植物细胞工程理论1

第一章 植物细胞全能性与形态发生

教学目标 (1)掌握细胞离体培养的基本理论；

(2)掌握培养条件下组织细胞脱分化和再分化的调控原理；

(3)掌握植物的离体器官发生；

(4)掌握体细胞胚胎发生与人工种子；

(5)了解“挑战杯”获奖作品“红掌气生根再生快繁体系建立”研究的全过程培养学生

的创新精神；

(6)介绍相关科研论文的研究结果培养学生的科研意识。

引言 植物细胞工程的理论基础是植物细胞全能性，所以深入理解植物细胞全能性及其表达与调控对学习理解后几章内容非常重要，本章作为重点章节介绍。

一、植物细胞全能性（totipotency）的概念

植物体每个正常细胞都含有该植物的全部遗传信息，在适宜的条件下能发育成完整的植株。把这种生活的植物细胞所具有的产生完整植株的潜在能力称为植物细胞全能性。

植物细胞按分裂能力分为3类（参照动物细胞分类类型）：

①周期细胞：始终保持分裂能力，从一个周期进入另一个周期，包括茎尖、根尖及形成层细胞。

②终端分化细胞：永久失去分裂能力的细胞，包括筛管导管、气孔保卫细胞等特化细胞。

③Go细胞：一般不分裂，但当受到外界刺激时可重新启动分裂，包括表皮细胞及薄壁细胞。

一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决于它的分化程度。

差异：1、受精卵的全能性最高 2、受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。植物细胞只要有一个完整的膜系统和一个有生命力的核，即使是已经高度成熟和分化的细胞，也还保持着回复到分生状态的能力，其回复过程取决于该细胞原来所处的自然部位、生理状态和外部环境条件。

营养生长中心 形成层细胞 伴胞及分泌细胞 薄壁细胞 厚壁细胞 纤维细胞 筛管

不同类型细胞脱分化可能达到的程度

根据细胞类型不同从强到弱：营养生长中心〉形成层〉薄壁细胞〉厚壁细胞（木质化细胞）〉特化细胞（筛管、导管细胞）；

根据细胞所处的组织不同从强到弱：顶端分生组织〉居间分生组织〉侧生分生组织〉薄壁组织（基本组织）〉厚角组织〉输导组织〉厚壁组织。

正因为许多类型的细胞可以在离体培养条件下发育为胚状体或植株。所以①在细胞水平上进行的任何遗传操作，通过细胞培养和植株再生，最终可将细胞的遗传修饰变以植物的遗传修饰，从而改变了整个植物的遗传特性。②植物细胞全能性使得它们能够在培养条件下无限的分裂和增殖，这样可以利用植物细胞的大量培养的方法，使它们像微生物一样，在生物反应器中生产有用的化合物。因此细胞全能性学说是细胞工程的理论基础。

二、植物细胞全能性的表达

（一）植物细胞全能性表达所需条件：

基本条件有2个：

①细胞或组织脱离母体（离体损伤刺激）：要使植物组织或细胞经脱分化再生植株，

必须从植物体其余部分的抑制性影响下解脱出来，即处于离体条件(正常植株叶片上不会再长植株或愈伤组织)。损伤刺激会使细胞呼吸速度增大，称为“损伤呼吸”，酶的活性增加，代谢物含量变化。

②激素的调控（营养物质和激素的刺激）

细胞离体后以异养方式生存，所以必须供给营养物质（培养基）。还必须供给激素刺激，以打破抑制力，恢复细胞分裂。

抑制假说：认为静止细胞仍然保存着在分生组织状态时的那种细胞分裂潜能，只不过存在一种抑制物质或抑制力，使细胞分裂能力不能表现。如果去除这种抑制，细

胞就恢复到分裂状态。这种抑制剂的作用原理及作用位点尚不清楚，但其抑制效能可

能会在生长调节物质（激素）的作用下而失掉，从而使细胞恢复分裂能力，实现脱分

化。

不同植物细胞内，抑制剂的质和量可能是不同的。因此在离体培养中，往往因植物不同培养基中添加激素的种类和浓度以及配比也不同。

激素在植物生长发育中具有重要的调控作用，也是离体培养条件下调控细胞脱分化和再分化的主要因素，其中生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分化的植物激素。此外，GA3、AB A、乙烯等也在细胞分化中起到一定的调节作用。

③还有光照和温度的影响

一般需要在黑暗条件下诱导愈伤组织；也有植物在光照条件下诱导愈伤组织。对温度的要求培养温度较高（如甘薯）；而耐低温植物，培养温度较低。一般植物培养温度在25℃左右。

（二）植物细胞全能性的表达过程:

离体培养条件下，植物细胞全能性的表达（过程）是通过细胞脱分化与再分化实现的。

1、脱分化

（1）分化〔differentiation〕：指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。（许智宏，1998）

（2）脱分化〔dedifferentiation〕：指已停止分裂的成熟细胞转变为分生状态并形成没有组织结构的细胞团（未分化的愈伤组织）的现象。还可表述为具有特异结构和功能的细胞转化成没有特异结构和功能的细胞的过程。

静止细胞(G0细胞)启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。

（3）细胞脱分化过程中细胞结构的变化

植物体内最大量的分化细胞是成熟的薄壁细胞，如叶肉细胞、表皮细胞、内皮层和髓部的薄壁细胞等，它们在形态上与分生细胞有明显的区别。即其细胞及其核的体积较大，核位于细胞边缘，细胞中央有一个大的液泡，细胞质内核糖体密度较低，多聚核糖体数目很少，质体为分化程度较高的叶绿体、杂色体、白色体或淀粉体。在离体培养条件下成熟的薄壁细胞从第一次分裂开始即进入脱分化的过程。通过几次有丝分裂新生的细胞逐步转变为分生状态的细胞。

脱分化过程中细胞结构会发生急剧变化。最终具有分生细胞的特点：细胞体积较小，细胞核体积增加并逐渐移位至细胞中央，细胞质显著变浓，大液泡消失，细胞器增加，液泡蛋白体的出现和叶绿体转变为原质体。

细胞脱分化的重要特征:

1、液泡蛋白体的出现

如烟草叶肉栅栏细胞从培养20h起直到培养3～4d，脱分化细胞的液泡中陆续出现电子密度很高的圆球体。放射自显影研究表明，标记的亮氨酸能渗透到这种圆球体中，证明它是一种蛋白体（PB）。单独用锇酸固定时，电子致密体可被完整地保存下来。如只用戊二醛固定，它们虽然也可固定下来，但其内部呈现网状结构，表明具有一些不能被戊二醛固定的物质。电子致密体对固定剂的反应说明，它除了含有能被醛固定的蛋白质外，还含有一些能被锇酸固定但不被醛类固定的物质，如脂类等。同时还可以看到在液泡中有一些新形成的球形细胞质团（NCM），其大小和外形与蛋白体十分相似，并经常与后者相连结。这些新形成的球形的细胞质团中多聚核糖体的数目很多，说明处于合成代谢活跃的状态。这种不寻常的电子显微图像给人的印象是，在蛋白体的基础上可以形成新的细胞质团，实现细胞质的改组。因此朱至清认为蛋白体的出现和细胞质的旺盛生长是烟草叶肉细胞开始脱分化的重要标志。

2、质体转变为原质体

脱分化过程中细胞质改组的另一个重要方面是细胞器的变化，变化最明显的是叶绿体。随着脱分化过程的进行，叶绿体内淀粉粒逐渐增多，有的几乎充满叶绿体的整个空间，叶绿体开始以缢裂方式分裂，随着分裂次数的增加，叶绿体的体积逐渐减小，片层退化和消失，变成只含有淀粉粒的淀粉体。淀粉体中的淀粉被消耗后，最终变成原质体。脱分化过程中线粒体、微体、高尔基体和粗面型内质网明显增多，胞质电子密度加大，这些胞质结构的变化显示细胞代谢非常活跃。

细胞脱分化过程包括3各阶段：

启动阶段：细胞质变浓，液泡蛋白体出现。

演变阶段：细胞核移向中央，质体演变成原质体。

终结期：恢复到分生状态，细胞分裂即将开始。

(4)细胞分裂与愈伤组织形成：

成功地脱分化将导致细胞分裂，形成愈伤组织或胚性细胞团。

有时组织细胞经脱分化后，不形成愈伤组织，而是从脱分化的细胞上直接再分化器官。

愈伤组织〔callus〕：在离体培养过程中形成的具有分生能力

的一团不规则无序生长状态的薄壁细胞，多在外植体切面上产

生。

（5）愈伤组织的生长：

经脱分化 导致 结果

细胞――→具备了分裂能力――→细胞不断增殖――→愈伤组织的生长

愈伤组织的生长并非一致进行，待细胞分裂到一定时期，便会停止分裂。但如果把处在旺盛生长且未分化的愈伤组织切成小块进行继代培养，可维持其活跃生长。利用此特点，进行继代培养，可大量增殖。

也有例外，有的情况下，组织细胞经脱分化后，不形成愈伤组织，而是从脱分化的细胞上直接再分化器官。

(6)脱分化影响因素：

A.植物种类、组织和细胞状态有关：

单子叶植物和裸子植物比双子叶植物难；

本植物比草本植物难。

成年植物组织和细胞比幼年组织和细胞难；

B.植物激素

C.光照

2、再分化

（1）再分化：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下又转变为各种不同类型细胞的现象。离体培养物可以由脱分化状态再度分化。包括细胞分化、组织分化和器官分化递进地进行，最后再生完整植株。

