荧光光谱基础知识
荧 光 光 谱(Fluorescence Spectroscopy )
韩荣成(10303023)
北京大学,03级生物医学工程
一、背景知识：
1.荧光，是指物质在吸收紫外光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光，以及吸收波长较短的可见光后发出波长较长的可见荧光。除了紫外荧光和可见荧光，还有红外荧光、X 射线荧光等。
在很多情况下，分子从激发态回到基态过程中，能量通过热量等形式散失到周围。但 是在某些情况下，能量能以光子发射的形式释放出来。
分子的能量状态在光学分析中涉及的分子能量有：E 0=Ee+Ev+Er ，其中Ee:价电子运动能（electron ）； Ev ：原子在平衡位置的振动能（vibration ）；Er ：分子绕其重心的转动能（rotation ）。Ee 大
约为1eV 数量级；Ev 大约为10－1～10－2 eV ；Er 大约为10－4～10－5eV 数量级，
可见⊿Ee>⊿Ev>⊿
Er
分子吸收能量后，处于激发态的分子通过非辐射过程丢失能量，首先到达S1的最低振动能
级，这一过程称为内转换（internal conversion）,发生在10－11s内。从S1的最低振动能级以光子形式放出能量而回到基态的不同振动能级，这一过程称为荧光
（fluorescence）,发生在10－9s内；如果以非辐射的形式丢失能量则称为淬灭
（quenching）。如果某种物质在被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发出比
荧光波长更长的波长的光，则称这种光为磷光。磷光产生的机制与荧光是不同的，虽然它们都属于发射光谱，但磷光不是处于第一电子激发态的最低振动能级的分子直接释放出光子回到基态的结果，而是从某种能量低于第一电子激发态的最低振动能级的另一种亚稳能级?三重态向基态的各振动能级以辐射方式产生跃迁时发出的光。
所谓三重态或三线态，是指分子中电子自旋量子数S=1，即原来两个配对的自旋
方向相反的电子之一自旋方向改变，以至电子自旋之和不为0的情况。处于第一电子激发态最低振动能级的分子，有可能通过无辐射跃迁(系间交连，intersystem crossing)消耗部分能量，其中一个电子的自旋方向倒转，从而处于三线态。从三线态的最低振动能级向基态的各振动能级跃迁并释放出光子，则其发光为磷光。由于三线态的电子自旋和不为零，这种跃迁是一种被禁跃迁，即跃迁几率很小。这样，
在三线态停留的时间即寿命就比较长(从10-3秒到数秒)，强度很弱。由于三线态能
量低于第一电子激发态最低振动能级，因此磷光的波长比荧光长。
二、荧光光谱：
荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作
用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率；发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，
也就是荧光中不同波长的光
成分的相对强度。
激发谱既然是表示某种荧光
物质在不同波长的激发光作
用下所测得的同一波长下荧
光强度的变化，而荧光的产生
又与吸收有关，因此激发谱和
吸收谱极为相似，呈正相关。
由于激发态和基态有相似的
振动能级分布，而且从基态的
振动能级跃迁到基态各振动能级的几率也相近，因此吸收谱与发射谱呈镜象对称关系.λex:maximum excitation wavelength; λem(λax): maximum emissio
wavelength
最低振动能级跃迁到第一电子激发态各振动能级的几率与由第一电子激发态的最低n
2.荧光光谱仪和主要谱参数
2．1荧光光谱仪
荧光谱仪结构上的最主要特点是入射的激发光与荧光探测方向垂直。
1. 光源：现在多用氙灯，氙灯在200-800nm范围内具较好的发射谱。
2. 入射光单色器：入射光单色器是用来选择特定波长的单色光，入射到样品上。荧光分光度计中采用光栅作为单色器。激发波长择描就是靠它来改变波长。
3. 监视探测器：这个探测器用来监测光源的恒定性。
4. 光闸：光闸关闭时，入射光被挡住，不能照到样品上，这样可以防止样品长期受到照射而产生化分解。另外，在打开样品室的盖时，关上光闸，可以防止读数过大，给图笔撞击端部。
5. 样品杯：样品杯是10mm×10mm的石英杯，四面透明，且用去荧光石英材料制成。注意荧光样品杯不能用紫外谱仪中的样品杯代替。
6. 发射光单色器：用来选择一定波长的光进入探测器测量。发射光择描就是用它来实现的。
7. 计算机辅助记录系统：用以完成绘图及荧光强度的测量。
2.2主要的谱参数
2．2．1荧光寿命(fluorescence lifetime)
去掉激发光后，分子的荧光强度降到激发时最大荧光强度的1/e所需要的时间，称为荧光寿命，常用τ表示:
τ=1/k――――――（1）
证明：I t=I 0e-kt
其中I 0是激发时最大荧光强度，I t是时间t时的荧光强度，k是衰减常数。假定在时τ时测得的I t为I 0的1/e，则τ是我们定义的荧光寿命。
01I e
I t = 则有：τ=1/k
如果激发态分子只以发射荧光的方式丢失能量，则荧光寿命与荧光发射的速率常数成反比，速 率常数即为单位时间中发射的光子数，因此有τF =1/K F 。K F 是速率常 数。τF 表示荧光分子的 固有荧光寿命，k F 表示荧光发射过程的衰减常数。如果除荧光发射外还有其它释放能量的过程 (如淬灭和能量转移)，则寿命τ还和这些过程的速率常数有关，结果是荧光寿命降低。由于吸收
几率与发射几率有关， τF 与摩尔消光系数εmax (单位为cm 2mol -1或(mol dm --3) -1cm -1)也就密切相关，
从下式可以得到τF 的粗略估计值(单位为秒)。
1/τF ≈104εmax
在讨论寿命时，必须注意不要把寿命与跃迁时间混淆起来。跃迁时间是跃迁频率的倒数，
而寿命是指分子在某种特定状态下存在的时间。通过量测寿命，可以得到有关分子结构和动力学 方面的信息。
2．2．2荧光量子产率(quantum yield)：
荧光量子产率是物质荧光特性中最基本的参数之一，它表示物质发射荧光的本领。荧光量
子产率通常用φ来表示，定义为发射量子数和吸收量子数之比，即由荧光发射造成的退激分子在全部退激分子中所占的比例，又称为荧光效率。φ＝ 发出量子数/吸收量子数。处于激发态的分子，除了通过发射荧光回到基态以外，还会通过一些其它过程回到基态。其结果是加快了激发态分子回到基态的过程(或称退激过程)。 φ =τ/τF
证明：总的退激过程的速率常数k 可以用各种退激过程的速率常数之和来表示:
k =k F +∑k i
k i 表示各种非辐射过程的衰减速率常数。
则总的寿命τ为:
τ=1/k =1/(k F + ∑k i )
因此，量子产率又可以表示为
∑+=i
i F F F k K K φ
因为 1/k F =τF ， τ=1/(k F +∑k i )
所以 φ =τ/τF
φ的绝对值是较难用实验的方法测量的，因为必须事先知道仪器的修正因子。实际测量中大 多采用相对法，即用已知量子产率的标准样品与待测样品进行比较。
证明：对稀溶液来说，荧光强度F 与吸收度A 成正比:
F =kI 0A ?
