌细胞。

四、我国干细胞研究概况

1. 需要：我国人口多，需要干细胞移植治疗的疾病发病率与其他国家相同。

2. 迫切：我国家庭结构以独生子女为主，能提供具有相同或相关基因组织器官的可能性低，因此对干细胞及其衍生组织需求量大、迫切。

3. 研究与应用：

我国的干细胞研究和应用有一定基础，研究和应用最多的是造血干细胞。

如骨髓移植治疗血液病于20世纪70年代末开始，90年代以来已逐步普及应用外周血和脐血干细胞移植治疗血液病和肿瘤。

我国人类胚胎干细胞指导原则

为保证促进我国人胚胎干细胞研究的健康发展，2003年12月24日科技部和卫生部联合下发了12条《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》。明确了人胚胎干细胞的来源定义、获得方式、研究行为规范等，并再次申明中国禁止进行生殖性克隆人的任何研究，禁止买卖人类配子、受精卵、胚胎或胎儿组织。 近年，国际上对人胚胎干细胞研究的争论激烈，我国对此的态度支持治疗性研究，反对生殖性研究。据科技部有关官员介绍，为规范我国这一领域的研究，"十五"以来，科技部和卫生部与我国医学研究、社会伦理、科研管理专家反复研究论证，依据联合国教科文组织有关讨论和其他国家的相关法规，综合制定出这一指导原则，要求各省、区、直辖市、科技厅(委)、卫生厅(局)有关部门在开展生物医学领域人胚胎干细胞的研究活动中遵守国家有关规定，尊重国际公认的生命伦理准则。 我国人胚胎干细胞研究伦理指导原则 第一条为了使我国生物医学领域人胚胎干细胞研究符合生命伦理规范，保证国际公认的生命伦理准则和我国的相关规定得到尊重和遵守，促进人胚胎干细胞研究的健康发展，制定本指导原则。 第二条本指导原则所称的人胚胎干细胞包括人胚胎来源的干细胞、生殖细胞起源的干细胞和通过核移植所获得的干细胞。 第三条凡在中华人民共和国境内从事涉及人胚胎干细胞的研究活动，必须遵守本指导原则。 第四条禁止进行生殖性克隆人的任何研究。 第五条用于研究的人胚胎干细胞只能通过下列方式获得：（一）体外受精时多余的配子或囊胚；（二）自然或自愿选择流产的胎儿细胞；（三）体细胞核移植技术所获得的囊胚和单性分裂囊胚；（四）自愿捐献的生殖细胞。 第六条进行人胚胎干细胞研究，必须遵守以下行为规范：（一）利用体外受精、体细胞核移植、单性复制技术或遗传修饰获得的囊胚，其体外培养期限自受精或核移植开始不得超过１４天。（二）不得将前款中获得的已用于研究的人囊胚植入人或任何其他动物的生殖系统。（三）不得将人的生殖细胞与其他物种的生殖细胞结合。 第七条禁止买卖人类配子、受精卵、胚胎或胎儿组织。 第八条进行人胚胎干细胞研究，必须认真贯彻知情同意与知情选择原则，签署知情同意书，保护受试者的隐私。 前款所指的知情同意和知情选择是指研究人员应当在实验前，用准确、清晰、通俗的语言向受试者如实告知有关实验的预期目的和可能产生的后果和风险，获得他们的同意并签署知情同意书。 第九条从事人胚胎干细胞的研究单位应成立包括生物学、医学、法律或社会学等有关方面的研究和管理人员组成的伦理委员会，其职责是对人胚胎干细胞研究的伦理学及科学性进行综合审查、咨询与监督。

