Transwell实验原理与操作步骤.pdf

Transwell实验原理与操作步骤

Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，

这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，

不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张

有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。

将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培

养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，

由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验：

（1）共培养体系：

小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不

需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择 3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。

（2）趋化性实验：

可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细

胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。

①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞

B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。

②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。

（3）肿瘤细胞迁移实验：

常用8.0、12.0μm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤

细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。

（4）肿瘤细胞侵袭实验常用8.0、12.0μm膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。

transwell侵袭实验，其实原理简单地说就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培

养液隔开，细胞放在低营养的培养液里，为了找吃的，细胞会往高营养的培养液里面跑，但

是有膜挡着，所以要穿过膜才行。我们在膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，于是细胞要把基质消化了才可以从低营养的培养液跑到高营养的培养液里面，最后我们检测高营养的培养液里细胞量就可以知道细胞的侵袭能力了，大概原理就是这样的。

第一节概念

这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。

1.Transwell

关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理

解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。

更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，

不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实

验需要，可有不同选择。

但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。

下图是一个Transwell装置的纵切面

将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层

培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内

的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、

细胞侵袭等多种方面的研究。

下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验：

（1）共培养体系：

小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要

细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择 3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。

将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。

（2）趋化性实验

可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞

量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。

①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。

②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因

子对细胞的趋化作用。

（3）肿瘤细胞迁移实验

常用8.0、12.0μm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细

胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。

（4）肿瘤细胞侵袭实验

常用8.0、12.0μm膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。

上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的

下室跑，但与肿瘤细胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可

通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

2.肿瘤细胞侵袭模型

用于研究肿瘤细胞侵袭能力的肿瘤细胞侵袭模型有如下几种（引自司徒镇强《细胞培养》）：2.1 体内癌细胞侵袭模型

2.1.1 皮下移植侵袭模型

2.1.2 肌肉内移植侵袭模型

2.1.3 腹腔内移植侵袭模型

2.1.4 小鼠肾包膜下移植侵袭模型

2.1.5 鼠睾丸包膜下移植侵袭模型

2.1.6 小鼠耳廓皮下移植侵袭模型

2.1.7 鼠爪垫皮下移植侵袭模型

2.1.8 视网内界膜侵袭模型

2.2 体外癌细胞侵袭模型

2.2.1 体外静止器官培养法

2.2.1.1 半固体培养基单细胞器官培养法

2.2.1.2 液体培养基单细胞器官培养法

2.2.2 半体外半体内器官培养法

2.2.3 单层细胞器官培养法

2.2.4 瘤细胞球体器官培养法

2.2.4.1 静止球体器官培养法

2.2.4.2 旋转摇动球体器官培养法

2.2.5 单层细胞侵袭实验模型

2.2.6 Transwell侵袭小室测定法

可见，Transwell与侵袭实验之间并不能划等号，Transwell有多种应用，侵袭实验也有多种方法。所谓Transwell侵袭实验，其实是指将Transwell这一技术应用于肿瘤细胞侵袭

研究的一种实验。由于其简单易行、重复性好，因而得到了越来越广泛的应用，但不能认为

研究肿瘤侵袭只有Transwell一种方法。

第二节Transwell侵袭实验

我的课题涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁移实验，其他方面的Transwell应用我不太清楚，因此这里主要谈谈Transwell侵袭实验。

1.实验用品：

①Transwell小室：

多种厂家可提供，论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室，我们实验室用的

是Chemicon公司的ECM550系列，另有Boyden chamber、Millipore公司的millicell 和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert。

这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来就可以用，很方便，但也比较贵，我们实验

室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的，质量很好，但是非常贵，24孔板配套的小室，每个价格约130元，不推荐给大家。BD也有已包被好的，价格不清楚。Coster和Corning公司生产的小室，是论坛里比较常用的，好像是要自己铺胶，但据说每个小室成本只有40左右，应该比较适合中国国情。

下面是一些战友提供的价格，具体建议大家联系代理商咨询。linanping1979战友提供的价格：coster的24孔板的transwell的价格是456元RMB,8μm，用于肿瘤的侵袭实验。iceyxy战友提供的价格：Millipore的8μm的50个1760RMB,0.4μm的2000多,是一次性的。梅林战友提供的BD价格：240RMB一块（6.5um,24孔,12instert），好像是没胶的。liguofan说国产的boyden30块一个。jjyy提供的价格是：corning cat No.3422.