这里k 是比例常数，I 0是吸收前的光强度， φ 是荧光量子产率。
若两种溶液测量条件完全相同，则:
F 1/F 2=A 1φ 1/(A 2φ 2)
φ 1/φ 2=F 1A 2/(F 2A 1)
已知φ 2就可求出φ 1。
由于各种竞争性过程而使荧光量子产率减小的现象称为淬灭(quenching)，如温度淬灭，杂质
淬灭等。量子产率对于生色团周围的环境以及各种淬灭过程很敏感。量子产率的改变必然会
引起荧光强度的改变。因此，如果只要研究量子产率的相对值，只要量测荧光强度也就足够了。
2．2．3荧光强度：
荧光强度F 取决于激发态的初始分布I A 与量子产率φ的乘积。Ｆ=I A φ这里的F 指的是向各个方 向上发射的荧光强度的总和，实际上，谱仪收集的只是其中的一小部分。因此仪器测到的荧光强 度Ｆ=I A φ Z ，这里Z 是仪器因子。
椐据Beer-Lambert 定律（A = KCL ，朗伯-比耳定律同时反映了溶液厚度L 和浓度C 对光吸收A 的关系,其数值随光的波长、溶液浓度和溶液的性质而定）
I A =I 0-I t =I 0{1-exp[-2.3ε (λA )·C ·l]}
式中ε (λA )为激发波长处的消光系数，Ｃ为样品分子的浓度，I 0为入射光强度，I 0为透过样品后的 光强度，l 为光程（样品池光径）。对于稀溶液，吸收很稀，ε (λA )很小?<<2.3ε (λA )C ·l ＜＜1， 因此，1-2.3ε (λA )C ·l ≈exp(-2.3ε (λA )C ·l)
I A =I 0(1-(1-2.3ε (λA )C ·l)) =2.3I 0ε (λA )C ·l
F λ=I A φZ =2.3I 0ε (λA )C ·l ·?·Z
如果激发光强保持不变，且?和Z 与激发波长无关，则F ∝ε (λA )很显然，荧光强度与样品在波度λA 处的消光系数有关，而消光系数与激发波长是密切相关的，消光系数随波长的变化即吸收谱， 因此荧光强度也随激发波长的变化而变化。激发谱与吸收谱的正相关关系在此一目了然。
当然，实际上仪器因子Z 与波长是有关的，这就使得激发谱与吸收谱并不完全相似。
2.2.4荧光偏振（fluorescence polarization ）
偏振片：吸收某方向光振动，而与其垂直方向的光振动能通过的装置
偏振化方向：能通过光振动的方向
自然光通过偏
振片后变为线偏振光，称为起偏; 线偏振光:光矢量只沿一个固定方
向振动的光(又称平面偏振光)
利用偏振片检
验光线的偏振化
程度，称为检偏
荧光偏振度P＝（I //- I ⊥）/ (I //+ I ⊥)
荧光各向异性A= (I //- I ⊥)/(I//+2I ⊥)
可以证明I //+2 I ⊥为荧光总强度，
（1/P-1/3）-1=(2/3)A
Perrin公式：1/P±1/3=(1/P 0±1/3)(1+3τ/ρ)
=(1/P 0±1/3)(1+RTτ/ηV 0) 其中，P 0为极限偏振度，τ为荧光寿命，R气体常数，T绝对温度，η为粘滞系数
V 0为分子体积（按球形计算），ρ旋转迟豫时间。研究大分子性质以及与小分子的相互作用。不同生理条件下生物大分子的P 不同，可以借此诊断疾病。
3 讨论：
（1）环境因素对λmax 的影响：
a.环境(如溶剂)的极性对λmax 的影响---同一种荧光物质在不同极性的环境中，其λmax 可能会有所差别。一般来说，激发态的极性比基态要强，因此被激发的荧光分子将趋向于与极性溶剂（或极性环境）相互作用，使溶剂分子的电子分布会发生变化，偶极子重新取向，而这又会反过来影响荧光分子的基态和激发态能级，减少激发态的能量，引起发射谱的红移这种影响的结果可
以用Lippert 方程来解释：32
*22)(1211212a n n hc f a μμεεσσ????????????????＋常数
其中，σa 与σf 分别为荧光分子的吸收波数与发射波数，σa ?σf 反映了吸收光与发射光
能量的差别；ε为溶剂的介电常数；h为普朗克常数；c为光速，a为荧光分子在溶剂
中所占空穴的半径，
μ?与μ分别为荧光分子处于基态和激发态时的偶极矩。由上式可见，折射率增加使能量差减少，而介电常数增加会使能量差增大。由于荧光分子激发态的偶极矩μ?一般要大于基态偶极矩μ，荧光分子偶极矩的增大与溶剂分子相互作用，使溶剂分子的电子分布和偶极子取向发生变化。溶剂偶极子的重新取向需要比电子重新分布长得多的时间。介电常数ε不仅与偶极子取向有关，也与电子取向有关，
上式中第一项(ε?1)/(2ε?1)是电子和偶极子重新取向的结果；
折射率n与电子重新分布有关，因此上式中第二项是电子重新分布的结果。
由于非极性溶剂分子没有偶极矩，因此没有在激发态荧光分子的作用下偶极子重新取向的问题，ε≈n 2， σa ?σf 很小。而在极性溶剂中σa ?σf 较大，产生红移.值得
提出的是“环境极性加强，λmax 红移”的规律，并不是绝对的。例如，如果在激发态
的寿命之内，分子没有足够的时间来重新排列并降低激发态的能量，则可能发生λmax 兰移的情况。这种现象称为“orientation constraint”。这说明在利用λmax 作为环
境极性的探针时要十分谨慎。
b.pH值对λmax 的影响：
如果荧光物质为弱酸或弱碱，则溶液pH值的改变常对λmax 有影响。这是因为弱酸
和弱碱分子和其离子在电子结构上有所不同，因而荧光λmax 也可能发生变化。例如，
1-萘胺-5-磺酸在不同pH值时，会以两种不同离子的形式存在，这两种离子的荧光波长是不同的。利用这种效应，可以将其荧光波长作为pH值的指示剂。
C. 溶液粘度对λmax 的影响
溶液粘度有时也会对λmax 有影响，例如TNS在蔗糖水溶液中的λmax 会随蔗糖浓度的
变化而变化。当蔗糖浓度由10%增加到60%，粘度从1.3分泊增加到58分泊，λmax 以580nm兰移到555nm。
d.共振能量转移对λmax 的影响
如果两种生色团荧光频率接近，则当两种基团足够接近时，用一种生色团能吸
收的光激发使之处于激发态后，处于激发态的这种生色团可能将激发能转移到另一种生色团，使第二种生色团进入激发态，产生第二种生色团特有的荧光，这种现象称为共振能量转移。显然，共振能量转移对λmax 可能造成影响。
(2) 环境对荧光量子产率φF 和荧光强度的影响
由于稀溶液中荧光强度F λ=KI 0A φ F ，（这里I 0是激发光强度，A是光密度或吸收
度，φ 0是荧光量子产率，K为常数）因此凡是会影响荧光量子产率φF 的环境因素也
必然会影响荧光强度。
a.溶剂（或环境）极性的影响
量子产率（荧光强度）会随着溶剂（或环境）极性的减小而增加。这一点前面
已经提到过。一种可能的机制是：在非极性的溶剂中系间交连（转移到另外的激发态）的速率会减少。
B.光化分解
荧光物质因吸收光能而造成某一键断裂的现象称为光化分解
（photodissociation），光化分解会造成荧光逐渐减弱。尤其是对于稀溶液来说，光化分解就更为严重。通常，为减少光化分解现象造成的影响，可采取以下措施：
I. 减少光照时间和强度II. 由于稀溶液更容易变质，而样品在浓溶液中要稳
定一些，因此储备液要配得浓一些，使用前再稀释。III. 仪器本身的改进如提高检测器灵敏度，降低光源强度等，也有利于减少光化分解。
C. 温度对荧光强度的影响
一般来说，溶液的荧光强度随温度的降低而增强，温度的升向与荧光强度的减弱在一定范围内是线性关系。温度每升高1°C，荧光减弱的百分数称为温度系数。一般荧光物质的温度系数大约为1%，但有些荧光物质可大到5%。
温度升高，荧光强度减弱的原因主要是溶液的粘度减小，溶剂与溶质分子的动能增加，使得荧光分子的其它分子之间的碰撞几率增加，激发态荧光分子通过分子间碰撞或分子内能量的转移，将自己的能量转移出去。以非荧光发射的形式回到基态，这就造成荧光淬灭，量子产率降低的情况。如果溶液中有淬灭剂存在，则淬灭剂的作用也会随温度升高而增大。
为减少温度对荧光强度的影响，可采用恒温样品架维持样品温度的恒定。
