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我国首次实现亚纳米分辨的单分子光学拉曼成像

拉曼光谱的原理及应用.doc

拉曼光谱的原理及应用拉曼光谱由于近几年来以下几项技术的集中发展而有了更广泛的应用。这些技术是：CCD检测系统在近红外区域的高灵敏性,体积小而功率大的二极管激光器,与激发激光及信号过滤整合的光纤探头。这些产品连同高口径短焦距的分光光度计,提供了低荧光本底而高质量的拉曼光谱以及体积小、容易使用的拉曼光谱仪。（一）含义光照射到物质上发生弹性散射和非弹性散射. 弹性散射的散射光是与激发光波长相同的成分.非弹性散射的散射光有比激发光波长长的和短的成分, 统称为拉曼效应当用波长比试样粒径小得多的单色光照射气体、液体或透明试样时,大部分的光会按原来的方向透射,而一小部分则按不同的角度散射开来,产生散射光。在垂直方向观察时,除了与原入射光有相同频率的瑞利散射外,还有一系列对称分布着若干条很弱的与入射光频率发生位移的拉曼谱线,这种现象称为拉曼效应。由于拉曼谱线的数目,位移的大小,谱线的长度直接与试样分子振动或转动能级有关。因此,与红外吸收光谱类似,对拉曼光谱的研究,也可以得到有关分子振动或转动的信息。目前拉曼光谱分析技术已广泛应用于物质的鉴定,分子结构的研究谱线特征（二）拉曼散射光谱具有以下明显的特征： a.拉曼散射谱线的波数虽然随入射光的波数而不同,但对同一样品,同一拉曼谱线的位移与入射光的波长无关,只和样品的振动转动能级有关； b. 在以波数为变量的拉曼光谱图上,斯托克斯线和反斯托克斯线对称地分布在瑞利散射线两侧, 这是由于在上述两种情况下分别相应于得到或失去了一个振动量子的能量。 c. 一般情况下,斯托克斯线比反斯托克斯线的强度大。这是由于Boltzmann分布,处于振动基态上的粒子数远大于处于振动激发态上的粒子数。（三）拉曼光谱技术的优越性提供快速、简单、可重复、且更重要的是无损伤的定性定量分析,它无需样品准备,样品可直接通过光纤探头或者通过玻璃、石英、和光纤测量。此外 1 由于水的拉曼散射很微弱,拉曼光谱是研究水溶液中的生物样品和化学化合物的理想工具。 2 拉曼一次可以同时覆盖50-4000波数的区间,可对有机物及无机物进行分析。相反,若让红外光谱覆盖相同的区间则必须改变光栅、光束分离器、滤波器和检测器 3 拉曼光谱谱峰清晰尖锐,更适合定量研究、数据库搜索、以及运用差异分析进行定性研究。在化学结构分析中,独立的拉曼区间的强度可以和功能集团的数量相关。 4 因为激光束的直径在它的聚焦部位通常只有0.2-2毫米,常规拉曼光谱只需要少量的样品就可以得到。这是拉曼光谱相对常规红外光谱一个很大的优势。而且,拉曼显微镜物镜可将激光束进一步聚焦至20微米甚至更小,可分析更小面积的样品。 5 共振拉曼效应可以用来有选择性地增强大生物分子特个发色基团的振动,这些发色基团的拉曼光强能被选择性地增强1000到10000倍。（四）几种重要的拉曼光谱分析技术 1、单道检测的拉曼光谱分析技术 2、以CCD为代表的多通道探测器用于拉曼光谱的检测仪的分析技术 3、采用傅立叶变换技术的FT-Raman光谱分析技术 4、共振拉曼光谱分析技术 5、表面增强拉曼效应分析技术 (五) 拉曼频移,拉曼光谱与分子极化率的关系 1、拉曼频移：散射光频与激发光频之差,取决于分子振动能级的改变,所以它是特征的,与入射光的波长无关,适应于分子结构的分析 2、拉曼光谱与分子极化率的关系分子在静电场E中,极化感应偶极矩P为静电场E与极化率的乘积诱导偶极矩与外电场的强度之比为分子的极化率分子中两原子距离最大时,极化率也最大拉曼散射强度与极化率成正比例（六）应用激光光源的拉曼光谱法应用激光具有单色性好、方向性强、亮度高、相干性好等特性,与表面增强拉曼效应相结合,便产生了表面增强拉曼光谱。其灵敏度比常规拉曼光谱可提高104~107倍,加之活性载体表面选择吸附分子对荧光发射的抑制,使分析的信噪比大大提高。已应用于生物、药物及环境分析中痕量物质的检测。共振拉曼光谱是建立在共振拉曼效应基础上的另一种激光拉曼光谱法。共振拉曼效应产生于激发光频率与待测分子的某个电子吸收峰接近或重合时,这一分子的某个或几个特征拉曼谱带强度可达到正常拉曼谱带的104~106倍,有利于低浓度和微量样品的检测。已用于无机、有