（2）极性与细胞分化

极性是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。极性无论在低等植物或高等植物中均普遍存在。极性一旦建立，在一般情况下不可逆转。通常细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志（即细胞分化的标志）。

（3）TE细胞分化

作为维管系统的主要成分，管状分子（tracheary elements，TEs）在维管系统的形成中具有中心作用。在植物系统发育条件下，TEs由根和芽的原形成层或次生形成层细胞分化形成。在离体培养条件下，TEs则由愈伤组织薄壁细胞分化形成，这也是愈伤组织细胞分化器官的前提。离体培养中，通常把TE细胞的出现作为组织分化的标志。

（4）组织分化

在细胞分化的基础上，可以分化出各种各样的组织。其中，拟分生组织和维管组织是两种重要的组织。是形成不定芽和不定根的基础。

拟分生组织：是脱分化后的培养物发生一系列细胞分裂而产生的一团小型、薄壁、液泡小的类似分生组织的细胞群。也叫做生长中心或分生组织结节。拟分生组织可以从一个细胞或几个细胞形成，可以起源于愈伤组织的表面，也可以起源于组织内部。拟分生组织形成的同时或稍后，愈伤组织中会分化出维管组织（结节）。

维管组织（结节）：一个区域的愈伤组织转化为韧皮分子和木质分子的混合结构（类似形成层），这种形成层状的细胞向外延伸与拟分生组织连接，形成芽原基或根原基。（5）植株再分化途径：

↗ 器官发生↘

组织、器官 ↘ 胚胎发生↗ 再生植株

到底通过哪个途径再生，取决于培养材料和培养基，尤其培养基中激素的种类、浓度及配比

三、器官发生

植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。

（一）离体培养中器官发生的方式

通过器官发生形成再生植株大体上有3种方式：

①先芽后根 ②先根后芽 ③根芽同长

（二）器官分化过程

1、经过愈伤组织再分化器官的过程：

离体培养条件下，经过愈伤组织再分化器官一般要经过3个生长阶段。

第一阶段是外植体经过诱导形成愈伤组织。

第二阶段是“生长中心”形成。当愈伤组织转移到利于有序生长的条件下时，首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群，称为拟分生组织，它们是愈伤组织中形成器官的部位。

第三阶段是器官原基及器官形成。

2、不经过愈伤组织再分化器官的方式：

有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基。这一途径有2种情况：

①外植体中已存在器官原基，进一步培养即形成相应的组织器官进

而再生植株，如茎尖、根尖分生组织培养和幼胚培养；

②外植体某些部位的细胞，在重新分裂后直接形成分生细胞团，然

后由分生细胞团形成器官原基。这种不经过愈伤组织直接发生器官的途径在以品种繁殖为目的的离体培养中具有重要的实践意义。

不经过愈伤组织的器官发生过程：P28图

有一个细胞（感受态细胞）脱分化或转分化进行第一次平周分裂——经过几次分裂后形成“生长中心”——形成原初分生

组织——芽原基形成——芽

研究表明，在叶肉细胞再生植株过程中，最初分裂细胞的第一次分裂轴向是十分重要的。在不经过愈伤组织的器官分化中，

这次平周分裂既是叶肉细胞的脱分化，同时也是该细胞转变发育

方式极性的确定。现在，有人把最先启动分裂的这些细胞称之为感受态细胞。

（三）器官分化与植物再生过程：

脱分化

外植体（组织细胞）―→愈伤组织―→细胞分化―→组织分化―→器官分化―→植株

（拟分生组织和维管组织节结）

器官分化主要指根和芽的分化。是否能够发生器官分化，与前培养有关，如脱分化、细胞分化、组织分化等。有了前边这些分化才会有器官分化。

（四）影响器官分化的因素：

细胞分裂分化成什么样的细胞，是拟分生组织细胞，还是维管组织细胞，或是其它细胞？

影响细胞分化的因素：

（1）起始材料对器官分化的影响（内因））

①母体植株的遗传基础

被子植物比裸子植物容易，被子植物中茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科和十字花科植物成功报道最多；

无性繁殖植物比有性植物器官发生容易；

同种植物不同品种（基因型）的培养效果不同；如：朗式烟草。

表1.1 不同基因型器官分化能力的比较 P29

表中看出基因型对培养反应的差异表现在器官分化的差异，而愈伤组织的差异较小。

②外植体的类型

影响培养的难易：一般生理状态年轻，来源于生长活跃或生长潜力大的组织和器官的细胞容易培养，但不同

植物类型有较大差异。

影响分化的程度和器官类型：1974年Tran Thanh Van 等取烟草正在开花的植株的茎表皮进行培养，结果不同

部位的表皮外植体所形成的芽的类型不同。

（2）培养基种类（营养成分）

（3）激素对器官分化的调控

激素在细胞生长与个体发育中具有重要的调控作用。离体培养下的器官分化，在大多数情况下是通过外源提供适宜的植物激素而实现的。

①在众多的植物激素中，生长素与细胞分裂素是两类主要的植物激素，在离体器官分

化调控中占有主导地位。离体培养中，外源激素在细胞内的吸收和代谢影响到激素的活性从而影响其培养效果。生长素与细胞分裂素是两类主要的植物激素，在离体器官分化调控中占有主导地位。

GA3、PSK对器官分化也有一定的调节作用。

外源激素通过调节内源激素的平衡状态而控制器官发生。

②离体培养中，外源激素在细胞内的吸收和代谢影响到激素的活性从而影响其培养效

果。

细胞分裂素：为嘌呤类化合物，进入细胞内会以核苷形式被钝化。

二氢玉米素活性比普遍玉米素作用强，因为二氢玉米素不是细胞分裂素氧化酶的底物，不会被转变为核苷。

表2.2外源生长素在胡萝卜上胚轴培养细胞中的总量和游离生长素含量 P31

（4）糖类物质：添加蔗糖浓度过低过高都不利，一般在2.5%—3%比较适宜。

（5）物理因素对器官分化的影响

光照时间、光照强度、光质、pH值和培养温度等对器官分化均有影响。由于培养条件下光合作用能力较低，因此光照的作用更大程度上是调节细胞的分化状态，而不是合成光

合产物。光照对器官发生的调节可能与其对培养物内源激素平衡的调节有关。

（6）器官发生的基因调控：研究很薄弱

A.Homebox基因是一类与系统发育有关的基因。

－Kn1是从玉米中鉴定出的第一个植物Homebox基因，只在分生组织中表达。

－STM基因参与了茎尖分生组织的分化调控。

－Homebox基因可能通过激素介导调控器官。

B.植物编码细胞周期依赖性激酶基因cdc2在离体培养中调节细胞进入分裂状态的过程

起着关键的作用。

（五）介绍“挑战杯”获奖作品“红掌气生根再生快繁体系建立”研究的全过程。

文：王桂兰等“红掌叶片愈伤组织和气生根再生团块的细胞学研究”

《园艺学报》2006（3），587～591

四、体细胞胚胎发生

细胞分裂 再分化

植物细胞――→体细胞胚――→植株

1958年Steward胡萝卜离体培养经过体细胞胚胎发生再生植株，此后胡萝卜一直被广泛地用于离体条件下胚胎发生过程中各种问题的研究。

对这种现象做过比较详细研究的其它植物有石龙芮、博落回以及柑橘属和咖啡属的一些物种。

（一）、愈伤组织的种类

1、胚性愈伤组织：表面光滑、组织结构紧凑、细胞小、再生力强。胚性愈伤组织容

易形成

胚状体，所以被称为胚性愈伤组织。

体细胞胚（胚状体、体胚）:指离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细

胞是体细胞还是生殖细胞）。

这一定义有以下几方面的界定：

①体细胞胚是离体培养的产物，只限于在离体培养范围使用，

以区别于无融合生殖胚；

②体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚；

③体细胞经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官发生形成

个体的途径。

2、非胚性愈伤组织：表面粗糙、组织结构疏松、细胞大。一般非胚性愈伤组织

诱导率较高，

可达到100％，而胚性愈伤组织诱导率相对较低。

（二）、体细胞胚的发生来源

1、外植体上直接产生胚状体

以叶片为外植体的培养中，体细胞胚的直接形成。可分为2个阶段：

①诱导期：叶片表皮细胞或亚表皮细胞感受培养刺激，进入分裂状态。

②胚胎发育期：形成的瘤状物继续发育，经过球形胚、心

形胚、鱼雷胚、子叶胚、成熟胚等发育过程，最后形成

体细胞胚。

2、由胚性愈伤组织产生胚状体

胚性愈伤组织的表面是高度分生组织化的细胞团，其表面可以产生大量的胚状体。在以幼胚、胚以及子叶为外植体时，

通常可以直接诱导胚性愈伤组织产生，进而发生体细胞胚。

一般培养过程：

胚性愈伤组织诱导培养基 体细胞胚诱导培养基 体细胞胚发芽培养基

有些植物种子需要冷处理才能打破休眠而发芽，这些植物的体细胞胚往往也需要冷处理，才能萌发长成植株。如葡萄的体

胚需在4℃下处理2周，才能发芽。

3、由非胚性愈伤组织产生胚状体

经过愈伤组织的胚胎发生需要3个培养阶段：

①诱导外植体形成愈伤组织；②诱导愈伤组织胚性化；③体细胞胚形成。

因此，经过愈伤组织的体细胞胚胎发生，胚性愈伤组织的形成是培养的关键。进而发生原胚，经过不同时期完成体细胞胚

胎发育。

4、悬浮细胞产生体胚状体

在胡萝卜细胞悬浮培养中，其培养物细胞中存在2种类型：一是自由分散在培养基中的大而高度液泡化的细胞，这类细胞

一般不具备胚胎发生潜力；二是成簇成团的体积小而细胞质致

密的细胞，这类细胞具有成胚能力，因而，把这类细胞团又称

为胚性细胞团。

胚性细胞团转移到适宜的胚胎发生培养基上以后，其外围的许多细胞开始第一次不均等分裂，靠近细胞团方向的一个细胞较大，以后发育成类似胚柄的结构。另一个细胞则继续分裂形成类似原胚的结构，以后经过类似于体内的发育过程，经球形期、心形期等发育阶段形成完整的体细胞胚（李浚明，1991）。

