双酶切连接反应的注意要点

双酶切连接反应的注意要点

双酶切：

1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。

2、回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。

3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ugDNA。

4、两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。

5、若质粒是在TE中保存的，TE 中的EDTA可能与酶的激活因子螯合，影响酶切效果，可放大酶切体积或重新浓缩质粒。

6、限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。

7、纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。

8、酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。

9、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接：摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol 为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER 每个条带约50ng。

10、连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。

11、双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表，如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer；如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和；任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20 ul。如果2种酶的buffer成份相差较大或2种酶的反应温度不同则必须分别做酶切。第1种酶切后要考虑用酚抽、电泳后胶回收或加热等方法使酶失活后再进行下一次酶切反应。厂家目录一般都会有相应的附录以供查阅各种酶的反应温度。有的酶可以用加热使之失活，如CIAP；有的则不行。

12、第一次酶切后通过电泳确证酶切完全后可以从胶中回收DNA片段再进行下次酶切，也可以在第一个酶切后直接用PCR产物回收试剂盒纯化酶切样保留少量样品做电泳分析之用，再进行下一次酶切。还可以用一种离心纯化管或叫做离心浓缩管，将酶切样加入后离心，盐等成份被过滤掉而核酸则被截留在柱子中间的膜上，加入适量ddH2O,离心以洗去膜上残留的杂质，再加几微升ddH2O在膜上，将柱子反转插入新的eppendorf管上，离心，即可将DNA片段离下来，做下一次酶切。

注意事项：

1、做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度。

2、对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干。

3、对照的设立：为验证双酶切是否成功,可做如下对照:

酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时,也要进行对照。

1) 即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下。

2) 酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒。

3) 设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误。

4) AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况。

所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。

4、同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。

5、如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。

6、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由于

内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。

7、只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。

8、注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。

9、某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。

影响限制性内切酶活性的因素

1、DNA纯度：在DNA样品中若含有蛋白质，或没有去除干净制备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高浓度金属离子，均会降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。

2、核酸内切限制酶的缓冲液：核酸内切限制酶的标准缓冲液包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris-HCL、巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等。

使用所有限制酶均可发挥活性的一种缓冲液。

不同限制性内切酶对NaCl浓度的要求不同，这是不同限制酶缓冲液组成上的一个主要的不同。据此可分为高盐、中盐和低盐缓冲液，在进行双酶解或多酶解时，若这些酶切割可在同种缓冲液中作用良好，则几种酶可同时酶切；若这些酶所要求的缓冲液有所不同，可采用以下三种方法进行消化反应：先用要求低盐缓冲液的限制性内切酶消化DNA，然后补足适量的NaCl，再用要求高盐缓冲液的限制酶消化；先用一种酶进行酶解，然后用乙醇沉淀酶解产物，再重悬于另一缓冲液中进行第二次酶解。

3、酶切消化反应的温度：DNA消化反应的温度，是影响限制内切酶活性的一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有各自的最适反应温度。多数限制内切酶的最适反应温度是37℃，少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于37℃。

4、DNA的分子结构：DNA分子构型对核酸内切限制酶的活性有很大影响，如消化超螺旋的DNA比消化线性DNA用酶量要高出许多倍。

有些限制酶在消化它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率也有明显差异。限制性内切酶反应的终止通常是采用65℃条件下温浴5min；加终止反应液（如0.5mol/L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10 mol/L）螯合Mg2+，以终止反应。

双酶切实验

双酶切概述 双酶切反应(Double Digests) 1、同步双酶切 同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。 2、分步酶切 如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。 3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图） 使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。 双酶切建议缓冲液 注： 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。 注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。 某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。上表中这些组合以“se q”标注。 [编辑本段] 双酶切的注意事项 1、做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。 2、对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干。 3、对照的设立：为验证双酶切是否成功，可做如下对照： 酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时，也要进行对照。 [编辑本段] 双酶切连接反应之全攻略 1、回收PCR产物：

酶切注意事项

酶切 DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。 DNA酶切及凝胶电泳 一.DNA的限制性内切酶酶切分析 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC ↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'

DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA 的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc 和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。 构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。 在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一

双酶切连接反应常见问题分析

前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1. 回收PCR产物： 在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 2. 纯化问题： 纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。 3. 酶量的问题： 对1单位酶的定义如下：在50μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 4. 酶切、回收后的PCR产物与载体的连接： 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PC R产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000（注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg，也可以直接用这个公式套。1pmol 1000bp DNA=0.66μg，如载体是5380b p，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 5. 测DNA浓度： 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。 6. 连接反应： TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λD NA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNa段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 7.转化： ①全量（10 μl）加入至100μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 ②42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 ③加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题： 1 做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度。