胚胎干细胞的体外诱导分化模型

胚胎干细胞的体外诱导分化模型马宗源　李祺福(厦门大学生命科学学院福建厦门361005) 胚胎干细胞是具有全能性及无限制的自我更新与分化能力的一类特殊的细胞群体,它能通过祖细胞为中介,分化为各种类型的体细胞,可重演体内干细胞的分化过程。自80年代从小鼠囊胚的内细胞团分离到胚胎干细胞并建系到现在已建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞、造血细胞等体外分化体系。将胚胎干细胞体外分化成为可利用的分化模型,无论从组织结构、细胞及分子水平都体现了体内分化过程的体外重演,再加上胚胎干细胞系具有体系简单,影响因子少,可控制,便于研究等特点,因此可用于研究早期胚胎发育和细胞分化调控;可成为器官移植和修复器官的细胞来源;还可用于新型药物筛选。 1　胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞具有与早期胚胎相似的结构特征,具有较高的核质比和整倍体核型。体外培养的细胞紧密堆积,呈克隆状生长,具有发育分化的多潜能性和无限制的自我更新能力,碱性磷酸酶染色呈阳性,具有高的端粒酶活性,早期胚胎细胞均表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、T RA-1-81、T R A-1-60等;表达种系转录因子OCT-4,并且可将O CT-4基因作为细胞多能性的一个标志;白介素6型细胞因子家族参与维持调节胚胎干细胞未分化状态。 胚胎干细胞建系的过程中要解决的问题在于体外不断增殖的过程中保持未分化的状态,但是细胞如何维持其未分化状态的机理并不清楚。研究发现主要是通过膜上的特异受体蛋白gp130来发挥作用,细胞因子受体蛋白g p130可激活JA N U S、酪氨酸激酶,JA K-ST A T、M EK/M A P K等信号途径,而JAK/ST A T3和M EK/ ERK信号途径则处于相对平衡的状态。另外,一些未知的膜结合分子也参与胚胎干细胞的增殖与分化。分离纯化及鉴定调节细胞的自我更新及分化的未知分子已成为研究的热点。 2　胚胎干细胞为基础的分化模型 胚胎干细胞要维持其未分化的状态,需要在胚胎饲养层中加入分化抑制因子。一旦改变了维持胚胎干细胞未分化状态的条件,胚胎干细胞首先形成胚胎小体,胚胎小体有外中内三胚层,继续分化可形成多种类型的细胞。在体外分化培养时,可自发形成有节律性跳动的心肌细胞,同时还形成骨骼肌、神经细胞、上皮细胞等。由于体外胚胎细胞可重演体内胚胎细胞的发育过程,并且基因的表达时相与体内的胚胎发育过程是相似的,在这一过程中加入外源的诱导分化因子并与相关的调控基因结合,可使胚胎干细胞分化为各种类型的细胞。现在已初步建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞和造血细胞等体外分化模型。 2.1　神经细胞　体外培养胚胎干细胞可模拟从未定型细胞向功能性神经元转化的过程,并且其基因的表达时相与体内的胚胎发育过程相似。在分化的早期表达N FL、N F M基因,后期则表达N eur ocan基因。维甲酸及神经生长因子可诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞,是常用的诱导分化物,它能上调神经元特异基因的表达,同时下调中胚层基因的表达。将神经元特异的SOX2基因转进胚胎干细胞,再经维甲酸诱导,可表达90%以上的具有神经元标志的神经细胞。可能是外源基因和维甲酸同时拮抗分化抑制因子的作用,阻碍细胞向其他的方向分化,迫使其向神经元的方向分化。维甲酸能诱导胚胎干细胞分化为C-氨基丁酸能和多巴胺能神经元,而维甲酸分别结合无血清培养基和含胎牛血清的培养基培养胚胎干细胞后发现,采用无血清培养时,几乎检测不到分化的多巴胺能神经元的存在;但在有血清培养时,却能检测到大量的多巴胺神经元。这暗示血清中的某些未知的因子和维甲酸共同起到定向诱导分化 化为特定组织细胞,将这些细胞回输体内,从而达到长期治疗的目的。干细胞的医学应用还包括体外克隆人体器官,然而这比体内移植干细胞要复杂的多。相信随着研究的不断深入,来自人体干细胞的器官应用于临床治疗已为期不远。干细胞研究与应用不仅在疾病治疗方面有着极其诱人的前景,而且将对克隆动物,转基因动物生产,发育生物学,新药物的开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响。 参考文献 　1　Th omson J A,Itsk ovitz-Eldor J os eph,Shapiro S S,et al. Em bryonic s tem cell lin es d erived from human b las tocysts.S cience,1998,282:1145—1147. 　2　Sh amb lott M J,Axelman J,W ang S,et al.Derivation of Plurip otent stem cells from cultured human primordial germ cell.Proc Natl Acad S ci U SA,1998,95:13726—13731. 　3　Jack son K A,M i T,Goodell M A.Hematopoietic potential of s tem cells isolated from murie s keletal mus cle.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:14482— 14486. 　4　裴雪涛.干细胞研究现状与展望.高技术通讯,2001, (6):93—95. (BH)

