变性与非变性电泳对牛羊乳蛋白质差异比较研究
第３１卷 第６期 陕西科技大学学报 Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．６ ２０１３年１２月 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｈａａｎｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｃ．２０１３倡 文章编号：１０００‐５８１１（２０１３）０６‐０１０９‐０５
变性与非变性电泳对牛羊乳
蛋白质差异比较研究
宋宏新，刘 静，张 歌，李红心
（陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安 ７１００２１）
摘 要：主要采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法（Ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ）对新鲜牛羊乳及其酪蛋白清蛋白的区别进行分析检测，对比研究两种电泳方法测定结果的差异，并用两种方法分别检测了掺入不同浓度牛乳的羊乳样品．结果显示ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ法对牛羊乳酪白质的分离效果好，该条件下牛羊乳的区别主要是酪蛋白αｓ２‐ＣＮ和αｓ１‐ＣＮ，而ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ法则是对清蛋白分离效果较好，该条件下的主要区别是牛乳较羊乳多两条β‐乳球蛋白．两种电泳方法对掺入不同浓度的羊乳样品的检测阈值均为５％，但ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ效果更明显．
关键词：ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ；Ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ；乳蛋白质；羊乳牛乳蛋白质差别
中图法分类号：ＴＳ２５２．４ 文献标识码：Ａ
Ｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｃｏｗａｎｄｇｏａｔｍｉｌｋ
ｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙＳＤＳ‐ＰＡＧＥａｎｄｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ
ＳＯＮＧＨｏｎｇ‐ｘｉｎ，ＬＩＵＪｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＧｅ，ＬＩＨｏｎｇ‐ｘｉｎ
（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｈａａｎｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉ′ａｎ７１００２１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｒｅｓｈｃｏｗａｎｄｇｏａｔｍｉｌｋａｎｄｃａｓｅｉｎｐｒｏｔｅｉｎ，ａｌｂｕｍｉｎｐｒｏｔｅｉｎｂｙｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｐｈａｔｅｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）ａｎｄｎａｔｉｖｅｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ），ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｄｉｆｆｅｒ‐ｅｎｃｅｓｏｆｔｗｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｎｄｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｇｏａｔｍｉｌｋｓａｍｐｌｅｓｄｏｐｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｃｏｗｍｉｌｋｂｙｂｏｔｈｍｅｔｈｏｄｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｂｙＳＤＳ‐ＰＡＧＥｃａｓｅｉｎｐｒｏｔｅｉｎａｒｅｓｅｐａｒａｔｅｄｂｅｔｔｅｒ，ａｎｄｔｈｅｍａｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｒｅαｓ２‐ＣＮａｎｄαｓ１‐ＣＮ，ｗｈｉｌｅｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥｓｅｐａｒａｔｅａｌｂｕｍｉｎｐｒｏｔｅｉｎｂｅｔｔｅｒ，ａｎｄｔｈｅｍａｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｓｔｈａｔｃｏｗｍｉｌｋｈａｓｔｗｏβ‐ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，ｂｕｔｇｏａｔｍｉｌｋｈａｓｎ′ｔ．Ａｎｄｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｈｒｅｓｈｏｌｄｏｆｔｈｏｓｅｔｗｏｋｉｎｄｓｏｆｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｍｅｔｈｏｄｓｏｆｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｇｏａｔｍｉｌｋｓａｍｐｌｅｓｄｏｐｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａ‐ｔｉｏｎｓｏｆｃｏｗｍｉｌｋｉｓ５％．Ｂｕｔｔｈｅｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥｉｓｍｏｒｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ；Ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ；ｍｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ；ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｃｏｗａｎｄｇｏａｔｍｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ
倡收稿日期：２０１３‐１０‐１４
基金项目：陕西省教育厅科研计划项目（２０１３ＪＣ０３）
作者简介：：宋宏新（１９５９－），男，陕西咸阳人，教授，研究方向：生物化学与分子生物学
陕西科技大学学报第３１卷
０ 引言
乳与乳制品含有丰富的蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质及多种维生素［１］，是一类营养丰富的理想食
品，牛乳和羊乳是两类重要的乳品工业原料．羊乳
的营养物质易于吸收、风味独特［２］，但羊乳资源相
对匮缺，致使其市场价高量少，在利益驱动下不法
商贩将牛乳掺入羊乳中降低成本，这种掺假不仅存
在于羊乳及其制品中，更多地会出现在原料乳的收
购过程．国际贸易对羊乳制品纯度要求高（大于
９５％），羊乳制品企业在生产经营过程对原料及产
品的保真性检验是一个急待解决的问题，基于牛羊
乳成分的差异比较研究是解决羊乳中掺入牛乳成
分的技术关键．
羊乳与牛乳的外观和主要化学成分相似，其差
别主要是在脂肪酸、蛋白质种类等微观组成上．乳
蛋白质是乳制品的重要营养质量指标之一，乳蛋白
质主要包括酪蛋白和乳清蛋白两大类［３］，乳脂肪球
膜蛋白的含量相对较少．蛋白质的电荷和分子质量
特性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）是蛋白质分
离分析的良好方法，ＰＡＧＥ分为变性聚丙烯酰胺凝
胶电泳（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）和非变性聚丙烯酰胺凝胶电
泳（ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ），两种电泳系统的主要差别是ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ添加ＳＤＳ和疏基乙醇变性剂，并在加热条件下将聚合蛋白质充分变性为亚基进行分离，
而ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ不含变性剂，多在低温条件下对天然构象的蛋白质（寡聚或单体）进行分离．ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ是乳品蛋白质研究应用最广泛的方法［４］，ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ的研究报道较少，本实验通过对牛羊乳在变性及非变性条件下的电泳分析，建立分析牛羊乳蛋白质的方法，通过比较牛羊乳的蛋白质差异为羊乳中掺入牛乳成分的分析检验提供依据．
１ 材料与方法
１．１ 实验仪器
分析天平（万分之一克），北京赛多利斯仪器系
统公司；Ｔ‐１０００型电子天平，江苏常熟双杰测试仪
器厂；ＨＣ‐３０１８Ｒ高速冷冻离心机；ＷＨ‐３微型旋
涡混合仪，上海泸西分析仪器厂；移液枪，德国艾尔
德股份有限公司；１０１‐２Ａ型电热鼓风干燥箱，天津
市泰斯特仪器有限公司；ＰＢ‐１０型酸度计，北京赛
多利斯仪器系统公司；恒温水浴锅，国华电器有限
公司；ＴＳ‐２型脱色摇床、恒温器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；ＨｏｅｆｅｒｍｉｎｉＶＥ型电泳槽，美国ＧＥ公司；ＢＧ‐Ｐｏｗｅｒ６００型电泳仪，北京百晶生物技术有限公司；ＪＤ‐８０１型捷达图像分析系统，江苏省捷达软件工程有限公司．
１．２ 实验药品及材料
主要试剂：丙烯酰胺、Ｎ，Ｎ‐甲叉双丙烯酰胺，优级纯，美国Ａｍｅｒｓｃｏ公司；十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ），优级纯，美国ＵＳＢ公司；过硫酸铵，分析纯，北京化学试剂厂；四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ），优级纯，北京化学试剂厂；α‐乳白蛋白、β‐乳球蛋白：美国Ｓｉｇｍａ公司；分子量标准蛋白Ｍａｋｅｒ，科昊生物工程有限责任公司；硫酸铜、硫酸钾、Ｔｒｉｓ‐Ｂａｓｅ、巯基乙醇、考马斯亮兰Ｒ‐２５０、甘油、溴酚蓝、盐酸、甲醇、冰乙酸等其它常用试剂为分析纯级．
１．３ 样品及处理
牛乳：西安未央区韩家湾奶牛场当天产的鲜乳．奶牛健康状况良好，无乳房炎、消化道疾病等．羊乳：西安市北郊夏家堡某农户家关中奶山羊当天产的鲜乳．
脱脂牛、羊乳：取新鲜牛、羊乳在４℃５０００ｒ／ｍｉｎ下离心３０ｍｉｎ，弃去上层脂肪即得．
牛、羊乳酪蛋白：酪蛋白的制备方法采用的是等电点沉淀法［５］，脱脂乳加热３７℃，用０．１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ调ｐＨ（牛乳调至ｐＨ４．６，羊乳调至ｐＨ４．１），４０℃保温３０ｍｉｎ沉淀酪蛋白，５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，下层沉淀干燥即为酪蛋白．保留上清液用于清蛋白制备．
牛、羊乳清蛋白：上步保留的离心上清过滤除去残留酪蛋白颗粒即为清蛋白液．
羊乳中掺入不同比例牛乳样品的制备：分别取脱脂乳按脱脂羊乳和脱脂牛乳体积比（Ｖ∶Ｖ）９５∶５、９０∶１０、８０∶２０、７０∶３０、６０∶４０、５０∶５０分别混匀，即制得掺入５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％脱脂牛乳的脱脂羊乳样品．
α‐乳白蛋白：准确称量０．０１ｇα‐乳白蛋白标准品溶于１ｍＬ纯净水中．
β‐乳球蛋白：准确称量０．０１ｇβ‐乳球蛋白标准品溶于１ｍＬ纯净水中．
１．４ 电泳方法
１．４．１ ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ
（１）样品处理：２×变性样品缓冲液（ｐＨ８．０：０．１２５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ‐ＨＣｌ，２％ＳＤＳ，１０％甘油，０．１％溴酚蓝，５％巯基乙醇，调完ｐＨ后再加巯基乙醇）．
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０１１
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第６期宋宏新等：变性与非变性电泳对牛羊乳蛋白质差异比较研究
脱脂乳用蒸馏水稀释５倍，取一定量与等体积２×变性样品缓冲液混合．乳酪蛋白样品用０．０５ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液溶解成乳酪蛋白浓度６ｍｇ／ｍＬ，
取一定量与等体积的２×变性样品缓冲液混合．乳清蛋白样品直接与等体积的２×变性样品缓冲液混合．α‐乳白蛋白和‐β‐乳球蛋白标准液与等体积的
２×变性样品缓冲液混合．掺入不同比例脱脂牛乳的脱脂羊乳样品与等体积的２×变性样品缓冲液混合．所有样品电泳前用混合仪混匀，煮沸５～１０ｍｉｎ，１０μＬ进样．
（２）电泳及分析［６］
：分离胶质量浓度为１２．５％，
浓缩胶质量浓度为３％［７］
，凝胶厚度为１ｍｍ的垂
直不连续ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ，缓冲系统中含０．１％ＳＤＳ，预电泳电流为１５ｍＡ，样品进入分离胶后调到３０ｍＡ．电泳结束后用考马斯亮蓝Ｒ‐２５０染色，甲醇、
冰醋酸溶液脱色，用捷达图像分析系统对电泳图片进行扫描．以ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分子量标准制作蛋白质（亚基）分子量对数与电泳迁移率的标准曲线，该曲线方程为ｌｏｇＭＷ＝－１．３７９ｘ＋２．１３４（ＭＷ—蛋白质分子量；ｘ—电泳迁移率），Ｒ２＝０．９６９，计算各蛋白组分的分子量大小．
１．４．２ ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ
（１）样品处理：２×非变性样品缓冲液不含
ＳＤＳ和巯基乙醇（１．２５ｍＬｐＨ６．８，０．５ｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ，３．０ｍＬ甘油，０．２ｍＬ０．５％溴酚蓝，５．５
ｍＬ水．）乳酪蛋白固体样品的溶解，其它乳品样的
稀释，液体样品与２×非样品缓冲液等体积混合与ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ样品处理相同，不同的是样品仅需用
混匀仪充分混合不加热，１０μＬ进样．
（２）电泳及分析［８］
：分离胶质量浓度为８％，浓缩胶质量浓度为５％
［９］
，凝胶厚度为１ｍｍ的垂直
不连续ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ，缓冲系统不含ＳＤＳ，预电泳电流为１５ｍＡ，样品进入分离胶后调到２０ｍＡ．为防止蛋白质在电泳过程中变性，电泳在０～４℃进行．电泳结束后染色脱色等程序同ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ．２ 实验结果与分析２．１ ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ
对脱脂牛羊乳及其清蛋白酪蛋白样品进行
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ电泳结果见图１（左）．
Ｍ．分子量标准蛋白质；１．脱脂羊乳；２．脱脂牛乳；３．羊乳酪蛋白；４．牛乳酪蛋白；５．羊乳清蛋白；６．牛乳清蛋白；７．α‐乳白蛋白；８．β
‐乳球蛋白图１ 脱脂牛羊乳及清蛋白酪蛋白的ＳＤＳ‐ＰＡＧＥＥ（左）和ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ（右）图谱
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ电泳可以将蛋白质变性为亚基，按其分子量大小进行分离，图１（左）显示从电泳的负极（上）到正极（下）可以显示乳中蛋白质（亚基）含量较大的组分有８种，依据分子量标准及两种牛乳α‐乳白蛋白和‐β‐乳球蛋白标注蛋白质，将其分为上（高分子量）、中（中分子量）和下（低分子量）３组，对其分子量和蛋白质种类进行以下讨论：
上端的高分子量区域主要为血清白蛋白（７２．１
ＫＤ）和免疫球蛋白（ＩｇＧ），ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ看到的ＩｇＧ
只是由于巯基乙醇和ＳＤＳ变性裂解的ＩｇＧ的重链
［１０］
，羊乳ＩｇＧ重链的分子量（５６．９ＫＤ）较牛乳
（５７．８ＫＤ）小．下端的小分子量组主要为β‐乳球蛋白（１２．０ＫＤ）及α‐乳白蛋白（１０．４ＫＤ），仅从分子量看，在此区间牛羊乳的差别不大．由图可见羊乳
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１１１?
