第一节 微生物微生物的的的的纯培养纯培养

第六章 微生物的生长繁殖及其控制

第六章微生物的生长及其控制 一、名词解释 生长繁殖连续发酵恒浊器恒化器同步培养(Synchronous culture)同步生长连续培养（continuous culture）二次生长现象防腐(Antisepsis)石炭酸系数抗代谢物(Antimetabolite) 消毒抗生素十倍致死时间和热致死时间 致死温度和致死时间灭菌 二、填空题 1.微生物的生长包括＿＿、＿＿、＿＿和衰亡期等四个时期。 2.微生物生长的＿＿期是产物的最佳收获期。 3.微生物死亡的原因可能是蛋白水解酶的活力增强而发生＿＿。 4.影响微生物生长的主要因素有温度、＿＿、＿＿三项。 5.实验室用＿＿法在光学显微镜下直接观察细胞并计数。 6.把稀释后的一定量的菌样通过＿＿或＿＿的方法，让其内的微生物单细胞一一分散在琼脂平板上，待培养后每一活细胞就形成一个单菌落，此即菌落形成单位。 7.影响延滞期长短的主要因素有＿＿、＿＿和培养基成分。 8.设法使培养液的流速保持不变，并使微生物始终在低于最高生长速率的条件下进行生长繁殖的连续培养装置是＿＿。 9.采用强烈的理化因素使人和物体内外部一切微生物永远丧失繁殖能力的措施是＿＿。 10.各种抗生素有其不同的制菌范围，此即＿＿；青霉素和红霉素主要抗＿＿细菌；＿＿和＿＿主要抗G细菌。

- 11.生长温度三基点是＿＿、＿＿、＿＿。 12.一般可把微生物的典型生长曲线可粗分为＿＿、＿＿、＿＿、＿＿。13.抗生素的活力称为＿＿。 14.多数细菌生长最适pH是＿＿，放线菌生长最适pH一般是＿＿，真菌生长的最适pH一般是＿＿。 15.消毒和灭菌的区别是＿＿。 16.计算世代时间应在细菌生长的＿＿期进行，生产中为了长期维持对数生长期可采取＿＿，如培养细菌的目的在于获得大量菌体，应在培养的＿＿期进行收获。 17.巴斯德消毒法的工艺条件是＿＿。 18.室温型微生物的最低生长温度为＿＿，最适生长温度为＿＿，最高生长温度为＿＿。 19.造成厌氧环境培养厌氧菌的方法有＿＿和＿＿。 20.低、中、高温型微生物的最适生长温度分别为＿＿、＿＿、＿＿。 21.根据微生物与氧气的关系，可将微生物分成＿＿、＿＿、＿＿、＿＿和＿＿五个类型。 22.酸菜，饲料青贮是利用＿＿发酵产生的＿＿抑制＿＿，使之得以长久贮存。 23.常用的防腐方法有＿＿、＿＿、＿＿、＿＿等。 24.调味品饮料中常加入＿＿作为防腐剂。 25.测定微生物的生长量常用的方法有＿＿、＿＿、＿＿和＿＿。而测定微生物数量变化常用的方法有＿＿、＿＿、＿＿和＿＿；以生理指标法来测定微生物的方法又有＿＿、＿＿、＿＿和＿＿等。

微生物的生长

微生物的生长 第一节微生物的分离和纯培养 在微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物(culture)，而只有一种微生物的培养物称为纯培养物(pure culture)。由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果，因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。 一、无菌技术 微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术(aseptic technique)，它是保证微生物学研究正常进行的关键。 1、微生物培养的常用器具及其灭菌 试管、玻璃烧瓶、平皿(culture dish，petri dish)等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌，使容器中不合任何生物。培养微生物的营养物质[称为培养基(culture medium)]可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。 2、接种操作 用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作，或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作。操作箱或操作室内的空气可在使用前一段时间内用紫外灯或化学药剂灭菌。有的无菌室通无菌空气维持无菌状态。 用以挑取和转接微生物材料的接种环及接种针，一般采用易于迅速加热和冷却的镍铬合金等金属制备，使用时用火焰灼烧灭菌。而转移液体培养物可采用无菌吸管或移液枪。 二、用固体培养基分离纯培养 不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌，以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板(culture plate)的简称，它是指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基是用琼脂或其他凝胶物质固化的培养基，每个孤立的话微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Koch建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。