通过悬浮细胞系再生体细胞胚，由于胚性细胞可以继代增殖，因此可提高胚胎的生产效率。(在悬浮培养中，有各种类

型的细胞及其组成的细胞团（愈伤组织）：胚性愈伤组织；非

胚性愈伤组织；还有细胞分裂直接形成体细胞胚)

5、单倍体胚胎发生

花药、花粉以及雌性器官中大部分细胞为单倍体，这些器官和细胞容易形成胚状体。由

单倍体细胞形成的胚状体也是单倍体。

(三)、体细胞胚的结构与发育特点

1、与器官发生途径相比体细胞胚在组织学上有3个特征：

①体细胞胚最根本的特征是具有双极性，即在发育的早期阶段从方向

相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都是单极性的；

②体细胞胚的维管组织与外植体现存组织无解剖结构上的联系，即存

在生理隔离，而不定根或不定芽与外植体或愈伤组织的维管组织有联系。

③体细胞胚胎的维管组织分布是独立的Y字形结构，而不定芽维管组织无此结构。

由于大多数体细胞胚起源于单细胞，因此对于单个植株来讲，通过体细胞胚形成的再生植株，其遗传特性相对稳定（因为只有未发生畸变的细胞才有可能形成体细胞胚）。

2、胚状体与合子胚的比较

合子胚 胚状体

质量 萌发率高，质量好 萌发率低，质量差

来源 受精卵 体细胞

胚柄 有，明显 即使有也不明显（一般无胚柄只有类似胚柄的结构）

形态 子叶固定，体积相对较大 复杂，常有两个以上的子叶，体积相对较小

变异率 低 高

体细胞胚没有休眠而直接形成植株。合子胚在胚胎发育完全进入子叶期以后，经过一系列的物质积累和脱水就进入休眠。同种植物比较，体细胞胚的体积明显小于合子胚。

（四）、影响体细胞胚发生的因素

1、外源激素对体细胞胚胎发生的调控

2，4－D是应用最为广泛的生长素。2，4－D的应用有着规律性的变化。首先是在较高浓度（一般0.5-2.0mg/L，花生需要在10mg/L以

上）下诱导胚性细胞的形成，然后在降低2，4－D的浓度下产生早期胚胎，一般在球形胚形成后，除去生长素则有利于体细胞胚的继续发育。

在体胚诱导培养基中，细胞分裂素的使用浓度一般低于生长素。

2、培养基及培养条件对体细胞胚形成的影响

培养基

氮源的影响：体细胞胚产生要求一定浓度的还原态氮NH+4 。氨基酸、酰胺等有机酸也能促进体胚的发生。酵母提取液、水解酪蛋白等含

有多种氨基酸，加入某一种有利于体胚发生。

无机盐浓度：球形胚形成后，如果降低培养基的无机盐浓度，可以显著促进体细胞胚的进一步发育。

糖：有时体细胞胚发育后期降低蔗糖浓度，有利于胚的继续发育和提高体细胞胚的成苗率。

培养条件 培养温度、光照等也影响体胚发生

一般胚性愈伤组织诱导需要在黑暗下进行，待转到体胚诱导培养上后，可在光照下培养。

3、植物的来源和年龄

外植体不同体胚发生能力也不同。一般生长点、幼胚、花药、花粉等容易形成胚性愈伤组织和体胚。

4、不同基因型间体细胞胚形成能力的差异

不同植物或同一植物不同品种（不同基因型）间胚性愈伤组织形成及体胚发生能力差别很大。在已成功获得体细胞胚的植物中，以

自然条件下容易产生无融合生殖胚的植物为多，且培养条件相对较

为简单，如咖啡属植物、芸香科植物等。

5、其他因素培养温度、光照时间和强度等也会影响体胚发生

一般胚性愈伤组织诱导需在黑暗下进行，待转到体胚诱导培养上后，可在光照下培养。

6、体细胞胚发生的生化和分子基础：

（1）体细胞胚形成过程中内源生长素的变化

（2）体细胞胚发生过程中特异蛋白质

（3）体细胞胚形成的基因表达调控

7、介绍相关科研论文：陈超等“长寿花胚性愈伤组织诱导与胚状体形态发生”《园艺学报》2004（2）

胚状体应用:

1、快速繁殖

2、人工种子

3、研究体细胞胚胎发生发育过程

五、人工种子

人工种子最早是由Murashige 1978年提出，随即引起各国政府和科学界高度重视。

我国1984年由上海植生所罗士韦先生最早介绍了人工种子。

1987年开始将人工种子研究纳入国家高科技发展规划（863计

划），主要是一些经济作物（西洋参、橡胶树、南方特有果树及高

营养胡萝卜等）的人工种子的研究。

1、人工种子概念有狭义和广义之分：

（狭义）植物离体培养中产生的体细胞胚，包裹在含有养分和具有保护功能的物质中，并在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。

（广义）在体细胞胚、微型营养变态器官、不定芽等微繁体之外加

上必要的营养成分后，用具有一定通透性而无毒的材料将其包裹起

来，形成的与天然种子相似的颗粒体。

2、狭义的人工种子结构：由胚状体、人工胚乳、人工种皮三部分构

成。

胚状体：由组织培养产生的具有胚芽、胚根双极性、类似天然种子胚的结构。

人工胚乳：人工配制的保证胚状体生长发育需要的营养物质，一般以生成胚状体的培养基为主，外加一定量的植物激素、抗生素等物质，尽可

能提供胚状体正常萌发所需条件。

人工种皮：包裹在最外层的胶质化合物薄膜，要求人工种皮能够允许内外气体交换畅通，防止人工胚乳中的水分及各类营养物质渗漏，并具有

一定的机械抗压性。

3、人工种子的制作流程：主要包括胚状体的诱导、包裹制种与发芽试验。

具体过程为：

愈伤组织的诱导——体细胞胚的诱导——体细胞胚的同步化——体细胞胚的分选——体细胞胚的包裹（人工胚乳）——包裹外膜

——储藏——发芽成苗试验——体细胞变异程度与农艺研究首先诱

导愈伤组织，并在含生长素的培养液中悬浮培养，然后置于含生长

素的发酵罐中使细胞迅速扩增，再将细胞移入无生长素的发酵罐中

诱导出大量胚状体。

为使种子发芽均匀，在包裹制种前必须将胚状体进行同步化处理。同步化方法主要有低温法、控制培养基成分法、密度梯度离心

法、过滤分选法等，其中过滤分选法较实用快速。

4、以海藻酸钠为包埋介质的操作程序：

将用人工胚乳溶液制备好的海藻酸钠（2～4％），按一定比例加入胚状体，混均后逐滴滴到氯化钙（2～2.5%）溶液中,经20～30min 离子交换络合作用，即形成一定刚性的小球珠，再用水漂洗20min终止反应。此时人工种子是一种胶囊状结构，将其晾干后可贮存或播种。

关于人工种子的储藏、萌发等问题，现在的实验结果还没达到令人满意的程度。

目前，世界范围内已进行人工种子试验的物种有：胡萝卜、苜蓿、芹菜、西洋参、橡胶树、柑桔、云杉、百合、杨树等30多种植物。

5、介绍相关科研论文：王桂兰等“长寿花组织培养与人工种子研究”《北京农学院学报》2003（3）

作业：

1．植物细胞全能性、脱分化、再分化、转分化？

2．植物细胞全能性表达的基本条件？

3．离体培养条件下植物细胞全能性表达的过程？

4．细胞脱分化过程中细胞结构的变化？

5．离体器官的发生方式有哪些？

6．离体条件下生长素与细胞分裂素在细胞分化中的作用？

7．影响器官发生和体细胞胚发生的因素有哪些?