d.样品浓度对荧光强度的影响：
在样品浓度较低时，荧光强度与荧光物质的浓度成正比。但到了一定浓度以后，就不再存在这种正比关系。这是因为：荧光强度F=KφεI
(1?e?εlc)，这里K是仪器常数，φ是量子产率，I0是激发光强度，ε是克分子消光系数，l是样品池光径，C是样品浓度。浓度增加到一定程度后，接近0，浓度继续增加，荧光强度不再增加。只有样
品浓度很稀时F=KI
0φ [1?(1?εlc)]=KI
φεlC。荧光浓度过大时，常常发生淬灭现象。
这样就使荧光强度反而大大低于接近饱和时的荧光强度。淬灭产生的原因至今仍众说纷纭，最简单的解释是：单线能级的激发分子在发出荧光之前就和未激发的荧光物质分子碰撞而自淬灭浓度过高，可能形成样品分的二聚体或多聚体。因而降低荧光强度。产生浓度淬灭的重要原因之一是荧光分子在样品池中分布均匀：当溶液较稀时，均匀分布在样品池中的荧光收强烈，越进入溶液，发荧光分子越少，因而大量的激发光在到达池内之前就被吸收了。这样，从垂直于激发光方向的角度来接收荧光，检测到的荧光就很微弱了。即使是在靠近入射光的面上，也只有靠近检测器的面上荧光容易被接收到。离探测器较远的荧光分发出的荧光又会被瓣面的荧光分子吸收（如果物质本身的吸收光谱和发射光谱有重叠的话），即大部分荧光发射在离开吸收池前就又被吸收。解决浓度淬灭的办法之一，是将样品尽量稀释到荧光强度与荧光染料宵度成范围线性关系的深浓度来测量。浓度淬灭的现象有时也可以加以利用，例如在脂质体里包裹高浓度的荧光染料，由于浓度淬灭，包裹在脂质体内的荧光染料荧光强度很低。一旦荧光染料从脂质体内泄漏出来，由于荧光染料浓度下降，进入线性区，因此荧光强度大大增加。
e.杂质对量子产率（荧光强度）的影响
f. pH值对量子产率和荧光强度的影响
如荧光物质为弱酸或弱碱，则溶液pH值的改变常对荧光强度有较大影响。利用这些物质对pH值的敏感性，可以将它们用作pH指示剂，或利用它们在不同pH值溶液中荧光强度的改变来判断酸碱滴定的络点（特别是在有色或混浊的溶液中）。
g.溶液粘度对荧光强度的影响
荧光强度一般随介质粘度的升高而增强。因为介质粘度增加，减少了分子碰撞，
从而减少了能量损失。例如荧光物质NTS在不同浓度的蔗糖水溶液中，荧光强度随
粘度增加而增加。
H.膜电位的影响
有些能和膜结合的荧光分子的荧光强度会随着膜电位的改变而改变，这种变化
有的是由于带电的荧光染料随膜电位变化而在膜内外重新分布。有的是由于荧光分
子的荧光谱在电场下发生改变（电生色性， electro chronism）。按照对膜电位变
化的反应速度，大小和光学信号改变的机制，这类电位敏感的荧光染料又可以分为
慢反应染料和快反应染料。这种现象可以用来监测膜电位的变化。
i.其它各种干扰因素:
还有一些其它的干扰因素可能影响荧光强度，例如光散射就可能影响荧光强度。
区分散射光和荧光发射的依据，是散射光与激发光波长相同，离荧光峰较远。荧光
污染也是影响荧光强度的一种因素
三．荧光分析在生物学中的应用
荧光分析应用的范围很广。生物学和医学的各个学科，包括生理、生化、
生物物理、药理、免疫、细胞、遗传等，都可以使用这一技术。从研究的材料来
看、氨基酸、蛋白质核酸、维生素酶、药物、毒物等都可以采用。下面就内源荧
光和外源荧光在生物学、医学中应用的可能性，举一些例子。
3.1内源荧光的探测和应用
生物学中比较重要的天然荧光分子多属具有共轮双键的系统。如芳香氨基酸、核黄 素、维生素A、卟啉、叶绿素、NADH和tRNA中的Y碱基（二氢尿嘧啶）等。对于
含有这些天然荧光物质的样品，可以直接通达量测其荧光来确定其存在，分布及数量。 3.1.1蛋白质的内源荧光
蛋白质的荧光来自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。它们的相对荧光强度为
100:9:0.5。检测蛋白质的天然荧光，可采用280nm的激发波长，发射波长范围
在340-350（蛋白溶液为中性时）。如果蛋白中不含色氨酸，只含苯丙氨酸和酪
氨酸，则荧光光谱主要表现酪氨酸的特征，最大发射波长约为304nm。对于含有
色氨酸的蛋白，荧光光谱则主要表现色氨酸的特征，最大荧光发射在320-350nm
之间。
3.1.2维生素的内源荧光分析
3.2 外源荧光的应用：
荧光探针，即外源荧光技术。目前，荧光探针的种类已经有上千种，人们可以根据所 研究问题的不同，选择不同的荧光探针。
3.2.1蛋白质的荧光标记：
3.2.2核酸的荧光标记：
3.2.3 生物膜的荧光标记
3.2.4金属代谢的荧光监测
3.2.5 荧光探剂作为pH指示剂
参考文献：
1.赵南明，周海梦，生物物理学，北京：高等教育出版社，海德堡：施普林格出版社，2000
2.林克椿，生物物理技术 波谱技术及其在生物学中的应用，北京：高等教育出版社，1989
3.林克椿，吴本玠，医学生物物理学，北京医科大学。中国协和医科大学联合出版社，1996
4．SNL讲义
生物物理技术综述
荧光分析法检测原理及应用举例
1 荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。 2 荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。 3 光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1。S为0或1，它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0表示所有电子自旋的角动量代数和为0，即所有电子都是自旋配对的，那么2S+1=1，电子所处的激发态为单重态， 用S i 表示，由此可推出，S 即为基态的单重态，S 1 为第一跃迁能级激发态的单重 态，S 2 为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+1=3，电子 在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i 来表示，T 1 即为第一激发态中 的三重态，T 2 即为第二激发态中的三重态，以此类推。
荧光光谱分析仪工作原理
X 荧光光谱分析仪工作原理 用x 射线照射试样时,试样可以被激发出各种波长得荧光x 射线，需要把混合得x 射线 按波长（或能量）分开，分别测量不同波长（或能虽:）得X 射线得强度，以进行左性与定疑 分析，为此使用得仪器叫X 射线荧光光谱仪。由于X 光具有一泄波长，同时又有一立能量, 因此，X 射线荧光光谱仪有两种基本类型:波长色散型与能量色散型。下图就是这两类仪器 得原理图. 用X 射线照射试样时，试样可以被激发出各种波长得荧光X 射线，需要把混合得X 射 线按波长（或能疑）分开，分别测量不同波长（或能量）得X 射线得强度，以进行定性与左疑 分析，为此使用得仪器叫X 射线荧光光谱仪。由于X 光具有一左波长，同时又有一左能量， 因此，X 射线荧光光谱仪有两种基本类型：波长色散型与能量色散型。下图就是这两类仪器 得原理图。 （a ）波长色散谱仪 （b ）能虽色散谱仪 波长色散型和能量色散型谱仪原理图 现将两种类型X 射线光谱仪得主要部件及工作原理叙述如下: X 射线管 酥高分析器 分光晶体 计算机 再陋电源