6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950

人民币不到。平均每个20元不到。

Transwell小室按照公司的要求，都是一次性使用的。不过其实洗洗泡泡还是可以重复用的。

我用的Chemicon公司的ECM554，用完后擦去基质胶，再用胰酶和75%酒精泡，可以

把膜洗得很干净，用前用紫外里外都照30min。sword01战友提供的处理方法：用棉签轻轻擦去胶和反面细胞，清水冲洗，超声清洗，低挡，30min，清水3×5min，蒸馏水3×5min，室温凉干，用前紫外线小室正面3h，反面6h，微波，低火10min×2。

因为我买的是铺好胶的，所以没买Matrigel，二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移

实验。以前的Chemicon ECM550系列，膜很结实，擦不坏，可以反复用很多次，但现在

的膜已经改用一种很薄很脆的材料，一般只能重复用一次，真黑啊！很多战友说Costar和Corning也是可以重复用的，大家可以试试。

本人没见过，有兴趣的可以自己研究一下。

另外，根据论坛战友提供的信息，osmonic公司有专用的膜出售，鼎国生物代理。Transwell

小室用过后，可把原来的膜切下，贴上osmonic公司的膜，这样又可以用了，不过我没用

过，有兴趣的可以试试。maojianwen战友的使用方法：trasnwell小室做一次后，将原

来的膜去掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油（注意用无色较稀的）将osmonic公司的膜贴上，剪掉多余的边缘。再照紫外。

②上层培养液：

上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2% BSA。

③细胞：

值得注意的是，有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。建议实验前先用酶谱法

检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。如果不清楚细胞MMPs的表达情况，就盲目

进行Transwell侵袭实验，可能会造成不必要的浪费，一次Transwell侵袭实验花钱少则

数百，多则数千，并不是笔小数目，还是小心为妙。

另外，为了让实验结果更明显，可先撤血清让细胞饥饿12－24h，再进行实验。

④基质胶：

常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，生产厂家有

BD、美国Collaborative Rsearch公司等。CaoY战友的帖这么说的：Matrigel是BD公司生产的，是一种细胞外基质，4度时是液体，在37度会逐渐凝固成胶状，不可逆。同样

的东西在sigma叫ECM。zhangyong1036战友提供的价格：BD公司的matrigel 1500

左右。

如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就不需要购买了。

⑤下层培养液：

下层常用含5%－10% FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可

适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋

化因子，但个人认为，FBS仍是最合适的。

⑥细胞培养板：

常用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常用。细胞培养板没什么特殊要求，普通的细胞培养板就可以。但要注意，细胞培养板应当与

购买的Transwell小室相配套。

⑦此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin，FN，Sigma有售)，这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上，也可用胶原（collagen）或明胶（gelatin）。很多战友认为这不是必须的，而且我也是不涂的，细胞照样贴壁很好。如果贴壁不好的话可以试试看。linanping1979战友认为，如果培养时间很长（>24h），细胞还是会掉到下室

里面去，所以有条件的话，最好还是在膜下层涂上FN。

另外，值得一提的是，膜下层涂上FN还有一定的趋化作用。

2．步骤

2.1 Transwell小室制备

2.1.1 无基质胶Transwell小室制备

①包被基底膜：

用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用

胶原（collagen）的话，一般配成0.5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。

②水化基底膜：

吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel

l (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37℃30min (3.9ug/ul) 60-80μ

使Matrigel聚合成凝胶。

2.1.2 有基质胶的Transwell小室制备

Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300μl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。

2.2 制备细胞悬液

①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1－10×105，个人认为不要超过5×105。

具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量

过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。

个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。

如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。

2.3 接种细胞

①取细胞悬液100－200μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell

小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200μl。

②24孔板下室一般加入500μl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同

要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一

旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考

虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h的IC50。用这个浓度处理细胞，24h内对细胞增殖并无明显抑制，但24h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组

细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。

时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可

能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点

研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。

另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象

在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培

养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。

2.4 结果统计

检测穿过的细胞数有两种方法：

2.4.1 直接计数法

贴壁”细胞计数

2.4.1.1 “

这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。如下图：

通过给细胞染色，可在镜下计数细胞

①用棉签擦去基质胶和上室内的细胞

②染色：常用的染色方法有结晶紫染色、台靡蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。

个人推荐采用0.1%结晶紫染色，这种方法有如下优势：(1). 不需要固定细胞，直接染色

即可。(2). 配制简单方便。(3). 染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，

洗脱液可在酶标仪上570nm 测其OD值，间接反映细胞数。个人认为这是结晶紫染色最

大的优势所在。因为，虽然经过准确的细胞计数，往往穿过膜的细胞数仍难以准确控制，可

能某一批实验穿过的细胞会特别多，以致细胞成堆，这种情况下就难以计数了，这种情况下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测。使用结晶紫染色要注意，染色前要将膜风干，否则可能会染不上。

③细胞计数：我们使用的是Leica DC 300F正置显微镜进行观察和拍照，把Transwell 小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。也有不少人用手术刀将膜切下后染色，再贴在玻片上，滴二甲苯，再盖上盖玻片，就可以长期保存，但是这样做小室就