8．体细胞胚与合子胚在形成途径和结构上的异同？

参考文献：

1、催凯荣，戴若兰主编《植物体细胞胚发生的分子生物学》科学出版社 2000年

2、朱至清等，“烟草叶片外植体脱分化细胞中的蛋白体”《植物学报》1984(2)，126～129

3、王桂兰等，“红掌气生根再生快繁体系的建立”《植物生理学通讯》2005(3),297～301

4、王桂兰等，“红掌叶片愈伤组织和气生根再生团块的细胞学研究”《园艺学报》2006(3)，587～591

5、陈超等，“长寿花胚性愈伤组织诱导与胚状体形态发生”《园艺学报》2004（2）

6、王桂兰等，“长寿花组织培养与人工种子研究”《北京农学院学报》2003（3）

生物选修三植物细胞工程知识点清单(自主整理适合学生识记)

植物细胞工程知识点清单 （一）植物组织培养 1.理论基础（原理）：细胞全能性 2.全能性概念：具有某生物发育所需全部遗传信息的细胞，都具有发育成完整个体的潜能。 3、过程：外植体—脱分化—愈伤组织—再分化—丛芽、不定根—新植株 4、相关概念及实验注意事项 ①外植体：离体植物器官、组织、细胞 ②愈伤组织：高度液泡化，无固定形态的薄壁细胞。全能性高，分化程度低 ③外植体消毒：70%酒精30s—无菌水冲洗—次氯酸钠30min—无菌水冲洗 ④取材：选取形成层部位 ⑤脱分化：23~26o C，避光 ⑥再分化：将愈伤组织转接到分化培养基，光照下培养 ⑦生长素/ 细胞分裂素：比值高—促进生根；比值低—促进发芽 5、植物组织培养概念：在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官，组织，细胞培养在人工配置的培养基上，诱导其产生愈伤组织，丛芽，最终形成完整的植株。 6、地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。 （二）植物体细胞杂交 1、植物体细胞杂交概念：将不同种的植物细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的过程。 2、过程及注意事项： ①去除细胞壁：酶解法（纤维素酶、果胶酶），获得原生质体 ②原生质体融合方法：物理法（离心、震荡、电刺激）；化学法：聚乙二醇 ③细胞融合成功的标志：杂种细胞再生细胞壁 3、融合结果：获得杂种细胞，进而获得杂种植株。 A细胞+B细胞所得杂种植株遗传物质=A+B 4、成功例子：番茄—马铃薯；烟草—海岛烟草；胡萝卜—羊角芹；白菜—甘蓝

5、优点：克服远缘杂交不亲和障碍 6、局限性：不能按照人的要求表达性状 （三）植物细胞工程应用 1、微型繁殖：可以高效快速地实现种苗的大量繁殖（观赏植物，经济林木，无性繁殖作物） 2、作物脱毒：采用茎尖等分生区组织培养来除去病毒（因为分生区附近的病毒极少或没有） 如：马铃薯；草莓；甘蔗；菠萝、香蕉等经济作物 3、人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经人工薄膜包装得到的种子。优点：完全保持优良品种的遗传特性，不受季节的限制；方便储藏和运输 4、作物新品种培育：单倍体育种 5、突变体利用：在组织培养中会出现突变体，通过从有用的突变体中选育出新品种（如筛选抗病、抗盐、含高蛋白的突变体） 6、细胞产物的生产：通过能够产生对人们有利的产物的细胞进行组织培养，从而让它们能够产生大量的细胞产物。 如：生产人参皂甙，三七，紫草，银杏等。 （定向诱导愈伤组织细胞分化为产生特定物质的细胞，提纯产物）

江苏省高中生物 第九讲 实验(一)学案 苏教版必修1

第九讲实验(一 ) 测试内容测试要求五年考情 检测生物组织中的还原糖、脂肪和蛋白质 实验原理 实验材料用具、实验方法步骤 实验结果及其分析 B A C 2013、2014、2015、2017(选)、 2016(主) 观察植物细胞的质壁分离和复原 实验原理 实验材料用具、实验方法步骤 实验结果及其分析 B A C 2015(选)、2016(选、主) 观察植物细胞的有丝分裂 实验原理 实验材料用具、实验方法步骤 实验结果及其分析 B A C 2013(主)、2015(选)、2016(主 ) 1.还原糖与________发生作用，生成________沉淀；脂肪被________染成________；蛋白质与________发生作用，产生________反应。 2.观察有丝分裂时常用的材料是____________细胞。染色体易被________________(如龙胆紫、醋酸洋红)染成深色。 3.有丝分裂装片的制作过程：________→________→________→________。 4.植物细胞的________相当于一层半透膜，当细胞液的浓度________外界溶液的浓度时，细胞液中的水分就透过原生质层进入外界溶液中，使细胞壁与原生质层都出现一定程度的收缩。由于原生质层比细胞壁的伸缩性________，当细胞失水时，原生质层就会与细胞壁分离开来，也就是________。当细胞液的浓度________外界溶液的浓度时，外界溶液中的水分就透过原生质层进入细胞液中，使细胞质壁分离复原。 5.光学显微镜的放大倍数：显微镜的放大倍数等于________放大倍数与________放大倍数的________。物镜越长，放大倍数越________，距装片距离越________；目镜越长，放大倍数越________。 6.显微镜的成像特点：显微镜下所成的像是倒立的放大的虚像，如字母“b”所成的像是________。要移动物像到视野中央时，应向________方向移动装片。 1.斐林试剂与双缩脲试剂的比较 (1) 溶液浓度不同：斐林试剂中NaOH浓度为0.1 g/mL，CuSO4浓度为0.05 g/mL；双缩脲试剂中NaOH浓度为0.1 g/mL，CuSO4浓度为0.01 g/mL。 (2) 使用方法不同：斐林试剂使用时，先把NaOH溶液和CuSO4溶液等量混合，然后立即使用，并需进行水浴加热后观察；双缩脲试剂使用时，先加入NaOH溶液，再滴加几滴CuSO4溶液，振荡后直接观察。 2.光学显微镜的使用

苏教版选修第二节《植物细胞工程》word学案

第2节 植物细胞工程 1、概念：是指依据 原理，在 条件下，分离植物的 、 、 或 （称为 ），并在培养基上培养，在适宜的条件下使其长成部分或完整植株的技术。 2、理论基础：植物细胞全能性 的细胞具有发育成为一个新的生物个体的 。因为每个细胞内都 含有该物种的 ，具有发育成完整个体所必需的 。 全能性的表现条件：① ②适宜的 。 全能性大小：①受精卵＞胚胎干细胞＞生殖细胞＞体细胞；②植物细胞＞动物细胞 3、材料：植株的 、 、 和 等。 4、培养条件： ① ； ②适宜的 ，其成分包括水、无机营 养、 、 和 等。 5、过程： 离体的器官、组织或细胞???→?脱分化（ ）???→?再分化 （ ）?→?植株。 ◆脱分化：由 的植物细胞形成 的过程。 ◆愈伤组织：是一团没有特定 和 并处于 状态的 细胞。 ◆再分化：愈伤组织重新 形成根、芽等器官的过程。 ◆胚状体：愈伤组织在一定的培养条件下 形成，类似 ，具有 和 ，在适宜条件下可发育成新的植株。 ◆人工种子：在 外包裹 和 制成。 人工种子的制备包括从植物组织培养诱导体细胞胚状体的发生， 的控制以及人工 的包埋过程。 人工种皮的制作材料： 人工胚乳的主要成分： 人工种子的优点：①不受 ； ② ； ③有利于 等。 人工种子的应用：①濒危植物的保护； ②经济植物的 等。 阅读：植物细胞全能性表现的条件：⑴离体；⑵无菌：培养基、外植体、操作工具及操 作环境必须严格消毒；⑶人为控制：控制好培养基及各种条件；⑷培养基成分：水、无机盐等无机营养成分、蔗糖、氨基酸等有机营养成分、植物激素；⑸环境条件：脱分化避光，再分化需光，光使细胞内形成叶绿体、叶绿素，进行光合作用；适宜的PH 和充足的氧气。 例1：要将胡萝卜韧皮部细胞培养成完整植株，不需要（ ） A.具有完整细胞核的细胞； B.离体状态； C.导入外源基因； D.一定的营养物质和激素。 二、植物细胞培养： 1、概念：是在实验室或工厂生产条件下，将组织培养过程中形成的 或其 他易分散的组织置于 中，进行 培养，得到分散游离的 细胞，通过 培养使细胞增殖，从而获得大量的 的一种技术。

植物烟草实验

烟草叶片愈伤组织诱导 摘要用不同成分培养基，附加0.8%琼脂，3%蔗糖，调pH5.8—6.0，取烟草叶片 作为外植体进行愈伤组织诱导培养，计算污染率、诱导率以及诱导情况，观察愈伤 组织的发生情况。实验表明，养分较高的培养基，外植体生长情况较好。当细胞分 裂素高于生长素的浓度时，有利于分化出芽；细胞分裂素低于生长素的浓度时，有 利于分化出根；当细胞分裂素及生长素的浓度适合时，愈伤组织不分化，但是生长 旺盛。 关键词：烟草叶片愈伤组织诱导 前言 烟草（Nicotiana tabacum）又名草烟，属茄科烟草属的一年生草本植物，本属约有60种，原产于美洲和大洋洲[1]。烟草是重要的经济作物和工业原料作物，其体内所含的烟碱等生物碱是非常宝贵的医药及化工原料[2]。有报道烟草细胞悬浮培养物获得细胞分裂素类物质，因此很有必要对烟草的组培快繁进行研究，以获得更有效的方法提高产率和产量。柯善强综述植物细胞的遗传全能性与组织培养形态发生控制[3]，戴冕进行了烟草叶肉原生质体再生植株的研究[4] ,徐瑞娟等通过烟草花序苞叶的离体培养分化出花芽[5],战淑敏用烟草叶组织培养直接获得再生植株[6]。本实验以烟草叶片组织为外植体进行组织培养，诱导愈伤组织，观察愈伤组织诱导情况。 1.材料与方法 1.1 配置培养基母液，每2人为一个小组，配置以下培养基，并分装，灭菌，然后室温下放置一周。 1.2 取烟草叶片取烟草的嫩叶片作外植体。先用自来水冲洗干净，再用蒸馏水洗2次后，置于超净台上，于无菌条件下先用75%的酒精浸泡30秒，然后置于无菌瓶中用10%次氯酸钠溶