陕西科技大学学报第３１卷
（泳道５）和牛乳（泳道６）清蛋白主要分布在高分子量和低分子量区．
中间的中分子量区主要为羊乳和牛乳酪蛋白（泳道３和泳道４）：αｓ１‐ＣＮ、αｓ２‐ＣＮ、β‐ＣＮ和κ‐ＣＮ４种，牛羊乳的差别明显，羊乳αｓ２‐ＣＮ分子量（３５．９ＫＤ）大于牛乳αｓ２‐ＣＮ分子量（３４．２ＫＤ），牛乳α‐ＣＮ含量比较多，羊乳β‐ＣＮ含量（条带更深）比较多．
可见ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ对两种乳品蛋白质的分离较好，电泳条带多而清晰，并且有较好的重复性，两种乳品酪蛋白的区分最好．
２．２ ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ
对脱脂牛羊乳及其清蛋白酪蛋白样品进行ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ电泳结果见图１（右）．
ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ分离羊乳及牛乳蛋白质的电泳图谱条带明显比ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ条带少，中间区域的酪蛋白仅有两条，且条带拖尾不清晰，虽然也能显示两种乳品（泳道３和泳道４，泳道１和泳道２）的差别，但是信息量较少，推测是由于多种酪蛋白以胶束状态在ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ时泳动的特点．
在下端的低分子区域可以看出乳清蛋白分离效果良好．羊乳与牛乳清蛋白的差别明显：羊乳清蛋白（泳道５）仅为一条带，表明羊乳非变性条件下羊乳的乳白蛋白和乳球蛋白聚合成一个较大的羊乳清蛋白（寡聚蛋白）而存在；牛乳清蛋白（泳道６）可分为三条，一条为牛α‐乳白蛋白（泳道７），最下端的两条为牛β‐乳球蛋白（泳道８），显示牛β‐乳球蛋白有两种不同聚合形式存在．
比较两种牛标准清蛋白的ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ和ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ图谱发现：图１（左）中牛α‐乳白蛋白亚基是分子量最小的一条带（图１左泳道７），图１（右）则显示牛α‐乳白蛋白（图１右泳道７）分子量较牛β‐乳球蛋白大；图１（左）显示牛α‐乳白蛋白亚基仅一条带，图１（右）则为两条，此现象的合理解释是两种乳清蛋白的天然（非变性）状态都是由相同亚基（图１左为一条带）的多个亚基聚合而成的寡聚蛋白．
ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ分离乳蛋白质的条带虽然较少，但是对清蛋白的分离效果良好，明显的差别是最下端的牛乳较羊乳体多两条β‐乳球蛋白条带，可以作为区别牛羊乳的良好标志．
２．３ 两种电泳方法检测羊乳中掺入牛乳结果及分析
羊乳中掺入不同比例牛乳样品的两种电泳分析结果见图２．
１．脱脂牛乳；２．脱脂羊乳；３‐８．分别为掺入５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％脱脂牛乳的脱脂羊乳图２ 羊乳中掺入牛乳的ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（左）和ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ（右）图谱
比较ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（图２左）和ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ（图２右）图谱可以看出，前者分离乳蛋白质的条带多而清晰，能够比较全面的表征乳蛋白质的组成．
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ图谱显示牛乳ＩｇＧ－Ｈ分子量比羊乳大，含量较羊乳少，最明显的差别是酪蛋白αｓ２‐ＣＮ的分子量和αｓ１‐ＣＮ含量，牛乳αｓ１‐ＣＮ含量较羊乳多（条带颜色较深），当向羊乳中掺入５％含量的牛
乳时（图２左，泳道３）就可以看出条带的差异．
图２（右图，泳道１和泳道２）显示ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ对酪蛋白及高分子量清蛋白分离不好，但是最前端小分子乳清蛋白差别明显，牛乳较羊乳多出
两条β‐乳球蛋白条带，羊乳随着掺入脱脂牛乳比例
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２１１
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第６期宋宏新等：变性与非变性电泳对牛羊乳蛋白质差异比较研究
的变化，β‐乳球蛋白条带（泳道２‐８）从无到有并逐
渐加深，两条β‐乳球蛋白条带可以作为羊乳中掺入
牛乳的特征蛋白，实验显示的检测阈值为５％．
比较羊乳和牛乳蛋白质差异，ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ显
示的αｓ２‐ＣＮ和αｓ１‐ＣＮ在较多的蛋白质条带中较
难区分，而ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ显示的两条β‐乳球蛋白条带从无到有更易观察识别，以其差别为基础建立
的羊乳中掺入牛乳成分更可取．
３ 结论
对牛乳和羊乳及由其制得的酪蛋白清蛋白进
行两种电泳方法分析比较发现以下特点：ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ法由于变性可以将聚合蛋白变性成单体蛋白质或亚基，该条件下的电泳分离效果好，可以显示更多的电泳条带（８～１０条），在该条件下牛羊乳最主要的差别是酪蛋白，羊乳αｓ２‐ＣＮ分子量（３５．９ＫＤ）大于牛乳αｓ２‐ＣＮ分子量（３４．２ＫＤ），羊乳αｓ２‐ＣＮ含量较高，而牛乳αｓ１‐ＣＮ含量较高（条带更深）；ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ法乳品中蛋白质是以天然（非变性）的完整聚合蛋白质进行分离，酪蛋白变条带少（几种酪蛋白聚合成酪蛋白胶束）且分离效果较差；小分子量的乳清蛋白分离好，羊乳有一条较大的羊乳清蛋白（羊乳的乳白蛋白和乳球蛋白聚合成一个蛋白质），而牛乳清蛋白分有一条牛α‐乳白蛋白，最下端有两条牛β‐乳球蛋白，这也是ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ显示羊乳和牛乳蛋白质最明显的差别，可以作为羊乳中掺入牛乳的检测特征目标蛋白．比较而言，ｎ‐ａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ更能明显区分牛羊乳，当羊乳中掺入５％牛乳时，在ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ电泳图谱中就可以看出明显差异．
从电泳操作方法比较，ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ比较成熟，
结构较稳定，反映的酪蛋白种类信息更多，ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ试剂少不变性，要求在较低温度下进行，蛋白质的溶解性对分析影响较大，更适应于乳清蛋白分析，可以作为羊乳中掺入牛乳的有效检测方法之一．进一步比较两种电泳清蛋白电泳结果，天然状态的羊乳清蛋白与牛乳清蛋白的差别显著，然而，有关羊乳清蛋白质中的乳白蛋白和乳球蛋白是如何聚集和其蛋白质结构特点的细节，还有待更深入的蛋白质结构解析研究，羊乳清蛋白质与牛乳清蛋白质的不同，究竟是如何影响羊乳的加工和营养消化特性也有待研究．ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ可以作为羊乳中掺入牛乳成分的有效检测方法．
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３１１
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变性与非变性电泳对牛羊乳蛋白质差异比较研究
作者：宋宏新， 刘静， 张歌， 李红心， SONG Hongxin， LIU Jing， ZHANG Ge， LI
Hongxin
作者单位：陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安,710021
刊名：
陕西科技大学学报（自然科学版）
英文刊名：Journal of Shaanxi University of Science and Technology (Natural Science
Edition)
年，卷(期)：2013(6)
参考文献(10条)