丝电源 灯丝 电了悚 X则线 BeiV 輪窗型X射线管结构示意图 两种类型得X射线荧光光谱仪都需要用X射线管作为激发光源?上图就是X射线管得结构示意图。灯丝与靶极密封在抽成貞?空得金属罩内，灯丝与靶极之间加高压（一般为4OKV）, 灯丝发射得电子经高压电场加速撞击在靶极上，产生X射线。X射线管产生得一次X射线, 作为激发X射线荧光得辐射源.只有当一次X射线得波长稍短于受激元素吸收限Imi n时，才能有效得激发出X射线荧光?笥？SPAN Ian g =EN-U S >lmin得一次X射线其能量不足以使受激元素激发。 X射线管得靶材与管工作电压决立了能有效激发受激元素得那部分一次X射线得强度。管 工作电压升高，短波长一次X射线比例增加，故产生得荧光X射线得强度也增强。但并不就是说管工作电压越髙越好，因为入射X射线得荧光激发效率与苴波长有关，越靠近被测元素吸收限波长，激发效率越髙。A X射线管产生得X射线透过彼窗入射到样品上, 激发岀样品元素得特征X射线，正常工作时，X射线管所消耗功率得0、2%左右转变为X 射线辐射，其余均变为热能使X射线管升温，因此必须不断得通冷却水冷却靶电极。 2、分光系统 第?准讥器 平面晶体反射X线示意图 分光系统得主要部件就是晶体分光器，它得作用就是通过晶体衍射现彖把不同波长得X射线分开.根据布拉格衍射左律2d S in 0 =n X ,当波长为X得X射线以0角射到晶体，如果晶面间距为d,则在出射角为0得方向，可以观测到波长为X =2dsi n 0得一级衍射及波长为X/2, X /3 ------ ―等髙级衍射。改变（）角，可以观测到另外波长得X
1 原子荧光光谱法的基本原理
1 原子荧光光谱法的基本原理 1.1 原子荧光光谱法原理 原子荧光光谱法（AFS)是原子光谱法中的一个重要分支，是介于原子发射(AES）和原子吸收（AAＳ)之间的光谱分析技术，它的基本原理就是：固态、液态样品在消化液中经过高温加热，发生氧化还原、分解等反应后样品转化为清亮液态,将含分析元素的酸性溶液在预还原剂的作用下，转化成特定价态，还原剂 KBH 4 反应产生氢化物和氢气，在载气（氩气)的推动下氢化物和氢气被引入原子化器(石英炉）中并原子化。特定的基态原子(一般为蒸气状态)吸收合适的特定频率的辐射,其中部分受激发态原子在去激发过程中以光辐射的形式发射出特征波长的荧光,检测器测定原子发出的荧光而实现对元素测定的痕量分析方法。1.2 原子荧光的类型 原子荧光是一种辐射的去活化(ｄｅcactｉｖatioｎ)过程。当有原子吸收由一合适的激发光源发射出的特征波长辐射后被激发，接着辐射区活化而发射出荧光。基本上，荧光线的波长和激发线的波长相同,也有可能比激发线的波长长，但比激发线波长短的情况也有，但不多。原子荧光有5中基本类型:①共振荧光。即激发波长与产生的荧光波长相同时，这种荧光称为共振荧光,是原子荧光分析中最常用的一种荧光;②直跃线荧光。即激发波长大于产生的荧光波长相同时，这种荧光称为直跃线荧光；③阶跃线荧光。即激发波长小于产生的荧光波长相同 时,这种荧光称为阶跃线荧光;④热助阶跃线荧光.既原子吸收能量由基态E 激发 至E 2能级时,由于受到热能的进一步激发,电子可能跃迁至于E 2 相近的较高能级 E 3，当其由E 3 跃迁到较低能级E 1 时所发射的荧光，称为热助阶跃线荧光;⑤热助 反Stokes荧光。即电子从基态E 0邻近的Ｅ ２ 能级激发至E ３ 能级时，其荧光辐射 过程可能是由Ｅ ３回到Ｅ 所发出的荧光成为热助反Sｔokes荧光。 1．3 汞的检测方法 汞及其化合物属于剧毒物质,是国际国内进出口商品中一项重要理化指标。汞在体内达到一定量时，将对人的神经系统、肾、肝脏产生严重的损害。汞测定方法有冷原子吸收光谱法、二硫腙比色法、原子荧光光谱分析法、电热原子吸收
光谱分析知识点
原子发射光谱分析 1、原子发射光谱分析的基本原理（依据） 2、ICP光源形成的原理及特点（习题2） ：ICP是利用高频加热原理。 当在感应线圈上施加高频电场时，由于某种原因（如电火花等）在等离子体工作气体中部分电离产生的带电粒子在高频交变电磁场的作用下做高速运动，碰撞气体原子，使之迅速、大量电离，形成雪崩式放电，电离的气体在垂直于磁场方向的截面上形成闭合环形的涡流，在感应线圈内形成相当于变压器的次级线圈并同相当于初级线圈的感应线圈耦合，这种高频感应电流产生的高温又将气体加热、电离，并在管口形成一个火炬状的稳定的等离子体焰矩。 其特点如下： 工作温度高、同时工作气体为惰性气体，因此原子化条件良好，有利于难熔化合物的分解及元素的激发，对大多数元素有很高的灵敏度。 （2）由于趋肤效应的存在，稳定性高，自吸现象小，测定的线性范围宽。（3）由于电子密度高，所以碱金属的电离引起的干扰较小。 （4）ICP属无极放电，不存在电极污染现象。 （5）ICP的载气流速较低，有利于试样在中央通道中充分激发，而且耗样量也较少。 （6）采用惰性气体作工作气体，因而光谱背景干扰少。 3、掌握特征谱线、共振线、灵敏线、最后线、分析线的含义及其它们之间的内 在联系。（习题3） 4、：由激发态向基态跃迁所发射的谱线称为共振线(resonance line)。共振线 具有最小的激发电位，因此最容易被激发，为该元素最强的谱线。 5、灵敏线(sensitive line) 是元素激发电位低、强度较大的谱线，多是共振 线(resonance line)。 最后线(last line) 是指当样品中某元素的含量逐渐减少时，最后仍能观察到的几条谱线。它也是该元素的最灵敏线。 进行分析时所使用的谱线称为分析线(analytical line)。 由于共振线是最强的谱线，所以在没有其它谱线干扰的情况下，通常选择共振线作为分析线。 发射光谱定性分析的基本原理和常用方法。（习题5 由于各种元素的原子结构不同，在光源的激发下，可以产生各自的特征谱线，其波长是由每种元素的原子性质决定的，具有特征性和唯一性，因此可以通过检查谱片上有无特征谱线的出现来确定该元素是否存在，这就是光谱定性分析的基础。 进行光谱定性分析有以下三种方法： （1）比较法。将要检出元素的纯物质或纯化合物与试样并列摄谱于同一感光板上，在映谱仪上检查试样光谱与纯物质光谱。若两者谱线出现在同一波长位置上，即可说明某一元素的某条谱线存在。本方法简单易行，但只适用于试样中指定组分的定性。
HORIBAFL-3000FM4荧光光谱仪操作说明解读
设备名称荧光光谱仪 设备型号HORIBA FL-3000/FM4-3000 设备操作规范: 一、开机前准备: 1、实验室温度应保持在15℃~30℃之间,空气湿度应低于75%。 2、确认样品室内无样品后,关上样品室盖。 二、开机 3、打开设备电源开关(氙灯自动点亮,预热20min; 4、打开计算机,双击桌面上的荧光光谱软件,进入工作站,等待光谱仪自检。 三、装样: 5、将样品处理为粉末状,装入样品槽,为防止样品脱落,可加盖载玻片;将样品槽装入样品室,盖好样品室盖子。 四、测试发射光谱: 6、点击菜单中的“Menu”按钮,选择“Spectral”项目中的“Emission”。 7、设置单色器(M:设置激发光波长(如460nm、发射波长扫描范围(如470nm-700nm和狭缝宽度(一般可设置1-5nm,荧光强度强,狭缝宽度要调小。 8、设置检测器(Detector:Formulars选择公式S1。 9、点击右下角“RUN”开始测量; 五、测试激发光谱:
10、点击菜单中的“Menu”按钮,选择“Spectral”项目中的“Excitation”。 11、设置单色器(M:设置监测波长(如625nm、发射波长扫描范围(如380nm-500nm和狭缝宽度(一般可设置1-5nm,荧光强度强,狭缝宽度要调小。 12、设置检测器(Detector:Formulars选择公式S1/R1。 13、点击右下角“RUN”开始测量。 六、测试量子产率: 14、线缆连接积分球:将积分球有指示箭头的一端连接激发口,另一端连接发射。 15、装样:将样品处理为粉末状,装入标准白板样品槽,并加盖石英片;将样品槽装入积分球样品台,先推上层样品台,卡好后,推入下层样品台。 16、点击软件菜单中的“Menu”按钮,选择“Spectral”项目中的“Emission”。 17、设置单色器(M:设置激发光波长(如460nm、扫描范围(如380nm-700nm和狭缝宽度(一般设置1nm。 18、设置检测器(Detector:选中暗电流选项和Correction S1选项,Formulars选择公式S1c,积分时间设置为1s(时间设置越大,扫描越慢。 19、点击右下角“RUN”开始扫描。 20、测试空白样品。测试方法如16-19,样品台内放置标准白板。 21、计算量子产率:点击“QY”按钮,在出现的对话框中设置如下参数:○1找校正谱(在D盘下“校正谱图”,选择固体校正谱;○2导入将要计算的样品谱图;○3导入空白样品谱图;○4输入需计算的激发与发射光谱起始与终止波长。 22、点击确定开始计算。