超分辨荧光显微技术原理

如果要观察小于80微米的物体，比如细菌，就需要先将物体放大，再用眼睛或者相机观察。现代光学显微镜的构造其实非常简单，样品放置在物镜的焦点处，从样品上发射或散射的光经过物镜变成平行（准直）光，再经过一个结像透镜，然后会聚到相机的感光芯片上成像。按照前面的方法来推算，要区分物体上相距为200纳米的两个点，如果使用科研级相机，比如最近火起来的sCMOS相机（每个感光像素尺寸为6.5微米），只需要使用放大倍率为65倍的物镜就足够了。那么是否可以通过提高物镜的放大倍率来观察低于200纳米的物体，比如细胞里面微管呢？答案是不可以。 2.光学衍射极限由于光是一种电磁波，具有衍射和干涉的特性。图1.光学显微镜简化示意图如上面的简图所示，紫色箭头表示的物体PQ经过物镜等之后在相机上成像为 P'Q'。由于光的衍射，物体上的点如P、Q，在相机上并不是单独的点，而是一个个有一定大小的斑，被称为夫琅禾费衍射斑（或称艾里斑），如右侧的同心圆所示。那么，当P'、Q'相距太近的时候，两个斑会叠加导致难以分辨。这就要求物体上的P、Q要相距一定的距离。 1873年，德国物理学家、卡尔蔡司公司的恩斯特·阿贝（ErnstAbbe）首次推算出衍射导致的分辨率极限。根据瑞利判据——“当一个像斑的中心落到另一个像斑的边缘时，就算这两个像刚好能被分辨”，显微镜能分辨的物体上两点P、Q 的最小距离h为：

拉曼光谱原理及应用简介

拉曼光谱原理及应用简介当用波长比试样粒径小得多的单色光照射气体、液体或透明试样时，大部分的光会按原来的发现透射，而一小部分则按不同的角度散射开来，产生散射光。在垂直方向观察时，除了与原入射光有相同频率的瑞利散射外，还有一系列对称分布着若干条很弱的与入射光频率发生位移的拉曼谱线，这种现象称为拉曼效应。由于拉曼谱线的数目，位移的大小，谱线的长度直接与试样分子振动或转动能级有关。因此，与红外吸收光谱类似，对拉曼光谱的研究，也可以得到有关分子振动或转动的信息。目前拉曼光谱分析技术已广泛应用于物质的鉴定，分子结构的研究。应用激光光源的拉曼光谱法。应用激光具有单色性好、方向性强、亮度高、相干性好等特性，与表面增强拉曼效应相结合，便产生了表面增强拉曼光谱。其灵敏度比常规拉曼光谱可提高104~107倍，加之活性载体表面选择吸附分子对荧光发射的抑制，使分析的信噪比大大提高。已应用于生物、药物及环境分析中痕量物质的检测。共振拉曼光谱是建立在共振拉曼效应基础上的另一种激光拉曼光谱法。共振拉曼效应产生于激发光频率与待测分子的某个电子吸收峰接近或重合时，这一分子的某个或几个特征拉曼谱带强度可达到正常拉曼谱带的104~106倍，有利于低浓度和微量样品的检测。已用于无机、有机、生物大分子、离子乃至活体组成的测定和研究。激光拉曼光谱与傅里叶变换红外光谱相配合，已成为分子结构研究的主要手段。

1. 激光拉曼光谱法的原理是拉曼散射效应拉曼散射：当激发光的光子与作为散射中心的分子相互作用时，大部分光子只是发生改变方向的散射，而光的频率并没有改变，大约有占总散射光的10-10-10-6的散射，不光改变了传播方向，也改变了频率。这种频率变化了的散射就称为拉曼散射。对于拉曼散射来说，分子由基态E0被激发至振动激发态E1，光子失去的能量与分子得到的能量相等为△E反映了指定能级的变化。因此，与之相对应的光子频率也是具有特征性的，根据光子频率变化就可以判断出分子中所含有的化学键或基团。这就是拉曼光谱可以作为分子结构的分析工具的理论工具。 2. 拉曼光谱仪的主要部件有：激光光源、样品室、分光系统、光电检测器、记录仪和计算机。 3. 应用激光拉曼光谱法的应用有以下几种：在有机化学上的应用，在高聚物上的应用，在生物方面上的应用，在表面和薄膜方面的应用。有机化学：拉曼光谱在有机化学方面主要是用作结构鉴定的手段，拉曼位移的大小、强度及拉曼峰形状是判断化学键、官能团的重要依据。利用偏振特性，拉曼光谱还可以作为顺反式结构判断的依据。高聚物：拉曼光谱可以提供关于碳链或环的结构信息。在确定异构体（单休异构、位置异构、几何异构和空间立现异构等）的研究中