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本文链接：https://www.wendangku.net/doc/9710728981.html,/Periodical_xbqgyxyxb201306024.aspx
RNA的变性电泳原理
RNA的琼脂糖凝胶电泳 实验原理 RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。 基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。 RNA非变性琼脂糖凝胶检测 实验材料、器具及药品 蘑菇的总RNA溶液。电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5μg/ml溴化乙锭（EB）10X载样缓冲液。 实验步骤 （1）用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。（2）在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4 ul于封口膜上。在实验台上再加入5 ul 1×TAE电泳缓冲液及1 ul 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。 （3）打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。
非变性电泳：上样量超过3ug，电压超过6V/cm，电泳缓冲液时间太长，均可能导致28S 和18S 条带分不开。使用2ug 上样量，电压小于6V/cm，使用新鲜的电泳缓冲液并且频繁混匀两极的缓冲液，是获得好的电泳结果的前提。(以DNA 标准为参照，28S 和18S 分别位于2.0kb 和0.9kb 左右。) 变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些。另外的可能是甲醛的质量不高。 RNA的变性琼脂糖凝胶检测 试剂： （1）MOPS缓冲液（10*）:0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS）(PH7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。 （2）上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。 （3）甲醛。 （4）去离子甲酰胺。
第四章 蛋白质化学题答案
第四章蛋白质化学 一、单项选择题 1．蛋白质分子的元素组成特点是 A．含大量的碳B．含大量的糖C．含少量的硫D．含少量的铜E．含氮量约16% 2．一血清标本的含氮量为5g/L，则该标本的蛋白质浓度是 A．15g/L B．20g/L C．31g/L D．45g/L E．55g/L 3．下列哪种氨基酸是碱性氨基酸？ A．亮氨酸B．赖氨酸C．甘氨酸D．谷氨酸E．脯氨酸 4．下列哪种氨基酸是酸性氨基酸？ A．天冬氨酸B．丙氨酸C．脯氨酸D．精氨酸E．甘氨酸 5．含有两个羧基的氨基酸是 A．丝氨酸B．苏氨酸C．酪氨酸D．谷氨酸E．赖氨酸 6．在pH6.0的缓冲液中电泳，哪种氨基酸基本不移动？ A．丙氨酸B．精氨酸C．谷氨酸D．赖氨酸E．天冬氨酸 7．在pH7.0时，哪种氨基酸带正电荷？ A．精氨酸B．亮氨酸C．谷氨酸D．赖氨酸
E．苏氨酸 8．蛋氨酸是 A．支链氨基酸B．酸性氨基酸 C．碱性氨基酸D．芳香族氨酸 E．含硫氨基酸 9．构成蛋白质的标准氨基酸有多少种？ A．8种B．15种 C．20种D．25种 E．30种 10．构成天然蛋白质的氨基酸 A．除甘氨酸外，氨基酸的α碳原子均非手性碳原子 B．除甘氨酸外，均为L-构型C．只含α羧基和α氨基D．均为极性侧链E．有些没有遗传密码11．天然蛋白质中不存在的氨基酸是 A．瓜氨酸B．蛋氨酸 C．丝氨酸D．半胱氨酸 E．丙氨酸 12．在中性条件下大部分氨基酸以什么形式存在？ A．疏水分子B．非极性分子 C．负离子D．正离子 E．兼性离子 13．所有氨基酸共有的显色反应是 A．双缩脲反应B．茚三酮反应 C．酚试剂反应D．米伦反应 E．考马斯亮蓝反应 14．蛋白质分子中的肽键 A．氨基酸的各种氨基和各种羧基均可形成肽键 B．某一氨基酸的γ-羧基与另一氨基酸的α氨基脱水形成 C．一个氨基酸的α-羧基与另一氨基酸的α氨基脱水形成 D．肽键无双键性质
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)的分类 有三种常用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法：blue native（BN-PAGE），clear native （CN-PAGE），quantitative preparative native continuous（QPNC-PAGE）。 在一个典型的native PAGE方法中，复合物被CN-PAGE或BN-PAGE分离。然后可以用其它分离方法如SDS-PAGE或等电聚焦做进一步分离。随后切割凝胶，蛋白复合物每一个部 分都被分开。蛋白的每个条带可以消化后做肽链指纹图谱或重新测序。这样就可以提供一个蛋白复合物中单个蛋白的重要信息。 1. Blue Native PAGE Blue Native PAGE是最古老的Native-PAGE技术。是以考马斯亮蓝作为电泳分离后蛋白 质鉴定染料的一种电泳方法。这种方法的缺点是：考马斯亮蓝与蛋白的结合起到了去垢剂的作用，可能导致复合物的分离；并对化学发光或蛋白质辅基的荧光或荧光染料的标记具有潜在的猝灭作用。 Blue Native PAGE在分析蛋白质-蛋白质相互作用以及膜蛋白复合物方面有很大的优势，其分离范围在100KDa-10MDa。在Blue native PAGE过程中，最重要的化合物就是考马斯亮蓝，除了增溶作用以外，蛋白质表面结合了大量的考马斯亮蓝染料而带上负电荷，这会导致即使碱性蛋白在pH7.5条件下也会向阴极迁移。但是，蛋白质虽然带有大量的负电荷，然而其分离依据的根本还是根据不连续的凝胶梯度-凝胶孔径的逐渐减小，蛋白质最终迁移 到其自身大小与凝胶孔径相近似的位置而停止。并且在分离膜蛋白的过程中，由于带有负电荷，而不会引起蛋白聚合，与酸性染料的结合，膜蛋白也由疏水性变成亲水性，溶解性大大提高。 1.2 Clear Native PAGE Clear Native PAGE是通过除染色以的其它方法如SLS鉴定蛋白的电泳技术。然而，这种方法最大的应用还是研究蛋白质-蛋白质相互作用，特别是和质谱联用。 Clear Native PAGE是在聚丙烯酰胺凝胶中分离酸性水溶性蛋白和膜蛋白（PI<7）的电泳
蛋白质变性
蛋白质在烹调过程中的变化 富含蛋白质的食物在烹调加工中，原有的化学结构将发生多种变化，使蛋白质改变了原有的特性，甚至失去了原有的性质，这种变化叫做蛋白质的变性。蛋白质的变性受到许多因素的影响，如温度、浓度、加工方法、酸、碱、盐、酒等。许多食品加工需要应用蛋白质变性的性质来完成，如:水煮蛋、咸蛋、皮蛋、豆腐、豆花、鱼丸子、肉皮冻等。 在烹调过程中，蛋白质还会发生水解作用，使蛋白质更容易被人体消化吸收和产生诱人的鲜香味。因此我们需要了解和掌握蛋白质在烹调和食品加工过程中的各种变化，使烹调过程更有利于保存时食物中的营养素和增进营养素在人体的吸收。 一、烹调使蛋白质变性 1、振荡使蛋白质形成蛋白糊 在制作芙蓉菜或蛋糕时，常常把鸡蛋的蛋清和蛋黄分开，将蛋清用力搅拌振荡，使蛋白质原有的空间结够发生变化，因其蛋白质变性。变形后的蛋白质将形成一张张有粘膜的网，把空气包含到蛋白质的分子中间，使蛋白质的体积扩大扩大很多倍，形成粘稠的白色泡沫，即蛋泡糊。 蛋清形成蛋泡糊是振荡引起蛋白质的变性。蛋清能否形成稳定的蛋泡糊，受很多因素的影响。蛋清之所以形成蛋泡糊，是由于蛋清中的卵粘蛋白和类粘蛋白能增加蛋白质的粘稠性和起泡性，鸡蛋越新鲜，蛋清中的卵粘蛋白和类粘蛋白质越多，振荡中越容易形成蛋泡糊。因此烹调中制作蛋泡糊，要选择新鲜鸡蛋。 如果搅拌震动的时的温度越低或振荡时间较短，蛋清形成的蛋白糊放置不久仍会还原为蛋清，因为这种情况下，只能破坏蛋白质的三、四结构，蛋白质二级螺旋结构没有拉伸开，无法形成稳定的蛋白质网。一旦失去振荡的条件，空气就会从泡沫中逸出，蛋白质又回复到原来的结构，这种变性称为可逆性。烹调和食品加工都不希望发生这种可逆变性发生，要设法提高蛋泡糊的稳定性。 向蛋清中加入一定量的糖，可以提高蛋泡糊的稳定性。蛋清中的卵清与空气接触凝固，使振荡后形成的气体泡膜变硬，不能保容较多的气体，影响蛋泡糊的膨胀。糖很强的渗透性，可以防止卵清蛋白遇空气凝固，使蛋泡糊的泡膜软化，延伸性、弹性都增加，蛋泡糊的体积和稳定性也增加。 做蛋泡糊时，容器、工具和蛋清液都不能沾油。搅打蛋清时如果沾上少量油脂就会严重破坏蛋清的起泡性能，因为油脂的表面张力大于蛋清泡膜的表面张力，能将蛋泡糊的的泡沫拉裂，泡沫中的空气很快从断裂处逸出，蛋泡糊就不能形成。
最新省时6 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
