利用PMSG和LRH-A3诱导间情期秋田犬发情效果的研究

利用PMSG和LRH-A3诱导间情期秋田犬发情效果的研究

摘要

为了探索提高母犬利用年限和终身产仔数。以不同剂量和给药次数的PMSG 组合的方法，对乏情期母犬进行外源激素诱导发情。第一组为皮下注与LRH-A

3

射PMSG 1500IU∕条，仅注射一次；第二组为皮下注射PMSG 500IU∕条，少量多次，总剂量1500IU。当两组中的母犬综合征状显示最佳配种时同时注射一次 25ug∕条；第三组为空白对照组不注射任何药物，为母犬正常状态。结

LRH-A

3

果，第二组采用少量多次皮下注射PMSG（500IU）进行诱导发情的发情率为37.5%，比第一组，一次注射PMSG(1500IU)的发情率75%，高37.5%（P<0.05）。而第一组的受胎率为33.33%，第二组的受胎率是50%，两者相差16.67%（P<0.05）。

试验证明，在外源性激素PMSG诱导母犬发情排卵时，在配种的同时应用LRH-A

3可以促进卵泡发育和排卵，增加可用胚胎数和提高受胎率。

关键词：孕马血清,促性腺激素释放激素，秋田犬，诱导发情

Utilization of estrus Estrus Akita between PMSG and LRH-A3

induced

Abstract

In order to explore the use of age and improve lifelong bitches litter size. In PMSG and methods LRH-A3 combinations of different dosage and administration times of anestrus bitches exogenous hormones induce estrus. The first group was injected subcutaneously PMSG 1500IU / bar, injected only once; the second group was injected subcutaneously PMSG 500IU / bar, a few times, a total dose of 1500IU. When two of the best breeding bitch syndrome-like display simultaneously injected once LRH-A3 25ug / bar; the third group was the control group were not injected any drug for bitches normal state. As a result, the second group received a small amount of multiple subcutaneous PMSG (500IU) for induction of estrus estrus was 37.5%, compared with the first group, the first injection of PMSG (1500IU) 75% of estrus, high 37.5% (P <0.05) . The first group pregnancy rate was 33.33%, the second group pregnancy rate is 50%, a difference of 16.67% (P <0.05). Tests show that exogenous hormone PMSG inducing ovulation during estrus bitches in breeding at the same time apply LRH-A3 can promote follicular development and ovulation, increase the number of available embryos and increase conception rate.

Keywords: pregnant mare serum gonadotropin-releasing hormone, Akitas, induce estrus

目录

前言 (1)

1 材料与方法 (2)

1.1 材料 (2)

1.1.1 试验时间和地点 (2)

1.1.2 试验动物 (2)

1.1.3 试验仪器与药品 (2)

1.2 方法 (2)

1.2.1 试验犬的饲养管理 (2)

1.2.2 激素处理方案及妊娠确定条件 (2)

1.2.3 外部观察法、试情法及最佳配种时间确定 (3)

1.2.4 阴道涂片镜检及最佳配种时间确定 (3)

2 结果与分析 (4)

2.1 注射一次PMSG母犬发情状况结果 (4)

2.2 多次皮下注射PMSG诱导母犬发情状况结果 (5)

2.3 采用PMSG不同注射方法和剂量诱导母犬发情状况结果 (6)

3 讨论 (6)

3.1 犬发情不稳定、不明显、配不上原因分析 (6)

3.2 外源性激素在体内转化作用机理 (7)

3.3 处理方法的分析 (8)

4 结论 (8)

参考文献 (9)

致谢 (11)

前言

随着社会经济的飞速发展和居民生活水平的不断提高，饲养宠物的人士越来越多。据初步统计，2015年全国在册宠物数量已达1亿多只，中国宠物行业的年总产值达到150亿元人民币[1]。现今中国已成为世界上宠物产品需求增长最快的国家之一。犬是人们最早驯化的动物之一，居我国传统养殖业“猪、马、牛、羊、犬”中六畜之一。犬从远古时代与人一道来到世上，共渡历史长河，漫漫长生，是人类忠实的伴侣和朋友。犬是理想的试验动物，广泛用于营养、病理、生理、药理、试验外科和遗传学的研究，加上狗皮在国际市场上畅销，狗肉又有很高的营养价值，因此“养狗热”一度出现[2]。