人胚胎干细胞研究的临床意义

人胚胎干细胞研究的临床意义 [关键词] 人胚胎干 健康讯: 吕广秀 20XX14上海市解放军第85医院儿科1998年11月，美国James和John Gearhart领导的2个科学小组分别发表论文阐述如何利用囊胚和原始的胚胎生殖细胞培养出可能的人全能型胚胎干细胞（ES cells）和胚胎生殖细胞系（EG cells）［1，2］。ES细胞最引人关注的2条特征是:ES细胞能在体外条件下生长，在原始的去分化条件下能够无限地分裂;同时在体外培养的所有时间内都能保持胚胎来源细胞的一个关键性特征—全能性，即发育成成体中各种细胞的能力。ES细胞的应用前景十分令人鼓舞。胚胎干细胞可以作为研究人类胚胎发育、出生缺陷及胚胎瘤等疾病的新的手段;可以用于至今为止尚未进行的关于的方法;制造人类疾病模型以利用于基础研究、药物开发和毒理学研究，如果克隆技术可以从患者自体组织中获得干细胞，则它们可解决用于治疗退行性疾病的组织短缺以及结束在移植治疗中使用免疫抑制剂;另外干细胞还可以用来作为基因治疗的一种新的基因运载系统。总之，其前景十分广泛。 1 胚胎干细胞的一般定义特征考虑到ES或EG细胞的特性，可以认为有一些表型是所有的ES细胞都应该具有的，其他一些特点可能是属于从不同种属或不同组织中分离出来的某种特定全能性细胞所特有，或表现出在胚胎发育过程中某个特定阶段所具有的特征。一般认为全能性干细胞所应具有的特征如下:（1）来源于一个全能性的细胞群体;（2）具有正常的细胞核型;（3）具永生性，在胚胎状态下能无限制的分裂;（4）培养的细胞株在体外或在畸胎瘤中能自发分化成胚胎外组织（extraembryonic tissues）和分属所有3种胚层的体细胞。但到目前为止，所有已培养成功的哺乳动物细胞中，除小鼠外，灵长类动物ES细胞只满足上述4条标准的前3条。一些研究人员将ES细胞的定义限定为那些能分化成包括生殖细胞在内的所有的细胞。但出于伦理上的原因，来源于人的ES细胞不可能进行试验以验证是否满足这一标准。因此，如果来源于人的细胞能满足其他3条关于ES细胞的一般定义，我们就认为它属于ES细胞。需要指出的是，要从体外培养或畸胎瘤试验验证一个ES细胞能否分化成所有组织类型的细胞是十分困难的，因为不论在体外培养条件下或畸胎瘤中，一些组织都是十分罕见的。 2 胚胎干细胞的最新研究James Thomson和同事于1998年报道利用治疗不孕症所遗弃的囊胚分离出ES细胞。他们所使用的技术与分离小鼠ES细胞相似:将可能

胚胎干细胞体外诱导分化综述

胚胎干细胞体外诱导分化综述 摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。 关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用 干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以 分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离 自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的 分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团 内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培 养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞

人胚胎干细胞的研究发展

人胚胎干细胞的研究发展 摘要：叙述了人胚胎干细胞（hES细胞）的研究现状，并对hES 细胞的研究进展及其应用前景等全面综述。 关键词：人，胚胎干细胞，原始生殖细胞，全能性，多功能性干细胞(Stemcell)是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，即干细胞保持未定向分化状态和具有增殖能力，在合适的条件下或给予合适的信号，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，又称其为“万用细胞”。干细胞来源于胚胎、胎儿组织和成年组织。根据发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。1998 年Thomson等第一次从胚胎中分离培养了人体胚胎干细胞(hES C)，并随后发现它能分化为体内几乎所有的细胞后，由此掀起全球范围内的hESC研究热潮。 人胚胎干细胞的生理意义：人胚胎干细胞最有价值的应用是用来修复甚至替换已丧失功能的组织和器官，因为它具有发育分化成所有类型组织细胞的能力。任何导致丧失正常细胞的疾病都可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗，如用神经细胞治疗神经变性疾病（帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等），用造血干细胞重建造血功能，用胰岛细胞治疗糖尿病，用心肌细胞修复已坏死的心肌等。 1 人胚胎干细胞的来源 胚胎干细胞来源于着床前的囊胚内细胞团或早期胚胎的原始生殖细胞是一大类未分化的二倍体全能干细胞，具有无限增殖、自我更新

和多向分化的潜能。 2 人胚胎干细胞的生物学特性 (1)具有分化的多潜能性，在体外可诱导分化出属于三个胚层的分化细胞; (2)具有种系传递功能; (3)具有长期的未分化增殖能力，细胞不仅能分化成各种器官组织，而且能增殖生成新的保持同种性状的ES 细胞; (4)易于进行基因改造操作; (5)保留了正常的二倍体的性质且核型正常; (6)胚胎干细胞端粒酶活性呈阳性,具有维持端粒长度,保持干细胞增殖能力的重要作用。 3 人胚胎干细胞的培养 (1) 常规培养液常用的基础培养基有改良伊格尔培养基(MEM)α、达氏修正依氏培养基(DMEM)、组织培养基(TCM)199、F12 等合成培养基，以DMEM应用最为普遍。它的主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和一些其他辅助物质。 (2) 无血清培养基血清中含有许多未知的成分和一些分化诱导因子，不利与ESC未分化状态的维持。为此人们尝试使用无血清培养液、化学合成培养液’进行ESC的培养，加入刺激细胞生长的激素、细胞因子等，实验表明ESC增殖旺盛，且能保持未分化状态，并认为无血清培养基优于血清培养基。但也有学者认为含血清培养液更利于胚胎干细胞向中胚层细胞分化,是因为血清中富含中胚层诱导因子,