超分辨荧光显微技术原理

2014 年的诺贝尔理综奖颁发给了“超分辨荧光显微技术”。也许接下来的几天，媒体会关注 Stefan Hell、Eric Betzig 二人的传奇经历，或者另一名华人女科学家与该奖项失之交臂的遗憾。但是八卦之外，这项成果背后的科学本身也非常有意思。这里面有三个关键词：“超分辨”、“荧光”和“显微技术”，我希望能够解释清楚以下几个问题，尤其是后两个问题： 1. 为什么需要（光学）显微技术？ 2. 为什么光学显微镜的分辨率存在理论极限？ 3. 用怎样的方法可以突破这个理论极限以达到“超分辨”？为什么这个理论极限可以被突破？ 5. 为什么非得是荧光显微技术，而非普通的明场（透射光）显微技术？ 1. 采样定理与显微镜我们用肉眼观察或者用相机拍摄一个物体时，物体上的每一个细微的点都会在眼睛的视网膜或是相机的感光芯片上成像。那么我们为什么不能看到细菌等微小的东西，为什么不能把照片无限放大以看清远处树木上面的每一片叶子呢？这个问题的答案比较简单：因为组成视网膜的每一个感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）、相机芯片上的每一个感光元件（CCD、CMOS等）都是有大小的。比如视网膜中央凹区域的视锥细胞直径平均约为 5 微米。而由于奈奎斯特-香农采样定理的限制，视网膜上能分清的两个相邻像点的距离是视锥细胞直径的两倍，即 10 微米。再结合眼球的构造，大致可以推断出，在距离眼睛 25 厘米的位置，我们能分辨物体上相距为 80 微米的两个点，换算成点阵密度就是大约 320 ppi，这也是苹果所谓“视网膜屏”分辨率的来历。如果要观察小于 80 微米的物体，比如细菌，就需要先将物体放大，再用眼睛或者相机观察。现代光学显微镜的构造其实非常简单，样品放置在物镜的焦点处，从样品上发射或散射的光经过物镜变成平行（准直）光，再经过一个结像透镜，然后会聚到相机的感光芯片上成像。按照前面的方法来推算，要区分物体上相距为 200 纳米的两个点，如果使用科研级相机，比如最近火起来的 sCMOS 相机（每个感光像素尺寸为 6.5 微米），只需要使用放大倍率为 65 倍的物镜就足够了。那么是否可以通过提高物镜的放大倍率来观察低于 200 纳米的物体，比如细胞里面微管呢？答案是不可以。 2. 光学衍射极限由于光是一种电磁波，具有衍射和干涉的特性。

Smart DXR 拉曼光谱仪技术参数

激光拉曼光谱仪（进口） 1．工作环境条件 1.1工作电压：220V交流稳压 1.2工作温度：15-28 oC 1.3相对湿度：<78% RH 2. 技术要求及配置 2.1 主要功能： 2.1.1食品、药物分析研究与检测； 2.1.2 实验室级研究用激光拉曼光谱仪（非便携式拉曼）。 2.2 激光拉曼光谱仪 *2.2.1 光谱分辨率：2cm-1 2.2.2 光谱重复性：优于±0.2cm-1 2.2.3 拉曼光谱测量范围： 532nm激光激发：50cm-1-3500cm-1拉曼位移 780nm激光激发: 50cm-1-3300cm-1拉曼位移 2.2.4近红外增强CCD探测器： *2.2.4.1半导体制冷-70oC控制。 2.2.4.2量子效率:650 nm处> 50%，暗噪声: <0.01电子/秒/像元，读出噪声: < 7电子/像元 2.3智能常规样品拉曼采样模块 2.3.1可调动态点检测功能，可一次获取范围5mm x 5mm非均相样品区域综合拉曼光谱信息，且不损失拉曼信号强度。软件控制选择的测样区域； *2.3.2灵敏度：标准polystyrene材料拉曼峰信噪比好于225 2.3.3通用采样台附件：软件自动识别，并报告序列号。不同样品附件之间轻松切换, 精确定位，无需关机即可实现与其他附件更换。 2.3.4具有玻璃瓶样品架、箍夹式样品架、平板式通用样品架等。 2.4激光激发光路组件 2.4.1. 532nm高亮度长寿命固体激光器，激光输出功率24mW, TEM00空间模式。模块化高稳定预准直设计； 2.4.2 780nm 高亮度长寿命半导体激光器，激光输出功率50mW,TEM00空间模式。模块化高稳定预准直设计。 *2.4.3 瑞利滤光装置：各激发波长均采用长寿命双瑞利滤光片与激光线滤光片，模块化高稳定预准直设计。各激发波长所对应拉曼测量低波数到50cm-1(445nm除外)。（低波数测量检测条件白光响应曲线低频截止区50%透射点位于50cm-1，并测量位于50cm-1的硫磺拉曼峰位）。 2.4.4样品点激光功率控制：具有激光功率监控控制功能，配置伺服反馈控制连续衰减中性密度滤光片，实现80级以上到样品激光功率调节，调节精度0.1mW。采用软件自动显示激光照射到样品绝对功率。软件自动显示激光照射到样品绝对功率。 2.4.5针对每个激发波长，分别采用优化闪耀角高通光效率高分辨光栅：400线/mm与830线/mm（780nm 激发）,900线/mm与1800线/mm（532nm激发），以保证系统高通光效率。 2.4.6激光器、光栅与滤光片装置模块化高稳定设计，多维高精确动态定位，不同激发波长置换无需任何工具,切换迅速，切换后无需准直。 2.4.7软件自动识别激光器、光栅与瑞利滤光片类别及序列号。 2.4.8软件自动显示激光照射到样品绝对功率 2.5 智能控制功能:

拉曼光谱原理及应用简介

拉曼光谱由于近几年来以下几项技术的集中发展而有了更广泛的应用。这些技术是：CCD检测系统在近红外区域的高灵敏性，体积小而功率大的二极管激光器，与激发激光及信号过滤整合的光纤探头。这些产品连同高口径短焦距的分光光度计，提供了低荧光本底而高质量的拉曼光谱以及体积小、容易使用的拉曼光谱仪。（一）含义光照射到物质上发生弹性散射和非弹性散射.弹性散射的散射光是与激发光波长相同的成分.非弹性散射的散射光有比激发光波长长的和短的成分,统称为拉曼效应当用波长比试样粒径小得多的单色光照射气体、液体或透明试样时，大部分的光会按原来的方向透射，而一小部分则按不同的角度散射开来，产生散射光。在垂直方向观察时，除了与原入射光有相同频率的瑞利散射外，还有一系列对称分布着若干条很弱的与入射光频率发生位移的拉曼谱线，这种现象称为拉曼效应。由于拉曼谱线的数目，位移的大小，谱线的长度直接与试样分子振动或转动能级有关。因此，与红外吸收光谱类似，对拉曼光谱的研究，也可以得到有关分子振动或转动的信息。目前拉曼光谱分析技术已广泛应用于物质的鉴定，分子结构的研究谱线特征（二）拉曼散射光谱具有以下明显的特征： a.拉曼散射谱线的波数虽然随入射光的波数而不同，但对同一样品，同一拉曼谱线的位移与入射光的波长无关,只和样品的振动转动能级有关； b.在以波数为变量的拉曼光谱图上，斯托克斯线和反斯托克斯线对称地分布在瑞利散射线两侧,这是由于在上述两种情况下分别相应于得到或失去了一个振动量子的能量。