1 如何获得微生物纯培养

1 如何获得微生物纯培养？为什么说获得微生物的纯培养仍然是一个挑战？ 首先要把微生物分散开，方法有：1破碎、碾磨、超声2 离心法分离3 稀释法分离4 单细胞分离5 选择性分离 然后进行培养，获得微生物菌株，方法分为：1.固体培养法：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的细胞生长群体。再通过平板划线法进行分离培养2厌氧稀释摇管法:针对厌氧菌进行厌氧稀释摇管 3.液体培养法：静置培养法；震荡培养法 最后对获得纯培养的微生物进行保藏 微生物发展到今天，只有大约5%的数量得到了纯培养，人们对一些微生物的生命活动，理化指标还不够了解，而且研究微生物的纯培养需要大量反复的实验，微生物的种类又有如此庞大的数量，如果不能在纯培养方面有质的飞跃，很难实现对一些不常用微生物的纯培养，因此说获得微生物的纯培养仍然是一个挑战。 2微生物的营养物质类型与营养类型有哪些？ 营养物质类型有：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水及能源 营养类型分为： 按照碳源划分自养型以CO2 为唯一或主要碳源 异养型以有机物为碳源 按照能源划分光能营养型以光为能源 化能营养型以有机物氧化释放的化学能为能源按照电子供体划分无机营养型以还原性无机物为电子供体 有机营养型以有机物为电子供体 3如何设计一种培养稀有放线菌的培养基？ 1首先要了解培养目的：培养什么菌？获何产物？实验室研究还是生产？一般研究还是生理、生化、遗传等紧密研究？做种子还是做发酵？ 2了解这种放线菌的生活习性：通过查阅文献以及参照前人的实验经验，对所要培养的放线菌有一个初步的了解。 3然后要选择培养基的营养成分：可以通过对放线菌生长环境的分析；放线菌的物质组成；以及培养其他放线菌的经验来选择适宜的营养成分 4然后选择适宜的理化环境：1. pH 值2.渗透压和水活度3.氧化还原电势4.氧气浓度 4原核细胞与真核细胞有哪些相同与不同？ 细菌细胞的特殊结构有哪些？它们有什么功能？细菌和真菌的细胞壁组分

实验8-微生物的纯培养技术

实验八微生物纯培养技术——划线法 一、实验目的 1、巩固微生物分离纯化的原理 2、掌握微生物分离纯化的常用方法 二、实验原理 微生物学中将实验室条件下从一个单细胞繁殖得到的后代称为纯培养，人们希望研究或利用某种微生物常常必须是一种微生物的纯培养后代。但微生物在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，欲获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养；另外，若人们原有用于试验研究与利用的微生物纯培养菌株，因接种转管以及保存不当等原因而被非目的菌种污染后，也必须再次进行菌种的纯化将污染的杂菌除去，以重新获得目的菌株纯培养。这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。 为了获得某种微生物的纯培养。一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法、稀释混合平板法、平板划线分离法、单孢分离法、挑取菌丝先端等方法分离、纯化该微生物，从而得到纯菌株。 当菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用划线法进行纯化（纯种分离）。此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散成由单个微生物细胞繁殖而来的菌落，从而达到纯化的目的。 二、实验器材 1、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马铃薯葡萄糖糖琼脂培养基(PDA)； 2、供试的细菌及霉菌的斜面菌种、无菌水、接种环、青霉素、无菌培养皿 三、操作步骤 1、培养基平板的制备将备用的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基加热融化，待加热冷却至45-50℃分别倒入90mm的无菌培养皿内，每个培养皿倒入培养基20ml，冷凝后贴上标签、并标明培养基的名称及自己的姓名。 2、菌悬液的制备取青霉菌、曲霉2种霉菌及大肠杆菌的斜面菌种试验各1支，倒入少量无菌水后以接种环刮菌苔表面，将细菌的细胞与霉菌的孢子洗下，倒入一无菌的三角瓶或培养皿，然后加入适量的无菌水稀释混匀得试验用的菌悬液。 3、取菌液将移菌环浸入菌悬液内，取一环菌液。 4、平板划线将有菌液的移菌环按图所示方法，在制备的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板和马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上来回划线。