红外光谱分析仪基础知识全解
红外光谱分析仪基础知识 前言 (2) 第一章红外光谱法及相关仪器 (4) 一. 红外光谱概述 (4) 1. 红外光区的划分 (4) 2. 红外光谱法的特点 (5) 3. 产生红外吸收的条件 (5) 二. 红外光谱仪 (6) 1. 红外光谱仪的主要部件 (6) 2. 红外光谱仪的分类 (9) 3. 红外光谱仪各项指标的含义 (12) 三．红外光谱仪的应用 (15) 四．红外试样制备 (16) 四．红外光谱仪的新进展 (17)
前言 分析仪器常使用的分析方法是光谱分析法，光谱分析法可分为吸收光谱分析法和发射光谱分析法，而吸收光谱分析法又是目前应用最广泛的一种光谱分析方法：它包括有核磁共振，X射线吸收光谱，紫外-可见吸收光谱，红外光谱，微波谱，原子吸收光谱等。但最常用的则是原子吸收光谱、紫外-可见吸收光谱和红外光谱，这些方法的最基本原理是物质（这里说物质都是指物质中的分子或原子，下同）对电磁辐射的吸收。还有拉曼光谱和荧光光谱，也是比较常用的手段，它们的原理是基于物质发射或散射电磁辐射。其实物质与电磁辐射的作用还有偏振、干涉、衍射等，由此发展而成的是另外一系列的仪器，如椭偏仪、测糖仪、偏光显微镜、X射线衍射仪等等，这些仪器都不是基于光谱分析法，不是我们介绍的重点。 吸收光谱可分为原子吸收光谱和分子吸收光谱。当电磁辐射与物质相互作用时，就会发生反射、散射、透射和吸收电磁辐射的现象，物质所以能够吸收光是由物质本身的能级状态所决定的。例如原子吸收可见光和紫外光，可以使核外电子由基态跃迁到激发态，相应于不同能级之间的跃迁都需吸收一定波长的光。因此，如有一波长连续的光照射单原子元素的蒸气（如汞蒸气、钠蒸气等），将会产生一系列的吸收谱线。由于在一般情况下原子都处于基态，通常只有能量相当于从基态跃迁到激发态的所谓主系谱线出现在原子的吸收光谱中。 而分于吸收光谱则比较复杂。它们不是分立的谱线而是许多吸收带。因为每一个分子的能量包括三部分，即分子的电子能量、振动能量和转动能量。每一种能量都是量子化的。当电子有一种能级跃迁到另一能级时，可能同时还伴有振动能级和转动能级的跃迁。应此分子吸收光谱是一系列的吸收带。通常引起原子或分子中外层价电子的跃迁需要1.5-8.0ev的能量，其相应的辐射波长在 150nm-800nm之间，这是紫外－可见吸收光谱的波长范围。引起振动跃迁或振动－转动跃迁的能量是0.05-1.2ev，相应的辐射波长在1.0-25μm之间，这是红外光谱的范围。
光谱基础知识解读
太阳光光谱 紫外线谱带：波长280-400nm之间，其特点是穿透性强，可使人体皮肤黑色素沉积，颜色加深，过度的紫外线曝晒会导致皮肤癌，可导致地毯、窗帘、织物及家具油漆褪色。 可见光谱带：波长380~780nm之间，其特点是肉眼可以看见的唯一光谱，可见光波段进一步可以分为不同的颜色（赤橙黄绿蓝靛紫七色），对人体没有直接伤害。 红外光谱带：波长700~2400nm之间，其特点是我们可以直接感受到阳光“不可见”的热量，所含能量最大，所以热量也高。 各波段的远近红外线构成了太阳能的53%，紫外线占3%，可见光占44%。 元素光谱简介 如果物质是以单原子的形式而存在，关键看该原子的电子激发能了。如果在可见光的某个范围内，并且吸收某一部分光线，那它就显剩下的部分的光线的颜色。如该原子的电子激发能非常低，可以吸收任意的光线，该原子就是黑色的，如果该原子的电子激发能非常高。不能吸收任何光线，它就是白色的。如果它能吸收短波部分的光线，那它就是红色或黄色的。 具体的元素光谱：红色代表硫元素，蓝色代表氧元素，而绿色代表氢元素。 元素燃烧发出的光谱 燃烧所发出的光色根据不同的元素发出不同的光谱，每一种元素燃烧时都发出多条光谱，这种光通过三梭镜或光栅后会在屏障上显现出多条亮线，也就是说只发出有限的几种频率的光，这就是这种元素的光谱。其中会有一条或几条最亮的线，这几条最亮的线决定了在人眼中所看到的颜色。 观察光谱的方法 连续光谱的光线在通过含某种元素的气体时在光谱带上会出现多条暗线，这些暗线刚好与这种元素的光谱线位置相同，强度刚好相反，（光谱线越强的位置暗线越明显）这就是元素的吸收光谱。天文学家就是利用吸收光谱来查明遥远的恒星大气和星云中所含的元素，观察恒星红移或蓝移也要利用吸收光谱。 观察固态或液态物质的原子光谱，可以把它们放到煤气灯的火焰或电弧中去烧，使它们气化后发光，就可以从分光镜中看到它们的明线光谱 原子决定明线光谱 实验证明，原子不同，发射的明线光谱也不同，每种元素的原子都有一定的明线光谱．彩图7就是几种元素的明线光谱．每种原子只能发出具有本身特征的某些波长的光，因此，明线光谱的谱线叫做原子的特征谱线．利用原子的特征谱线可以鉴别物质和研究原子的结构。 吸收光谱 吸收光谱高温物体发出的白光（其中包含连续分布的一切波长的光）通过物质时，
分子荧光分析法基本原理
分子荧光分析法基本原理 一. 分子荧光的发生过程 （一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称“单线态”； 图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C） 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即 ?S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”； 如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1 其多重性： M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”； “三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的 10-6~10-7。 （二）分子去活化过程及荧光的发生： （一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级） 处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为： 1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。
稳态瞬态荧光光谱仪(FLS 920)操作说明书
稳态/瞬态荧光光谱仪（FLS 920）操作说明书 中级仪器实验室 一、仪器介绍 1.FLS 920稳态/瞬态荧光光谱仪具有两种功能 稳态测量：激发光谱(荧/磷光强度~激发波长)、发射光谱(荧/磷光强度~发射波长)、同步扫描谱(固定波长差、固定能量差、可变角)。 瞬态测量：荧光(磷光)寿命(100ps—10s)。 适合各类液体和固体样品的测试。 2.主要应用 高分子和天然高分子自然荧光的研究 溶液中大分子分子运动的研究 固体高分子取向的研究 高聚物光降解和光稳定的研究 光敏化过程的研究 3.主要性能指标 光谱仪探测范围：(光电倍增管， 190－870nm；Ge探测器，800－1700nm) 荧光寿命测量范围：100ps－10s 信噪比：6000：1(水峰Raman) 可以配用制冷系统，为样品提供变温环境 液氮系统(77K－320K) 使用Glan棱镜，控制激发光路、发射光路的偏振状态 使用450W氙灯和纳秒、微秒脉冲闪光灯做激发光源 F900系统软件：控制硬件，包括变温系统，数据采集、分析
4. 仪器主要部分结构图