人胚胎干细胞研究进展

人胚胎干细胞的研究进展 周进学号10170807 【摘要】干细胞( Stem Cell)是一类具有分化潜能和自我复制的早期未分化细胞。胚胎干细胞( Embryonic stem cells, ES细胞)是一种早期胚胎内细胞（inner cell mass, ICM）或原始生殖细胞（primordial germ cell, PGC）经体外分化抑制培养，分离和克隆得到的具有发育全能性的高度未分化细胞。人类胚胎干细胞系的建立是人类发育生物学研究的重大突破,揭示了人体发生发展奥秘的进程,可能为现代临床医疗模式带来革命性的变化。现对人类胚胎干细胞的来源,建系、生物学特性、应用前景及所涉及的伦理学问题作一综述。 【关键词】胚胎干细胞；克隆；伦理学,医学;综述 1、胚胎干细胞的概念 胚胎干细胞是从哺乳动物早期胚胎内细胞团(ICM)或桑椹胚分离出来的、能在体外长期培养的、高度未分化的全能细胞系,可在适合的条件下分化为胎儿或成体的各种类型的组织细胞。 胚胎干细胞属全能干细胞。ESCs 这一名词因其来源于胚胎而得名, 但从研究角度来说, 其概念一直没有一个特殊的标准, 2001 年美国国立卫生院根据Austin Smith 对小鼠ESCs 的研究, 概括了ESCs 的一些基本特征, 对其概念提出了一系列标准[1]: ①、来源于内细胞团或囊胚上胚层; ②、能够无限地进行对称分裂并保持未分化状态( 长期自我更新) ; ③、显示并维持正常、完整( 二倍体) 和稳定的染色体核型; ④、全能的ESCs 能够分化成三个胚层( 内胚层、中胚层、外胚层) 来源的所有细胞类型;⑤、在发育过程中能整合到所有胚胎组织中( 体外经长期培养的小鼠ESCs, 被植入另一胚胎形成嵌合体动物后, 仍能产生所有组织) ; ⑥、具有能克隆形成胚胎细胞系的能力, 并能产生卵子或精子细胞; ⑦、基因克隆, 即一个单一的ESCs 能产生一群具有相同遗传特性的细胞( 克隆) , 这些细胞有着与亲代细胞

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤

细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。

b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养

【2018新课标 高考必考知识点 教学计划 教学安排 教案设计】高二生物：胚胎分割和胚胎干细胞

二、重难点提示 重点：1. 胚胎分割的过程 2. 胚胎干细胞的特点和应用 难点：胚胎干细胞的特点和应用

【随堂练习】 1. 胚胎分割是一种现代生物技术，关于这一技术的叙述正确的是（） A. 胚胎分割可以将早期胚胎任意分割成多份 B. 胚胎分割技术可以获得同卵双胎或多胎 C. 胚胎分割技术属于有性生殖，不属于克隆 D. 胚胎分割技术可以分割任意时期的胚胎 思路分析：在胚胎分割时要将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育，所以不能将早期胚胎任意分割成多份；胚胎分割移植可以看作无性生殖；胚胎分割一般要在桑椹胚或囊胚时期进行。 答案：B 2. 北京市某医院接生了一名婴儿，医院为他保留了脐带血，如果后来他患了胰岛素依赖型糖尿病，就可以通过脐带血中的干细胞为其治疗。关于这个实例说法正确的是（） A. 用干细胞培育出人体需要的器官来治疗疾病，需要激发细胞的所有全能性 B. 用脐带血干细胞能治疗这个孩子的所有疾病 C. 如果要移植用他的干细胞培育出的器官，需要用到细胞培养技术 D. 如果要移植用他的干细胞培养出的器官，应该长期给他使用免疫抑制药物 思路分析：用脐带血干细胞培养出人体需要的器官用来治疗疾病，不需要激发细胞的所有全能性。脐带血干细胞不能治疗所有疾病，如意外伤害、毒药伤害等。脐带血干细胞最大的优点就是自体移植不会有免疫排斥反应，因而不需要给他使用免疫抑制药物。 答案：C 例题1 利用胚胎干细胞治疗肝衰竭，实现此过程的最重要原因是（） A. 细胞生长 B. 细胞特化 C. 细胞分化 D. 细胞增殖 思路分析：胚胎干细胞具有发育的全能性，可以被诱导分化形成新的组织细胞，移植胚胎干细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能，因此利用胚胎干细胞治疗肝衰竭主要是利用其分化特性而实现的。 答案：C 例题2 如图为经过体外受精和胚胎分割移植培育优质奶牛的过程，请回答下列问题： （1）A细胞是____________，在进行体外受精前要对精子进行____________处理。 （2）进行胚胎分割时，应选择发育到____________时期的胚胎进行操作。 （3）②指的是____________。 （4）通过胚胎分割产生的两个或多个个体具有相同遗传性状的根本原因是