c.一般情况下，斯托克斯线比反斯托克斯线的强度大。这是由于Boltzmann分布，处于振动基态上的粒子数远大于处于振动激发态上的粒子数。（三）拉曼光谱技术的优越性提供快速、简单、可重复、且更重要的是无损伤的定性定量分析，它无需样品准备，样品可直接通过光纤探头或者通过玻璃、石英、和光纤测量。此外 1由于水的拉曼散射很微弱，拉曼光谱是研究水溶液中的生物样品和化学化合物的理想工具。 2拉曼一次可以同时覆盖50-4000波数的区间，可对有机物及无机物进行分析。相反，若让红外光谱覆盖相同的区间则必须改变光栅、光束分离器、滤波器和检测器3拉曼光谱谱峰清晰尖锐，更适合定量研究、数据库搜索、以及运用差异分析进行定性研究。在化学结构分析中，独立的拉曼区间的强度可以和功能集团的数量相关。4因为激光束的直径在它的聚焦部位通常只有0.2-2毫米，常规拉曼光谱只需要少量的样品就可以得到。这是拉曼光谱相对常规红外光谱一个很大的优势。而且，拉曼显微镜物镜可将激光束进一步聚焦至20微米甚至更小，可分析更小面积的样品。5共振拉曼效应可以用来有选择性地增强大生物分子特个发色基团的振动，这些发色基团的拉曼光强能被选择性地增强1000到10000倍。（四）几种重要的拉曼光谱分析技术 1、单道检测的拉曼光谱分析技术

超分辨成像技术的新发展

超分辨显微成像技术的新发展马利红引言人类获得信息的主要器官是眼睛，然而靠人眼观察客观事物的空间分辨率的极限约为4 ′米，客观世界中人眼不能分辨的所有细微结构称为微观世界。显微成像技术将310- 微观过程或结构成放大图像，以便于人眼能够直接观察。研究微观世界所涉及的学科领域十分广泛，有生物、医学、材料科学、精密机械、微电子学、分子及原子物理、核物理等等，微观世界中细分的微量尺度原则上是无穷的，因而显微学是跨多学科的，其发展也是无止境的。 1665年，Robert Hooke用原始显微镜发现了池塘水中单细胞有机体，它的出现为人类打开了微观世界的大门。光学显微镜由此成为历代生物学家的主要研究工具之一。生物学家把显微镜作为一种主要工具来研究生物器官、组织和细胞，由此奠定了细胞学和组织学的基础，并对生物学、遗传学、微生物学、病理学和医学的发展起到了极大的推动作用。但传统光学显微镜有以下两个主要缺点：(1)受衍射极限的限制，其分辨率与照明波长是同一个数量级，具有一个数值孔径(NA=nsin(q))的传统光学显微镜，分辨极限l，称之为瑞利判据；(2)由于使用的是场光源，观测到的是一个宽视野图像，为0.61/NA 从而降低了信噪比，影响了图像的清晰度和分辨率。随着生物医学、材料科学等的发展对显微提出了更高的要求，不仅希望其具有更高的分辨率，而且能对样品进行无损成像，甚至希望可观察其三维图像。因此，传统的显微镜已不能满足要求。电子显微镜的分辨率虽然远高于光学显微镜，但它需要在真空条件下工作，因此很难观察活的生物样品，另外电子束的照射也会使生物样品受到辐照损伤。电子显微镜、的局限以及高分辨显微的需求，迫使人们转向超经典衍射极限的光学超分辨理论和技术研究，利用新原理、新技术、新方法来实现光学高分辨力成像和检测。

拉曼光谱仪的工作参数介绍

拉曼光谱仪的工作参数介绍当开始进行样品测试时，需注意选择正确的工作参数和条件。激光器的功率要随不同测试样品而改变，对固体或液体等不易分解的可用较强功率激发，生物样品等应选较低功率激发。积分时间可在开始时选择10s一次，正式测量时可根据信噪比的情况而定，信噪比高的积分时间可稍短，反之可采用较长时间积分。狭缝宽度的选择可根据所测光谱是否需要高分辨或高共焦模式来决定大小。为保证给出的拉曼光谱图，可在光路调校好之后用快速扫描模式进行一次预扫描；然后根据测定要求和预扫描情况设定扫描范围、步长、积分时间、狭缝宽度、激发功率和扫描次数等进行正式测定。若样品易于光解，除降低激光功率外，还可更换测试点实施分段扫描。完成测试后，应在显微镜下检查样品足否已经损伤(光解、热解、脱落或变性等)。拉曼光谱仪在中草药研究中的应用包括： 1、中药的优化对于中草药及中成药和复方这一复杂的混合物体系，不需任何成分分离提取直接与细菌和细胞作用；