限制性内切酶酶切反应的标准操作规程

限制性内切酶酶切反应的标准操作规程（编号：007） 1、目的及适用范围 利用限制性内切酶在特异性的识别位点上或附近切割双链DNA分子，用于特定基因的克隆等分子生物学研究。 2、主要试剂及仪器 微量移液器、恒温水浴锅、限制性内切酶 EcoR I, BamH I 等、通用缓冲液10× Buffer 3、操作步骤 按顺序加入下列反应物，放入37℃水浴锅内反应2h。 反应物体积（μL） 灭菌水3 DNA40 10× Buffer K 5 EcoR I1 BamH I1 总体积50 4、问题向导 4.1 建立一个标准的酶切反应：目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μL的反应体系中，1μL的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1h即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16h）也可完全反应。4.2 选择正确的酶：选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3\'或5\'突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。 4.3 内切酶：内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。 21

双酶切连接反应之全攻略

双酶切连接反应之全攻略 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照： 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/ 微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约 为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算: 很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。 pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为 0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 测DNA浓度: 可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER 进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。 连接反应：TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段 被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连 接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 3、转化： a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题 1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般 连接3小时,16度.

酶切和连接5页

双酶切： 载体大小为3000bp左右，在SfiⅠ和BssHⅡ位点之间有370bp左右的片段存在。 我想通过SfiⅠ和BssHⅡ双酶切，将370bp的片段切掉，然后装入不同的片段。 我的酶切体系如下： 质粒（载体＋老片段）1ul（约100ng） (NEBlack Eye SfiⅠ1ul (NEBlack Eye BssHⅡ1ul 10×buf 2.2ul 100×BSA 0.2ul 水14.8ul 总体积20ul 50度，2小时。切出了370bp左右的片段，回收载体。 然后取回收载体的1ul自连，铺平板，但是长出了300多个克隆。证明酶切不完全，怀疑有大量载体只是单酶切。50度3小时我试过，但是质粒有降解。酶量应该说是过量的。请问有什么办法可以酶切完全？ 粘性连接 （一）外源DNA和质粒载体的连接反应 外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和Ｔ４噬菌体DNA连接酶。实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。 ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。在瓜作用的底物。如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。这

双酶切连接反应

【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创） 双酶切连接反应之全攻略 前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照： 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者，后者取。pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=μg,如载体是5380bp，则为 ××=μg。 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为个小时足已。3，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间350 U/μl 3、转化： a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题 1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度. 2 对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为 55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干 3对照的设立： 为验证双酶切是否成功,可做如下对照: A 酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功. 做转化时,也要进行对照. 设4个: A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功, 当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下. B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒 C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误. 阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况. 4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。