成了一次性的了，未免有点浪费。

取若干个视野计数细胞个数。论坛里一般采用3－5个视野，也有人用10个，都是随机选取，个人认为这样选择的视野带有很大的偶然性，也会掺进人为影响，特别是计数视野较少的时候。我选取16个视野，不是随机选择，而是有固定的位置。我们使用的显微镜所看到

的视野的直径刚好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4。

如图，蓝色部分表示膜的大小，白色圆形表示视野的大小，绿色方形则表示拍照时所能拍下

的视野的中心部分。这样，每个小室都拍摄如下图的16个视野进行计数，这样得到结果是

比较客观和准确的。

2.4.1.2 “

非贴壁”细胞计数

由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系，有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上，而是掉进下室。如下图：

2.4.2 间接计数法

间接计数法主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法，与常用的MTT实验是同样的原理。

2.4.2.1 MTT法

①用棉签擦去基质胶和上室内的细胞

②24孔板中加入500μl含0.5mg/ml MTT的完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没

在培养基中，37℃4h后取出。

③24孔板中加入500μl DMSO，将小室置于其中，使膜浸没在DMSO中，振荡10min，使甲湃充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上测OD值。

2.4.2.2 荧光试剂检测

这类方法一般是与Transwell小室一起出售的，其原理与MTT法类似，是用一种荧光染料

染细胞，再将细胞裂解，检测荧光值。Chemicon的ECM554即属于这类。

2.4.2.3 结晶紫检测

上文已说过，这里不再赘述，原理与MTT法也是类似的。但结晶紫染色还有个优点，就是

染色和脱色的过程并不影响膜上细胞，在脱色后还可重新染色。

这是用正置显微镜拍摄的图，结晶紫染色，进行细胞计数。

第三节Transwell的其他应用的实验步骤

1．Transwell肿瘤细胞迁移实验

过程与Transwell侵袭实验基本一致，不同的只是不需要铺Matrigel。个人认为，由于没

有基质胶的阻挡，细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快，所以细胞量要更大。我做侵袭实验的细胞密度是1×105，而迁移实验的密度是1×106。另外，下层培养液的FBS浓度也可适当下调，我做侵袭实验的浓度是5%，迁移实验的浓度是 2.5%。

2．cathywxy战友的Transwell上皮细胞培养步骤

做了一段时间的原代细胞培养，把经验拿出来跟大家分享一下吧，请有关战友共同探讨：

(1) 将雄性wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4℃含0.1％胰蛋白酶XIV (Sigma)，100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（Gibco-BRL）、无Ca 2＋、Mg2＋，无血清的MEM。

(2) 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞。

(3) 离心后立即用新鲜的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5％胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC-8 medium (Biofluids)冲洗一次。

(4) 冲洗过后，将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于90％，则将细胞以

106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12 mm SNAPWELL, Costar），以37°C 5％CO2-95% 空气含5% 胎牛血清(Gibco-BRL) and 100 U/ml 青霉素and

100ug/ml 链霉素的LHC-8 medium孵育6~10天。

(5) 孵育后，经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间，即可用于电生理试验。

显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层

细胞片

3. metastasis战友的Transwell B16细胞的体外迁移实验

我以前用costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验，具体是这么做的：首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8 um）的下表面涂一层fibronectin(10

ug/ml，50ul),37度2小时，PBS洗一遍后，放入预先每孔加有600ul的培养基（含10%血清）的24孔板内，后在Transwell的内室加入细胞（100ul,用含0.1%血清的培养基

稀释好自己所需密度），放入培养箱，12-18小时后，取出Transwell，用棉签擦去PVPF 膜靠近内室那一面的细胞，另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。

4．mci战友的内皮细胞HMEC-1迁移实验

1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后，上室加入100μl用serum-free MCDB131稀释的5*104/孔的HMEC及不同浓度的药物，下室加入0.6ml serum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激迁移,同时设置相应阴性及阳性对照，置于CO2培养箱中作用8小时，然后弃去孔中培液，用90%酒精常温固定30分钟，0.1%结晶紫常温染色10分钟，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜(Olympus, DP50, Japan).下观察并拍照，最后用10%乙酸100μl/孔抽提10分钟，于600nm处测定OD值。抑制率计算公式为：抑制率（%）=[(OD值给药组-OD值无刺激阴性对照)/（OD值不加药阳性对照- OD值无刺激阴性对照)] ×100%.