简述干细胞的形态特征及其研究进展

简述干细胞的形态特征及其研究进展 干细胞是一类具有自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类各组织器官的原始的多潜能的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞在形态上具有共性，通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性。根据它所处的发育阶段可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。 胚胎干细胞的发育等级较高，是全能干细胞，而成体干细胞的发育等级较低，是多能干细胞或单能干细胞。干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。目前人类胚胎干细胞已可成功地在体外培养。 干细胞的形态特征： 干细胞具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。 1 胚胎干细胞：胚胎干细胞当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团的 细胞即为胚胎干细胞。具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。进一步说，胚胎干细胞是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。 2 成体干细胞：成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具 有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。 3 造血干细胞：造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在 于骨髓、外周血、脐带血中。造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效方法。 4 神经干细胞:理论上讲，任何一种中枢神经系统疾病都可归结为神经 干细胞功能的紊乱。脑和脊髓由于血脑屏障的存在使之在干细胞移植到中枢神经系统后不会产生免疫排斥反应。除此之外，神经干细胞的功能还可延伸到药物检测方面，对判断药物有效性、毒性有一定的作用。 5 肌肉干细胞:可发育分化为成肌细胞，可互相融合成为多核的肌纤维，形成骨骼肌最基本的结构。

胚胎干细胞体外培养.

胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs

胚胎干细胞的起源和同一性

胚胎干细胞的起源和同一性 摘要 胚胎干细胞在生物研究方面应用广泛，也作为研究哺乳动物早期发育的模型，但是它们精确的起源却是备受争议。传统上认为它们来源于植入前的胚胎，但这暗示着形成胚胎干细胞的细胞可能已经有发育为原始生殖细胞命运倾向的外胚层细胞产生，它通过原始生殖细胞系形成胚胎干细胞。根据最近的研究发现我们提出胚胎干细胞可以直接来源于早期的外胚层细胞，这些胚胎干细胞可以通过不同培养条件形成的两条不同路径出现。 关键词：细胞，胚胎干细胞，同一性 简介 多能性是小鼠胚胎内细胞团形成外胚层的首要要求。在合适的培养条件下，内细胞团细胞可以在体外以胚胎干细胞的形式增殖。这些细胞保持有重新进入一个胚胎（形成嵌合体）的能力，使这些细胞发育为成体的所有组织，包括生殖细胞系和俗称为幼稚多能细胞。多能干细胞最初来源于小鼠睾丸的畸胎瘤。由于畸胎瘤相对其他组织而言在生殖细胞系中更常见可以推断这些畸胎瘤起源于干细胞；小鼠的睾丸瘤一般在出生后形成；在胎儿的睾丸小管中可以清晰的观察到初期的瘤。随后发现多能性细胞系很难与胚胎干细胞区分开来，这些胚胎干细胞来源于体外发育的小鼠重新编程的胚胎的原始生殖细胞。因此，捕获幼稚多能细胞的机会之窗在发育过程中打开两次：第一次在早期的外胚层而第二次在干细胞系。

胚胎生殖细胞与胚胎干细胞的相似之处强烈暗示着胚胎干细胞可能来源于那些已经有发育为原始生殖细胞倾向的外胚层细胞。也有假说称是原始生殖细胞促进培养植入前和植入后发育阶段的胚胎形成外植体。在这个假说中，我们依据近来的发现猜想胚胎干细胞可能通过两条途径得到外植体：直接来源于新形成的外胚层，它处于幼稚多能状态；或者培养在进行遗传重编程的特定原始生殖细胞，使它们重获多能性（图1）。 图1.幼稚多能细胞来源在一定条件下分离小鼠的胚胎干细胞、胚胎生殖细胞和原始生殖细胞。（A）体内发育过程。在囊胚后期的早期外胚层（红色）出现幼稚多能细胞系和受精后8.5天的原始生殖细胞（黄色）（B）体外培养到囊胚期的另一条产生幼稚多能细胞的途径。红心代表早期外胚层分离胚胎干细胞的路径；黄心代表通过形成原始生殖细胞而发育为胚胎干细胞的较长的路径。灰色箭头代表长期培养可能会得到胚胎干细胞或胚胎生殖细胞的假说。图示大小不代表真实比例。 幼稚多能性的出现 哺乳动物受精后产生一个发育为完整的胚胎的受精卵和形成胚外世系。受精卵经过几轮的卵裂之后产生均等的卵裂球，但是在囊胚