液浸泡20分钟至30分钟，再用无菌水冲洗4次，最后在无菌培养皿中将嫩叶片切成1cm见方小块，接种在培养基中。 1.3.1 观察污染情况：观察是否有细菌性污染（菌斑呈粘液状,接种后1-2天出现）和真菌性污染（出现不同颜色霉菌,接种后3-10天出现），并计数。计算污染率。 污染率(%)=污染的材料数/总接种材料数×100%[7] 1.3.2 观察各培养基中的外植体产生愈伤组织的情况，愈伤组织出现时间和愈伤组织形态特征（颜色和质地等），计数形成愈伤组织的材料数，并计算诱导率。 诱导率(%)=形成愈伤组织的材料数/总接种材料数×100%[7] 2.结果及分析 2.1愈伤组织诱导情况 三天后发现部分组有细菌性污染（如图1），7天后发现部分有真菌性污染。计算出污染率和如表1所示： 表1. 愈伤组织诱导的污染情况 造成污染的可能原因有：叶片消毒灭菌不彻底，接种室超净工作台消毒不彻底，接种操作时操作不规范等等。 叶片在第4天后边缘慢慢上卷，外植体开始膨胀，于接种后第7 天膨大成圆拱型，愈伤首先发生在叶片边缘, 为黄绿色颗粒状，有些呈现半透明。随着进一步培养, 10天愈伤组织不断加大。 排除褐变及感染的外植体后，诱导情况如表2所示： 表2.愈伤组织诱导情况

高中生物选修3优质教学设计2：2.1.1植物细胞工程基本技术 教案

第二节细胞工程简介──植物细胞工程教学设计案例 教学目标 1．知识方面 （1）细胞的全能性（理解）。 （2）植物细胞工程的主要技术──植物组织培养和植物体细胞杂交（知道）。 2．态度观念方面 （1）通过介绍植物组织培养技术发展简史,植物体细胞杂交技术取得的进展和尚未解决的问题，激发学生探索生命科学奥秘的兴趣。同时，使学生认识到随着人们视野的不断拓宽，认知的不断加深，科学技术呈现日新月异、日臻完善的发展趋势。从而在学习过程中用发展的眼光看待问题，分析问题，不墨守陈规，不拘泥于原有知识的限制而勇于开拓，推陈出新。 （2）在植物细胞工程两大技术的学习过程中，渗透科学态度、科学方法和科学精神的养成教育。 3．能力方面 （1）在教学过程中，合理利用录像、软件等相关资料，培养学生的观察能力、思维能力以及整合、运用科学信息的能力。 （2）创设问题情境，在质疑、探究的学习过程中，培养学生独立思考，推理判断和创造性思维能力。 （3）通过联系农业生产实际，培养学生活学活用，理论联系实际的能力。 重点、难点分析 1．植物组织培养是本节的重点。 分析：植物组织培养重点讲述植物组织培养技术和基本原理，即离体培养的植物细胞脱分化和再分化的过程。其不仅在知识上对高二必修课中有关内容进行了深化和扩展，而且还为培育无病毒植株、制备人工种子、培养转基因植物以及植物体细胞杂交等提供技术支持。

同时，随着科学技术的不断进步，植物组织培养这门崭新的技术将日益普及和深入，成为现代农业生产中重要的技术手段。 2．植物体细胞杂交是本课的难点。 分析：植物体细胞杂交是在植物组培技术的基础上，借助动物细胞融合的方法发展起来的一门新型生物技术。这部分知识对于学生是全新的，加之与其有关的感性材料不多，因而给教学带来一定难度。 教学模式 自学──指导──启发──探究。 教学手段 实物材料、录像、软件。 课时安排一课时。 设计思路 1．布置课前预习：要求学生充分复习与本课有关的旧知识，预习新课，并对新知识的框架及层次结构有一个初步的认识。 2．从新旧知识联系入手，进一步深入学习细胞全能性理论，并在学习过程中，渗透对学生能力和方法的培养。 3．充分利用学生已有的知识积累，借助于多种直观教学手段，采用综合──分散──深化的教学方法，引导学生对植物组培知识进行比较广泛、深入的学习。 4．在学习植物体细胞杂交技术时，教师有意识地创设情境，提出渐进式问题，引导学生进行思维探索，并借助于计算机课件，对该技术进行由点及面的学习。 5．智能训练，实现知识的正向迁移。 重点提示 1．在本段教学中，应注意发挥教材的多功能性，深刻发掘教材的内涵，以知识学习为载体，强化学生多方面良好素质和能力的培养。

1340064《植物细胞工程》课程教学大纲

GDOU-B-11-213 《植物细胞工程》课程教学大纲 课程简介 课程简介： 本课程以植物细胞工程有关的概念、基本原理、操作程序和关键技术为主线，系统传授植物细胞的全能性、植物细胞脱分化和再分化、植物快速微繁殖、人工诱发单倍体、植物胚胎培养、植物单细胞培养与突变体筛选、原生质体培养、细胞融合、人工种子、超低温冷冻贮藏种质、细胞遗传转化体系等内容。 课程大纲 一、课程的性质与任务： 本课程为作物遗传专业研究生的专业课，其涉及当今生物科技领域的许多高新技术。本课程在专业性上起着承上启下的作用：植物学、植物生理生化和作物遗传学作为本课程的基础课程；基因工程和作物育种学则是本课程的延伸和提高课程。它将理论教学和技能性教学融为一体，是开展科学研究和生产开发的重要工具。 二．课程的目的与要求： 学生学完本课程后，应掌握植物细胞工程有关的概念、基本原理、操作程序和关键技术。 三．面向专业： 本课程适宜作物遗传育种专业研究生选修。 四．先修课程： 学习本课程前，应先修《植物学》《植物生理生化》、《作物遗传学》、《作物栽培学》等有关课程。五．本课程与其它课程的联系： 先修课《植物学》为本课程打下植物发育的基础知识；《植物生理生化》为本课程打下植物生理生化的专业基础知识；《作物遗传学》为本课程打下植物遗传变异的专业基础知识；《作物栽培学》为本课程打下作物对光、温、水、肥环境条件要求的专业知识。本课程为后续课程《作物育种学》提供细胞水平的育种手段；为后续课程《基因工程》提供组织培养手段。 六．教学内容安排、要求、学时分配及作业： （教学要求按从高到低分掌握-A、理解-B、了解-C三种） 0 绪论（1学时） 0.1 植物细胞工程的概念和任务 植物细胞工程概念（A）。 植物细胞工程的内容（C）：器官培养、胚胎培养、组织培养、细胞培养、原生质体培养、培养技术的延伸。 植物细胞工程的任务（B）：研究剌激因子和营养条件（无机和有机营养、激素）；环境条件（光、温、湿）；形态发生规律、遗传的稳定性和变异性。

2020苏教版生物选修三新素养同步练习：第二章 第二节 植物细胞工程的应用知能演练轻巧夺冠(含解析)

[随堂检测] 知识点一植物组织培养技术的应用 1．甘薯种植多年后往往会感染病毒而减产，为此农户都希望得到无病毒的幼苗进行种植。获得无病毒幼苗的最佳办法是() A．选择优良品种进行杂交 B．进行远缘体细胞杂交 C．利用芽尖进行组织培养 D．人工诱导基因突变 解析：选C。利用芽尖通过组织培养能够快速得到大量的甘薯无病毒苗，提高繁殖率。 2．红江橙种植多年后易积累病毒而导致品种退化。目前生产上采用茎尖分生组织离体培养的方法快速繁殖无病毒的种苗，以保证该品种的品质和产量水平。这种通过分生组织离体培养获得种苗的过程不涉及细胞的() A．有丝分裂B．分化 C．减数分裂D．全能性 解析：选C。采用茎尖分生组织离体培养获得无病毒种苗的技术是植物的组织培养，整个过程中植物细胞的分裂方式都是有丝分裂，不涉及减数分裂，植物组织培养技术的原理是植物细胞的全能性。 3．制造人工种子的原理是在组织培养得到的“胚状体”的最外面用一层有机膜包裹，并在薄膜以内放入一些营养物质，如图所示。据此判断下列说法不正确的是() A．“胚状体”最外面的一层有机膜和里面营养物质分别具有种皮和胚乳的功能 B．“胚状体”来源于离体的植物体细胞，其形成过程中要经过的生理变化大体上是脱分化和再分化 C．从保证人工种子正常的生命力及生态系统物质循环上来看，其外部薄膜应具有全透性和能被微生物降解的特点 D．在人工种子萌发的过程中“胚状体”细胞吸收营养液中的物质用于生长等 解析：选C。从保证人工种子正常的生命力上来看，其外部薄膜应具有半透性，可以透气和透水，但是不能让薄膜以内的营养物质出来。 知识点二植物细胞培养技术的应用 4．下列关于植物组织培养应用的说法，错误的是() A．脱毒苗、人工种子的制备都运用了植物组织培养技术 B．采用茎尖、根尖等组织经培养得到的脱毒植物可提高产量和品质 C．运用组织培养得到人参、紫草等植株个体，然后从它们的细胞中提取细胞产物 D．组织培养过程中经人工诱变等可得到有用突变体，如抗除草剂的白三叶草等已用于生产 解析：选C。运用组织培养技术大量生产人参皂苷干粉、紫草素等药物，利用了细胞产物的工厂化生产，并未培养出完整的植株，而是将离体组织、器官培养到愈伤组织阶段，利用细胞的分裂增殖，获得大量的细胞产物。