AFLP双酶切和连接方法探讨

植物保护２００３年１２月塑垫鲞蔓！塑！丛蔓！堕堕旦坚！型堕竺．２００ｔ！堕．！！。奠！：！ Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ（北京鼎国生物技术公司）１：ＥｃｏＲＩ（０２ｐＬ）／Ｍ删Ｉ（０２ｐＬ）２：ＥｃｏＲＩ（Ｏ．３ＰＬ）／ＭｓｅＩ（０３止）３：６７一『ＹＪＲＩ．（０４￡ｔ１．）／ＭｍＩ（０．４ｖＬ）４：Ｆ“，ＲＩ（０．５ｖＬ）／Ｍ∞Ｉ（０５／ＬＬ）５：ＥｃｏＲＩ（０６ｐｌ。）／Ｍ．∞Ｉ（０．６ｐＬ）６：ＥｃｏＲＩ（ｆ）７ｆｍ）／ＭｓｅＬ（０７“Ｌ）７：ＥｃｏＲＩ（Ｏ８¨Ｌ）／Ｍ，ｅｌ（０８ｇＬ）８：ＥｃｏＲＩ（Ｏ９ｖＬ）／ＭｓｅＩ（０９ｔｚＬ） 圄１小麦基因组ＤＮＡ不同酶切用量的酶切效果 从图１可看出，５泳道的ＥｃｏＲＩ（０．６＂Ｌ）和Ｍｓｅｌ（０、６“Ｌ）的酶切效果比较理想，基因组１００～ｌ８００ｂｐ问的ＤＮＡ片段都有出现。ＥｖｏＲＩ和ＭｓｅＩ两种酶用量各为０．２ｕＬ时酶切ＤＮＡ片段为７００～Ｉ８００ｂｐ之间，各Ｈｊ０．３“Ｌ的酶切片段在５００～一Ｉ８００ｂｐ之间，各用０．４“Ｌ的酶切片段在４００～１８００ｂｐ之间，各用０．５＂Ｌ的酶切片段在２５０～１８００ｂｐ之间。由此可见，由于限制性内切酶』甘量太少，酶切不完全，基因组多态性不丰富。在６、７、８泳道则酶用量太多，既造成浪费，也容易出现酶切过头现象，产生许多低于１００ｂｐ的ＤＮＡ片段，导致接头连接不上，ＰＣＲ反应失败的结果。６、７、８泳道的两种酶总用量分别是１．４、１．６、１．８ＨＬ，都接近或超过总反应体系１５止的ｌ／１０（１，５止）。显而易见，一般两种酶的总量不能超过反应体积的ｌ／１０。２限制性内切酶的缓冲液选择 在双酶切过程中，如果两种酶反应温度一致而缓冲液不同时，可查阅内切酶供应商提供的各种酶在不同缓冲液中的话力表。如果一种缓冲液能同时使两种酶的活力都超过７０％，便可用这种缓冲液作为反应缓冲液。如果两种酶厂家不同，可比较其缓冲液成份，倘若相似，可各取一半中和，也可使用通用缓冲液。例如，作者在进行小麦抗锈基因的ＡＦＬＰ标记研究中，选用Ｅ∞Ｒｌ（上海生工）和ＭｓｅＩ（纽英伦生物有限公司）两种限制性内切酶，分别查阅并比较了卜述公司的酶在不同缓冲液中的活力表，确定用ＢｕｆｆｅｒＹ＋／ＴＡＮＧＯ…（表１）。 从表１可见，ＥｃｏＲＩ和Ｍ”Ｉ两种酶在２倍Ｂｕｆｆｅｒｙ＋／ＴＡＮＣｒ）ＴＭ中括力均为１００％，而且没有过度消化现象。因而选用２倍液Ｂｕｆｆｅｒｙ＋门＂ＡＮＧＯ＂‘” 寰１限制性内切酶ＥｃｏＲ［和ＭｓｅＩ在苇同缓冲液中韵酶活力情况 １）ＨｕｆｆｅｒＢ＋（蓝）Ⅲ１０ＩＩｍｌ／ＬＴｒｉｓＨＣＩ（ｐＨ７５）。１０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，０．１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ；２）ＢｕｆｆｅｒＧ＋（绿）：１０ｍｍｏ］／Ｉ，ＴｒｉｓＨＣＩ（ｐＨ７５）．１０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，５０ｍｍｏ］／Ｉ。ＮａＣＩ，０．１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ；３）ＢｕｆｆｅｒＯ＋（橘）：１０ｍｍｏ［／ＬＴｒｉｓ—ＨＣＩ（ｐＨ７５）?１０ｎｍａｏｌ／ＬＭｇＣＩｚ，１００ｍｍｏ［／ｌ—Ｎ《１．０１ｍｇ／ｍｌ。ＢＳＡ；４）ＢｕｆｆｅｒＲ’（红）：ｉｏｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣＩ（ｐＨ８５），１０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌｚ，１００ｍｍｏｌＡ—ＮａＣ［。０１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ；５）ＢｕＨｅ“＋，ｌ＇ＡＮＧＯⅢ：３３ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ８ｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７９），１０ｍｍｏｌ／Ｉ，Ｍｇａｅｅｔｓｔｅ，６６ｍｍｏｌ／ＬＫＲｅＳｔａｔｅ，０１ｒａｇ／ｍＬＦＫｑＡ。 作为２种内切酶的通用缓冲液。 ３酶切时间 酶切时间是双酶切时较易忽略的问题，但却是酶切成败的关键。酶切时问过长，许多酶可能出现新的活性，就不能在原定的酶切位点切割，使接头连接不上，ＰＣＲ反应无结暴。在作琼脂糖检测时，Ｍａｒｋｅｒ１００ｂｐ条带下方出现一片弥散，很可能就是酶切时间太长所致。因为ＡＦＬＰ经过ＰＣＲ反应扩增出的产物主要在１０００ｂｐ左右，范围可在１００～１５００ｂｐ之间，小于１００ｂｐ的小分了量片段，接头可能连接不ｒ。这是引起ＰＣＲ扩增不出结果的原因之一。酶切时间太短，酶坷Ｊ不完全，酶切片段就不能覆盖整个基因组，影响ＰＣＲ扩增的多态性。 一般来讲，酶切时间长短与酶的性质有关，具体