人类胚胎干细胞以及如何诱导获得多功能干细胞

张绪生科2班 1213223 人类胚胎干细胞以及如何诱导获得多功能干细胞 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESCs，简称ES或Ek细胞。）胚胎干细胞是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞，也是指当受精卵分裂发育成囊胚时内细胞团（Inner Cell Mass）的细胞，它具有体外培养无限增值、自我更新和多向分化的特性也具有“全能”的发展潜力。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导为机体几乎所有的细胞类型，所以胚胎干细胞也叫“万能”细胞，可以分化成所有不同种类的体细胞。 由于胚胎干细胞的“全能”性，仅从技术角度来说，用胚胎干细胞来培养人体组织和器官以治疗疾病是最理想的。科学家认为，用胚胎干细胞能培育出全新的细胞和组织，可以为治疗糖尿病、心脏病、癌症、帕金森氏综合征等疾病提供 新方法。 人诱导多功能干细胞合成的方 法有很多，近年来的一些研究有：不 使用病毒载体生成人iPS细胞系；不 含外来DNA的人类iPS细胞；OCT4 基因在干细胞的增殖、分化、应激反 应、凋亡过程中的作用；将iPS细胞 培育成为多巴胺神经元细胞。 目前研究比较透彻的就是鼠的 胚胎干细胞，最新的一项研究是研究 人员成功运用病毒表达转录因子把大鼠成体细胞成功地重编程到多能干细胞状态。从数百个形态类似胚胎干细胞的细胞克隆中，建立了22个类似胚胎干细胞的细胞系。经过进一步筛选、鉴定，最终获得两株符合多能干细胞标准的大鼠iPS细胞系。这些细胞系形态类似小鼠胚胎干细胞，具有跟小鼠胚胎干细胞类似的干细胞标记基因的表达，而且在体外和体内都具有向内、中、外三个胚层分化的能力。可以说成功用人诱导的多功能干细胞培养出了小鼠，图示的就是人诱导小鼠细胞得到多功能干细胞的简单实验步骤。一项最新的研究表明通过一个成熟的NKT细胞重新编程，可诱导产生多能干细胞并能分化成小鼠。NKT细胞的特点是他们的一个不变的NKT细胞特异性抗原受体α链Vα14Jα18基因片段编码的表达。

苏教版高中生物选修3 3.2《胚胎干细胞的研究及其应用》学习要点

第二节胚胎干细胞的研究及其应用 学习目标 1.理解干细胞的概念与分类。 2.掌握胚胎干细胞来源、特点及分离途径与方法。 3.举例说明胚胎干细胞的应用。 4.了解胚胎干细胞的研究进展及其所面临的各种挑战。 学习重、难点 学习重点 1.理解干细胞的概念。 2.简述胚胎干细胞的特点及其研究进展。 学习难点 简述胚胎干细胞的特点及其研究进展。 知识要点梳理 一、胚胎干细胞及其研究进展 1.干细胞的概念：是动物（包括人）胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞。 2.干细胞作用：具有重建、修复病损或衰老组织、器官功能。 3.干细胞分类 （1）专能干细胞：只能分化成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞。（2）多能干细胞：具有分化成多种细胞或组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，如造血干细胞等。（3）全能干细胞：可以分化为全身的多种细胞，并进一步形成机体的所有组织、器官。 二、胚胎干细胞的应用 1.如果科学家最终能够成功诱导和调控胚胎干细胞的分化与增殖，将会给胚胎干细胞的基础研究和临床应用带来积极的影响。 2.在研究新药对各种细胞的药理和毒理试验中，提供了材料，大大减少了新药研究所需动物的数量，从而降低了成本。 3.胚胎干细胞研究为细胞或组织移植提供无免疫原性的材料，用于疾病治疗等，给人类带来全新的医疗手段。

4.通过胚胎干细胞，结合基因工程等还可以在试管中改良并创造动物新品种，培育出生长快、抗病力强、高产的家畜品种等。 三、胚胎干细胞研究面临的挑战 1.胚胎干细胞的应用给法律、伦理、国家和社会安全带来的冲击是空前的。 2.胚胎干细胞在体内或者是体外都具有自我分化的潜能，极易分化成其他细胞，对培养条件的优化仍需要进一步研究。 3.对胚胎干细胞向不同组织细胞定向分化的条件还不清楚。 4.创造一种“万能供者”细胞，需要破坏或改变细胞中的许多基因，其可行性仍不清楚。