微生物的分离和培养的一轮复习

微生物的分离和纯培养技术 一、培养基 1、培养基的概念：人们按照______________对营养物质不同的_______，配制出供其生长繁殖的________________叫培养基。根据其物理状态，一般分为_______________________和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂_____________后，就能制成__________________ 2、培养基的营养成分：各种培养基的配方不同，但一般都含有__ 、、、和______等最基本的生命物质。在此基础上还要满足微生物生长对_________、特殊营养物质以及_________的要求。 二、无菌技术 1、消毒方法：___________________、__________________、化学药剂消毒法 2、灭菌方法：___________灭菌、_______________灭菌、___________________灭菌 【思考】无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？ 【思考】请选用合适的方法为下列材料或用具进行消毒或灭菌 （1）培养细菌用的培养基与培养皿。___________（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管。__________ （3）实验操作者的双手。___________ 三、分离和纯培养大肠杆菌的实验操作 1、制备培养大肠杆菌的培养基：即牛肉膏蛋白胨固体培养基，一般步聚：计算、_______、_______、_______、倒平板。 2、接种和纯化大肠杆菌 ①平板划线法：是通过______________在琼脂固体培养基表面划线的操作，将聚集的菌种___________________到培养基表面。在数次划线后培养，可以分离到由_____个大肠杆菌繁殖而来的肉眼可见的菌落 ②稀释涂布平板法：是将菌液进行_______________________稀释，再将不同稀释度的菌液_____________涂布到琼脂________培养基的表面进行培养。在涂布稀释度_____________的培养基表面上可获得单个菌落。 课题延伸：对于频繁使用的菌种我们可以采用_______________的方法，但这种方法保存的时间不长，菌种易被污染或产生变异，需长期保存的菌种可采用___________________的方法放在___________℃的冷冻箱中保存。 【讨论】1、平板划线时，为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物； 每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的未端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环

第六章微生物的生长及其控制

第六章微生物的生长及其控制 微生物的生长：在适宜环境条件下，微生物吸收营养物质，进行新陈代谢，有机体的各细胞组分协调而平衡地增长，为生长。 微生物的繁殖：单细胞微生物当细胞增长到一定程度时，就以二分裂等方式形成子细胞，引起个体数目的增加，为繁殖。多细胞微生物唯有通过形成无性孢子和有性孢子等使个体数目增加的过程才能称为繁殖（细胞数目的增加若不伴随着个体数目的增加，只能叫生长，不能称繁殖）。 微生物的发育：从生长到繁殖是一个从量变到质变的过程，这个过程就是发育。 个体生长个体繁殖群体生长 群体生长=个体生长+个体繁殖 第一节测定生长繁殖的方法

一、测生长量 测定生长量（原生质含量的增加）的方法很多，适用于一切微生物。 （一）直接法 1、粗放的测体积法 2、精确的称干重法 （二）间接法 1、比浊法 用分光光度计对无色的微生物悬液进行测定，不同浓度的菌悬液光密度吸收值呈线性关系。常选450～650nm波段。光束通过菌悬液时引起光的散射或吸收，从而降低透光度。 菌悬液中细胞浓度与混浊度成正比，与透光度成反比。测定菌悬液的光密度或透光度即可反映细胞的浓度。将未知细胞数的悬液与已知细胞数的悬液相比，可知前者所含细胞数。

2、生理指标法 与微生物生长量相平行的生理指标很多： 含氮量（细菌含氮量为干重的12.5%、酵母见7.5%、霉菌为6.5%,含氮量×6.25为粗蛋白含量）； 含碳、磷、DNA、RNA、ATP、DAP、几丁质、N-NAM 及产酸、产气、耗氧、粘度、产热等。