6 ％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验试剂及配制： a, 40 %丙烯酰胺单体凝胶贮存液。丙烯酰胺38 g，甲叉双丙烯酰胺 2 g，加双蒸水定容至 100mL，过滤，贮存于棕色瓶中。 b,变性剂。1 M NaOH 1 mL，甲酰胺 95 mL，溴酚蓝 0. 05 g，二甲苯青 0. 05 g，加双蒸水定容至100 mL。 C, 固定液。100 mL 冰醋酸溶于双蒸水定容至1 000 mL。 d, 银染液。硝酸银 1 g， 37 甲醛 1. 5 mL，加双蒸水定容至1000 mL。 f, 显影液。无水碳酸钠 30 g， 37 甲醛 1. 5mL， 10 mg /mL 硫代硫酸钠 200 μL，加双蒸水定容至 1 000 mL。 DNA 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作流程 6 ％变性凝胶的制备：40 %的凝胶贮存液 11. 2 mL，尿素36.36g， 5 × TBE 15mL，加双蒸水定容至 75 mL。预冷至 4 ℃后，加入500 μL 10 过硫酸铵和 50 μL TEMD 混合均匀，灌胶。灌胶完毕，插入样品梳，在室温下聚合 30 ～60 min。聚合完全后，梳齿下可见二条折光线。 电泳:安装电泳装置，在电泳槽中加入1 × TBE缓冲液，使缓冲液覆盖样品孔。拔出样品梳，用移液器吸取适量缓冲液冲洗样品孔。打开变压器，恒定功率 60 W 预电泳 15 ～30 min。预电泳结束后，用移液器将 DNA 样品小心注入样品孔中( 加样量为 3 ～ 5 μL) ，电泳直至带型分开。
固定:关闭电源，卸下玻璃板，剥离玻璃板，将胶板置于固定液中固定 30 min，直到指示剂颜色褪去。 漂洗:将胶板转移到双蒸水中漂洗三遍， 每次 2 ～ 3 min。 染色:转移胶板至染色液中，在摇床上摇 动染色 30 ～ 40 min。 显影:将胶板在双蒸水中漂洗 5 ～ 10 s 后 立即放入预冷为 4 ℃～ 10 ℃的显影液中，摇动显 影直到带型完全出现。 定影:将出现带型的胶板放入固定液中定 影 2 ～ 3 min，再用双蒸水漂洗两次 ( 每次 2 min) 。 干胶:胶板置于室温自然干燥。 带型统计 改良方法：a,银染 0.5%HNO+0.1 %AgNO b,漂洗蒸馏水2-3s C,显影 1.5% NaOH+0.2%Na_CO+0.5%HCHO 2-5 min d, 终止 5%无水乙醇+ 0.5 %HNO1 m后用自来水冲洗1 min。
第一部分-蛋白质练习答案
蛋白质章节课后练习（第2——6章） 一、填空 1、蛋白质多肽链中的肽键是通过一个氨基酸的羧基和另一氨基酸的氨基连接而形成的。 2、稳定蛋白质胶体的因素是表面的水化膜和同性电荷。 3、当氨基酸溶液的pH=pI时，氨基酸以两性离子形式存在，当pH>pI时，氨基酸以负离子形式存 在。 4、球状蛋白质中有极性侧链的氨基酸残基常位于分子表面而与水结合，而有非极性侧链的氨基酸位 于分子的内部。 5、今有甲、乙、丙三种蛋白质，它们的等电点分别为8、0、4、5和10、0,当在pH8、0缓冲液中， 它们在电场中电泳的情况为：甲不动，乙向正极移动，丙向负极移动。 6、加入低浓度的中性盐可使蛋白质溶解度增大，这种现象称为盐溶，而加入高浓度的中性盐，当达 到一定的盐饱和度时，可使蛋白质的溶解度_减小,这种现象称为盐析。 7．蛋白质变性主要是空间结构遭到破坏，而其一级结构仍可完好无损。 8、皮肤遇茚三酮试剂变成蓝紫色颜色，是因为皮肤中含有蛋白质所致。 9、维持蛋白质二级结构最主要的力是氢键。 10、蛋白质中氨基酸的主要连接方式是肽键。 11、蛋白质在等电点时溶解度最低。 13、蛋白质的二级结构主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲等四种形式，维持蛋白质二级结 构的力主要是氢键。 14、除脯氨酸以外，氨基酸与水合茚三酮反应产物的颜色是蓝紫色。脯氨酸与亚脯氨酸直接生成亮黄色产物 15、在各种蛋白质分子中，含量比较相近的元素是氮（N），测得某蛋白质样品含氮量为14.0克，该 样品蛋白质含量应为87.5克。 16. 组成蛋白质分子的碱性氨基酸有赖氨酸(Lys)，精氨酸（Arg）和组氨酸（His）。酸性氨基酸有 天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）。 17. 氨基酸在等电点时，主要以两性离子形式存在，在pH>pI的溶液中，大部分以负离子形式存 在，在pH 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(acrylamide,Acr)单体相互聚合成多条长链，再与N,N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,Bis)在引发剂和加速剂的作用下交联而成的凝聚胶多孔聚合物。凝胶孔径的大小可通过控制单体和交联剂的浓度来调节，从而满足不同分子量物质的分离要求。不同浓度的聚丙烯酰胺非变性凝胶的有效分离范围如表所示： 表1 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围 丙稀酰胺[%(w/v)]a有效分离范围（bp）二甲苯青FF b溴酚蓝b 3.51000－2000 460 100 5.080－500 260 65 8.060－400 160 45 12.040－200 70 20 15.025－150 60 15 20.0 6－100 45 12 a．N,N′-亚甲双丙稀酰胺占丙稀酰胺浓度的1/30 b．给出的数字是迁移率与染料相同的双链DNA片段的粗略大小（核苷酸对）。 聚丙烯酰胺凝胶的制备和电泳都比琼脂糖凝胶更为费事。聚丙烯酰胺凝胶几乎总是铺于两块玻璃板之间，两块玻璃板由间隔片隔开冰封以绝缘胶布。在这种配置形式下，大多数丙烯酰胺溶液不会与空气接触，所以氧对聚合的抑制仅限于凝胶顶部的一个窄层里。聚丙烯酰胺凝胶一律是进行垂直电泳，根据分离的需要，其长度可以在10-100cm之间。聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比有3个主要优点：（1）分辨力强，长度仅仅相差０.2%（即500bp中的1bp）的DNA分子即可分开;(2)所能装载的DNA分子量远远琼脂糖凝胶：多达10μg的DNA可以加样于聚丙烯酰胺凝胶的一个标准样品槽（1cm×1mm）而不致显著影响分辨力；(3)从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高，可适用于要求最高的实验（如鼠胚胎微注射）。 常用的是两种聚丙烯酰胺凝胶： （1）用于分离和纯化双链DNA片段非变性聚丙烯酰胺凝胶 （2）用于分离、纯化单链DNA的变性聚丙烯酰胺凝胶 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 【原理】 非变性聚丙烯酰胺凝胶用于分离和纯化小分子双链DNA片段（<1 000bp），多数双链DNA在此胶中的迁移率大略与其大小的对数值成反比，但迁移率也受碱基组成和序列的影响，同等大小的DNA分子可能由于空间结构的不同而使迁移率 变性梯度凝胶电泳(DGGE)实验 【实验目的】 掌握变性梯度凝胶电泳检测新的突变，以及测定高度多态基因的基因型的技术方法。 【实验原理】 在现代遗传学中DNA 序列突变的分析占有十分重要的地位。由于在较大DNA 序列中检测一个细微的突变非常困难，因而现在人们建立了几种方法来解决这一难题。变性梯度凝胶电泳(DGGE)能把长度相同而核苷酸顺序不同的双链DNA 片段分开。这种方法利用了DNA 分子从双螺旋型变成局部变性型时电泳迁移率会下降的现象。不同的DNA 片段发生这种变化所需梯度不同。DGGE 的凝胶中沿电场方向变性剂(甲醛和尿素)含量递增，当DNA 片段通过这种变性剂递增的凝胶时，不同分子的电泳迁移率在不同区域会发生降低。这就可使核苷酸顺序不同DNA 片段分开。此方法可作为测序的初始步骤在杂合个体中分离等位基因。许多研究表明变性递度凝胶电泳分离能力很强，它可以把相差仅1bp 的DNA 片段分开。 【仪器、材料与试剂】 1.50×TAE 缓冲液(2mol/LTris 乙酸盐，0.05mol/L EDTA pH8.0)1L 体积：242gTris碱，57.1mL 冰醋酸，100mL 0.5mol/L EDTA pH8.0，加水至lL。 2.丙烯酰胺贮存液：40%丙烯酰胺(38:2 丙烯酰胺:双丙烯酰胺)。 3.过硫酸铵贮存液(10%)：10mL 配制：1g 过硫酸铵加水至10mL。TEMED(N，N，N＇，N＇，—四甲基乙二胺)。 4.变性剂贮存液：(0%)6%丙烯酰胺TAE 溶液。250mL 溶液：37.5mL 丙烯酰胺贮存液，5mL50×TAE 缓冲液，加水至250mL，过滤和排气。 5.变性剂贮存液(100%)：6%丙烯酰胺，7mol/L 尿素，40%甲醛TAE 溶液。250mL配制：37.5mL 丙烯酰胺贮存液，5mL50×TAE 缓冲液，105g 尿素，100mL 甲醛，加水至250mL，过滤并排气。 6.