5.仪器光路图 二、仪器测试原理(SPC) 时间相关单光子计数原理是FLS920测量荧光寿命的工作基础。 时间相关单光子计数法(time－correlated single photon counting)简称“单光子计数(SPC)法”，其基本原理是，脉冲光源激发样品后，样品发出荧光光子信号，每次脉冲后只记录某特定波长单个光子出现的时间t，经过多次计数，测得荧光光子出现的几率分布P(t)，此P(t)曲线就相当于激发停止后荧光强度随时间衰减的I(t)曲线。这好比一束光(许多光子)通过一个小孔形成的衍射图与单个光子一个一个地通过小孔长时间的累计可得完全相同的衍射图的原理是一样的。
光谱仪基础知识
第1章衍射光栅：刻划型和全息型 衍射光栅由下列两种方法制成：一种是用带钻石刀头的刻划机刻出沟槽的经典方法，另一种是用两束激光形成干涉条纹的全息方法。(更多信息详见Diffraction Gratings Ruled & Holographic Handbook). 经典刻划方法制成的光栅可以是平面的或者是凹面的，每道沟槽互相平行。全息光栅的沟槽可以是均匀平行的或者为优化性能而特别设计的不均匀分布。全息光栅可在平面、球面、超环面以及很多其他类型表面生成。 本书提到的规律、方法等对各类不同表面形状的经典刻划光栅和全息光栅均适用，如需区分，本书会特别给出解释。 1.1 基础公式 在介绍基础公式前，有必要简要说明单色光和连续谱。 提示：单色光其光谱宽度无限窄。常见良好的单色光源包括单模激光器和超低压低温光谱校正灯。这些即为大家所熟知的“线光源”或者“离散线光源”。 提示：连续谱光谱宽度有限，如“白光”。理论上连续谱应包括所有的波长，但是实际中它往往是全光谱的一段。有时候一段连续谱可能仅仅是几条线宽为1nm的谱线组成的线状谱。 本书中的公式适用于空气中的情况，即m0=1。因此，l=l0=空气中的波长。 定义单位 α - (alpha) 入射角度 β - (beta) 衍射角度 k - 衍射阶数整数
定义单位 n - 刻线密度刻线数每毫米 D V - 分离角度 μ - 折射率无单位 λ - 真空波长纳米 λ0 - 折射率为μ0介质中的波长 其中λ 0 = λ/μ 1 nm = 10-6 mm; 1 mm = 10-3 mm; 1 A = 10-7 mm 最基础的光栅方程如下： (1-1) 在大多数单色仪中，入口狭缝和出口狭缝位置固定，光栅绕其中心旋转。因此，分离角D V成为常数，由下式决定， (1-2) 对于一个给定的波长l，如需求得a和b，光栅方程(1-1)可改写为： (1-3) 假定D V值已知，则a和b可通过式(1-2)、(1-3)求出，参看图1.1、1.2和第2.6节。
X-荧光光谱仪基本理论及工作原理
自从1895年伦琴发现X-射线以来，产生的X-射线仪器多种多样。但是进入80年代，由于20世纪末，半导体材料和计算及技术的迅速发展，出现了Si(Li) 探测器技术和能量色散分析技术。最近十几年在国际上一种新的多元素分析仪器迅速发展起来。已经成为一种成熟的，应用广泛的分析仪器。他就是X-射线荧光能谱仪,全称为：能量色散X-射线荧光光谱仪。以下介绍一下这种仪器的情况： 一. X-荧光能谱技术基本理论 1．X-荧光 物质是由原子组成的，每个原子都有一个原子核，原子核周围有若干电子绕其飞行。不同元素由于原子核所含质子不同，围绕其飞行的电子层数、每层电子的数目、飞行轨道的形状、轨道半径都不一样，形成了原子核外不同的电子能级。在受到外力作用时，例如用X-光子源照射，打掉其内层轨道上飞行的电子，这时该电子腾出后所形成的空穴，由于原子核引力的作用，需要从其较外电子层上吸引一个电子来补充，这时原子处于激发态，其相邻电子层上电子补充到内层空穴后，本身产生的空穴由其外层上电子再补充，直至最外层上的电子从空间捕获一个自由电子，原子又回到稳定态（基态）。这种电子从外层向内层迁移的现象被称为电子跃迁。由于外层电子所携带的能量要高于内层电子，它在产生跃迁补充到内层空穴后，多余的能量就被释放出来，这些能量是以电磁波的形式被释放的。而这一高频电磁波的频率正好在X波段上，因此它是一种X射线,称X-荧光。因为每种元素原子的电子能级是特征的，它受到激发时产生的X-荧光也是特征的。 注意，这里的X-荧光要同宝石学中所描述的宝石样品在X射线照射下所发出可见光的荧光概念相区别。 2．X荧光的激发源 使被测物质产生特征X-射线，即X-荧光，需要用能量较高的光子源激发。光子源可以是X-射线，也可以是低能量的γ-射线，还可以是高能量的加速电子或离子。对于一般的能谱技术，为了实现激发，常采用下列方法。 a. 源激发放射性同位素物质具有连续发出低能γ-射线的能力，这种能力可以用来激发物质的X荧光。用于源激发使用的放射性同位素主要是: 55Fe（铁）、109Cd（镉）、241Am（镅）、244Cm（锔）等，不同的放射性同位素源可以提供不同特征能量的辐射。一般将很少量的放射性同位素物质固封在一个密封的铅罐中，留出几毫米或十几毫米的小孔径使射线经过准直后照射到被测物质。源激发具有单色性好，信噪比高，体积小， 重量轻的特点，可制造成便携式或简易式仪器。但是源激发功率低，荧光强度低，测量灵敏度较低。另一方面，一种放射性同位素源的能量分布较为狭窄，仅能有效分析少量元素，因此，有时将两种甚至三种不同的放射性同位素源混合使用，以分析更多的元素。 b. 管激发 管激发是指使用X-射线管做为激发源。X-射线管是使用密封金属管，通过高压使高速阴极电子束打在阳极金属材料钯上（如Mo靶、Rh靶、W靶、Cu靶等），激发出X-射线，X-射线经过(X射线)管侧窗或端窗、并经过准直后，照射被测物质激发X-荧光。 由于X-射线管发出的X-射线强度较高，因此，能够有效激发并测量被测物质中所含的痕量元素。另一方面X-射线管的高压和电流可以随意调整，能够获得不同能量分布的X-射线，结合使用滤光片技术，可以选择激发更多的元素。
荧光光谱仪操作规范
XXX有限公司 荧光光谱仪操作规范文件编号 :WI-ZL-389 版本/版次: A/2 页次：1/1 1.目的 为保证使用者正确的操作，以达成仪器之正确使用维护。提高仪器的使用寿命，特制定此规范。 参考资料：《Ux220 WorkStation V6.0使用说明书》 2．使用环境： 温度：15℃-25℃ 湿度：30-80%RH 3．仪器说明： 荧光光谱仪由测试仪主机，电脑及测试软件，测试结果输出的打印机组成。 4. 荧光光谱仪的操作方法： 4.1打开仪器电源：测试主机电源、电脑电源； 4.2开启操作程序Ux220 v6.4； 4.3开机预热：打开“设置X光管”窗口，勾选“打开高压电源”及“慢速升管压管流”，确定即可； 4.4用银校正片进行校正，校正不成功重新校正； 4.5输入样品信息、选择合适基材； 4.6将样品放入样品室，确认样品信息、测量次数无误后点击开始测量； 4.7测量完成输出报告并把报告存档。 5．注意事项： 5.1本仪器只允许经过专业培训并有上岗证的人员操作。 5.2本仪器只能检测均匀且颜色单一的物质，如导线，必须把铜丝与绝缘外皮分别进行检测；必须确保样 品厚度在2-3mm以上，若厚度不足可堆叠数个样品至适当厚度；若粒状样品其粒径大于5mm可直接进行测量，若粒径小于5mm则将样品放置样品杯中，尽量不要留下空隙且样品厚度要有2-3mm。 5.3银片校正时银片金属面朝下。 5.4关机时先降管流管压，再关程序，最后关电源； 5.5“Running”指示灯亮时，禁止打开仪器样品室的盖，以免X射线辐射对人体造成危害。 5.6测试大件样品样品室盖无法关闭时，仪器附件人员必须远离仪器三米以外，待延时灯闪烁10秒后 仪器开始测试，待延时灯（也叫做测量指示灯）熄灭后，人员方可靠近。
荧光分析法基本概念