2.1.1植物细胞工程的基本技术

2.1.1 植物细胞工程 教学目标 1、简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术 2、列举植物细胞工程的实际应用 3、尝试进行植物组织培养 教学重点 1、植物组织培养的原理和过程 2、植物体细胞杂交的原理 3、植物细胞工程应用的实例 教学难点 植物组织培养的实验 教学过程 复习： 细胞分化： 1、概念：在个体发育过程中，由一种或一个细胞通过增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生 稳定性差异的过程 注意：不改变细胞数目，不改变遗传，增加了细胞种类 2、原因：相同的基因在特定的时间和空间内进行选择性表达的结果 3、特点： ①普遍性：单细胞生物没有细胞分化 ②持久性：细胞分化存在于生物体的整个生命进程中，但在胚胎时期达到最大限度 ③不可逆性：分化的细胞要维持分化后的状态直到死亡 4、结果：产生了不同的组织和器官 5、意义：个体发育的基础（包括细胞分裂和细胞分化） 细胞全能性： 1、概念：已经分化的细胞，仍然具有发育成完整个体的潜能(起点：细胞、组织、器官；终点：完整个体) 举例：壁虎断尾后再生（×）；皮肤烧伤后再生（×）；种子长成幼苗（√）；植物扦插（√）； 受精卵发育成婴儿（√）； 2、物质基础：每个细胞里有该种生物全套的遗传信息（所以单个卵细胞或精子也可发育成完整个体，体现全能性） 3、条件：①离体②营养物质③外界条件 4、发挥顺序 植物细胞》动物细胞 受精卵＞生殖细胞（卵＞精子）＞体细胞 体细胞：分裂能力强的细胞＞分裂能力弱的细胞（分化程度低＞分化程度高） 注意：①受精卵是未分化的细胞，所以全能性最高 ②生殖细胞是分化程度高，全能性也高（特例）

细胞工程：是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞水平或细胞器水平上的操作，按照 人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。 分类：植物细胞工程和动物细胞工程 一、植物组织培养 1、理论基础：植物细胞全能性 2、流程： 相关知识点： ①取材：根尖、茎尖、芽尖等分生组织，分裂能力强，全能性易发挥 ②脱分化（诱导培养基） 实质：使细胞恢复分裂能力 a ．概念：让已经分化的细胞经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转变成未分化的细胞的过程 形式：固体 b ．培养基 无机物：水、无机盐 成分 有机物：氨基酸、维生素、蔗糖 植物激素：生长素和细胞分裂素 注：培养基中加入蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压 另外，脱分化培养基上可加入2,4－D ，促进愈伤组织的产生和生长 c ．条件：黑暗（因为在光照条件下容易分化成维管组织，不利于产生大量的愈伤组织） 无菌（一旦污染，迅速生长的各种杂菌不仅会与培养物争夺营养，而且杂菌会产生大量对培养 ③愈伤组织：排列疏松，高度液泡化的无定形状态的薄壁细胞。（分化程度低，全能性高） ④再分化（分化培养基） 实质：基因的选择性表达 a ．概念：脱分化产生的愈伤组织继续培养又可以重新分化成根或芽等器官的过程 b ．培养基：同脱分化培养基 c ．条件：光照（有利于诱导形成叶绿素） ⑤植物激素的使用对植物组织培养的影响 高→有利于根的形成 a ．使用比例： 低→有利于芽的分化 适中→促进愈伤组织的形成 先生长素后细胞分裂素：有利于细胞分裂，但不分化 b ．使用顺序 先细胞分裂素后生长素：细胞既分裂又分化 同时使用两种激素：分化频率提高 离体的植物细胞、 组织或器官（外植体） 脱分化 已分化 未分化 生长素 细胞分裂素

植物细胞工程综合大实验

植物细胞工程综合大实验（一） ——培养基配制和无菌操作 一、实验目的与要求 熟练掌握器皿的洗涤 MS培养基的配制分装 培养基和物品的高压灭菌 实验室的消毒灭菌 植物材料的取材及流水冲洗 无菌操作 材料的培养观察 二、实验原理 植物细胞的全能性。 三、仪器设备与器具 电子天平、移液枪、冰箱、高压锅、超净工作台、 三角瓶、烧杯、容量瓶、培养皿、搪瓷缸、镊子、 解剖刀、酒精灯、试剂瓶、玻璃棒、线绳、pH试纸、封口膜、试管刷、洗涤剂、打火机等。 四、实验材料 彩云阁茎段（用于诱导愈伤组织） 茎节（用于诱导芽） 五、实验方法与步骤 （一）器皿的洗涤

一般器皿 有培养物但未污染的器皿 有培养物且污染的器皿 （二）MS培养基的配制分装 1、MS培养基母液的配制 母液A-F，每组配制A-E 100ml、F 50ml 0.1%升汞的配制 75%酒精的配制 6-BA NAA 2、MS培养基的配制 按每人配制100ml，分5小瓶。 过程如下；每组按1L配制，先取容器内加70%的蒸馏水； 加入蔗糖30g/L；量取母液A-F；加入PGR（自己设计）；用容量瓶定容；用0.1-1N NAOH或HCl调整pH5.6-5.8；每人分100ml；加琼脂粉8g/L；分装到5个小三角瓶中、封口。 （三）培养基和物品的高压灭菌 培养基、无菌水（每组至少5瓶）、空瓶（每组至少2个）、烧杯（每组至少1个）、培养皿（每组至少一套）、接种工具（2套），包好或者分好以备高压灭菌。 高压锅的使用。 （四）实验室的消毒灭菌

75%的酒精擦拭超净工作台内表面，新洁尔灭水进行超净工作台外表面、培养架表面、墙壁及其他房间表面的擦拭。 （五）植物材料的取材及流水冲洗 选取适宜的彩云阁茎节及茎段，切割成适宜大小后放在流水下冲洗。 （六）无菌操作 演示。 （七）材料的培养观察 接种完的材料放在培养室的培养架上进行培养。培养初期每天观察一次，持续1周。之后每2-3天观察一次。 统计指标： 污染率（%）= （污染的外植体个数／接种外植体的总数）×100%。 愈伤组织诱导率（%）= （长愈伤外植体个数／接种外植体总数）×100%。 芽诱导率（%）= （长芽外植体个数／接种外植体的总数）×100%。（八）结果与分析

植物保生长与环境实训大纲

《植物生长与环境》实验教学大纲 《植物生长与环境》实验是《植物生长与环境》课程教学过程中的重要环节，是对理论教学的重要补充和验证，是实践技能培养的重要途径。实验内容的安排以实用性为宗旨，以提高实践技能为目的，做到与理论教学相辅相成，互相促进，提高教学效果。 按校种植类专业教学计划要求，《植物生长与环境》实验分12个项目，教学30学时。 具体内容如下： 实验实训一显微镜的构造及使用方法 实验实训二植物的细胞结构的观察 实验实训三植物营养器官的观察 实验实训四植物生殖器官的观察 实验实训五快速测定种子生命力的方法 实验实训六土壤含水量测定与田间验墒技术 实验实训七土壤样品的采集与制备 实验实训八土壤酸碱度的测定 实验实训九降水量与空气湿度的观测 实验实训十土壤温度与空气温度的测定 实验实训十一土壤速效氮、磷、钾的测定

实验实训十二化学肥料定性鉴定 实训大纲 实验实训一显微镜的构造及使用方法 一、目的要求 1. 了解显微镜的构造、性能及成像原理。 2. 掌握显微镜的正确适用及维护方法。 二、实验内容 显微镜各部分的名称和作用。显微镜的使用方法。显微镜的保养与使用注意事项。 实验实训二植物的细胞结构的观察 一、目的要求： （1）学会制作和观察植物细胞的临时装片． （2）认识植物细胞的基本结构． （3）会画植物细胞结构图． 二、实验内容: 1、临时玻片标本切片的制作。 2、光学显微镜下植物细胞结构观察 3、生物绘图法。通过观察切片掌握细胞的基本结构。 三、实验作业 绘洋葱鳞叶表皮细胞结构图，并注明各部分名称