二、计繁殖数 单细胞状态的细菌和酵母菌要一一计算各个体的数目，放线菌和霉菌等丝状生长的微生物只能计算其孢子数。 （一）直接法 用血球计数板在光学显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法。得到的数目是死、活细胞的总菌数。特殊染料可将死、活细胞区分开，可用于活菌和总菌记数。 （二）间接法 活菌计数法。活菌在液体培养基中会使其变混或在固体培养基上（内）形成菌落。常用菌落计数法。 1、平板菌落计数法 可用浇注平板或涂布平版等方法进行，适用于各种好氧菌或厌氧菌。

微生物的生长和纯培养

第二章 微生物的纯培养和显微技术 [教学目标教学目标]] 通过本章的教学，使学生掌握什么是纯培养？微生物分离纯化的基本技术。 [教学的重点和难点教学的重点和难点]] 纯培养的概念和微生物的无菌操作技术。 [教学方法和手段教学方法和手段]] 应用多媒体授课，主要以讲授为辅，实验教学为主。 [教学内容教学内容]] 第一节第一节 微生物纯培养微生物纯培养 纯培养（（pure culture pure culture）：）： ）：单个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代。 克隆：对于微生物，由于其主要进行无性繁殖，故纯培养即为克隆。 建立纯培养，证实其纯度无可置疑，并保持不受污染是微生物学家最重要的任务之一。（即控制无杂菌） 一、获得纯培养的方法： （一）.平板分离法： 1、划线分离法：快速、方便。 分段划线（（适用于浓度较大的样品适用于浓度较大的样品）） 连续划线（（适用于浓度较小的样品适用于浓度较小的样品）） 扇形划线 方格划线

分段划线法 2、稀释倾注分离法： 可定性、定量。 方法：先取稀释液注入平皿，再注入45℃左右的培养基，将稀释液冲开培养基表面、中间均会出现菌落。 3、涂布平板法（培养基表面出现菌落） 简单易行，但易造成机械损伤 （二）．液体分离法

适用于细胞较大的微生物。用液体培养基对菌液做10倍系列稀释，使试管中只存在一个细胞，由此繁殖得到的后代必是纯培养。 （三）单细胞（单孢子）分离法 较大的微生物可用毛细管挑取单个个体；个体较小的微生物，需用显微操作仪，在显微镜下进行。 （四）.选择培养分离（通常做成固体的培养基） ：通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离。 1、利用选择平板进行直接分离 2、富集培养

(完整版)微生物学第七章生长与控制

第十六授课单元 一、教学目的 此章为本课程的重点内容之一，使学生掌握微生物生长发育的规律及生长条件的控制，掌握生长的测定方法，学会同步培养和连续培养的方法，了解物理因素、化学因素对微生物生长发育的影响及实际应用，掌握消毒和灭菌的原理和方法等 本教学单元注重使学生了解微生物生长的测定：重点介绍单细胞微生物的典型生长曲线，并了解丝状真菌的生长曲线；介绍同步培养的方法（机械筛选法和环境条件控制法）；恒浊连续培养和恒化连续培养的原理、控制方法和应用。 二、教学内容 第七章微生物的生长及其控制 第一节个体细胞生长概述 第二节微生物的群体生长 一、单细胞微生物的生长曲线 二、丝状真菌的生长曲线 三、同步培养 四、连续培养 第三节微生物生长的测定 一、计数法 二、质量法 三、生理指标法 三、教学重点、难点及处理方法 重点: 1. 单细胞微生物的典型生长曲线, 在介绍单细胞微生物的生长曲线之前让学生了解微生物生长测定的方法. 根据对于微生物生长的测定, 重点介绍单细胞微生物的典型生长曲线, 说明各个时期微生物生长的特点, 并结合实践说明微生物生长曲线对于生产有何指导意义. 2. 同步培养的方法（机械筛选法和环境条件控制法）；恒浊连续培养和恒化连续培养的原理、控制方法和应用. 连续培养的原理来自于典型生长曲线, 使微生物保持一定比生长速率进行生长. 在一个恒定体积的培养物中, 通过不断地移出营养物质和以同样速率移走培养物的方法来得以实现. 难点: 1. 单细胞微生物的典型生长曲线对于单细胞微生物生长曲线中的指数期的三个重要参数例如: 繁殖代数, 代时和生长速率常数的意义及其相互关系及计算方法应说明清楚. 并将生长曲线各个时期对于实践的指导意义举例加以说明. 以加深对于生长曲线的理解. 分析微生物的生长曲线, 有重要的实际意义. 首先在扩大培养各级种子时就必须选择适宜的菌龄和接种量.其次为了获得大量菌体或代谢产物, 需经常设法延长细胞的对数生长阶段. 这就是连续培养的根据. 2. 恒浊连续培养和恒化连续培养的原理、控制方法和应用. 恒浊连续培养和恒化连续培养的原理比较复杂, 应用画图的方法加以说明, 主要通过多媒体, 为学生展示恒浊连续培养主要是通过不断调节流速使培养液浊度保持不变, 从而使微生物保持一定比生长速率进行生长. 而此生长速率一般是微生物生长曲线中的最高生长速率. 但是恒化连续培养中, 细菌的生长速率取决于限制性因子的浓度, 并低于最高生长速率. 营养物质浓度对微生物有影响, 一般认为营养物质适当时, 并不影响微生物的生长速率, 而低浓度时, 则会影响. 而且在一定范围内生长速率与营养浓度成正比关系. 恒化培养所用的培养基成分中, 要将一种必须营养物质控制在较低浓度, 以作为限制生长因子, 其它营养均可过量, 这样细胞的生长速率将