人类胚胎干细胞基础培训教材1130

人类胚胎干细胞基础技术 高级培训班 2010-12

目录 1. 绪论 (3) 2. 饲养层细胞的制备 (4) 2.1 从胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） (4) 2.2 MEF的传代 (5) 2.3 MEF的冻存 (5) 2.4 MEF的失活 (6) 3. 饲养层细胞的准备 (7) 4. ES/iPS细胞的复苏 (9) 5. ES/iPS细胞的传代 (10) 6. ES/iPS细胞的冻存 (12) 7. 人类胚胎干细胞的无滋养层培养 (13) 7.1 人类胚胎干细胞条件培养基（CM）的收集 (13) 7.2 无饲养层人胚胎干细胞系的培养及传代 (13) 8. 拟胚体的形成 (14) 9. 胚胎干细胞全能性的鉴定 (15) 9.1碱性磷酸酶活性检测 (15) 9.2干细胞表面marker的免疫染色检测 (16) 9.3干性因子的去甲基化程度分析 (17) 9.4干细胞内源基因的表达分析 (19) 9.5端粒酶活性检测 (21) 9.6核型检测 (21) 9.7拟胚体形成 (21) 9.8畸胎瘤形成实验 (22) 10. 干细胞技术培训及服务一览表 (23) 11. 附录 (24)

1.绪论 本操作手册将为您详细介绍人胚胎干细胞/iPS细胞培养的基础知识、技术细节及相关的产品信息。目的是为了让您更好地培养您购买的细胞，请按照此手册进行培养操作直至获得可靠的冻存细胞。上海斯丹赛生物技术有限公司专业提供各类胚胎干细胞/iPS细胞及成套产品服务，为您的干细胞研究提供一站式解决方案。

2.饲养层细胞的制备 材料与仪器 ?成纤维细胞完全培养基，货号EFM-01 ?胰酶，货号M-005-1 ?成纤维细胞冻存液（2x），货号EFFM-01 ?基质胶（Matrigel matrix），BD Pharmingen，货号356235 ?CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），货号MEF-CF1-01 ?T25透气培养瓶，NUNC，货号156367 ?T75透气培养瓶，NUNC，货号156499 ? 2 ml移液管，NUNC，货号159617 ?5ml移液管，NUNC，货号159625 ?10 ml移液管，NUNC，货号159633 ?15ml离心管，货号366036 ?50ml离心管，货号373660 ?冻存管，NUNC，货号377267 ?Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头 ?生物安全柜，货号 ?CO2培养箱，Thermo，HERA cell 150i ?电子计数器，millipore，货号PHCC00000 ?电动移液器，Thermo Scientific Finnpipette C1，货号4580800 ?低速离心机，Thermo Scientific CL10 ?液氮罐，Thermofisher，货号CN50900 2.1从胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） 1. 拉断颈椎处死怀孕12-13天的CF-1小鼠，浸入70％的酒精中消毒。 2. 将小鼠放在超净台无菌的解剖盘中，在腹中线处做一横向切口。 3. 剪开的皮肤拉向切口的上下两侧，提起腹膜，将其剪开，充分暴露腹腔。 4. 找出子宫，一只手用无菌钝口镊子轻轻提起子宫，另一只手持无菌镊子小心分离子宫周围的结缔组织。当两侧子宫都与其相连的组织分离好后，用剪刀将左右两侧的子宫在输卵管与子宫角的衔接处剪下，小心剪下子宫的联体部分，置于无菌的60mm培养皿中。

人胚胎干细胞培养手册

操作指南 运输和保存：人胚胎干细胞（hESCs）和PMEFi被装在含90％FCS和10％二甲基亚砜的冻存管中，hESCs 4×105/管，可接种一个3.5cm培养皿（或六孔板的一个孔），PMEFi 4×106/管，可接种一块六孔板。冻存管用干冰运输，收到后，hESCs投入液氮，PMEFi放入－80℃保存。 培养条件：温度：37±0.5℃ CO2浓度：5.1±0.6％ 相对湿度：85-100% 主要技术： 1．细胞培养： 当进行hESC培养时，总的培养原则必需遵守，所有的操作都应该在相应的细胞培养间和超净台内按无菌技术进行。此外，通过安装空气处理和过滤设备减少空气颗粒制造一个相对洁净的空间。当接触和细胞有关的一切试剂和材料时，应该带手套（包括开冰箱门）。工作间在使用前后要用70％的异丙醇彻底消毒。 2．培养液和材料 所有的培养液和试剂在使用前都要用0.2μm的滤膜过滤；培养瓶和TC材料在拿进培养间之前都应该用70％异丙醇消毒。 3．细胞处理 为了便于操作，最好不要同时处理两个以上的标本。操作时，在室温和低CO2的时间不要太长。所有的细胞离心：室温，500－600g，5分钟。