酶切

DNA的酶切实验 采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；3）使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免星号活力。一材料、试剂和仪器： 1 材料：质粒DNA 2 试剂：限制性内切酶、ddH2O 3 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅，电泳仪，紫外透射观测仪 实验程序： I. .单酶切： II. 双酶切： 注：酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系，这样抑制因素得以稀释；基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大，一般为1μg/10U;所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10，否则甘油浓度会超过5%，会产生星号活力；对难切的质粒或基因组DNA应延长反应时间4—5hr, 甚至过夜。灭火限制性内切酶活性可以采用加热灭活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活，这一点需要注意。 二. 结果与分析： 假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点, 且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果, 则单酶切应为一条带, 而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值,那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开。 图4 重组质粒HindIII XbaI双酶切琼脂糖凝胶电泳分析

实验2 酶切 片段回收和连接

酶切、片段回收与连接 黄华如 （生命科学学院，生技091，29号） 摘要：实验用bt2质粒和pet质粒做酶切材料，回收目的片段，经连接后，转入以氯化钙罚制备的大肠杆菌感受态细胞中，并让转化大肠杆菌在含有抗生素培养基上生长，最后用长出来的大肠杆菌做验证PCR。本次试验中，质粒经过双酶切后，可以清晰的看到目的条带，转化后的大肠杆菌也可以在含有抗生素培养基中长出来，但是最后的验证PCR验证在培养基上生长的是假阳性大肠杆菌。说明了实验中目的基因没有成功转入大肠杆菌。 关键词：重组；酶切；连接；转化；片段回收 基因文库的建立为重组DNA研究工作提供了方便的、有意义的基因。构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。 基因工程(gene engineering)是20世纪70年代以后兴起的一门新技术，即用人工的方法，把遗传物质DNA分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组，然后再转移到生物体内并进行表达的技术。基因工程中的关键一步是将目的基因与DNA载体连接成重组DNA，获得重组子，并把重组子筛选出来。近年来，建立了许多方法来筛选重组子，其中较为常用的是利用a互补原理，根据菌落的蓝白颜色进行筛选1oL一互补是指E．coli B一半乳糖苷酶的两个无活性片段(N端片段和c端片段)组合而成为功能完整的酶的过程。现在使用的许多质粒载体都带有一个E．coli DNA的短片段，其中含有B．半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码信息及调控序列。在这个编码区中插入了一个多克隆位点，可在此处插入外源DNA 片段。这种类型的载体适用于可编码B．半乳糖苷酶c端部分的宿主细胞。尽管宿主和载体编码的两个片段都没有活性，但他们能够融合为具有酶活性的蛋白质，在含有底物X-gal的培养基中形成蓝色菌落。当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，导致N端片段丧失仪．互补能力，因此，带有重组质粒的宿主细胞将形成白色菌落[1]。 1 材料与设备 1.1 试供材料 大肠杆菌、质粒DNA 1.2 试剂准备 质粒DNA回收试剂盒、灭菌水、琼脂糖、BamHI、HindIII、T4连接酶、T4 Buffer、LB 固体培养基、等 1.3 实验设备及用具 高速冷冻离心机、液氮罐、恒温水浴锅、紫外分光光度计、制冰机、冰箱、移液枪、PH 计、冰盒、恒温培养箱、恒温振荡摇床、高压灭菌锅、恒温水浴锅等。 2 实验步骤 2.1 提取质粒DNA 这个步骤由老师完成 2.2 酶切