第二章 微生物的纯培养和显微技术

第二章微生物的纯培养和显微技术 计划学时：2 重点：微生物的分离和纯培养技术，常用的菌种保藏方法。 第一节微生物的分离和纯培养 一、无菌技术 微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术（aseptic technique），它是保证微生物学研究正常进行的关键。 1. 微生物培养的常用器具及其灭菌 试管、玻璃烧瓶、平皿（culture dish，Petri dish）等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌，使容器中不含任何生物。培养微生物的营养物质称为培养基可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染 2. 接种操作 用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作（图2-1），或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作（图2-2）。操作箱或操作室内的空气可在使用前一段时间内用紫外灯或化学药剂灭菌。有的无菌室通无菌空气维持无菌状态。 用以挑取和转接微生物材料的接种环及接种针，一般采用易于迅速加热和冷却的镍铬合金等金属制备，使用时用火焰灼烧灭菌。而移植液体培养物可采用无菌吸管或移液枪。 二、用固体培养基分离纯培养 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落（colony）。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔（lawn）。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据（图2-3）。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板（culture plate）的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤

高中生物第一章微生物培养技术1.1微生物的分离和纯培养1教案中图版选修1

课题1 微生物的分离和纯培养 教材内容解读 要点1 培养基 （1）培养基按照物理性质可分为液体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂琼脂后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。 （2）各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种营养物质。满足微生物生长还需要适宜的pH、氧气的要求（根据微生物的需求提供有氧或无氧环境）、特殊营养物质等。 碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、蛋白质、脂肪等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。 氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+、蛋白质、氨基酸等。只有固氮微生物才能利用N2。 要点2 无菌技术 （1）获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面： ①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。 ②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。 ③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。 ④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 （2）消毒与灭菌的区别 消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、红外线消毒。 灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。 要点3 制作牛肉膏蛋白胨固体培养基 （1）方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。 （2）倒平板操作的步骤： ①将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。 ②右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。 ③用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。 ④等待平板冷却凝固，大约需5～10min。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。 要点4 纯化大肠杆菌 （1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。 （2）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。 （3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。 （4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。 （5）平板划线法操作步骤： ①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。 ②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。