Transwell实验原理与操作步骤

Transwell实验原理与操作步骤 Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 （2）趋化性实验： 可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 ①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 ②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 （3）肿瘤细胞迁移实验： 常用8.0、12.0μm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。

管理学原理与方法周三多第六版

第一篇 第一章管理与管理学 第一节人类的管理活动 一：人类活动的特点(目的性、依存性、知识性) 二：管理的必要性 三：管理的概念 第二节管理的职能与性质 一：管理的职能（计划、组织、领导、控制、创新） 二：管理的自然属性 三：管理的社会属性 第三节管理者的角色与职能 一：管理者的角色（人际角色、信息角色、决策角色） 二：管理者的职能 罗伯特卡次的研究，管理者必须具备三种技能：（技术技能、人际技能、概念机能）第四节管理学的对象与方法 一：管理学的研究对象 二：管理学的研究方法 （一）归纳法（二）试验法（三）演绎法 第二章管理思想的发展 第一节中国传统管理思想 一：中国传统思想形成的社会文化背景 二：中国传统管理思想的要点 第二节西方传统管理思想 一：西方早期管理思想的产生 1：亚当斯密《国富论》1776（英国） 2：查理巴贝奇（英国） 3：罗伯特。欧文（英国的空想主义家） 二：科学管理理论的产生和发展（19世纪末20世纪初） （一）“泰罗”的科学管理理论——科学管理之父 亨利。甘特：布雷斯及他的妻子： （二）对“泰罗制”的评价 （三）法约尔的“组织管理理论” 第三节西方现代管理思想的发展 一：行为科学学派 霍桑试验： 1：需求层次理论——马斯洛 2：双因素理论——赫茨伯格 3：X、Y理论 4：Z理论——威廉。大内 二：“管理科学”学派 三：“决策理论”学派 四：对现代管理理论的思考 五：新经济时代管理思想的变革

（一）管理思想的创新 （二）管理原则的创新 （三）经营目标创新 （四）经营战略创新 （五）生产系统创新 （六）企业组织创新 第三节中国现代管理思想的发展 一：中国现代管理思想形成的历史背景 （一）中国官僚资本企业和民族资本企业的管理 （二）我国革命根据地公营企业的管理 （三）全面学习西方的管理模式 （四）探索中国现在管理模式 二：社会主义经济管理体制改革 （一）由国内管理向国际化管理转化 （二）由科学管理向信息化管理转化 （三）由首长管理向人性化管理转化 （四）由政府管理向民营化管理转化 （五）由封闭式实体管理向开放式虚拟管理转化 第三章管理的基本原理 第四章第一节管理原理的特征 第五章一：管理原理的主要特征 第六章二：研究管理原理的意义 第七章第二节系统原理 第八章一：系统的概念 第九章二：系统的特征 第十章三：系统原理要点 第十一章第三节人本原理 第十二章一：职工是企业的主体 第十三章二：有效管理的关键是职工参与 第十四章三：现代管理的核心是使人性得到最完美的发展 第十五章四：管理是为人服务的 第十六章第四节责任原理 第十七章一：明确每个人的职责 第十八章二：职位设计和权限委任要合理 第十九章三：奖惩要分明，公正而及时 第二十章第五节效益原理 第二十一章一：效益的概念 第二十二章二：效益的评价 第二十三章三：效益的追求 第四章信息化管理 第一节信息与信息化 一、信息的含义 二、信息化的内涵 三、信息化的影响

transwell实验(整理版)

第一节概念 这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。 1．Transwell trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。 更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。 Fig1 但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 下图是一个Transwell装置的纵切面 Fig2 将Transwell小室放入培养板中，小室称上室，培养板称下室，上室盛装上层培养液，下室盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。 我们将细胞种在上室，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 Fig3 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： (1).共培养体系：

(完整版)transwell实验原理与步骤

一、Transwell小室制备 1. 无基质胶Transwell小室制备 ①包被基底膜： 用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜： 吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。 2. 有基质胶的Transwell小室制备 Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 μl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。 ②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48 h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24 h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象 在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2 h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。

transwell实验原理与步骤

一、Transwell小室制备 1、无基质胶Transwell小室制备 ①包被基底膜: 用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN的话,可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原(collagen)的话,一般配成0、5 mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜: 吸出培养板中残余液体,每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液,37 ℃,30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法:在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3、9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置37 ℃30 min使Matrigel 聚合成凝胶。 2、有基质胶的Transwell小室制备 Chemicon公司的ECM550系列说明书要求,将小室放入培养板中,在上室加入300 μl预温的无血清培养基,室温下静置15－30 min,使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。 二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h,进一步去除血清的影响。但这一步并不就是必须的。 ②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1－2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105,个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索,因为不同细胞,其侵袭能力就是不同的。个人经验,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,如果最后用计数法统计结果的话将难以计数;而过少的话,可能还没到检测的时间点,所有的细胞都已穿过,因此最少也要保证在收样的时候,上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为,对照组与处理尽量不要分开计数,因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数,那么计数一定要多重复几次,力求准确,尽量保证对照组与处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室,不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求,请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。 ②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基,不同的培养板加的量有不同要求,具体请参考说明书。这里要特别注意的就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。 ③培养细胞:常规培养12－48 h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例,我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力,还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度就是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞,24 h内对细胞增殖并无明显抑制,但24 h后,抑制作用就开始出现了。所以,用这个浓度来做Transwell,处理时间也必须限定在24 h内,否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡,使处理组细胞数目少于对照组,那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少,究竟就是由于侵袭被抑制引起,还就是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以,同样,过短也不行,因为细胞内会有一定量的MMPs储存,短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去,进而发挥作用,影响MMPs表达,到最后释放到培养基中,还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点,也可选择多个时间点研究时间依赖效应,但前提就是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外,我瞧到细胞在小室内的形态不就是正常培养贴壁的形态,而就是圆形的,仍就是悬浮时的形态,不过会聚集成团,所以瞧到细胞不正常贴壁也不要紧张,就是正常现象 在培养过程中,膜下会逐渐有少量小气泡产生,这就是正常现象,可不予处理,但我遇到过培养一段时间后,膜下出现了大气泡,幸亏及时发现,否则后果将非常严重。因此,个人建议,最好接种细胞后1－2 h把培养板从培养箱里拿出来瞧瞧,确信没有大气泡产生。