现代人由于社会节奏加快、生活、工作和学习压力增大，加上独生子女现象、社会老龄化与城市居住单元化等因素影响使得人际交往逐渐减少，而豢养宠物有助于缓解紧张状态对人们精神生活的冲击，有利于人们的身心健康与感情释放。并能创造性地做出许多惊人的事迹。因此，加强犬的繁殖育种工作，以提供适应各种用途的优良犬种愈加重要。

我国宠物文化的产生与发展可以概括为三句话，即：悠久的历史、落后的现实、兴盛的未来。由于种种原因，多年来缺乏科学选种、育种和饲养管理，优良纯系减少，品种退化迫在眉睫。而且，目前国内有关犬繁殖的资料甚少，尤其犬的繁殖生理特点与其他动物比较差异甚大，且犬的品种较多，人们喜欢共识名犬100多种。不同品种犬的体型，用途差异很大，各种犬的生理指标也不尽相同。一般认为，秋田犬在家庭单独饲养犬正常情况下每年发情两次，多在春（3～5月份）、秋（9～11月份）两季。群养犬的发情与季节无关，通常间隔6个月出现二次发情，因犬个体不同，发情表现和持续时间略有差异[3]。秋田犬初次发情时间平均为10～12月龄，初配在1.5岁以后，体重在成年体重的75%以上较好，错过一次发情、配种就意味着要等半年，严重地提高了劳动报酬。

犬的生殖活动受着内分泌系统的精确调节，而这一调节贯穿生殖的全过程。由犬体内激素不平衡导致激素分泌紊乱母犬不发情和公犬性欲低下，而引起生育功能低下或不育等问题；严重影响了养犬业的发展阻碍了其繁殖速度，对犬的社会经济价值的开发利用造成了重大影响。近几年来，国内外学着已有对犬诱导发情处理的研究报道，但收到效果不尽人意。研究报道使用激素常为PG、HCG、E、PMSG和GnRH较多为单独使用，效果不甚理想[4,5]。本试验为了促进犬的发情，排

处理方法,观察其对秋田犬发情的影响。

卵和提高受胎率，采用PMSG+LRH-A

3

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验时间和地点

试验地点河南省*****有限公司，试验时间为2016年03月20日到05月5日。

1.1.2 试验动物

日系秋田犬由河南省******业有限公司提供2～3岁成年经产母犬21条体质量20～26kg，健康公犬2条在试情和配种时使用，共计23条犬；试验犬只经驱虫，三联疫苗和狂犬疫苗免疫，生殖机能正常。

1.1.3 试验仪器与药品

显微镜（深圳市赛克数码科技开发有限公司，型号SK2009HS）；B超仪（广州索诺星信息科技有限公司，型号SS1000）；一次性2.5ml、5ml注射器（江西洪达医疗器械集团有限公司）；注射用促性腺激素释放激素(LRH-A

，赤峰博恩

3

药业有限公司，批号兽药字（2007）050072090)，25ug/支；注射用孕马血清促性腺激素(杭州动物药品厂，批号兽药字(2012)110204564)1000IU/支；生盐水（山东康宁药业有限公司500ml/瓶）；棉签（石家庄康尔泰医疗器械有限公司20cm×20只/包）；载玻片（姜堰市夏南生化器械厂50片/盒）；瑞氏-姬姆萨复合染色液（珠海贝索生物技术有限公司A、B液一瓶50ml，A染色液B 是稀释液）。以上试验药品均采购于郑州桑园饲料兽药批发市场。

1.2 方法

1.2.1 试验犬的饲养管理

本次试验在犬的间情期进行，根据养殖场的档案记录随机抽取21条非繁殖期经产母犬和2条公犬组成，共计23条。单笼饲养于河南省******有限公司的饲养室内，专人负责。随机对母犬进行编号即，1号～21号，同理公犬也随机分为A公犬和B公犬，以便减少公犬自身因素而带来的误差。所有犬只自由饮水，母犬日粮为自制犬粮，公犬日粮是优卡成犬犬粮。一日饲喂两次即，早06点和17点各一次；每日对犬只仔细观察3次即07点、13点和18点各一次。

1.2.2 激素处理方案及妊娠确定条件

对已编号的母犬按顺序分为三组：即1～8号为第一组，皮下注射PMSG 1500IU ∕条，仅注射一次；9～16号为第二组，皮下注射PMSG 500 IU∕条,24h∕次，