微生物纯培养的方法

一、固体培养基分离 1、稀释倒平板 特点：菌落分离较为均匀，进行微生物计数结果相对准确。但操作相对麻烦，热敏感菌有时易被烫死，而严格好氧菌也可能因被固定在培养基中生长受到影响。 2、涂布平板法 特点：操作相对简单，是较常使用的常规方法。但有时会因涂布不均匀使某些部位的菌落不能分开，进行微生物计数时需对稀释和涂布过程的操作特别注意，否则不易得到准确的结果。 3、平板划线法 特点：操作简单，多用于对已有纯培养的确认和再次分离。 应用：这三种方法可用于所有能在固体培养基表面形成菌落的微生物的纯培养分离。并且，通过选用适当的选择平板及培养条件，可直接分离各种具有特定生理特征的微生物。和厌氧罐或厌氧手套箱技术结合，这3种方法也可用于获得各种厌氧菌的纯培养。 4、稀释摇管法 特点：稀释倒平板法的一种变通形式，但由于菌落形成在琼脂柱的中间，观察和挑取都相对困难。 应用：在缺乏专业的厌氧操作设备的情况下对严格厌氧菌进行分离和观察。 二、液体培养基分离 1、稀释法 特点：工作量大，是否获得纯培养需依靠统计学的推测。 应用：不能或不易在固体培养基上生长的微生物进行纯培养分离或数量统计。 2、富集培养 特点：一般不能直接获得微生物的纯培养，在通过富集培养使原本在自然环境中占少数的微生物的数量大大提高后，需再通过平板法进行相应微生物纯培养的分离和检测。 应用： （1）根据某种微生物的特殊生长要求，按照意愿从自然界中对这种微生物进行有针对性的有效分离； （2）分离培养出由科学家设计的特定环境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长。 三、显微操作 单细胞（孢子）挑取 特点：分离过程直观，可靠，但对仪器和操作技术要求较高，多限于高度专业化的科学研究。而挑取的微生物单细胞或孢子需经固体或液体培养基培养后才能获得其纯培养物。 应用：从样品中直接分离所需的微生物细胞或孢子，获得其纯培养。

第六章-微生物的生长繁殖及其控制讲课教案

第六章微生物的生长繁殖及其控制 计划学时：5 重点：细菌生长曲线的定义、各时期的特点、应用及生产指导意义。控制微生物生长繁殖及控制微生物生长的条件及原理。 第一节细菌纯培养的群体生长规律 一、细菌纯培养的群体生长规律 以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速度为纵坐标作图，可以得到如图6-6的曲线，称为繁殖曲线根据细菌生长繁殖速率的不同，可将生长曲线大致分为延迟期、对数期、调整期或滞留适应期。 （一）延迟期 处于延迟期细菌细胞的特点可概括为8个字：分裂迟缓、代谢活跃。 延迟期出现的原因，可能是为了调整代谢。 延迟期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关。在生产实践中，通常采取的措施有增加接种量，在种子培养中加入发酵培养基的某些营养成分，采用最适种龄(即处于对数期的菌种)的健壮菌种接种以及选用繁殖快的菌种等措施，以缩短延迟期，加速发酵周期，提高设备利用率。 (二) 对数期(log phase) 对数期又称指数期(exponential phase)。 在此期中，细胞代谢活性最强，组成新细胞物质最快，所有分裂形成的新细胞都生活旺盛。这一阶段的突出特点是细菌数以几何级数增加，代时稳定，细菌数目的增加与原生质总量的增加，与菌液混浊度的增加均呈正相关性。 处于对数期的微生物，其个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛，生长迅速，代时稳定，所以是研究基本代谢的良好材料，也是发酵生产的良好种子，如果用作菌种，往往延迟期很短以至检查不出，这样可在短时间内得到大量微生物，以缩短发酵周期。 (三) 稳定期(stationary phase) 又称恒定期或最高生长期。处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡，此时生长速度，又逐渐趋向零。 稳定期的细胞内开始积累贮藏物，如肝糖、异染颗粒、脂肪粒等，大多数芽孢细菌也在此阶段形成芽孢。 生产上常常通过补料、调节pH、调整温度等措施，延长稳定期，以积累更多的代谢产物。 (四) 衰亡期(decline hpase)