管理学原理与方法_试题及答案

一、判断题： （）1、管理是任何组织集体劳动所必需的活动，因此任何社会的管理性质都是相同的。 （）2、泰罗是科学管理学派的杰出代表人物。 （）3、我们将管理层次少而管理幅度大的组织结构称作直式结构，它可以密切上下级之间的关系。 （）4、根据菲德勒的权变理论，在情境较好的情况下，采用高LPC领导，效果较好。 （）5、计划工作之所以是一项普遍的工作，是因为一个组织无论大小，它的管理过程都是完整的。 （）6、根据公平理论，当获得相同结果时，员工会感到他们是被公平对待的。 （）7、当重要细节必须被传递时，非语言沟通是最适宜的方式。 （）8、衡量绩效是控制活动的最终目的。 答案：1、×2、√3、×4、×5、√6、×7、×8、× 1、（）科学管理对人性的假设是“社会人”的假设。 2、（）经验管理学派认为学生和管理者通过研究各种成功与失败的管理案例，就能理解管理问题，但并不能因此学会有效地进行管理。 3、（）目标并不决定未来，但它们是动员企业中各种资源和力量去创造未来的手段。 4、（）在计划中体现的灵活性越大，则所制定的计划越实际，越能保证得到切实完成。 5、（）决策就是要选择一个最好的方案去实现组织的目标。

6、（）当组织处于不稳定的环境之中，较宽的管理幅度能确保更有效的管理。 7、（）赫茨伯格认为企业政策、工资水平、人际关系都属于保健因素。 答案：1、×2、√3、√4、√5、×6、√7、√ 1.管理既是一门科学，又是一门艺术.（） 2.管理者权力比权威更重要。（） 3.未来企业竞争将主要是企业文化的竞争。（） 4.霍桑实验证明：人是“经济人”，不是“社会人”。（） 5.管理效益原理认为现代管理的核心是使人性得到最完美的发展。（） 6.管理原理和管理原则基本没什么区别，可以等同。（） 7.按决策的重要程度可将决策分为高层决策、中层决策和基层决策。（） 8.头脑风暴法、德尔菲法和哥顿法属于集体决策方法。（） 9.运用期望值法进行决策时，期望值大的方案较优。（） 10.经济批量模型中库存费用与订货费用是成反比的。（） 11.决策是计划的前提，计划是决策的逻辑延续。（） 12.边际分析法是制订计划时经常采用的一种方法。（） 13.力求维持最少部门是部门划分的原则之一。（） 14.领导者不一定是管理者，但管理者一定是领导者。（） 答案：1~5√×√××6~10××√×√11~14√×√× 1.管理的双重性是指不确定性和复杂性。（） 2.管理者权力比权威更重要。（）

不同实验中transwell小室的选择和使用

不同实验中transwell 小室的选择和使用 Transwell 小室在细胞实验中很常用，共培养实验、趋化实验、细胞迁移、细胞侵袭以及药物转运实验都会用到，但小室的规格有很多种，不同的实验需要用到的小室规格也不同。 根据transwell 板的不同，transwell 小室可以分为6孔板小室、12孔板小室和24孔板小室以及和transwell 皿配套的75 mm直径的小室；根据孔径的不同，从小孔径到大孔径又分为0.4μm 规格、3μm 规格、5μm 规格、8μm 规格，不同实验对小室孔径的要求也不一样。 小于3μm 孔径的小室，细胞不会迁移通过，研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，应该选择3μm 以下的孔径。例如共培养实验和caco-2细胞转运模型实验。 共培养实验： 常用0. 4、34μm，将细胞A 种于上室，细胞B 种于下室，可以研究细胞B 分泌或代谢产生的物质对细胞A 的影响。 caco-2细胞转运模型： 选用0.44μm 膜，将Caco-2细胞以约l×10个/mL，每孔0.5 mL的密度接种在Transwell 内培养21d左右，前1周隔天换液，1周后每天换液。在模型建立的同时对其跨膜电阻值及碱性磷酸酶活性进行监测来判断模型是否达到转运实验要求。 涉及到细胞迁移的实验： 要用5. 0、8. 0、12.0μm 的小室，这样上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映细胞的趋化能力、迁移能力和侵袭能力。