染料：40%(W/V)蔗糖，0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青和30%甘油。 7.塑料胶框、梳子和垫片，两个用于固定胶框中玻璃片的塑料支架。 8.一有柄和一无柄的两片玻璃板(尺寸：17.78cm 宽×20.32cm 长×0.635cm 厚)，有柄的玻璃板有一个13.97cm 宽，2.54cm 厚的突出。 Native-PAGE原理 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。 实验方法 非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。 一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。 酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。 工作液配制 1.40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）； 2.4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存； 3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存； 4.10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase，144g 甘氨酸，加水定容到L，4℃贮存； 5.2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH 6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O；-20℃贮存； 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验 一变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 配制溶液： 1、30% Acrylamide（14.5 g 丙烯酰胺，0.5g 双丙烯酰胺，加水溶解，定容至50 ml，4℃，棕色瓶中储存） 2、10% 过硫酸铵（0.5g APS，溶于5ml 去离子水中，4℃可储存数个月） 3、10 ×TBE 缓冲液（10.8g Tris,0.744g EDTA,5.5g 硼酸，定容到100ml） 4、TEMED 5、20-200 DNA marker 6、尿素 实验步骤： 1、配置10%的胶10ml：8M*10ml*60g/mol=4.8g 尿素 6.1ml water 3.3ml 30% Acrylamide 1ml 10 ×TBE 0.11ml APS 0.01mlTEMED 2、立即将胶倒入两块板间并插好梳子，放置，待凝固30min，时间可以适当延长。 3、向电泳槽加入1×TBE，拔出梳子并用注射针筒多次洗涤点样孔，尽可能排除未聚合 的丙烯酰胺。 4、将DNA marker 加到点样孔中，以120V（10V/cm）进行电泳直到燃料走到靠近底部 的三分之一处，大约需要60-90分钟。 二银染实验 银染溶液的配置：实验之前准备4℃水 1、固定液（10%醋酸）：20ml冰醋酸，180mlddH2O混匀（通风厨中进行） 2、染色液：将0.1g AgNO3溶解于100 ml ddH2O中，使用前加1.5ml37%甲醛溶液，必须 储存于避光瓶中，防止接触皮肤（通风厨中进行） 3、显影液：将30gNa2CO3溶解于ddH2O中，冷却至4℃，使用前加1.5ml37%甲醛溶液 （通风厨中进行），0.1M五水硫代硫酸钠150μl；（0.1M Na2S2O3。5H2O：将2.48g Na2S2O3。5H2O溶于100mlddH2O）。 注意事项： 1、染色液和显影液要现用现配； 2、显影液必须在4℃使用且必须保存在4℃； 3、甲醛蒸汽致癌，在通风厨内操作； 4、实验室中柔和的背景光线有利于降低背景颜色； 5、显色不能在透光的盒子中进行； 6、溶液不能直接倒在胶面上，应使盘倾斜后将溶液倒在盘的角上，或者将每种溶液各方 一盘，然后将胶从一个盘转到另一个盘； 7、溶液的体积必须足够将胶全部浸没； 蛋白质变性后的方面 （一）生物活性丧失 蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。 （二）某些理化性质的改变 蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。（三）生物化学性质的改变 蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。蛋白质的变性作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构（但一级结构并未改变）。所以，原来处于分子内部的疏水基团大量暴露在分子表面，而亲水基团在表面的分布则相对减少，至使蛋白质颗粒不能与水相溶而失去水膜，很容易引起分子间相互碰撞而聚集沉淀。 DNA变性 DNA变性指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性。 变性DNA常发生一些理化及生物学性质的改变： 1）溶液粘度降低。DNA双螺旋是紧密的刚性结构，变性后代之以柔软而松散的无规则单股线性结构，DNA粘度因此而明显下降。2）溶液旋光性发生改变。变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构性改变，使DNA溶液的旋光性发生变化。 3）增色效应(hyperchromic effect)。指变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。DNA分子中碱基间电子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波长紫外光的特性。在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。 各类连接键，结构稳定的键 多肽链中氨基酸残基的构成以及排列顺序称为氨基酸的一级结构,连接一级结构的键是肽键。氨基酸的二级结构是指氨基酸主链原子的局部空间结构,并不涉及氨基酸残基侧链构象,二级结构的种类有α-螺旋、β-折叠、β-转角儿以及无规卷曲。氢键是维系二级结构最主要的键。三级结构是指多肽链主链以及侧链原子的空间排布。次 电泳检测技术是指利用带电颗粒在电场中能向异性电极泳动这一现象来分离、纯化或分析检测供试品的一种生物化学技术。 原理：许多生物分子都带有电荷，在电场作用下可发生移动，由于混合物中各组分所带电荷性质、数量以及相对分子质量各不相同，使在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速率也各有差异，所以在一定时间内，它们移动距离不同，从而可达到分离鉴定的目的。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，包括电荷效应和分子筛效应。 琼脂糖是由天然的琼脂加工制得，是一种直链杂聚多糖，溶于热水，形成溶胶，冷却后成为孔径范围从50nm到大于200nm的大网孔径凝胶。由于孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，该电泳技术是目前分离、分析DNA片段的标准方法。 DNA琼脂糖凝胶电泳的原理 DNA 分子是两性电解质，在高于其等电点的溶液（pH8.0~pH8.3 DNA分子本身的大小和构型、凝胶浓度决定了DNA分子的迁移速度。）中，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离，DNA 分子带负电荷，在电场中向正极移动。 DNA分子大小对迁移速率的影响：相对分子质量大，迁移慢；相对分子质量小，迁移快。DNA分子构型对迁移速率的影响：迁移速度：闭环﹥直链DNA﹥开环DNA。 琼脂糖凝胶浓度的影响：同样大小的线性DNA片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移速度不同，浓度越大，迁移的越慢 常用的电泳上样缓冲液含溴酚蓝，有的还含有二甲苯青，这些指示剂可以指示电泳的速度。溴化乙淀（EB）是核酸的染色剂，能插入DNA分子中形成荧光结合物，EB在紫外线照射下的发射荧光。荧光的强度与DNA的含量成正比，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置及估计出待测样品的浓度。 EB是强致癌剂。 电泳操作步骤(整个过程要求带一次性手套 1、胶槽准备 ①将凝胶托盘放入制胶盒中; ②将加样梳垂直插入到制胶盒的小凹槽内，梳齿底端和凝胶托盘有1mm的间隙; ③将制胶盒放在调整好的水平台上。 2、凝胶准备用1×TAE配制1％琼脂糖凝胶。 ①称0.15g琼脂糖置三角瓶中，加15ml 1×TAE; ②微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖; ③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入DNA染料，并轻轻混匀。 3、倒胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的制胶盒内，凝胶厚度3～5mm,室温下静置半小时左右冷却，凝胶固化。 4、轻轻拔出固定在凝胶中的加样梳。将带凝胶的凝胶托盘置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极，向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可,出去样品孔的气泡。 6、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/10的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。 7、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般5-7μl。 8、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。 电泳条件：5v/cm；时间20-30分钟左右 9、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。 DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤 最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂： 1、30％聚丙烯酰胺(29:1) 丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。 2、10％过硫酸胺 过硫酸胺1克，水10ml。 3、TEMED 4、5xTBE Tris 27克，硼酸13.75克，0.5M EDTA(pH 8.0) 10ml，定容至500ml。 二、银染试剂 1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。 2、0.2% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。 3、1.5% NaOH：NaOH 7.5克，水500ml。 4、37％甲醛。 三、配胶(6%)： 30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；T EMED 20ul。室温凝固时间>1小时。 四、银染： 1、固定液固定10m。 2、水洗2m x3次。 3、0.2% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。 4、水洗 20秒x2次。 5、1.5% NaOH 100ml，加37％甲醛 0.5ml，混匀，显色3～10m。 6、水洗若干次，终止显色。 电泳时间：150v x 3h，溴酚兰的位置相当于40bp。 银染后胶面积将膨胀10％。 在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。 显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴！！！ 聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，0.4mm厚。同位素十分灵敏，特异，但是由于其操作的复杂性，许多实验室开展有一定困难。银染法相对简便易行，便于一般的实验室开展。 需要指出的是，应用与筛选基因组的银染往往采用测序胶的染色方法，这样才能保证灵敏性，我们在长期的工作中积累了一些银染的经验，与大家分享。 下面是网上的一个银染方法，我们使用后觉得效果不错，然后以此为基础，介绍一下我们的经验 测序凝胶的银染 变性梯度凝胶电泳 摘要：变性梯度凝胶电泳（DenaturingGradientGelE1ectrophoresiS，DGGE）是由Fisher 和Lerman发明用于检测DNA突变的技术，其主要是基于突变型和野生型棱酸序列的不同而导致其变性浓度的差异，利用变性梯度凝胶进行分离, 该手段分辨率达一个碱基。恒定变性凝胶电泳(CDGE)、瞬时温度梯度电泳(TTGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)是由DGGE经改进而成。它们在突变分析上都有着重要的作用。 关键词：变性梯度凝胶电泳、恒定变性凝胶电泳、瞬时温度梯度电泳、温度梯度凝胶电泳 1、前言： 随着结构基因组计划接近尾声，人类基因神秘的面纱已逐步揭开，GenBank中已知基因的数目也与日俱增，各种遗传病的相关基因也了解得越来越多。但是，在找到了候选基因后，还需要在相关的遗传病病人中进行突变检测，只有找到了相应的突变。才能真正确定该基因与疾病的关系，从而服务于临床。变性梯度凝胶电泳就是一种很有实用价值的突变分析方法。该方法经改进，又发展出了恒定变性凝胶电泳(constant denaturant gel elec—trophoresis，CDGE)、瞬时温度梯度电泳(temporaltemperature gradient electrophoresis，TTGE)和温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel elec—trophoresis，TGGE)。现在上述方法已经广泛应用于遗传病的诊断、突变分析和肿瘤相关基因的筛查等许多方面。 2、基本原理 2.1变性梯度凝胶电泳 由Fisher和Izrman口3于1983年创立，以后该技术和PCR技术相结合被广泛应用于各种突变分析。它主要是利用梯度变性胶来分离DNA片段。电泳开始时，DNA在胶中的迁移速率仅与分子太小有关，而一旦DNA泳动到某一点时，即到达该DNA变性浓度位置时，使得DNA双链开始分开，从而大大降低了迁移速率。由于不同的DNA片段的碱基组成有差异，使得其变性条件产生差异，从而在凝胶上形成不同的条带。目前常用的变性荆有尿素(urea)和甲酰胺(formamide)。根据DGGE变性梯度方向与电泳方向是否一致，可将其分为两种形式的DGGE：垂直DGGE和平行DGGE。垂直DGGE的变性梯度方向与电泳方向垂直，可用于优化样本的分离条件，也可用于分析PCR产物的组成；平行DGGE的变性梯度方向与电泳方向一致，可用于同时分析多个样本。检测某种突变的变性剂浓度一般通过变性 浅谈蛋白质变性的原因 引起蛋白质变性的原因可分为物理和化学因素两类.物理因素可以是加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波的作用等；化学因素有强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)等.在临床医学上,变性因素常被应用于消毒及灭菌.反之,注意防止蛋白质变性就能有效地保存蛋白质制剂.蛋白质的变性很复杂,要判断变性是物理变化还是化学变化,要视具体情况而定.如果有化学键的断裂和生成就是化学变化；如果没有化学键的断裂和生成就是物理变化. 1、重金属盐使蛋白质变性,是因为重金属阳离子可以和蛋白质中游离的羧（suo）基（含 C、H、O的基）形成不溶性的盐,在变性过程中有化学键的断裂和生成,因此是一个化学变化. 2、强酸、强碱使蛋白质变性,是因为强酸、强碱可以使蛋白质中的氢键断裂.也可以和游离的氨基或羧基形成盐,在变化过程中也有化学键的断裂和生成,因此,可以看作是一个化学变化. 3、尿素、乙醇、丙酮等,它们可以提供自己的羟基或羰基上的氢或氧去形成氢键,从而破坏了蛋白质中原有的氢键,使蛋白质变性.但氢键不是化学键,因此在变化过程中没有化学键的断裂和生成,所以是一个物理变化. 4、加热、紫外线照射、剧烈振荡等物理方法使蛋白质变性,主要是破坏蛋白质分子中的氢键,在变化过程中也没有化学键的断裂和生成,没有新物质生成,因此是物理变化.否则,鸡蛋煮熟后就不是蛋白质了.而我们知道,熟鸡蛋依然有营养价值,其中的蛋白质反而更易为人体消化系统所分解吸收. (1)蛋白质受热或遇到_____、____、____等化学物质，会发生化学反应，失去原有的生理 活性。（填具体物质） (2)维生素是人们不可缺少的营养物质，缺乏维生素或摄入不足，会导致人体患病。缺乏 维生素C，会引起___________。请例举两种富含维生素的常见食品：_________、_________等。 (2)1蛋白质受热或遇到（）、（）、（）等化学物质时,结构就会被破坏,失去 生理活性.（填类） 2变质食品中含有有毒的（）,其中（）的毒性较大. 3一氧化碳可与人体血液中的（）结合,使红细胞输氧能力降低.，尼古丁和焦油使吸烟者对香烟产生依赖性并诱发疾病. 蛋白质变性 集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289- 蛋白质在烹调过程中的变化 富含蛋白质的食物在烹调加工中，原有的化学结构将发生多种变化，使蛋白质改变了原有的特性，甚至失去了原有的性质，这种变化叫做蛋白质的变性。