利用拉曼光谱无损采集细菌和细胞的光谱图，观察细菌和细胞的损伤程度，研究其药理作用，并进行中药材、中成药和方剂的优化研究。 2、中草药化学成分分析薄层色谱(TLC)能对中草药进行有效分离但无法获得各组份化合物的结构信息；而表面增强拉曼光谱(SERS)具有峰形窄、灵敏度高、选择性好的优点，可对中草药化学成分进行高灵敏度的检测。利用TLC的分离技术和SERS的指纹性鉴定结合，是一种在TLC原位分析中草药成分的新方法。 3、中草药的无损鉴别由于拉曼光谱分析，无需破坏样品，因此能对中草药样品进行无损鉴别，这对名贵中中草药的研究特别重要。 4、中草药的稳定性研究利用拉曼光谱仪动态跟踪中草药的变质过程，这对中草药的稳定性预测、监控药材的质量具有直接的指导作用。拉曼光谱仪使用的注意事项 (1)激发光使用好预热一下，拉曼光谱仪的话还要注意拉曼探头端面的清洁，如果窗口片脏掉的话会影响测试效果了。 (2)在打开拉曼光谱仪之前，先把拉曼探头的盖子打开且探头禁止对着人。

超分辨处理理论基础

2超分辨处理理论基础 2.1超分辨率基础知识 2.1.什么是分辨率分辨率是屏幕图像的精密度，是指显示器所能显示的像素的多少。由于屏幕上的点、线和面都是由像素组成的，显示器可显示的像素越多，画面就越精细，同样的屏幕区域内能显示的信息也越多，所以分辨率是个非常重要的性能指标之一。可以把整个图像想象成是一个大型的棋盘，而分辨率的表示方式就是所有经线和纬线交叉点的数目。分辨率决定了位图图像细节的精细程度。通常情况下，图像的分辨率越高，所包含的像素就越多，图像就越清晰，印刷的质量也就越好。同时，它也会增加文件占用的存储空间。用于量度位图图像内数据量多少的一个参数。通常表示成ppi（每英寸像素）。包含的数据越多，图形文件的长度就越大，也能表现更丰富的细节。但更大的文件也需要耗用更多的计算机资源，更多的ram，更大的硬盘空间等等。在另一方面，假如图像包含的数据不够充分（图形分辨率较低），就会显得相当粗糙，特别是把图像放大为一个较大尺寸观看的时候。所以在图片创建期间，我们必须根据图像最终的用途决定正确的分辨率。这里的技巧是要首先保证图像包含足够多的数据，能满足最终输出的需要。同时也要适量，尽量少占用一些计算机的资源。通常，“分辨率”被表示成每一个方向上的像素数量，比如640x480等。而在某些情况下，它也可以同时表示成“每英寸像素”（ppi）以及图形的长度和宽度。比如72ppi，和8x6英寸。 2.1.1什么是超分辨图像的超分辨率(super resolution , SR)是指由一幅低分辨率图像(low resolution , LR)或图像序列恢复出高分辨率图像(high resolution , HR )。低分辨率的图像包含的细节信息较少，但我们可以得到一系列低分辨率的图像，这些图像包含的部分细节信息各有不同，能够相互补充。通过这一系列低分辨的图像，经过一定的处理，可以得到一幅分辨率较高、包含信息较多的图像。这个处理过程就是超分辨率重建。在图像采集系统中，光学传感器的分辨率不能满足一些特殊应用的需求，而且成像过程受加性噪声及透镜点扩散函数(PSF, Point Spread Function)的影响，因此，图像成像过程只能获得降质的低分辨率图像}s-ion。尽管随着技术的进步，传感器的分辨率有了明显的提高，但受成本的影响，也限制了其使用范围，而且受工艺等因素的影响，依靠提高传感器的分辨率来提高图像质量的能力是有限的。按照傅立叶光学的观点，在成像系统中的光学透镜是一个低通滤波器，由于受到光学衍射的影响，其传递函数在由衍射极限分辨率所决定的某个截止频率以上的值均为零，图像超分辨率处理试图重构截止频率以外的信息。另一方面，对于通常的图像显示设备具有固定的分辨率，而对低分辨率的图

突破衍射极限的超高分辨率成像技术发展(修改)

突破衍射极限的超高分辨率成像技术发展(修改) -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

结课论文题目突破衍射极限的超高分辨率成像的技术进展学生姓名学号学院专业班级二〇一五年十二月

一引言 1.1选题意义光学显微成像具有极为悠久的历史，但一直以来，光学成像一直受到衍射极限的限制而分辨率无法突破200 nm。后来虽然有了电子显微镜、核磁共振显像、x光衍射仪等微观观测或者显像设备，但是使用光学显微镜可以在活体状态下观察生命体使得其在生物、医学观察方面仍有巨大优势。值得庆贺的是近年来，超高分辨率显微技术的发展使得光学显微成像分辨率达到了20 nm以下。其中德国科学家Stefan Hell、美国科学家Eric Betzig和William Moerner因其在超高分辨率显微技术方面的突出贡献获得了2014年的诺贝尔化学奖。在这篇文章中，我们就简要介绍一下超高分辨率显微技术的发展和应用，并对诸位大师致以敬意。 1.2技术指标显微技术成像优劣一般通过X-Y平面分辨率与Z 轴分辨率大小来判定，分辨率越高数值越小。下表是各种显微成像技术的分辨率指标。

STED显微技术50-70 STED+4技术50 50 PALM技术20 30 3D STORM技术20-30 50-60 dSTORM技术30 50 2D SSIM技术50 3D SSIM技术100 200 电子显微镜 X光衍射仪