趋化性实验： 细胞B 对细胞A 的趋化作用，将细胞A 种于上室，细胞B 种于下室，可以研究细胞B 分泌或代谢产生的物质对细胞A 的趋化作用；趋化因子对细胞的趋化作用，将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 细胞迁移实验： 常用8. 0、12.0μm 膜，上室种细胞，下室加入FBS 或某些特定的趋化因子，细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映细胞的迁移能力。 细胞侵袭实验： 常用8. 0、12.0μm 膜，原理与细胞迁移实验类似。上室种细胞，下室加入FBS 或某些特定的趋化因子，细胞会向营养成分高的下室跑，但与细胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映细胞的侵袭能力。

管理学原理与方法学习心得

管理学原理与方法学习心得 管理学原理与方法学习心得 管理学原理与方法学习心得1 ——对管理学的认识和学习管理学的重要性 一、对管理学的认识： 通过对《管理学原理》的学习，使我充分认识到：管理是社会中存在的最普遍的社会现象。从个人、家庭、企事业单位乃至其他社会组织，从农村、城市、国家乃至世界都需要管理，都存在管理活动。凡是有人群活动的地方或领域，都存在与之相适应的管理。 管理是在一定环境中、组织中的管理者，通过实施计划、组织、领导和控制等职能，有效地利用各种资源，以达到组织目标的过程。管理总是存在于一定的组织之中，组织是管理的载体，是人类集体协作的产物。其管理的基本含义大致包括以下几点： (1)、管理是在一定环境中进行的。任何一个组织都有一定的生存环境，包括组织的外部环境和内部环境。管理始终处于不断变化的环境之中。能否适应环境的变化，是决定管理成败的重要因素。 (2)、管理是在一定的组织中进行的。由两个以上的人组成的、有共同目标的组织，就像一个乐队要演奏出动人心弦的乐

章，就需要指挥使演奏不同乐器的人员分工协作。指挥就是管理。管理是一切有组织的集体活动所不可缺少的因素。 (3)、管理的主体是管理者。所谓管理主体，是指在管理过程中具有主动支配和影响作用的要素。一切管理职能都要通过管理主体去发挥作用。要成为一名管理者，必须具备一定的素质和技能。 (4)、管理的客体是组织中的各种资源。所谓管理客体也就是管理的对象，指的是管理过程中管理者所作用的对象。在一个组织中，管理客体主要是指人、财、物、信息、技术和时间等一切资源，其中最重要的是人力资源，是对人的管理。 (5)、管理是一个过程。管理是实施计划、组织、领导和控制管理职能的过程，这四个管理职能构成了管理过程。 (6)、管理的目的是实现组织的目标。管理本身并不是目的，管理是围绕组织目标进行的，其最终目的是实现组织的目标，管理没有目标就是一种盲目的行动。世界上不存在没有目标的管理，也不可能实现无管理的目标。即管理的目的是协助企业组织实现宗旨，完成任务，达到目标。 (7)、管理的任务是设计和维持一个良好的工作环境，使员工在这个环境里能积极主动、热情高效并愉快地工作，使组织有效地完成任务。 另外，管理学的产生对人类社会的影响是史无前例的。在当今社会，管理已成为全社会普遍关注的焦点问题，大到国家、政

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)

迁移实验（cell migration assay） 实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 2.1基质胶铺板： 用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 2.2制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 2.3接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 2.4结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。 取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。 0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。 400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。 实验材料

管理学原理与方法(周三多第五版)期末复习重点.