培养液准备： MEF和hESCs培养液在无菌条件下进行，完成后用0.2μm的滤膜过滤。当准备hESCs培养液时，保持一致性很重要。如有可能，尽量使用相同的试剂。使用满足于附录提供的血清替代品尤为重要。 生长因子应该最后添加，需要强调的是bFGF进行重悬时需要蛋白载体，在少量培养液中不要试图重悬它。 MEF培养液： hESCs培养液： 冷冻培养液：90％FCS+10%二甲基亚砜, 0.2μm的滤膜过滤,4℃保存。 明胶准备： 用超纯水配制0.1％明胶溶液，加热确保明胶完全溶解，使用前高压或0.2μm 的滤膜过滤。 明胶包被：

人类胚胎干细胞基础培训教材完整版

人类胚胎干细胞基础培 训教材 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】

人类胚胎干细胞基础技术 高级培训班 2010-12

目录

1.绪论 本操作手册将为您详细介绍人胚胎干细胞/iPS细胞培养的基础知识、技术细节及相关的产品信息。目的是为了让您更好地培养您购买的细胞，请按照此手册进行培养操作直至获得可靠的冻存细胞。上海斯丹赛生物技术有限公司专业提供各类胚胎干细胞 /iPS细胞及成套产品服务，为您的干细胞研究提供一站式解决方案。

2.饲养层细胞的制备 材料与仪器 成纤维细胞完全培养基，货号EFM-01 胰酶，货号M-005-1 成纤维细胞冻存液（2x），货号EFFM-01 基质胶（Matrigel matrix），BD Pharmingen，货号356235 CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），货号MEF-CF1-01 T25透气培养瓶，NUNC，货号156367 T75透气培养瓶，NUNC，货号156499 2 ml移液管，NUNC，货号159617 5ml移液管，NUNC，货号159625 10 ml移液管，NUNC，货号159633 15ml离心管，货号366036 50ml离心管，货号373660 冻存管，NUNC，货号377267 Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头 生物安全柜，货号 CO2培养箱，Thermo，HERA cell 150i 电子计数器，millipore，货号PHCC00000 电动移液器，Thermo Scientific Finnpipette C1，货号4580800 低速离心机，Thermo Scientific CL10 液氮罐，Thermofisher，货号CN50900 2.1从胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） 1. 拉断颈椎处死怀孕12-13天的CF-1小鼠，浸入70％的酒精中消毒。 2. 将小鼠放在超净台无菌的解剖盘中，在腹中线处做一横向切口。 3. 剪开的皮肤拉向切口的上下两侧，提起腹膜，将其剪开，充分暴露腹腔。 4. 找出子宫，一只手用无菌钝口镊子轻轻提起子宫，另一只手持无菌镊子小心分离子宫周围的结缔组织。当两侧子宫都与其相连的组织分离好后，用剪刀将左右两侧的子宫在输卵管与子宫角的衔接处剪下，小心剪下子宫的联体部分，置于无菌的60mm 培养皿中。 5. 用无菌的剪刀在子宫头与子宫尾分别剪去输卵管及子宫角部分。 6. 将子宫置于15ml离心管中，用10mlPBS洗三遍。 7. 用尖镊子撕开子宫壁和胎膜，取出胎鼠，放在新的培养皿中。 8. 用8mlPBS 将胎鼠洗三遍。

2.1 干细胞来源及生物学特征

干细胞来源及生物学特征

什么是干细胞(STEM CELL)？ ?干细胞(stem cell)是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。 ?在细胞的分化过程中，细胞往往由于高度分化而完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。 ?机体在发展适应过程中为了弥补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞，称之为干细胞。 ?一旦生理需要，这些干细胞可按照发育途径通过分裂而产生分化细胞。 ?1963年，恩尼斯特.莫科洛克和詹姆士.堤尔首次证明了血液中干细胞的 存在，开启了干细胞研究的大门。 ?。

什么是细胞分化？ ?细胞分化(cell differentiation )：同一来源的细胞，通过细胞分裂在细胞间产生形态结构、生化特征和生理功能有稳定性差异的过程。 ?是个体发育中组织器官形成的基础，是发育生物学的中心问题。 ?时间上的分化：一个细胞在不同的发育阶段有不同的形态结构、生化特征和生理功能，如骨髓内血细胞的发生过程。 ?空间上的分化：同一种细胞的子代细胞所处的环境位置不同，其形态结构、生化特征和生理功能也不一样，如外胚层来源的细胞可发育成表皮细胞、神经细胞等。

干细胞的特点 ?干细胞本身不是处于分化途径的终端。 ?能无限的增殖分裂。 ?可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。 ?通过两种方式生长： 对称分裂--形成两个相同的干细胞 非对称分裂--由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配，使得一个子细 胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细胞;另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来。 干细胞是具有多向分化潜能和自我更新特点的增殖速度较缓慢的细胞。