紫外可见吸收光谱 一紫外吸收光谱分析 基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。它属于分子吸收光谱,就是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。 二紫外光谱的产生 物质分子的能量具有量子化的特征(即物质分子的能量具有不连续的特征)。一个分子有一系列能级,其中包括许多电子能级,分子振动能级以及分子转动能级。分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱分子的紫外吸收光谱就是由于分子中价电子的跃迁而产生的,从化学键的性质上考虑,与电子光谱有关的主要就是三种电子: (1)形成单键的σ电子;(2)形成双键的π电子;(3) 分子中非键电子即n电子。 化合物不同,所含的价电子类型不同,所产生的电子跃迁类型不同,根据分子轨道理论,分子中这三种电子能级的高低次序大致就是: (σ)＜(π)＜(n)＜(π*)＜( σ* ) σ,π就是成键轨道,n 就是非键轨道,σ* ,π* 就是反键轨道 由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动与转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级与转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。 二紫外光谱的表示方法 紫外光谱图就是由横坐标、纵坐标与吸收曲线组成的。 横坐标表示吸收光的波长,用nm(纳米)为单位。
纵坐标表示吸收光的吸收强度,可以用A(吸光度)、T(透射比或透光率或透过率)、1-T(吸收率)、 (吸收系数) 中的任何一个来表示。 吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置,纵坐标为它的吸收强度。 四、紫外光谱中常用的几个术语
1、发色基团与助色基团 发色基团:就是能导致化合物在紫外及可见光区产生吸收的基团,不论就是否显示颜色都称为发色基团。一般不饱与的基团都就是发色基团(C=C、C=O、N=N 、三键、苯环等) 助色基团:指那些本身不会使化合物分子产生颜色或者在紫外及可见光区不产生吸收的一些基团,但这些基团与发色基团相连时却能使发色基团的吸收带波长移向长波,同时使吸收强度增加。助色基团通常就是由含有孤对电子的元素所组成(-NH2, -NR2, -OH , -OR , -Cl等),这些基团借助P-π共轭使发色基团增加共轭程度,从而使电子跃迁的能量下降。 2.红移、蓝移、增色效应与减色效应 由于有机化合物分子中引入了助色基团或其她发色基团而产生结构的改变、或者由于溶剂的影响使其紫外吸收带的最大吸收波长向长波方向移动的现象称为红移。与此相反,如果吸收带的最大吸收波长向短波方向移动,则称为蓝移。 由于化合物分子结构中引入取代基或受溶剂的影响,使吸收带的强度即摩尔吸光系数增大或减少的现象称为增色效应或减色效应、分子荧光分析法 一、荧光的产生 物质分子的能级包括一系列电子能级、振动能级与转动能级。分子吸收能量后,从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级(这一过程速度很快,大约10-15s),成为激发单重
布鲁克XRF荧光光谱仪说明书 11-SampleDef-样品定义
SAMPLEDEF 目录 1 启动 1.1 为什么使用SAMPLEDEF 1.1.1 LOADER 和DEF 文件 1.1.2 使用几个DEF文件 1.1.3 在SPECTRA plus数据里样品定义表的互动1.2 启动SAMPLEDEF 2 使用SAMPLEDEF 2.1 列的管理 2.1.1 创建新列 2.1.2 在列表里工作 2.1.3 设置列的选项 2.2 定义列的类型 2.3 选择数据类型 2.3.1 指定列内容的数据类型 2.3.2 设置为数字数据类型的选项 2.3.3 设置为字符数据类型的选项 2.3.4 设置为组合数据类型的选项 2.3.5 设置为字符串数据类型的选项 3 教材：使用SAMPLEDEF 设置标准样品定义表步骤一启动SAMPLEDEF 步骤二创建位置列 步骤三创建样品列 步骤四创建方法列 步骤五创建SSD-文件列 步骤六创建样品颜色 步骤七创建样品尺寸列 步骤八创建Sample-ID-样品编号列 步骤九创建制样方法列 步骤十创建类型列 步骤十一保存和测试样品定义表 步骤十二从LOADER运行样品定义表 索引
1 启动 1.1 为什么使用SAMPLEDEF 1.1.1 LOADER 和DEF 文件 我们可以通过LOADER程序把样品交付到测量程序。为此，需建立样品与进样器位置、测量程序、样品编号之间的联系，以便日后查询数据。还可以增加其他参数（如样品的稀释比、流水号等等）。在SPECTRA plus，这些样品信息都在SampledDef里定义。 输入界面，即：样品定义表里的各个列，是在扩展名为DEF的文件里定义的。这些DEF文件可以在SAMPLEDEF创建。 1.1.2 使用几个DEF文件 如何建立样品与仪器的联系有很多不同的方法，最简便的方法是接近实验室的实际工作，下面举例说明： 1 样品从不同的工厂送来，并且需要区别，测量方法可以在已建立的方法里选，等等； 2 不同班次的工人用相同的分析方法测量同样的样品，只需要让仪器知道需要测量的样品 在进样器的位置。 当然，很多实验室需要进行上述两样的工作，甚至更多。这就是为什么实验室需要多个样品定义表。 特定的样品定义表（DEF 文件）可以保存选项，从而避免输入错误。如：样品类型强制规定为液体，就可以避免在真空光路测量液体样品。 标准的样品定义表是随SPECTRA plus交付的，（Routine.def 在\Libraries\MeasMethods\）。这个表是通用的表，可以在SAMPLEDEF里进行个性化设定。
光谱仪基础知识概要
光谱仪基础知识概要 第1章衍射光栅：刻划型和全息型 衍射光栅由下列两种方法制成：一种是用带钻石刀头的刻划机刻出沟槽的经典方法，另一种是用两束激光形成干涉条纹的全息方法。(更多信息详见& ). 经典刻划方法制成的光栅可以是平面的或者是凹面的，每道沟槽互相平行。全息光栅的沟槽可以是均匀平行的或者为优化性能而特别设计的不均匀分布。全息光栅可在平面、球面、超环面以及很多其他类型表面生成。 本书提到的规律、方法等对各类不同表面形状的经典刻划光栅和全息光栅均适用，如需区分，本书会特别给出解释。 1.1 基础公式 在介绍基础公式前，有必要简要说明单色光和连续谱。 提示：单色光其光谱宽度无限窄。常见良好的单色光源包括单模激光器和超低压低温光谱校正灯。这些即为大家所熟知的“线光源”或者“离散线光源”。 提示：连续谱光谱宽度有限，如“白光”。理论上连续谱应包括所有的波长，但是实际中它往往是全光谱的一段。有时候一段连续谱可能仅仅是几条线宽为1的谱线组成的线状谱。 本书中的公式适用于空气中的情况，即m0=1。因此，0=空气中的波长。 定义单位 α - () 入射角度 β - () 衍射角度 k - 衍射阶数整数 n - 刻线密度刻线数每毫米 - 分离角度
光谱仪基础知识概要 定义单位 μ0 - 折射率无单位 λ - 真空波长纳米 λ0 - 折射率为μ0介质中的波长 其中λ0 = λ/μ0 1 = 10-6 ; 1 = 10-3 ; 1 A = 10-7 最基础的光栅方程如下： (1-1) 在大多数单色仪中，入口狭缝和出口狭缝位置固定，光栅绕其中心旋转。因此，分离角成为常数，由下式决定， (1-2) 对于一个给定的波长l ，如需求得a和b ，光栅方程(1-1)可改写为： (1-3) 假定值已知，则a和b可通过式(1-2)、(1-3)求出，参看图1.1、1.2和第2.6节。
布鲁克XRF荧光光谱仪说明书 3-Getting Started-总体介绍
目录 1 安装SPECTRA plus 2 使用 SPECTRA plus第一步2.1 连接 2.2 无标样测量 2.2.1 预装的测量方法 2.2.2 特殊测量方法 2.2.3 分析结果的重新评估 2.3 绘制校准曲线 2.4 特殊应用 3 登录 3.1 登录的目的 3.2 操作人员管理 3.3 登录和退出 3.4 在不同的Windows 用户中登录