连用3天，总剂量1500IU（当一组和二组母犬综合征状显示最佳配种时同时注射LRH-A

3

25ug∕条，一次）；第三组17～21号为空白对照组不注射任何药物，为母犬不正常状态；A公犬和B公犬不注射任何激素，参与察情配种。

妊娠诊断：经过配种后30天的母犬仰卧或站姿用5.0MHz的探头纵切和横切扫描，子宫位于膀胱背侧，降结肠腹侧探查卵巢时应在肾脏后部和邻近区域[6]。正常未怀孕的母犬子宫一般不现像。这样就能更加精确的判断犬所处的生理状态，指导生产实践提高繁殖效率。

1.2.3 外部观察法、试情法及最佳配种时间确定

外部观察法、试情法判定方法:母犬公犬调情，公犬阴茎接触母犬外阴时，母犬尾根倒向一侧，四肢叉开踏地，接受爬跨。如试验员手指轻拍母犬外阴表现有规律地收缩或插入阴道内，母犬不反抗，则为接受交配阳性[7,8]。对两条公犬的其中一条有反应即为阳性，此反应若在晚上出现，当天就算进入发情期。拒绝公犬交配之日为发情结束，各种发情症状逐渐减弱、消失。

每天对犬只观察3次即07点、13点和18点各一次，观察犬的一般状态、外阴部变化、阴道前庭粘液性状及阴道分泌物变化等，当阴户漏出粘液有血时，用公犬试情，以确定容许与否。试情法是根据母犬在性欲上对公犬的反映情况或实施压背法，视其“静立反射”程度来判断其发情程度。把A、B公犬栓在舍外，牵母犬过去进行试情，每天07点和18点各一次。试验所用公犬均有交配经验、健康且性欲旺盛。

表1 雌犬最佳配种时间

临床行为表现最佳配种时间

行为表现（1）首次对公犬表现性趣3～5天后

（2）首次接受交配

（3）愿意把尾倒向一侧2～3天后

（4）阴道排除血红色粘液13（8～14）天后（5）粘液由红色变黄色2～3天后

1.2.4 阴道涂片镜检及最佳配种时间确定

阴道涂片镜检方法:当母犬阴户开始滴血或水肿时，助手保定待检母犬，术者用0.9%NaCl润湿固定棉签，以防脱落掉入阴道内。左手抓住尾根部用力向上，右手持湿润好的棉签紧贴背侧插入阴道先斜向上45℃角插入，再水平推进边旋转变插入10cm左右后轻轻抽出。制片时将棉签紧贴于洁净的载玻片上轻轻滚动，室内自然干燥；先在涂好的载玻片上滴加足量瑞氏-姬姆萨A液静置1分钟；再

滴加瑞氏-姬姆萨B液，轻轻抖动载玻片使A、B液混合均匀静置8分钟；最后水洗、干燥镜检[9～11]。

根据阴道分泌物中有无白细胞、红细胞、上皮细胞及其特征性变化，确定犬发情周期的时期。其中最重要的是上皮细胞的变化。白细胞在各期都出现，但排卵时消失。1～3天红细胞在发情前期初较多，发情结束时减少。有核上皮细胞在发情期和发情后期都可见，呈鳞片状或圆柱状，细胞核和细胞膜清晰。角化上皮细胞在发情前期末到发情期可见，细胞较大。呈长方形或鳞片状核与核仁清晰，发情后期有形态不整的细胞碎片[12,13]。9～14天排卵时上皮细胞角化指数达80%以上时，核不明显，白细胞崩解消失成不规则的碎片，此时的红细胞有无不定。但母犬乏情期时有大量小的圆形透明的白细胞，角化指数小于10%[14]。连续制作阴道涂片镜检可以准确地判断犬所处的发情期,为指导母犬配种提供参考依据。

表2 雌犬最佳配种时间

显微镜临床检查最佳配种时间

阴道细胞图片（1）无核表皮细胞100%时（2）白细胞重新出现时（3）角化指数（CI）≧80%时（4）嗜酸性细胞指数（EI）60%时

注；角化指数 = （角化细胞总数/上皮细胞总数）×100%

嗜酸性细胞指数 = （嗜酸性细胞总数/上皮细胞总数）×100%

2 结果与分析

2.1 注射一次PMSG母犬发情状况结果

由表3可知，试验的1～8号母犬中，经PMSG诱导后外阴水肿充血、流出褐色或黄红色血液性分泌物,表现最强烈，且有较强的性欲接受A、B公犬的爬跨的是1号、4号、6号；而2号母犬虽然在临床特征上显示外阴水肿充血、精神状态（如兴奋、敏感和食欲不振等）的表现程度一般，但涂片镜检角化程度较弱，外阴无分泌物流出因此判定此犬在试验期的表现为不发情。第一组试验母犬发情率为37.5%，平均发情天数为9.67天，与其自然发情的平均天数相吻合[15]。