实验实训三植物营养器官的观察 一、目的要求 1、掌握双子叶植物和单子叶植物根的结构特点。了解种子植物的根尖分区。 2、掌握枝、芽和茎的外部形态和类型。掌握双子叶植物茎的内部构造。 3、掌握叶的组成、叶片的形态、叶脉的类型、单叶与复叶的区别、复叶的类型、叶序。掌握叶的解剖结构。 4、学会叶脉书签的制作。 二、实验内容： 根、茎、叶的形态描述和内部解剖结构的观察 三、实验作业 绘出根茎叶结构图 实验实训四植物生殖器官的观察 一、实验目的要求: 掌握花的基本结构及其形态变化，认识各种花和花序的类型。 重点掌握雄蕊和雌蕊的构造。 二、实验内容: 1、油菜花的观察

植物细胞工程

HUAZHONG AGRICULTURAL UNIVERSITY 烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生的研究Research on Callus Induction and Plant Regeneration of Tobacco Leaves 姓名: 黄金波 CANDIDATE：Huang-Jin Bo 学号: 2012304200510 STUDENT ID：2012304200510 课程: 植物细胞工程实验CURRICULUM：Plant Cell Engineering Experiment 班级: MAJOR: 生技1201班Biotechnology 1201 指导老师：SUPERVISOR：柳俊齐迎春陈浩 Liu-Jun Qi-Ying Chun Chen-Hao 中国武汉 WUHAN， CHINA

二○一四年十二月DEC, 2014

烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生的研究 黄金波 华中农业大学生命科学技术学院生技1201班 [摘要] [目的]以烟草叶片为材料，通过这次实验，基本掌握植物愈伤组织诱导与植株再 生的原理和方法，熟练掌握相关实验操作技术；另外，通过本次实验，完成烟草植株再生，并对比光照和黑暗等不同方法，对诱导愈伤组织状态和诱导率的影响，进行结果分析。 [方法]在无菌条件下，把烟草叶片剪成1cm2大小的小方块，先通过含0.25mg/L NAA和0.25mg/L BA的MS诱导培养基在光照和黑暗条件下诱导培养；三周后，转接到含0.25mg/L NAA和1.0mg/L BA的MS分化培养基中光照培养；两个月后，观察结果，统计分析。 [结果]诱导培养后，在光照条件下和在黑暗条件下培养的均有67.7%的被污染了；用剩下的33.3%全部接种到分化培养基上培养。结果表明分化率在光照条件下和在黑暗条件下无差别；每个愈伤组织分化芽数在光照条件下明显多于在黑暗条件下诱导；分化芽状态在黑暗和光照条件有一定的区别，分化植株苗在光照和黑暗条件下诱导没有明显区别。 [结论]光照条件和在黑暗条件下诱导可以影响愈伤分化芽数和分化芽状态。 [关键词] 烟草叶片；愈伤组织；细胞工程；分化；诱导；植株再生 Research on Callus Induction and Plant Regeneration of Tobacco Leaves Huang-Jin Bo Huazhong Agriculture University , College of Life Science and Technology , Biotechnology 1201 [Abstract] [Objective]Using tobacco leaves as materials, through the experiment, we should handle the basic principle and method of plant callus induction and plant regeneration，master related experiments’technology; In addition, through this experiment, to complete the tobacco plant regeneration, and compared different methods of callus induction, such as light and dark state, and the effects to the state and induction rate, then analyzing the results. [Method]The tobacco leaf was cut into 1 cm2 size small squares under aseptic conditions. Firstly induced in the MS induction medium with 0.25 mg/L NAA and 0.25 mg/L BA, under the condition of light and dark, respectively; Three weeks later, transferred to MS differentiation medium with 0.25 mg/L NAA and 1.0 mg/L BA culturing under light; Two months later , observing the results, and analyzing the statistics. [Results]After the induction culturing, 67.7% materials were polluted both under the condition of light and dark; rest 33.3% materials were inoculated to the differentiation medium, continuing to cultivate. As a result, it was successfully. The results show that there are no obvious differences between with the light condition and dark condition. Each number of callus bud differentiation under the condition of the light induced significantly more than in the

植物细胞工程理论课内容(1)

目录（共十一章，包括绪论） 绪论 第一章实验室设备和一般技术 第二章培养基及其配制 第三章外植体的选择和灭菌 第四章外植体的接种和培养 第五章愈伤组织的培养 第六章营养器官培养 第七章植物快速繁殖和脱毒 第八章细胞培养 第九章原生质体培养和体细胞杂交 第十章种质保存 参考书目：请链接参考书目. https://www.wendangku.net/doc/8e2400008.html,/v_playlist/f1461876o1p7.html（优酷网上的视频请插入到绪论中） 绪论 知识点：1.掌握植物细胞工程的概念及相关的专有名词 2.理解细胞全能性理论 3.掌握植物细胞离体培养发生的途径 4.了解植物细胞工程的应用 一．植物细胞工程（plant cell engineering）概念 植物细胞工程是指植物在细胞水平上进行的遗传操作。其相关的理论和技术主要是：植物生理学、细胞生物学和分子生物学等。 植物组织培养（plant tissue culture）:在无菌条件下将离体的植物器官、组织、细胞或原生质体培养在人工配制的培养基上，人为控制培养条件，使其生长、分化、增殖发育成完整植株或生产次生代谢物质的过程和技术，也叫离体培养（in vitro culture）相关的专有名词： 外植体（explant）：从植物体上切取下来用以培养的材料。 愈伤组织(callus)：由外植体增殖而形成的一种无特定结构和功能的细胞团。 继代培养(subculture)：由最初的外植体上切下新增殖的组织，继续转入新的培养基上培养的过程。 胚状体(embryoid)：在离体培养过程中，起源于非合子，并经过胚胎发育过程分化出的类似胚的细胞群。 分化(differentiation)：导致细胞或组织形成不同结构并引起功能或潜在发育方式改变的一种过程。 脱分化(dedifferentiation)：原已分化的细胞失去原有的形态和机能，又回复到没有分化的无组织的细胞团或愈伤组织的过程。 再分化(redifferentiation)：由脱分化状态的细胞再度分化形成另一种或几种类型的细胞的过程。 无性繁殖系(clone)：由同一外植体反复进行继代培养后所得的一系列无性繁殖后代。 二、植物细胞工程的理论基础——细胞全能性

2019-2020年高考生物精华学案 动物生命活动的调节之体液调节

2019-2020年高考生物精华学案动物生命活动的调节之体液调节 班级姓名学号日期编号：34 【考纲要求】 【复习目标】 （1）描述动物激素的调节 ①概述体液调节的概念 ②举例说明动物激素的概念和特点 ③简述人体内主要的内分泌腺所分泌激素的种类与主要作用 ④举例说出激素间的协同作用和拮抗作用 ⑤比较神经调节和激素调节的特点 （2）探讨动物激素在生产中的应用 ①了解动物激素在农业生产上的运用情况 ②评价动物激素在生产中应用的利与弊 【自主学习】 一、人体内主要的内分泌腺所分泌激素的种类与主要作用 （创新P167，考点2，要点整合表格）

二、甲状腺激素分泌的分级调节 三、激素调节的特点 四、神经调节和体液调节的关系 （创新P169，考点4） 【试试身手】 1、青蛙垂体提取液中有促进雌蛙排卵的激素，该激素作用的器官是 A、甲状腺 B、胰腺 C、卵巢 D、肾上腺 2、将蛙的卵巢放入含有蛙脑垂体提取液的培养液中，同时检测某种激素的含量。经过一段时 间培养后，再检测培养液中该激素的含量，发现该激素含量增加，这种激素是 A．促性腺激素释放激素 B．促性腺激素 C．促甲状腺激素 D．雌激素

3、右图为人体甲状腺激素分泌调节的示意图，下列叙述中错误的是 A．甲状腺机能亢进患者激素③分泌过多 B．缺碘时激素①和②浓度都高于正常水平 C．图中共有3处箭头表示负反馈调节 D．垂体还能分泌与激素③有相似生理效应的激素 4、有同一器官分泌，且生物效应相反的一组激素是 A．胰岛素和胰高血糖素 B．肾上腺素和肾上腺皮质激素 C．促甲状腺激素和生长激素 D．甲状腺激素和促甲状腺激素 5、右图①②③表示人体细胞间信息传递的三种主要方式。 下列描述错误的是 A. 方式①②的信息传递缓慢，方式③传递迅速 B. 方式③的信息传递不通过体液 C. 体温调节可能涉及①②③三种传递方式 D. 方式①②的信息传递都经过血液循环，存在反馈调节 6、关于人体激素的叙述，错误的是 A．激素在人体内作为信息物而发挥作用 B．激素在人体内含量较低，但有高效的生物催化作用 C．甲状腺激素除了促进人体产热，还有其他生理效应 D．正常人体内，激素的分泌受反馈调节 7、关于下丘脑功能的叙述，正确的是 ①可参与血糖平衡的调节②有调节躯体运动的高级中枢③可合成和分泌促甲状腺激素释 放激素④垂体通过下丘脑控制性腺的生长发育 A．①② B．②③ C．②④ D．①③ 8．研究发现，胰岛素必须与细胞膜上的胰岛素受体结合，才能调节血糖平衡。如果人体组织细胞膜缺乏该受体，则可能导致 A.细胞减缓摄取血糖，血糖水平过高 B.细胞减缓摄取血糖，血糖水平过低 C.细胞加速摄取血糖，血糖水平过高 D.细胞加速摄取血糖，血糖水平过低 9．在人体内，可以在同一细胞中产生的是