二衍射极限衍射极限我们能看到什么看到多小的范围看得有多清楚几百年来，依靠不断进步的科学手段，微观世界正一层层揭开面纱，让人们可以看得越来越“小”，进而可以进行研究。人的肉眼能分辨毫米尺度的物体，再小，就要借助工具。1665年，英国科学家罗伯特·虎克制造了第一台用于科学研究的光学显微镜，用它观察薄薄的软木塞切片。虎克看到了残存的植物细胞壁，它们一个个像小房间一样紧挨在一起，这就是“细胞”一词的由来。此后，显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，帮助科学家第一次发现了细菌和微生物。那么，光学显微镜是否可以无止境地“放大”下去，让我们想看到多小就能看到多小科学家为此做了很多尝试，最终发现，存在一道法逾越的“墙”—衍射极限。 1873年，德国科学家阿贝提出了衍射极限理论：光是一种电磁波，由于存在衍射，一个被观测的点经过光学系统成像后，不可能得到理想的点，而是一个衍射像，每个物点就像一个弥散的斑，如果这两个点靠得很近，弥散斑就叠加在一起，我们看到的就是一团模糊的图像。阿贝提出，分辨率的极限近似于入射光波长的二分之一(d=λ/2)。可见光的波长通常在380~780纳米之间，根据衍射极限公式，光学显微镜的分辨率极限就在200纳米（微米）左右。如果物体小于微米，你仍旧看到的是一个模糊的光斑。这就是很长一段时间内，光学显微镜的分辨极限——衍射极限。

Raman_拉曼光谱原理及应用

拉曼光谱学 ——原理及应用HORIBA Jobin Yvon北京办事处

报告内容 ?1-什么是拉曼光谱? –简单介绍 ?2-拉曼光谱仪工作原理介绍 ?3-拉曼光谱在材料研究中的应用介绍?4-HORIBA Jobin Yvon拉曼光谱仪简介

1928年，印度科学家C.V Raman in首先在CCL 4光谱中发现了当光与分子相互作用后，一部分光的波长会发生改变（颜色发生变化），通过对于这些颜色发生变化的散射光的研究，可以得到分子结构的信息，因此这种效应命名为Raman效应。时间和发现人? Provided by Prof. D. Mukherjee, Director of Indian Association for the Cultivation of Science

λlaser λscatter >λlaser 瑞利散射λscatter = λlaser 拉曼散射光散射的过程：激光入射到样品，产生散射光。散射光弹性散射（频率不发生改变-瑞利散射）非弹性散射（频率发生改变-拉曼散射）

2 0004 000 6 0008 00010 000I n t e n s i t y (c n t )400600Raman Shift (cm -1) 520不同材料的拉曼光谱有各自的不同于其它材料的特征的光谱-特征谱 z 为表征和鉴别材料提供了指纹谱 z 深入开展光谱学和材料物性研究打下基础 1332 1580 20000 15000 10000 5000 100012001400160018002000 Wavenumber (cm-1)?组分信息?结构信息

拉曼光谱的原理

1. 拉曼光谱的原理．喇曼效应喇曼效应起源于分子振动(和点阵振动)与转动，因此从喇曼光谱中可以得到分子(点阵振动能级)与转动能级结构的知识。用虚的上能级概念可以说明了喇曼效应：设散射物分子原来处于基电子态，振动能级如图所示。当受到入射光照射时，激发光与此分子的作用引起的极化可以看作为虚的吸收，表述为到虚态（Virtual state），虚能级上的电子立即跃迁到下能级而发光，即为散射光。设仍回到初始的电子态，则有如图所示的三种情况。因而散射光中既有与入射光频率相同的谱线，也有与入射光频率不同的谱线，前者称为瑞利线，后者称为喇曼线。在喇曼线中，又把频率小于入射光频率的谱线称为斯托克斯线，而把频率大于入射光频率的谱线称为反斯托克斯线。 . 瑞利散射与拉曼散射当一束激发光的光子与作为散射中心的分子发生相互作用时，大部分光子仅是改变了方向，发生散射,而光的频率仍与激发光源一致，这种散射称为瑞利散射。但也存在很微量的光子不仅改变了光的传播方向，而且也改变了光波的频率,这种散射称为拉曼散射。其散射光的强度约占总散射光强度的10-6～10-10。拉曼散射的产生原因是光子与分子之间发生了能量交换改变了光子的能量。 . 拉曼散射的产生光子和样品分子之间的作用可以从能级之间的跃迁来分析。样品分子处于电子能级和振动能级的基态，入射光子的能量远大于振动能级跃迁所需要的能量，但又不足以将分子激发到电子能级激发态。这样,样品分子吸收光子后到达一种准激发状态，又称为虚能态。样品分子在准激发态时是不稳定的,它将回到电子能级的基态。若分子回到电子能级基态中的振动能级基态,则光子的能量未发生改变,发生瑞利散射。如果样品分子回到电子能级基态中的较高振动能级即某些振动激发态，则散射的光子能量小于入射光子的能量，其波长大于入射光。这时散射光谱的瑞利散射谱线较低频率侧将出现一根拉曼散射光的谱线，称为Stokes 线。如果样品分子在与入射光子作用前的瞬间不是处于电子能级基态的最低振动能级,而是处于电子能级基态中的某个振动能级激发态，则入射光光子作用使之