1 安装SPECTRA plus 安装必须在管理员界面里进行。 安装程序需以管理员权限进入，以安装某些动态资料库（DLL 文件），特别是这关系到数据库的管理，和某些注册钥匙，如在.DEFAULT 文件夹。 如果没有进入管理员界面，请询问网络管理员取得此资格。 安装时，请参考”Installation notes”（它是与SPECTRA plus分开的另一文件），和安装光盘里的READMEFIRST.TXT 文件、INSTALLATION.PDF 文件。 安装术语 ? Recalibration data diskette 重校正数据软盘： 是随光谱仪一起交付的软盘，包括与用户光谱仪相对应的特定文件：硬件配置文件和谱线库。在首次安装时必须安装，但不要用于升级：因为在使用了一段时间后，谱线库里会加进用户自己定义的谱线，硬件配置文件也可能进行了修改，如果重新安装时再使用重校正数据软盘里的数据，仪器就回到了出厂时的状态，用户加进去的内容会被删除，。 ? Master diskette 母盘： 是随初始SPECTRA plus软件包一起交付的软盘，内有信用证。在第一次安装时信用证被转移到硬盘。如果您想卸载软件，如，将软件安装至另一台电脑或其他目录，不要忘了把信用证转移回母盘，然后再转安装至其他地方。如果只是软件升级，没有改变目录，建议把信用证留在硬盘以避免误操作。 信用证的管理，见L_WIZARD程序。 快捷键图标程序手册?章 无L_WIZARD.EXE 11 只是在安装或卸载SPECTRA plus软件时才需要转移信用证，在通常情况下不要安装或卸载SPECTRA plus软件，也就不要用L_WIZARD去转移信用证。
荧光光谱分析讲义
荧光光谱分析 一、实验目的 1、了解荧光光谱的基本原理； 2、熟悉荧光光谱仪的基本原理和操作规程； 3、了解荧光光谱的基本分析方法。 二、荧光光谱原理 分子吸收辐射后,使其价电子处于不稳定的激发态，随后以光的形式辐射出能量、这称为“光致发光”。在二次发光的发射过程中，最常见的两种光致发光是分子荧光(fluorescence)和分子磷光(phosphorescence)。由测量分子荧光和磷光强度而建立起来的定量分析法称为分子荧光分析法和分子磷光分析法。在化学反应过程中，分子吸收反应释放出的化学能产生激发态物质，这种激发态物质发出的光辐射称为化学发光(chemiluminescence)。根据化学发光强度或发光总量来确定物质组分含量的分析方法称为化学发光分析法。化学发光分析、分子荧光分析和磷光分析统称为分子发光分析法。 2.1、荧光及磷光的产生原理 含有孤对电子n和π轨道的分子，吸收光能后产生π→π*和n→π*电子跃迁。在通常情况下，基态分子的电子自旋是配对的，净自旋S＝0，光谱项的多重性2S+1＝l，这种状态称为单重态。电子激发态的多重性也是2S+1。若有一个电子激发至高能轨道时，当S=0, 此时分子所处的状态就称为激发单重态；若—个电子激发至高能轨道，但S＝1时，即2S+l ＝3，这种状态的分子就处于激发三重态。假若分子中含有奇数电子，则S＝1/2时，分子处于二重态。 在图11-1电子激发能级图中，处于激发态的分子可以有多种辐射形式去激发而回到基态。首先由于与同类分子或其它分子碰撞，损失一部分能量，产生无辐射跃迁。然后，若能态的多重性不变(激发单重态向基态单重态跃迁)所产生的辐射称为荧光。而能态的多重性改变(激发三重态向基态单重态跃迁)时产生的辐射称为磷光。由图11-1可知，吸收光谱的能级高于荧光光谱能级，荧光光谱能级又高于磷光光谱能级。所以，荧光波长较磷光短；荧光的寿命约为10-9～10-6s, 而磷光的寿命约为10-3～10s; 一般荧光在常温下即可以发射，但磷光必须在极低的温度下（液氮，-196o C）才可以发射。
布鲁克XRF荧光光谱仪说明书 2-应用SPECTRA plus作你的第一条回归曲线
应用SPECTRA plus作你的第一条校准曲线目录 应用SPECTRA plus作你的第一条校准曲线 简介 建立校准曲线 了解校准曲线工具箱 开始作校准曲线 Si KA1 HS-Min的校准曲线 如何检查计算的浓度是否被接受 P KA1-HS-Min 的校准曲线 S KA1 HR-Min的校准曲线 V KA1-HS-Min的校准曲线 Cr KA1-HS-Min的校准曲线 Mn KA1-HR-Min的校准曲线 V KA1 HS-Min的校准曲线 Ni KA1-HS-Min的校准曲线 Cu-KA1-HS-Min的校准曲线 漂移校正/重校正 低合金未知样品的测量 使用Results Monitor功能 监视分析结果 查询结果 转移结果 再评估测量数据 结论
简介 本教学课程包括下列内容，以便使你熟悉制作校准曲线的过程： l建立校准曲线 l组织材料 l输入标准浓度到数据库 l定义测量方法 l了解校准曲线工具 l校准已测量的低合金样品 l用低合金曲线测量未知样品 l使用结果管理器 按照这一部分的介绍，你可以一步一步地制作你的第一条校准曲线。使用一套BCS低合金标样，SPECTRA plus谱线库中预定义的谱线及扫描测量模式，你的任务是绘制低合金样品的校准曲线。由于所有的样品已经在德国Bruker AXS 公司测量过，不需要在你的仪器上进行实际的测量。为了得到所显示的相同结果，必须仔细地按照所有步骤进行。
建立校准曲线 从SPECTRA plus程序或桌面打开Quantification Editor (FQuant) 程序。 图 1 桌面上的Spectra Plus程序文件夹
液相色谱原子荧光光谱联用方法通则
《液相色谱-原子荧光光谱联用方法通则》 （征求意见稿） 编制说明 中国广州分析测试中心 《液相色谱-原子荧光光谱联用方法通则》 广东省地方标准起草小组 2017年10月 《液相色谱-原子荧光光谱联用方法通则》 （征求意见稿）编制说明 一、任务来源和起草单位 本标准根据广东省质监局《关于批准下达2016年省地方标准制修订计划项目（第二批）的通知》（粤质监标函[2017] 106号）立项，要求中国广州分析测试中心承担广东省地方标准《液相色谱-原子荧光光谱联用方法通则》的制定任务。 《液相色谱-原子荧光光谱联用方法通则》标准由广东省分析测试标准化技术委员会（GD/TC22）归口管理，中国广州分析测试中心负责组织制定。 二、标准制订的目的和意义 目前国内重金属污染情况较为严重，受能源及冶金工业影响，进入环境中的砷、汞等重金属已成为全球性的污染物质。其中1956年日本发生甲基汞中毒引起“水俣病”震惊全球，不同形态的砷其毒性也大不同。在各个领域内对重金属污染物以及其形态的分析检
测技术应用迫在眉睫。 同时，液相色谱-原子荧光光谱联用仪（简称：LC-AFS）具备对能形成氢化物或原子蒸气如砷、硒、锑、汞等元素的不同形态进行定性定量分析的能力。 本标准拟研究制订液相色谱-原子荧光光谱联用方法的使用通则，为各应用液相色谱-原子荧光光谱联用仪器进行分析的方法提供依据，以此规范液相色谱-原子荧光光谱联用仪器 三、标准的制定过程 （1）成立《液相色谱-原子荧光光谱联用方法通则》标准制定工作组。 依据项目计划和标准化工作程序，工作组于2017年2月成立，工作组成员中国广州分析测试中心的有关技术人员。 （2）调研和资料收集。 根据粤质监标函[2017] 106号下达的广东省地方标准制修订计划（第二批）任务的通知，中国广州分析测试中心组织标准编制工作小组，查询、收集和认真研究国内外标准及相关资料，并结合实验室的自身条件、仪器特性和方法技术特点，初步设计编制方案。 （3）形成标准草案。 在标准的制定过程中，中国广州分析测试中心结合我国的实际情况，邀请中心和行业内相关专家进行探讨，吸取专业意见建议，并结合液相色谱-原子荧光光谱联用方面相对成熟的检测方法及其相关文献资料，修编形成标准的草案。