管理学原理与方法(周三多第五版) 总论 人类活动的特点：目的性，依存性，知识性 管理的概念：管理是管理者为了有效地实现组织目标（目的性有效性协调性过程性）１：管理是人类有意识有目的的活动。２：管理应当是有效的。 ３：管理的本质是协调。４：协调是运用各种管理职能的过程。 管理的职能：决策、组织、领导、控制、创新，是一切管理活动最基本的职能。 1：决策：所有管理者必须制定符合并支持组织的总体战略目标。（制定目标、行动） 2：组织：设计岗位，授权分工，使整个组织协调地运转。（设计、授权） 3：领导：指导人们的行为，通过沟通增强互相理解，统一思想和行动，激励成员自觉地为实现组织目标共同努力。（指导、沟通、激励） 4：控制：使实践活动符合于计划，计划是控制的标准。（衡量、纠偏） 5：创新：与其他职能结合中表现。 管理二重性：1、管理的自然属性--反映人与自然的关系不以人的意志为转移，也不因社会制度形态的不同而有所改变，这完全是一种客观存在。 2、管理的社会属性--反映社会关系 管理者的角色：明茨伯格这十种角色可归入三类。 人际角色：代表人角色、领导人角色、联络者角色 信息角色：监督者、发言人、传播人 决策角色：企业家、干扰对付者、资源分配者、谈判者 管理者三种技能：卡次 1：技术技能，运用管理者所监督的专业领域中的过程、惯例、技术和工具的能力。 2：人际技能，成功地与人打交道并与人沟通的能力。 3：概念技能，把观点设想出来并加以处理以及将关系抽象化的精神能力。 管理学的研究方法：归纳法、试验法、演绎法 中国传统管理思想的要点： 1：宏观管理的治国学--（财政赋税、人口管理、货币管理、等） 2：微观管理的治生学--（农副业、手工业、运输、建筑工程等） 顺道、重人、人和、守信、利器、求实、对策、节俭、法治 西方早期思想产生的三个人物：亚当斯密巴贝奇罗伯特欧文 泰罗创立的科学管理理论 主要观点：1：科学管理的根本目的--谋求最高工作效率 2：达到最高效率的重要手段--用科学的管理方法代替旧的经验方法 3：实施科学管理的核心问题-要求管理人员和工人双方在精神上和思想上来一个彻底的改变提出的以下管理制度：1：对工人提出科学的操作方法，以便合理利用工时，提高效率 2：在工资制度上实行差别计件制3：对工人进行科学的选择，培训和提高 4：制定科学的工艺规程5：使管理和劳动分离 评价：1：它冲破了传统地落后地经验管理办法，将科学引进了管理领域，创立了一套具体地科学管理方法 2：科学地管理方法和科学地操作程序使生产效率提高了二三倍，推动了生产地发展，适应了资本主义地发展。 3：由于管理职能于执行职能地分离，企业中开始有一些人专门从事管理工作 4：泰罗把人看成会说话的机器，只能按照管理人员的决定、指示、命令执行劳动，在体力

不同实验中transwell小室的选择 和使用

不同实验中 transwell 小室的选择和使用 Transwell 小室在细胞实验中很常用，共培养实验、趋化实验、细胞迁移、细胞侵袭以及药物转运实验都会用到，但小室的规格有很多种，不同的实验需要用到的小室规格也不同。 根据transwell 板的不同，transwell 小室可以分为6 孔板小室、12 孔板小室和 24 孔板小室以及和 transwell 皿配套的 75 mm 直径的小室；根据孔径的不同，从小孔径到大孔径又分为0.4μm 规格、3μm 规格、5μm 规格、8μm 规格，不同实验对小室孔径的要求也不一样。 小于3μm 孔径的小室，细胞不会迁移通过，研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，应该选择3μm 以下的孔径。例如共培养实验和 caco-2 细胞转运模型实验。 共培养实验：常用 0.4、34μm，将细胞 A 种于上室，细胞 B 种于下室，可以研究细胞 B 分泌或代谢产生的物质对细胞 A 的影响。 caco-2 细胞转运模型：选用0.44μm 膜，将Caco-2 细胞以约l×10个/mL，每孔 0.5 mL 的密度接种在 Transwell 内培养 21d 左右，前 1 周隔天换液，1 周后每天换液。在模型建立的同时对其跨膜电阻值及碱性磷酸酶活性进行监测来判断模型是否达到转运实验要求。 涉及到细胞迁移的实验：要用 5.0、8.0、12.0μm 的小室，这样上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映细胞的趋化能力、迁移能力和侵袭能力。 趋化性实验：细胞 B 对细胞 A 的趋化作用，将细胞 A 种于上室，细胞 B 种于下室，可以研究细胞 B 分泌或代谢产生的物质对细胞 A 的趋化作用；趋化因子对细胞的趋化作用，将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 细胞迁移实验：常用 8.0、12.0μm 膜，上室种细胞，下室加入 FBS 或某些特定的趋化因子，细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映细胞的迁移能力。 细胞侵袭实验：常用8.0、12.0μm 膜，原理与细胞迁移实验类似。上室

transwell实验原理与步骤

一、Transwell小室制备 1. ?无基质胶Transwell小室制备 ①包被基底膜： 用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN 的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成 0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜： 吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。另有 tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min使Matrigel聚合成凝胶。 2. ?有基质胶的Transwell小室制备 ?Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 μl预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。 二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。 ②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48 h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24 h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象 在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2 h 把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。? 四、结果统计 检测穿过的细胞数有两种方法： 1. ?直接计数法 （1）“贴壁”细胞计数 这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。 通过给细胞染色，可在镜下计数细胞