表3 一次性皮下注射PMSG（1500IU）处理后母犬发情的临床综合征状

注 ：“-”表示 不符合该情况； “+”表示符合程度较弱 ； “+ +” 表示符合程度一般；“+ + +” 表示符合程较高 （五项临床评判标准中若显示“-”、“+”或“否”同时或不同时出现三次，均判定该母犬不发情。）

2.2 多次皮下注射PMSG 诱导母犬发情状况结果

由表4可知， 9～16号母犬中，采用少量多次给药方法处理母犬判定为发情的有9号、10号、11号、13号、15号、16号，但2号母犬虽在外部表现和阴道图片检查中显示有轻微类似发情症状，可能由于体内激素不平衡或受某种因素抑制而没有充分表现出来，且不接受A 、B 公犬爬跨，故而判定为不发情。由表中数据可知；其发情率可达75%，平均发情天数17.33天，比自然发情（9～

14）天数较长[16～18]。

表4 少量多次PMSG （500IU/次）注射母犬发情临床综合征状

母犬临床表现

9 号 10号 11号 12号 13号 14号 15号 16 号 ① 阴水肿充血潮红湿润

+++ +++ ++ + +++ + ++ +++ ②阴门流出褐色或黄红色血液

性分泌物

+++ +++ +++ + +++ + +++ ++ ③精神状态（如兴奋、敏感和食

欲不振等）

+++ ++ +++ - ++ - +++ +++ ④涂片镜检角化程度

+++ +++ +++ + +++ - +++ +++ ⑤是否接受交配

是 是 是 否 是 否

是 是 母犬临床表现

1号 2号 3号 4号 5号 6号 7号 8号 ①外阴水肿充血潮红湿润

++ ++ + +++ + +++ + ++ ②阴门流出褐色或黄红色血液

性分泌物

+++ + - ++ + +++ + - ③精神状态（如兴奋、敏感和食

欲不振等）

+++ ++ + +++ - +++ ++ + ④涂片镜检角化程度

+++ + ++ ++ ++ +++ - + ⑤是否接受交配

是 否 否 是 否 是 否 否 滴血天数

7 0 0 13 0 9 0 0 平均发情天数 9.67

滴血天数21 14 18 0 19 0 15 17 平均发情天数17.33

注：“-”表示不符合该情况；“+”表示符合程度较弱；“+ +”表示

符合程度一般；“+ + +”表示符合程较高（五项临床评判标准中若显示“-”、“+”或“否”同时或不同时出现三次，均判定该母犬不发情。）

2.3 采用PMSG不同注射方法和剂量诱导母犬发情状况结果

由表5知，判定发情后的第一组母犬愿意接受交配的第二天配一次，间隔48小时再配一次采用人工辅助重复方案，受胎率为33.33%。第二组母犬参加配种，配种时间为发情出血后的第9～14天首配，即允许交配的第2～3天，受胎

率为50%。故而采用外激素PMSG少量多次注射效果优于一次注射方案两者差异

显著，与前人报道相一致。本次试验采用人工辅助交配重复配种方案，既保证了

公犬阴茎顺利插入母犬阴道内并正常抽动和射精在交配过程中互不伤害，而且便

于日后记录其后代血统。

表5 PMSG一次给药和少量多次给药诱导母犬效果表

组别

试验母犬数∕

条

判定发情母犬

数∕条

配种母犬数∕

条

妊娠母犬数∕

条

500IU 1500IU 500IU 1500IU 500IU 1500IU 500IU 1500IU

第一

组0 8 0 3 0 3 0 1

第二

组

8 0 6 0 6 0 3 0

3 讨论

3.1 犬发情不稳定、不明显、配不上原因分析

所引起母犬不发情、发情不明显和配不上的原因主要有一下几个方面；a.母犬先天性不孕：是由于生殖器官发育异常，生殖器发育不全，生殖道畸形，子宫角或子宫颈畸形。或同时具有雌性与雄性某部分生殖器为两性畸形。一些遗传