微生物的分离和纯培养

一、微生物的分离和纯培养 ?混合培养物：含有两种以上微生物的培养物。 ?纯培养技术：把特定微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的技术。 ?纯培养（pure culture）：微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养。 1.平板划线分离法（Streak Plate） 将纯菌或含菌材料用微生物接种针在固体培养基表面进行划线，使微生物的单个细胞能分散在平板上。 2.倾注平板分离法（pour plate） 将待分离的材料用无菌生理盐水进行一系列稀释,然后取不同稀释液少许(一般是1ml)分别置于无菌平皿中，而后倾入熔化并冷却到50℃左右的琼脂培养基，均匀混匀，冷凝后进行培养. 3.涂布平板分离法（spread plate） 先用固体培养基制成无菌平板,然后将一定稀释度的少量样品(一般是0.2-0.5ml)加到平板上,并用无菌玻璃涂棒将菌液均匀涂布到整个平板表面,经过培养后挑取单个菌落。 4.液体稀释法 待分离材料→接种于培养液中→培养→测定或估计单位容积中的含菌数目→稀至两、三滴液体中只含有一个微生物个体→每次取一滴至另一盛有新鲜培养基的试管中→摇匀，培养→观察→大多数试管无微生物生长，少数管底有一菌落，可能由一个细胞繁殖而来。 5.选择性培养分离法 为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。 5.单细胞（单孢子）分离法 采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞 或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法 要在显微镜下进行。 毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生 物。 显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以 获得纯培养。 小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微 镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。

实验室常用微生物菌种的分离和纯化方法

实验室常用微生物菌种的分离和纯化方法 发布日期：2010-03-01 浏览次数：18 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的微生物悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落（图1）。 图1 涂布平板法 1.3 平板划线法 最简单的分离微生物的方法是平板划线法，即用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行连续划线（图2），微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。

微生物的生长及其控制

第七章微生物的生长及其控制 习题 一、填空题 1、一条典型的生长曲线至少可分为、、和4个生长时期。 2、测定微生物的生长量常用的方法有、、和。而测定微生物数量变化常用的方法有、、和；以生物量为指标来测定微生物生长的方法有、和。 3、获得细菌同步生长的方法主要有（1）和（2），其中（1）中常用的有、和。 4、控制连续培养的方法有和。 5、影响微生物生长的主要因素有、、、和等。 6、对玻璃器皿、金属用具等物品可用或进行灭菌；而对牛奶或其他液态食品一般采用灭菌，其温度为，时间为。 7、通常，细菌最适pH的范围为，酵母菌的最适pH范围为，霉菌的最适pH范围是。 8、杀灭或抑制微生物的物理因素有、、、、和 等。 9、抗生素的作用机制有、、和。 10、抗代谢药物中的磺胺类是由于与相似，从而竞争性地与二氢叶酸合成酶结合，使其不能合成。 二、选择题 1、以下哪个特征表示二分裂？（） （1）产生子细胞大小不规则（2）隔膜形成后染后体才复制（3）子细胞含有基本等量的细胞成分（4）新细胞的细胞壁都是新合成的。

2、代时为0.5h的细菌由103个增加到109个时需要多长时间？（） （1）40h （2）20h （3）10h （4）3h 3、如果将处于对数期的细菌移至相同组分的新鲜培养基中，该批培养物将处于哪个生长期？（） （1）死亡期（2）稳定期（3）延迟期（4）对数期 4、细菌细胞进入稳定期是由于：①细胞已为快速生长作好了准备；②代谢产生的毒性物质发生了积累；③能源已耗尽；④细胞已衰老且衰老细胞停止分裂；⑤在重新开始生长前需要合成新的蛋白质（）。 （1）1，4 （2）2，3 （3）2，4 （4）1，5 5、对生活的微生物进行计数的最准确的方法是（）。 （1）比浊法（2）显微镜直接计数 （3）干细胞重量测定（4）平板菌落记数 6、下列哪咱保存方法全降低食物的水活度？（） （1）腌肉（2）巴斯德消毒法（3）冷藏（4）酸泡菜 7、连续培养时培养物的生物量是由（）来决定的。 （1）培养基中限制性底物的浓度（2）培养罐中限制性底物的体积（3）温度（4）稀释率 8、常用的高压灭菌的温度是（）。 （1）121℃（2）200℃（3）63℃（4）100℃ 9、巴斯德消毒法可用于（）的消毒。 （1）啤酒（2）葡萄酒（3）牛奶（4）以上所有 10、（）能通过抑制叶酸合成而抑制细菌生长。 （1）青霉素（2）磺胺类药物（3）四环素（4）以上所有 三、是非题 1、在群体生长的细菌数量增加一部所需时间为代时。 2、最初细菌数为4个，增殖为128个需经过5代。 3、一般显微镜直接计数法比稀释平板涂布法测定的菌数多。 4、一切好氧微生物都含有超氧化物歧化酶。 5、分批培养时，细菌首先经历一个适应期，所以细胞数目并不增加，或增加很少。