管理学原理与方法周三多 第六版

第一篇 第一章? 管理与管理学 第一节人类的管理活动 一：人类活动的特点(目的性、依存性、知识性) 二：管理的必要性 三：管理的概念 第二节? 管理的职能与性质 一：管理的职能（计划、组织、领导、控制、创新） 二：管理的自然属性 三：管理的社会属性 第三节? ?管理者的角色与职能 一：管理者的角色（人际角色、信息角色、决策角色） 二：管理者的职能 罗伯特卡次的研究，管理者必须具备三种技能：（技术技能、人际技能、概念机能）第四节? 管理学的对象与方法 一：管理学的研究对象 二：管理学的研究方法 （一）?归纳法（二）试验法（三）演绎法 第二章? ?管理思想的发展 第一节? 中国传统管理思想 一：中国传统思想形成的社会文化背景 二：中国传统管理思想的要点 第二节? 西方传统管理思想 一：西方早期管理思想的产生 1：亚当斯密《国富论》1776（英国） 2：查理巴贝奇（英国） 3：罗伯特。欧文（英国的空想主义家） 二：科学管理理论的产生和发展（19世纪末20世纪初） （一）“泰罗”的科学管理理论——科学管理之父 亨利。甘特：布雷斯及他的妻子： （二）对“泰罗制”的评价 （三）法约尔的“组织管理理论” 第三节? ?西方现代管理思想的发展 一：行为科学学派 霍桑试验： 1：需求层次理论——马斯洛 2：双因素理论——赫茨伯格 3：X、Y理论 4：Z理论——威廉。大内 二：“管理科学”学派 三：“决策理论”学派 四：对现代管理理论的思考 五：新经济时代管理思想的变革

（一）管理思想的创新 （二）管理原则的创新 （三）经营目标创新 （四）经营战略创新 （五）生产系统创新 （六）企业组织创新 第三节? ? ? ? 中国现代管理思想的发展 一：中国现代管理思想形成的历史背景 （一）?中国官僚资本企业和民族资本企业的管理 （二）?我国革命根据地公营企业的管理 （三）?全面学习西方的管理模式 （四）?探索中国现在管理模式 二：社会主义经济管理体制改革 （一）?由国内管理向国际化管理转化 （二）?由科学管理向信息化管理转化 （三）?由首长管理向人性化管理转化 （四）?由政府管理向民营化管理转化 （五）?由封闭式实体管理向开放式虚拟管理转化 第三章? ?管理的基本原理 第四章第一节? ?管理原理的特征 第五章一：管理原理的主要特征 第六章二：研究管理原理的意义 第七章第二节? ?系统原理 第八章一：系统的概念 第九章二：系统的特征 第十章三：系统原理要点 第十一章第三节人本原理 第十二章一：职工是企业的主体 第十三章二：有效管理的关键是职工参与 第十四章三：现代管理的核心是使人性得到最完美的发展 第十五章四：管理是为人服务的 第十六章第四节? 责任原理 第十七章一：明确每个人的职责 第十八章二：职位设计和权限委任要合理 第十九章三：奖惩要分明，公正而及时 第二十章第五节? ?效益原理 第二十一章一：效益的概念 第二十二章二：效益的评价 第二十三章三：效益的追求 第四章信息化管理 第一节信息与信息化 一、信息的含义 二、信息化的内涵 三、信息化的影响

transwell实验原理与步骤

一、Tran swell 小室制备 1. 无基质胶Tran swell 小室制备 ①包被基底膜： 用50 mg/LMatrigel 1:8 稀释液包被Tran swell小室底部膜的上室面， 4 C风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉，吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原(collagen )的话，一般配成0.5 mg/ml ，直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜： 吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 C, 30min。 另有tianjin_glioma 战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60- 80卩l (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 C 30 min 使Matrigel聚合成凝胶。 2. 有基质胶的Tran swell 小室制备 Chemicon 公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300卩1预温的无血清培养基，室温下静置15 - 30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。 二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12 - 24 h ,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1 - 2遍，用含BSA的无血清培养基 重悬。调整细胞密度至1-10 X10 5,个人认为不要超过 5 X105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多 过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点， 所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。 个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证 对照组和处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100 —200 加入Tran swell小室，不同公司的、不同大小的Tran swell小 室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200卩l。 ②24孔板下室一般加入500 □含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同 要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一 旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出 现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12 —48 h (主要依癌细胞侵袭能力而定)。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Tran swell , 处理时间也必须限定在24h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组 细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可 能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达， 到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点 研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞 在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成 团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象 在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培 养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1—2 h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。

Transwell实验 超详细

Transwell侵袭实验总结 第一节概念 这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。 1.Transwell 关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。 更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。 但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 下图是一个Transwell装置的纵切面

将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。 我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。