酶切反应注意事项

1、DNA纯度 一般而言，纯度高的DNA（即混入的蛋白质、RNA或多糖类物质较少）容易被限制性内切酶消化，基因重组是严重洪的所有酶促反应都有类似共性，因此应尽量提高DNA纯度。若DNA不能被限制性内切核酸酶切割，应对DNA样品进行酚抽提、乙醇沉淀等操作，以提高DNA纯度。下列因素影响DNA纯度： (1)DNA样品中常常杂有RNA，虽然它的存在不影响酶的反应速度，但RNA可和酶蛋白 发生非特异性结合而减少酶的有效浓度，使酶解不彻底。另外，RNA在凝胶电泳中 呈现的区带会掩盖该区带范围内的DNA片段的呈现，干扰DNA片段的观察。 (2)一般来说，少量蛋白质的污染对DNA酶解的影响不大，但如果杂有核酸酶等蛋白质， 就会干扰酶切反应，并影响酶解产物。有一类蛋白质叫结合蛋白，他能与DNA发生 非特异结合，不仅封闭DNA上的识别序列而影响酶切反应，而且DNA与蛋白质结 合物在凝胶电泳上迁移甚慢，从而改变DNA片段在电泳图谱中的位置，影响DNA 片段的定性分析。 (3)样品中杂有其他DNA，如制备的质粒DNA中含有染色体DNA片段等，它们不影响 酶解作用，但干扰酶解产物电泳图谱并影响以后的重组连接反应。 (4)DNA样品中的其他杂志，如Hg2+、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，这些杂 质常常是制备过程中不慎带进的，它们影响酶切速度，甚至改变识别特异性，出现 酶的第二活性。 2、DNA甲基化 限制性内切核酸酶的识别序列若被修饰酶产生了修饰反应（如甲基化酶的甲基化反应），则该DNA不能被限制酶再切割。甲基化酶是大多数大肠杆菌菌株中都存在 的酶系之一，有dam甲基化酶和dcm甲基化酶两大类。Dam甲基化酶在5’GATC3’ 的A上甲基化，dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’的C上甲基化。若出现甲基 化影响，则应使用甲基化酶缺陷菌株（dcm或dam），或使用不受甲基化酶影响的限 制性内切核酸酶，如MboI和Sau3A是同裂酶，因MboI受甲基化影响程度大，则宜 使用几乎不受甲基化酶影响的Sau3A。 3、星号活力 又称第二活力，是指该改变了酶切反应条件后特异序列识别特性降低的一种现象。 由于识别特异性降低，可能对原识别序列相似的序列也产生切割反应。如EcoRI的典型识别序列为GAATTC，条件改变后，其识别序列由原来的六核苷酸降为四核苷酸AATT。 高浓度甘油、高PH、低离子强度、β-巯基乙醇、DMSO、Mn2+等的存在可能导致酶产生星号活力。厂家提供的酶一般存放在50%甘油溶液中，若酶量站反应体系的1/10以上，将可能导致星号活力。小的反应体系若长时间在恒温水浴锅中进行酶切反应，因Eppendorf管里的内外温差将导致水分蒸发，蒸气凝结在盖子上而使反应体积缩小非常明显，将改变反应体系的组成，而容易产生星号活力，因此长时间进行酶切反应，宜使用空气恒温箱为保温设备，可避免水分蒸发和凝结。 4、终止限制性内切核酸酶反应的方法 (1)加EDT A以Mg2+,使酶失去辅助因子而终止酶切反应； (2)65℃下保温5-10min而使酶失活。但是有些酶在此温度下仍有活性，这种酶就不能 用高温失活方法来终止酶切反应； (3)加SDS至终浓度0.1%或加尿素至0.5mol/L，使酶蛋白解聚变形； (4)用等体积酚抽提酶解产物，这种方法使酶活性丧志最彻底，灭火后的样品用乙醇沉 淀法回收DNA；

双酶切编辑

双酶切编辑 做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度；对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP 时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来。我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干；对照的设立：为验证双酶切是否成功。 目录1简介 2连接反应 3注意事项 1简介编辑双酶切反应(Double Digests) 1、同步双酶切 同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer 的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。 2、分步酶切 如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。 3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图） 使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。 双酶切建议缓冲液 注： 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。 注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。 某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。上表中这些组合以“seq”标注。 2连接反应编辑1、回收PCR产物： 在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI，HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基

酶切反应的建议

酶切反应建议 一、建立一个标准的酶切反应 目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。 二、选择正确的酶 不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3'或5'突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。 三、酶 内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。 四、DNA 待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。关于甲基化的内容， 五、缓冲液 对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。在这种情况下，我们也相应提供100X的BSA（10mg/ml）。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。 六、反应体积 内切酶活力单位的定义是：1小时内，50μl反应体积中，降解1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶：DNA的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的

双酶切(1)