2017-18学年高中生物第一章微生物培养技术第一节微生物的分离和纯培养自我小测

第一章微生物培养技术第一节微生物的分离和纯培养1．高温灭菌的原理是（） A．每种微生物生长的最适温度是一定的 B．微生物对高温环境不适应 C．高温破坏了细胞内的蛋白质、核酸，影响其生命活动 D．高温降低了环境中氧的浓度 2．下列叙述错误的是（） A．微生物的分离和纯培养中，必须采用无菌技术进行操作 B．把相应的研究对象移入培养基中的过程称为接种 C．划线的方法包括连续划线法和交叉划线法 D．培养不同的微生物，使用的培养基、培养的温度和时间相同 3．能排除培养基是否有杂菌污染的方法是（） A．将未接种的培养基放在实验桌上培养 B．将未接种的培养基放在窗台上培养 C．将未接种的培养基放在恒温箱中培养 D．将已接种的培养基放在恒温箱中培养 4．无菌技术包括以下几个方面的叙述，其中错误的是（） A．对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌 B．将培养器皿、接种用具和培养基等进行灭菌 C．为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行 D．实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触 5．下列有关平板划线操作的叙述正确的是（） A．使用已灭菌的接种环、培养皿，操作过程中不再灭菌 B．打开含菌种的试管需通过酒精灯火焰灭菌，取出菌种后需马上塞上棉塞 C．将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线即可 D．最后将平板倒置，放入培养箱中培养 6．微生物培养过程中，肉眼鉴别金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的重要依据是（）A．细菌的大小、形状、颜色 B．菌落的大小、形状、颜色 C．有无鞭毛 D．培养基的不同 7．实验时务必注意安全，对此不正确的叙述是（） A．规范操作，以防被致病微生物感染 B．规范操作，防火防烫伤

微生物学教案 第二章 微生物的纯培养和显微技术

第二章微生物的纯培养和显微技术 大多数动物植物的研究、利用都能以个体为单位进行，而微生物由于个体微小，在绝大多数情况下都是利用群体来研究其属性，微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存。在微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物（culture），而只有一种微生物的培养物称为纯培养物（pure culture）。由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果，因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。相应的，微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。显微技术包括显微标本的制作、观察、测定、分析及记录等方面的内容。实际上，正是由于显微技术及微生物纯培养技术的建立才使我们得以认识丰富多彩的微生物世界，并真正使对微生物的研究发展成为一门科学。 第一节微生物的分离和纯培养 一、无菌技术 微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术（aseptic technique），它是保证微生物学研究正常进行的关键。 1.微生物培养的常用器具及其灭菌 试管、玻璃烧瓶、平皿（culture dish，Petri dish）等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌，使容器中不含任何生物。培养微生物的营养物质（称为培养基（culture medium））可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。 图2-1 无菌操作转接培养物

微生物的分离和纯培养

在微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物(culture)，而只有一种微生物的培养物称为纯培养物(pure culture)。由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果，因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。 一、无菌技术 微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术(aseptic technique)，它是保证微生物学研究正常进行的关键。 1、微生物培养的常用器具及其灭菌 试管、玻璃烧瓶、平皿(culture dish，petri dish)等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌，使容器中不合任何生物。培养微生物的营养物质[称为培养基(culture medium)]可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。 2、接种操作 用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作，或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作。操作箱或操作室内的空气可在使用前一段时间内用紫外灯或化学药剂灭菌。有的无菌室通无菌空气维持无菌状态。 用以挑取和转接微生物材料的接种环及接种针，一般采用易于迅速加热和冷却的镍铬合金等金属制备，使用时用火焰灼烧灭菌。而转移液体培养物可采用无菌吸管或移液枪。 二、用固体培养基分离纯培养 不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌，以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板(culture plate)的简称，它是指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基是用琼脂或其他凝胶物质固化的培养基，每个孤立的话微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Koch建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。 1、稀释倒平板法(pour plate method)