SAR图像超分辨技术

2.1 正则化数学思想见解正则化在线性代数理论中，不适定问题通常是由一组线性代数方程定义的，而且这组方程组通常来源于有着很大的条件数的不适定反问题。反问题有两种形式。最普遍的形式是已知系统和输出求输入，另一种系统未知的情况通常也被视为反问题。许多反问题很难被解决，但是其他反问题却很容易得到答案。显然，易于解决的问题不会比很难解决的问题更能引起人们的兴趣，我们直接解决它们就可以了。那些很难被解决的问题则被称为不适定的。一个不适定问题通常是病态的，并且不论是简单地还是复杂地改变问题本身的形式都不会显著地改善病态问题。另一方面，病态问题不一定是不适定的，因为通过改变问题的形式往往可以改善病态问题。在严格的数学意义上，我们通常不可能对不适定问题进行求解并得到准确解答。其基本理论为：只考虑一帧图像得： y Hx n =+ (1) 上式就是病态方程, 即方程的解不能同时满足以下三个条件：解的存在；解的唯一性；解连续依赖于观测数据。正则化方法的基本思想是利用关于解的先验知识，构造附加约束以确保问题解的存在、唯一和连续，从而把不适定问题转化为适定问题。采用正则化方法来确定问题的近似解。通常需要求解如下表达形式的目标泛函的极小值： ()()2 J x y Hx p x αα=-+， (2) 2d x y Hx -()=表示数据拟合项，衡量数据拟合程度。 ()p x 为正则项，衡量信号的某种奇异性。正则项函数()p x 对未知图像X 造成了一个约束，使其得到一个稳定解，它的系数表示约束的强度。通常2P(x)Rx = ，R 是约束算子，它根据图像的先验信息对解进行约束,通常是基于一阶微分或二阶微分的高通滤波器算子。 α为正则化变量或动态正则化参数，起平衡正则项和数据项的作用，当它变大时，重建解趋于光滑，反之则数据拟合误差变小。超分辨率重建问题的本质就是在充分拟合观测数据的前提下，使某种奇异性度量最小，从而寻找理想的解X 。正则项和正则化参数的确定直接影响到复原图像的效果，这也是研究正则化方法的第一步。在正则化方法的实现过程中还会遇到离散算子，迭代算法等问题。为了更好的在去除噪声的同时保留图像边缘以及纹理细节信息，还要结合其他方法对标准正则化方法进行改进。这些内容都将在研究过程中深入讨论。正则化算法主要涉及到以下几个要点： ·正则化参数正则化参数α用来调整正则项和数据项的平衡，它的取值将直接影响到复原图像的效果。如果α取值偏小，不能有效地消除高频噪声，会引入寄生波纹和假象；如果α取值偏大，图像会因为丢失很多边缘信息而仍然模糊。通常情况下，在已知噪声的方差的情况下，参数计算过程如下所示：

超分辨荧光显微技术原理

超分辨荧光显微技术原理 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT

光学超分辨技术综述——微光学小论文

光学超分辨技术综述学号：SA14009025 姓名：邱金峰摘要：由于无论是源于人类本身对未知世界探索的渴望，还是现代工程技术的各种需要，对微观领域的高分辨率成像都是一个十分重要的研究方向，故本文对国内外光学超分辨技术研究的历史和现状做出综述是十分必要的。一、背景及意义人类对未知领域的探索永远是促进科学进步的最强大动力。在众多未知领域中我们身边的微观世界无疑是最令人着迷的。在这一领域中既涉及到生物细胞、遗传基因这些关乎我们自身的重要元素，又涉及到分子结构、基本粒子这些构成我们关于物质知识的核心命题。也只有对微观世界的深入研究才能让我们回答诸如什么是人类能够观测的最小尺度，宇宙是否存在物质的最小极限这样的物理学中的基本问题。而研究往往始于观察，成像又是观察的最基本手段。所以寻找对微观物质高分辨率成像的方法，制造对微观物质高分辨率成像的仪器，就成为了研究微观领域必不可少的首要一环。正是推动科学本身进步这一要求，使科研人员不断地采用各种各样的技术革新来尽可能地提高观测系统的分辨率和有效信息获取量，并尽可能地重建和恢复原始自然图像，以满足人类对未知的微观世界知识获取的渴望。另一方面，在技术层面上，随着许多新兴的超精密工程学的发展，人们提出了纳米级与亚纳米级分辨率成像的要求。如在巨大规模集成电路（Giga ScaleIntegration circuits）制造中，已经开始使用32nm工艺，并且正在开发22nm工艺；在纳米技术的研究中，从上世纪七十年代，首先提出使用单分子作为电子器件开始，到现在研制中的各种微纳机电系统，各个研究对象的线度也都在数微米到几纳米之间；而在现代生物科技和现代医学技术的发展中，人们不但提出了对大生物分子在纳米级和亚纳米及三维成像的要求，甚至还希望能对活性样品进行动态检测和显微操作。这就要求图像和数据同步、动态地显示在我们面前。为达到以上要求，人们应用了光学、微电子、计算机、机械制造、信号处理等各个学科的最新成果，来制造先进的现代成像系统。在这些现代成像系统中，又以现代光学成像系统，应用最为广泛。现代光学成像系统除了具备简单高效、使用方便、造价相对较低等传统光学成像系统的特性外，还具有更高的时间和空间成像分辨率，突破了传统意义上的衍射成像分辨率极限。而研究使光学成像系统突破衍射成像分辨率极限，获得高分辨率成像的相关方法也逐渐成为了一个独立的课题——光学超分辨技术。光学超分辨技术又可以根据成像系统对物体反射或透射光场不同部分的成像作用分为近场光学超分辨技术和远场光学超分辨技术。近场光学超分辨技术的主要思想是采用光纤探头等探测装置对物体表面进行扫描，探测物体表面的倏逝波并对其成像，已达到提高成像分辨率的目的。远场光学超分辨技术则是在传统的光学显微成像系统的基础上应用光瞳滤波、共焦扫描、荧光显微技术以及其他各种频带展宽技术，实现成像分辨极限的突破。二、历史与现状在研究光学超分辨成像技术时，就必须首先提到显微术。超分辨技术在某种程度上可以认为是显微术发展的延伸。在19世纪，人们主要利用透镜成像原理