2.1.1植物细胞工程的基本技术导学案

2.1.1植物细胞工程的基本技术 【学习目标】1、简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术。 2、尝试进行植物组织培养。 【学习重点】1、植物组织培养的原理和过程 2、植物体细胞杂交的原则 【学习难点】植物组织培养的实验 课 前 案 读课本，独立完成下列问题 （要求：能准确写出关键词与句，以课本为准） 一、细胞工程 1．概念：应用 和 的原理和方法，通过 或 上的操作，按照人的意愿来改变细胞内的 或获得 的一门综合科学技术。 2．分类：根据操作对象不同，可分为 、 。 二、植物细胞的全能性 1、植物细胞的基本结构包括 、 、 、 。 2、植物细胞主要的增殖方式是 ，细胞分化是指 ，_____________________________________________________________________________原因是 。 3、全能性是指 ，表现为全能性的原因是 。 4．在理论上，生物的任何一个细胞都具有 ，但在生物的生长发育过程中，细胞并不表现 ，而是分化成各种 。 5．特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会有 地表达出各种 ，分化形成 不同的细胞，从而构成生物体的不同 。 三、植物组织培养技术 1．原理：植物细胞具有 ，具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成 的潜能。 2．过程: 离体植物的 ??→ ?脱分化 _ 组织??→ ?再分化幼根和芽或 胚状体 ??→ ?发育 完整植株。 3．细胞脱分化：已 的细胞经过诱导后，失去其特有的 而转变成未分化 细胞的过程。 4．植物组织培养：在 和 的条件下，将 的植物器官、组织、细 胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生 、丛芽，最终形 成完整植株。 四、胡萝卜的组织培养实验 1、实验原理 生物体细胞一般都是由受精卵经过有丝分裂形成的，因而都含有该生物的全套的遗传信息，都 具有发育成完整个体的潜能。因此，植物体的根、茎、叶细胞都具有 ，在一定的营养和激素条件下，可以脱分化形成 。将愈伤组织转接到含有不同激素成分的培养基上，就可以诱导其再分化生成胚状体或丛芽，进而发育成 。 2、实验步骤 ①．将 用自来水充分洗净，削去外皮，并切成段。用酒精棉球擦手 。 ②．在超净工作台(或接种箱)上将胡萝卜段用酒精溶液消毒30s 后，立即用 清洗2～3次，再用 处理30min 后，立即用无菌水清洗2～3次。 ③．用 的滤纸吸去胡萝卜段表面的水分。然后，在 瓷砖上，用无菌的解剖刀将胡萝卜段切成1 cm 厚的横切片，再选取有 的部位，切取1 cm 。左右的小块。 ④．将 接种到培养基上，用锡箔纸封盖瓶口，并用橡皮筋扎紧。然后，在培养瓶上贴上标签，写明材料名称、接种日期和小组号。 ⑤．将接种后的胡萝卜组织块，放在 恒温避光条件下培养。4d 后，检查培养材料的污染情况；14d 后，观察愈伤组织的生长状况。然后，在恒温箱中继续避光培养。在培养过程中，注意定期观察和记录愈伤组织的生长情况。 ⑥．培养一段时间后，将生长良好的 转接到分化培养基上，培养一段时间后，胡萝卜的愈伤组织就可以诱导出 。然后将试管苗移栽到大田，培养成 。 五、植物体细胞杂交技术 1．概念：不同种植物的 ，在一定条件下融合成 ，并把杂种细胞培育成新的 的技术。 2．过程 离体的细胞果胶酶纤维素酶???→ ?不同细胞原生质体--------→原生质体融合 →杂种细胞→杂种植株。 【预习自测】 1、下列细胞的全能性最高的是 ( ) A 、植物的卵细胞 B 、植物的花粉 C 、被子植物的受精卵 D 、被子植物的叶肉细胞 2．下列属于组织培养的是 ( ) A ．花粉培育成单倍体植株 B ．芽发育成枝条 C ．根尖分生区发育成成熟区 D ．未受精的卵细胞发育成个体 3．组织培养的理论根据是 ( ) A ．培养基中营养物质全面 B ．细胞的全能性 C ．细胞的分裂 D ．细胞的分化 4．愈伤组织细胞在一种包含所有必需物质的培养基中培养了几个小时，其中一种化合物具有放射性(氚标记)。当这些细胞被固定后镜检．利用放射自显影技术发现放射性物质集中于细胞核、线粒体和叶绿体。可以肯定标记的化合物是 （ ） A 一种氨基酸 B ．尿嘧啶核苷酸 C ．胸腺嘧啶脱氧核苷酸 D ．葡萄糖

生物选修三植物细胞工程测试题(打印)

植物细胞工程测试题 一、单选题 1．下列有关植物细胞全能性的叙述，不正确的是（ ） A ．植物体内某些体细胞没有表现出全能性，原因是所含基因在特定的时空条件下选择性表达各种蛋白质 B ．高度分化的植物细胞只有处于离体状态时才有可能表现出全能性 C ．植物细胞的全能性是植物体细胞杂交的理论基础 D ．植物体只有体细胞才具有发育成完整个体所必需的全部基因 2．植物细胞工程中的叙述中不正确的是是指（ ） A ．植物组织培养是指离体的植物器官、组织或细胞培养成完整植物体 B ．植物体细胞杂交的结果是产生杂种细胞 C ．重压方法是不能人工诱导原生质体融合的． D ．用植物组织培养技术，可以培养或生产出食品添加剂、无病毒植物、人工种子 3．如图是“白菜一甘蓝”杂种植株的培育过程。下列说法正确的是（ ） A ．图示“白菜—甘蓝”植株不能结子 B ．愈伤组织有叶绿体，代谢类型是自养需氧型 C ．上述过程中包含着有丝分裂、减数分裂和细胞分化等过程 D ．“白菜—甘蓝”杂种植株具有的性状是细胞全能性表达的结果 4.在植物细胞工程中原生质体融合成一个细胞后，需诱导产生细胞壁，参与该过程的细胞器是 （ ） A ．叶绿体、高尔基体 B ．线粒体、高尔基体 C ．叶绿体、线粒体 D ．线粒体、内质网 5．科学家把天竺葵的原生质体和香茅草的原生质体进行诱导融合，培育出的驱蚊草含有香茅醛， 能散发出一种特殊的达到驱蚊且对人体无害的效果。下列关于驱蚊草培育的叙述中，错误的是 （ ） A ．驱蚊草的培育属于细胞工程育种，其优点是能克服远源杂交不亲和的障碍 B ．驱蚊草培育过程要用到纤维素酶、果胶酶、PEG 等试剂或离心、振动、电刺激等方法 C ．驱蚊草培育过程是植物体细胞杂交，不同于植物组织培养，无愈伤组织和试管苗形成 D ．驱蚊草不能通过天竺葵和香茅草杂交而获得是因为不同物种间存在生殖隔离 6．植物组织培养过程中的脱分化是指（ ） A.植物体的分生组织通过细胞分裂产生新细胞 B ．未成熟的种子经过处理培育出幼苗的过程 C ．植物的器官、组织或细胞，通过离体培养产生愈伤组织的过程 D.取植物的枝芽培育成一株新植物的过程 7. A 种植物的细胞和B 种植物细胞的结构如右图所示（仅 显示细胞核），将A 、B 两种植物细胞 去掉细胞壁后，诱导二者的原生质体融合，形成单核的杂种细胞，若经过 组织培养后得到了杂种植株，则该杂种植株是（ ） A ．二倍体；基因型是DdYyRr B ．三倍体；基因型是DdYyRr C ．四倍体；基因型是DdYyRr D ．四倍体；基因型是DDddYYyyRRrr 8．植物组织培养过程的顺序是 （ ） ①离体的植物器官、组织或细胞 ②根、芽 ③愈伤组织 ④脱分化 ⑤再分化 ⑥植物体 A ．①④③⑤②⑥ B ．①④③②⑤⑥ C ．①⑤④③②⑥ D ．⑥①④③⑤② 9．下列有关细胞工程的叙述不正确的是 （ ） A.在细胞整体水平上定向改变遗传物质 B ．在细胞器水平上定向改变遗传物质 C ．在细胞器水平上定向改变细胞核的遗传物质 D ．在细胞整体水平上获得细胞产品 10．有关全能性的叙述，不正确的是( ) A ．受精卵在自然条件下能使后代细胞形成完整个体，因此全能性最高 B ．生物体内细胞由于分化，全能性不能表达 C ．卵细胞与受精卵一样，细胞未分化，全能性很高 D ．植物细胞离体培养在一定条件下能表现出全能性 11植物繁殖的新途径中正确的理解是 （ ） A 植物的微型繁殖技术是指植物体细胞杂交技术． B ．马铃薯获得无病毒幼苗的最佳办法是利用芽尖进行组织培养 C ．人工种子种皮是能自我生成 D ．植物的微型繁殖的优点是取材多、培养周期短、繁殖率高 12下图是植物组织培养的简略表示。据此回答不正确的是（ ） 脱分化 再分化 ①——→②——→③——→④