病，如髋关节发育不全和甲状旁腺功能减退[19～21]。b.衰老性不孕：由于年老体弱全身机能减退，而导致生殖机能停止，进入绝经期，丧失繁殖能力，卵巢缩小，并没有卵泡和黄体，子宫角下垂。c.母犬营养性不孕：主要是饲料单一，质量不佳，缺少必须的营养物质。也许过肥引起卵巢内的脂肪沉积，卵泡上皮发生脂肪变性，通常表现生殖机能紊乱。d.疾病性不孕：全身性严重疾病及饲养管理、利用和调教不当、近亲繁殖和卵巢炎而引起。主要表现性周期延长，发情不排卵。有的母犬持久黄体，主要是缺乏运动，饲料单一缺乏矿物质和维生素。e.繁殖技术性不孕：为不及时发现母犬发情，造成漏配或配种不及时，不是过早、就是过晚。f.原产地：地理环境，适应性，气候差异。日本世界上降水量较多的地区以温带和亚热带季风气候为主，夏季炎热多雨，冬季寒冷干燥，四季分明。河南属暖温带-亚热带、湿润-半湿润季风气候。

3.2 外源性激素在体内转化作用机理

外源性激素诱导母犬发情的辅助繁殖措施能缩短其繁殖周期、提前配种、开发其繁殖潜能并能提高繁殖能力和延长雌犬利用年限增加其终生产仔数。本次试验证明犬与其他哺乳动物一样，可以通过外源激素诱导其发情的。由于PMSG是一种糖蛋白激素，在血液中的半衰期较短，具有FSH和LH两种活性，但LH作用很小, FSH和LH配合使用在血液中达到一定浓度和比例时才能引起排卵并刺激卵泡产生雌激素，在排卵后LH使粒膜形成黄体，产生孕酮[22]。LH的刺激在卵泡发育的过程，优势卵泡选择、卵泡成熟及排卵都发挥着重要的作用。当卵泡发育接近成熟时，LH也大量分泌，快速达到峰值，即触发排卵[23]。故而采用少量多次皮下注射PMSG（500IU）进行诱导发情，并于阴道涂片检查角化指数≧80％和临床表现等五项综合症状，有3∕5项显示一般或较强程度符合时即为发情症状。第一组的发情率是37.5%而第二组的发情率是75%，比第一组高37.5%，显著差异。因而在生产实践中采用少量多次的注射方法可以提高母犬的发情率，代替昂贵的FSH，节约成本[24～26]。

GnRH是动物生殖过程中最重要的调节激素之一，其功能是刺激垂体合成和释放FSH和LH,调节生殖功能。因天然的GnRH分子在体内极易受酶解作用而失

(促排三号) 在雌性动物配种时应用活，半衰期很短[27]。故而人工合成的LRH-A

3

可促进卵泡发育成熟，加速排卵，提高情期受胎率，据报道，给母犬配种的同时 25ug∕条,第一情期受胎率比对照组提高18.3%。第一组的妊娠率为肌注LRH-A

3

33.33%第二组的妊娠率为50%，比第一组高16.67%，这与前人报道相一致。因此

25ug∕条，间隔48小时再配在确定发情后于母犬首次配种同时皮下注射LRH-A

3

一次，提高母犬受胎率效果显著。空白对照第三组，均无发情症状。

3.3 处理方法的分析

在根据以往报道基础上对处理方案优化，采用PMSG+LRH-A

外源性激素能打

3

破犬自身激素的平衡可以脱离自然因素的影响，从而诱导其发情、排卵、受精、妊娠。本试验采用少量多次注射PMSG诱导母犬发情的效果优于一次注射处理方法，与现有报道余道伦，王禄华等观点一致。而配种时同时注射LRH-A

显著提

3

在犬体内表达出LH和FSH双重活性，LH浓度的高了受胎率，这可能由于LRH-A

3

升高再次诱导黄体退化，引起发情，FSH促进排卵[28,29]。激发其潜在的繁殖能力，提高其终身产仔数和利用年限。遗憾的是由于时间限制，并没有对母犬产仔数进行统计，需要在以后的试验中进一步探讨。

4 结论

本试验中应用PMSG少量多次的注射方法诱导母犬发情的，效果优于PMSG的一次注射，相差37.5%，两者的诱导效果差异显著；受胎率第二组较第一组多16.67%证明了，PMSG+LRH-A

诱导乏情期秋田犬发情是可行有效的，但妊娠率低，

3

还需在以后的研究中继续探讨。

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致谢

本论文是在导师的耐心指导下完成的，衷心感谢韩老师的谆谆教诲。在他的悉心指导下无论从论文的选题上，还是试验的整个过程中都给予了我极大的帮助和指导，让我从试验中掌握了技术，学到了知识。韩老师精益求精、诲人不倦、博学多才、胸怀宽广为我树立人生典范，是我学习的榜样。

其次，真挚的感谢在论文创作中给过我帮助的所有老师和同学，谢谢您们！感谢各位老师，和帮助过我的人们！