蛋白质的变性受到许多因素的影响，如温度、浓度、加工方法、酸、碱、盐、酒等。许多食品加工需要应用蛋白质变性的性质来完成，如:水煮蛋、咸蛋、皮蛋、豆腐、豆花、鱼丸子、肉皮冻等。 在烹调过程中，蛋白质还会发生水解作用，使蛋白质更容易被人体消化吸收和产生诱人的鲜香味。因此我们需要了解和掌握蛋白质在烹调和食品加工过程中的各种变化，使烹调过程更有利于保存时食物中的营养素和增进营养素在人体的吸收。 一、烹调使蛋白质变性 1、振荡使蛋白质形成蛋白糊 在制作芙蓉菜或蛋糕时，常常把鸡蛋的蛋清和蛋黄分开，将蛋清用力搅拌振荡，使蛋白质原有的空间结够发生变化，因其蛋白质变性。变形后的蛋白质将形成一张张有粘膜的网，把空气包含到蛋白质的分子中间，使蛋白质的体积扩大扩大很多倍，形成粘稠的白色泡沫，即蛋泡糊。蛋清形成蛋泡糊是振荡引起蛋白质的变性。蛋清能否形成稳定的蛋泡糊，受很多因素的影响。蛋清之所以形成蛋泡糊，是由于蛋清中的卵粘蛋白和类粘蛋白能增加蛋白质的粘稠性和起泡性，鸡蛋越新鲜，蛋清中 的卵粘蛋白和类粘蛋白质越多，振荡中越容易形成蛋泡糊。因此烹调中制作蛋泡糊，要选择新鲜鸡蛋。 如果搅拌震动的时的温度越低或振荡时间较短，蛋清形成的蛋白糊放置不久仍会还原为蛋清，因为这种情况下，只能破坏蛋白质的三、四结构，蛋白质二级螺旋结构没有拉伸开，无法形成稳定的蛋白质网。一旦失去振荡的条件，空气就会从泡沫中逸出，蛋白质又回复到原来的结构，这种变性称为可逆性。烹调和食品加工都不希望发生这种可逆变性发生，要设法提高蛋泡糊的稳定性。 向蛋清中加入一定量的糖，可以提高蛋泡糊的稳定性。蛋清中的卵清与空气接触凝固，使振荡后形成的气体泡膜变硬，不能保容较多的气体，影响蛋泡糊的膨胀。糖很强的渗透性，可以防止卵清蛋白遇空气凝固，使蛋泡糊的泡膜软化，延伸性、弹性都增加，蛋泡糊的体积和稳定性也增加。 做蛋泡糊时，容器、工具和蛋清液都不能沾油。搅打蛋清时如果沾上少量油脂就会严重破坏蛋清的起泡性能，因为油脂的表面张力大于蛋清泡膜的表面张力，能将蛋泡糊的的泡沫拉裂，泡沫中的空气很快从断裂处逸出，蛋泡糊就不能形成。 蛋清变成稳定性的蛋泡糊，不能在恢复成原来的蛋清，这种变性称作不可逆变性。不可能变性完全破坏了蛋白质的空间结构，组成蛋白质大分子的肽链充分伸展开，这些肽链在搅拌过程中互相聚集又互相交联，形 凝胶电泳 ————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期： 论文题目：凝胶电泳 专业：化学 年级：10级 学号：10101550203 姓名：马慧 摘要 凝胶电泳（Gel electrophoresis）或称胶体电泳，也可称为扁平式电泳法，是一大类技术，被科学工作者用于分离不同物理性质（如大小、形状、等电点等）的分子。它是以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法。凝胶电泳通常用于分析用途，但也可以作为制备技术，在采用某些方法，如质谱、聚合酶链式反应、克隆、DNA测序或者 免疫印迹检测之前，进行部分提纯分子。通过学习，了 解凝胶电泳的类别、原理、特点及其应用范围。 关键词：制备，类别，定义，原理，特点，应用范围 正文 一、凝胶制备 1、设备与试剂：琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种。其中水平型可制备低浓度琼脂糖凝胶，而且制胶与加样都比较方便，故应用比较广泛。核酸分离一般用连续缓冲体系，常用的有TBE（0.08mol/L Tris?HCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/L EDTA）和THE（0.04mol/L Tris?HCl。pH7.8，0.2mol/L醋酸钠，0.0018mol/L EDTA）。 2、凝胶制备：用上述缓冲液配制0.5％-0.8％琼脂糖凝胶溶液，沸水浴或微波炉加热使之融化，冷至55℃时加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5μg/ml，然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模子中，厚度依样品浓度而定。注胶时，梳齿下端距玻璃板0.5-1.0mm，待脱凝固后，取出梳子，加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下1mm处。 蛋白质变性机理 1、蛋白质介绍 2、蛋白质变性结果 1)活性丧失 蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。有时蛋白质的空间结构只要轻微变化即可引起生物活性的丧失。 2）某些理化性质的改变 蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来, 分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低 蛋白质分子凝聚从溶液中析出 3）生物化学性质的改变 蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。蛋白质的变性作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构（但一级结构并未改变）。所以，原来处于分子内部的疏水基团大量暴露在分子表面，而亲水基团在表面的分布则相对减少，至使蛋白质颗粒不能与水相溶而失去水膜，很容易引起分子间相互碰撞而聚集沉淀。 4）致变因素 引起蛋白质变性的原因可分为物理和化学因素两类。物理因素可以是加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波的作用等；化学因素有强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)等。在临床医学上，变性因素常被应用于消毒及灭菌。 反之，注意防止蛋白质变性就能有效地保存蛋白质制剂。蛋白质的变性很复杂，要判断变性是物理变化还是化学变化，要视是物理变化 加热、紫外线照射、剧烈振荡等物理方法使蛋白质变性，主要是破坏蛋白质分子中的氢键，在变化过程中也没有化学键的断裂和生成，没有新物质生成，因此是物理变化。 否则，鸡蛋煮熟后就不是蛋白质了。而我们知道，熟鸡蛋依然有营养价值，其中的蛋白质反而更易为人体消化系统所分解吸收。 5）复性 浅谈蛋白质变性和水解原理的烹饪应用 作者:黄五洲 摘要:蛋白质的变性与水解是烹饪化学中的重要原理,是烹饪时原料发生的各种变化中最重要的变化之一.理解蛋白质的变性与水解的理论,运用其理论指导烹饪实践,解决烹饪的相关问题,无疑对菜肴食品的色、香、味、形、质感的改善与提高有着重要的现实意义.本文谨以本人多年的烹饪学习与实践体会,浅谈蛋白质的变性与水解,以求与烹饪同行作为学习交流,以求对烹饪后学者有所指点帮助 关键词:蛋白质变性.水解 论文正文 一.蛋白质的理解 蛋白质是一种结构十分复杂的高分子有机化合物。由碳、氢、氧、氮等元素构成。 蛋白质是食物原料, 特别是肉食性原料的主要组成分(一般的食物原料, 蛋白质与水分、碳水化合物、脂类即点有原料有效成分的95%多), 豆类、蛋类、各种瘦肉和鱼类含蛋白质较丰富13%～18%。粮谷类的蛋白质含量为7%～10%。蔬菜为0.9%～2%。因此说, 蛋白质在烹饪过程中的变化, 是食物原料烹饪过程中最重要变化, 学习、关注蛋白质的烹饪变化情况, 对烹饪菜肴食品的色、香、味、形以及质感的调整有着重要的指导意义 二.蛋白质的变性与水解的概念认识 蛋白质在温度、酸、碱、盐、有机溶剂、机械作用、紫外线照射等物理化学因素作用下，内部的分子高度规则性排列发生了变化，使蛋白质改变了原来的性质，这就是蛋白质变性。原料内蛋白质变性，有利于人体消化液对蛋白质的消化吸收，并可形成菜品特殊的形态、口感和滋味。 肉料蛋白质变性后，若继续加热，蛋白质会发生水解，形成多肽，这些多肽类物质进一步水解，最后分解成各种氨基酸，溶于汤汁中，使汤汁有鲜味。 三. 蛋白质的变性的烹饪应用 1.温度使蛋白质变性 ⑴烹饪熟处理 肉料须经过加热至蛋白质变性才是成熟。成熟的肉与生肉相比，无论在形态、口感，还是滋味方面，都有极大的区别。 事实上, 烹饪更多的利在利用温度使蛋白质发生应有的变化,从而获得良好的色、香、味、形、质感,使之成为美食,使烹饪成为一种艺术 ⑵温度使蛋白质变性,从而形成菜肴良好的形态 利用蛋白质变性原理,在带有一定韧性的动物原料表面刻切花刀,经焯水处理,能获得菜肴食品优美的形态.聚丙烯酰胺凝胶电泳
变性梯度凝胶电泳(DGGE)
非变性凝胶电泳技术
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验
蛋白质变性后的方面
琼脂糖凝胶电泳技术
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤
变性梯度凝胶电泳
浅谈蛋白质变性的原因
蛋白质变性
凝胶电泳
蛋白质变性机理
浅谈蛋白质变性原理的烹饪应用