超分辨光学显微

Karl Wang Microprobe Photonics Technology Co., Ltd

1671年，荷兰人Leeuwenhoek磨制成世界上第一架单式显微镜； 1830年，英国人Lister提出用火石和冕牌玻璃制成物镜以消色差和球差；德国物理学家Abbe用衍射理论证明普通光学显微镜存在分辨率极限；后来，Rayleigh给出具体的表达式 20世纪前半叶，出现暗场显微镜、偏光显微镜、相衬显微镜、荧光显微镜、干涉显微镜、体视显微镜、倒置显微镜和离心显微镜等。

激光共聚焦扫描显微镜是80年代发展起来的光机电一体化的高科技显微镜，可以进行三维成像。 LSCM的分辨率除与激光波长有关外，还取决于针孔直径和物镜数值孔径；近场光学显微镜(NSOM)，探头与被观察物的距离小于光波长，利用所谓“光学隧道效应”，分辨率可达几纳米；透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM，探测二次电子)；扫描探针显微镜：扫描隧道显微镜(STM)，原子力显微镜(AFM)，磁力显微镜，静电力显微镜，摩擦力显微镜等。

SPIM/HELM/SSIM TPM/MPM I2M/I3M/I5M CARS FLIM/FRET STED/STORM NSOM/TRIF 4Pi

LSCM以单色激光作为光源，并用附设光源针孔(pinhole)使光源成为点光源。同时，在检测器前方也有一个检测针孔，点光源对标本内焦平面上的每一检测针孔后的光电点扫描，标本上的被照射点在检测针孔成像，由倍增管或冷电耦合器件逐点或逐线接受，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像，光源针孔与检测针孔的位置相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于光源针孔和检测针孔，焦平面以外的点不会在检测针孔成像，这就是所谓的“共聚焦”。 LSCM在普通光镜基础上引入共聚焦装置，该装置能够排除非焦平面及焦平面非焦点光斑信息，大大提高分辨率和图象清晰度。在此基础上，由于计算机及相应的软件技术组合，可以对较厚样品进行连续光学切片及三维重建。

超分辨显微镜

光学显微镜有个分辨率的极限问题，大概是半个光学波长，比这个波长更小的物体，就分辨不出来了，比如使用400纳米的光，分辨率就是200纳米左右。这个极限大概19世纪就知道了，最近二十年才被打破，所以意义重大，所用的手段是纯粹的物理学，所以说今年的化学诺奖是物理学的胜利。以前有双光子显微镜，可以稍微低于这个分辨率极限，但是实际上就在极限上工作。所谓的超分辨率荧光显微镜，就是打破了这个分辨率的极限，比如还用400纳米的光，可以容易分辨200纳米以下的物体，甚至可以达到20纳米。以前的显微镜总是用一束光，这束光是一根细丝，聚焦到一个很小的小点上，这个小点就是分辨率极限。由于光的衍射效应，这个小点的大小受到光的波长的限制。这也是自从人类发明光学显微镜以来，困扰了200多年的难题。阎王爷先生的超分辨荧光显微镜叫做STED, 基本原理是用两束光，实际上是两束激光，一束是正常的光聚焦到一个小点上，下图左边，这个就是衍射极限的最大分辨率；另一束激光变成中空的筒子一样，下图中间；两束光聚焦到同一点上，由于第二束光把第一束光给灭了，只有中间那点没有灭掉，所以才能看到，这个更小的小点就是新的分辨率，打破了衍射极限，下图右边。这就是这个项目的重大意义所在。这样，使用这样的光学显微镜就可以清楚看到更小的物体，比如纳米材料的形貌，更广泛的应用是在生物学领域，比如下图，等待生物学专业人士来科普。

顺便说一句，中国目前是否有这样的超分辨光学显微镜我还不清楚，北大的席锋那里可能有，质量和运性情况不知道，其他单位没有听说过。比这个显微镜更低档一点是，双光子显微镜，所用的激光就是飞秒激光，国内估计总共有50台左右，价格每台300万到600万元，全部西方制造，只有五家公司：尼康，奥林巴斯，莱卡和蔡斯等。更低一点档次的显微镜是激光显微镜，每台大概200万元，国内估计200台到300台之间，只有西方制造。还有电子显微镜，分辨率可以达到0.1纳米或许更小，远远比这个超分辨的光学显微镜高，但是各有优缺点。以后抽空再来评述。庄小威的超级显微镜 vs 赵忠贤的高温超导消息传来，超级显微镜（这里是俗名，学名是超分辨荧光显微镜）获得2014年诺贝尔化学奖，恭喜！其实很多人都看准了这个项目，连我在2012年都留下了笔迹： *********************************************************** 2012-10-4，我看到的一些诺贝尔奖级别的成果和工作