③双酶切处理目的片段和带有GFP的质粒并纯化 一、实验原理 1. 核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链DNA中特定 碱基序列的核酸水解酶，他们的功能类似动物的免疫系统，用于抗击外来DNA的侵袭。现已发现几百种限制性内切酶，他们以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH，由于限制性内切酶能识别DNA特异序列并进行切割，因而在基因重组、DNA序列分析、基因组甲基化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技术上受到广泛应用。在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。 2.DNA的酶切反应 II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电用酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。 3.DNA的连接 在T4 DNA连接酶的作用下，平端或带有相同粘末端的DNA分子可以连接上。DNA连接酶的作分三步： ①T4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物。 ②酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’-羟基切口的DNA分子上，使DNA腺苷 化 ③产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。 二、实验器材与处理方法（参照） 1、限制性内切酶酶BUFFER GFP质粒 2、T4 DNA连接酶连接酶缓冲液 3、电泳缓冲液（0.5×TBE或1×TAE）10×电泳加样缓冲液 4、溴酚蓝琼脂糖溴化乙锭（工作浓度0.5ug/ml）EcoR I 5、酚氯仿无水乙醇70%乙醇灭菌双蒸水 6、1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭 菌）电泳仪电泳槽紫外检测仪摄影设备 7、恒温水浴槽 三、实验步骤 先将步骤②扩增的目的片段进行纯化（柱层析或电泳割胶法） 1.酶切反应（按情况加大反应体系） 取GFP质粒（DNA）样品于合适的离心管中，按照表1加入试剂 ↓ 混匀；4000rpm离心30s,甩至管底 ↓ 37℃（限制性内切酶最适水温）,保温1~3h酶切（酶切过夜则建议用稍大的酶切体积，以避免水分蒸发过多酶切体系各组分浓度改变过大，记得根据不同酶切位点加保护碱基）

双酶切连接反应之全攻略(

原创】双酶切连接反应之全攻略（原创） 转自医学教育网的一篇贴子，很精彩，希望大家有做到的一定仔细看看，也添加了一些自己的体验。希望大家继续补充 双酶切连接反应之全攻略 前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照： https://www.wendangku.net/doc/9310573157.html,/upload/2006/08/13/31219184.pdf。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA 的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。 pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为 0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。 连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl 的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 3、转化： a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题

限制性酶切常见问题分析

限制性内切酶酶切注意事项 在进行限制性酶切反应过程中，影响限制性酶切反应效果的因素较多，要设计酶切反应，一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。根据各种不同的 条件，酶切反应的设计一般应注意以下问题： 1. 大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活 性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。 2. 浓缩的限制酶可在使用前用1×限制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶失活，用水稀释的酶不能长期保存。 3. 反应体系中Mg2+是限制酶仅有的共同因子，当用其它二价阳离子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA时，酶活性会被抑制，或改变酶的特异性，导致星型反应。 4. 多种因素可引发星型反应：①非最适的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶浓度大于25u/ug；④盐浓度降低；⑤高浓度甘油的存在(>12%)；⑥有机溶剂的存在。 5. 反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。 6. 酶切反应所加入的酶量应适中，根据底物的种类、量的多少和体积的大小而定，对不同的限制酶，各厂家均有一最大的消化量指标可参考。 7. 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割，如果这些酶所要求的缓冲液有所不同，则可采用以下两种替代方法：①先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA，然后加入适量NaCl及第二种酶，继续反应； ②使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。 8.用同一种酶切割不同的DNA时，所需酶量不同，可根据DNA底物上酶切位点的多少与 λDNA存在位点的数目比较后，决定用酶量。对于超螺旋DNA，基因组DNA、琼脂糖包埋的DNA，使用的酶单位活性应适当加大。 9. 反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。 10.酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醚，大于10mM 的EDTA，去污剂SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。 11.D NA碱基上的甲基化修饰也是影响酶切的一个重要因素，所以转化实验所选择的受体菌株应考虑到使用的菌株中的酶修饰系统。 12.要保证酶作用时的最佳反应条件(ph, 温度)和底物用量，酶反应才能有效地进行。 13.反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。 14.高于37℃或需长时间保温时，可加入矿物油覆盖在反应液上以减少水分蒸发。 15.反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。 16.反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。 17.用已硅化的离心管进行酶切反应，可获得更佳的酶切效果，否则DNA可能粘附于管壁而影响酶切效果。 18.终止酶反应可根据需要采用不同的方法：①酶切后不需进行下一步反应，可加入含EDTA 的终止液终止反应；②若需进一步反应(如连接，切割等)，可将反应管置65℃保温20-30分钟，以灭活酶终止反应。③可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀获得较纯DNA进行下一步酶学操作。