PCR技术(包含引物设计)
聚合酶链式反应（PCR）
原理：
DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性 - 退火(复性）- 延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板 - 引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的
半保留复制链，重复循环就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR技术分类（常用）
（1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA 序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。
（2）锚定PCR技术(Anchored PCR, APCR)：用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。
（3）不对称PCR技术(asymmetric PCR)：两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用50～100÷1比例。在最初的10～15个循环中主
要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引
物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。
（4）反转录PCR技术(reverse transcription PCR, RT-PCR)：当扩增模板为RNA时, 需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。应用非常广泛, 无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。
（5）巢式PCR技术(NEST-PCR)：先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量, 然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带, 此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些, 且用量较少, 同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度, 这样在第一次PCR时, 由于较高退火温度下内引物不能与模板结合, 故只有外引物扩增产物, 经过若干次循环, 待外引物基本消耗尽, 无需取出第一次PCR产物, 只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤, 同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR，
主要用于极少量DNA模板的扩增。
（6）多重PCR技术(multiplex PCR)：在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消失。主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。
（7）重组PCR技术：重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中, 两对引物分别由其中之一在其5’-端和3’-端引物上带上一段互补的序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR 条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。（8）原位PCR技术：利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增，可进行细胞内定位，适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。
（9）荧光定量实时PCR技术
反应动力学
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升，最终DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算，Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n表示循环次数。平均扩增效率理论值为100%，但实际情况达不到，反应初期靶序列DNA 片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，此效应称平台期，与DNA聚合酶数量和活性、PCR扩增效率、非特异性产物的竞争等因素有关。
PCR扩增产物
可分为长产物片段和短产物片段两部分，短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短、长产物片段是由于引物所结合的模板不同而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是长产物片段。进入第二个反应周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（长产物片段）结合引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，故这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点、止点都限定于引物扩增的序列以内，形成长短一致的短产物片段。由于短产物片段是按指数倍数增加，而长产物片段则以算术倍数增加，故可忽略不计，使得PCR的反应产物不需再纯化既可以保证足够纯的DNA片段供分析、监测。
反应五要素---引物、模板、DNA聚合酶、四种dNTP、Mg2+（1）引物设计
①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，引物自身连续互补碱基不能超过3个，一对引物间也不易多于四个连续碱基的互补性。【引物的GC含量和Tm值应该协调：Tm=4（G+C）+2（A+T）】
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端为关键碱基，是PCR延伸的起始端，不能进行任何修饰，也不能形成二级结构的可能，一般3‘端也不能发生错配，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR 失败。 5’端无严格限制，只起限定PCR产物长度的作用，对扩增特异性影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
⑧引物量：每条引物的浓度～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
（2）DNA聚合酶：目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量 U/50 ml，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
（3）dNTP的质量与浓度：dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL的缓冲液将其PH调节到～，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。
（4）模板(靶基因)核酸：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。
（5）Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，
Mg2+浓度为～L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
RT-PCR -- 是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
总RNA提取（-70℃保存）
Trizol法：
1、取组织100㎎于玻璃匀浆器中，加入1ml Trizol 冰上抽打匀浆（边匀浆边暂停）
2、移入管中，颠倒混匀，室温保存5min
3、加氯仿（总体积的1/5），振荡混合，室温放置5min
4、4℃，离心12000 rpm，15min
5、取上层液相（约400μl）移入一新 EP管中，加等体积异丙醇（约400μl）,振荡混合，室温保存10min
6、4℃，离心12000 rpm，10min
7、弃上清液，加1ml 75%无水乙醇（4℃保存），振荡混合
8、4℃，离心7500 rpm，5min
9、弃上清液，室温放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥（不能完全干燥）
10、加20ul DEPC水至EP管中，在60℃孵育3-5min(或手握
3-5min),使RNA充分溶解（可保存在液氮或低温冰箱-70℃）测RNA浓度：走RNA变性电泳观察18s、28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值
调零：750ul DEPC水
测量：745ul DEPC水 + 5ul RNA
总RNA浓度= OD260×40×稀释倍数（150倍）ug/ml
= OD260×40×150 ug/ml
= OD260×6 ug/ul
A1/A2应在之间
注意：提取RNA的质量主要是要通过260/280的比值看是不是在左右，当OD260/OD280<时提示有蛋白或酚的污染，需要进一步纯化RNA；还要跑胶看看28s、18s、5s的三条带是不是清晰，一般质量好的RNA，28s:18s的亮度比例在2:1左右，最后一条5s的应该比较淡。
②逆转录RT（cDNA：一周内-20℃保存，长期-70℃保存）
RT反应体系：20ul体系
第一步：约20分钟
RNA抽提物 5μl Radome引物 2μl RNAsin μl
1、65℃ 15分钟
2、立即放入冰浴
第二步：约2小时
RNAsin μl
10mM dNTP 1μl
5× RT缓冲液 4μl
25mM MgCl2 4μl AMV 3μl
1、37℃小时
2、94℃ 5-10分钟
3、反应物保存于-20℃或进行PCR
③聚合酶链反应PCR(产物-20℃保存)
PCR反应体系：100μl体系
约小时约5小时
25mM MgCl2 2μl 3μl
10×PCR缓冲液 5μl 5μl
10mM dNTP 1μl 1μl
10pmol/μl上游引物μl μl
10pmol/μl下游引物μl μl
cDNA模板μl 5μl
ddH2O 34μl 30μl
Taq酶μl 1μl
轻质石蜡油 50μl 50μl
1、94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟为第一个步1个循环
2、94℃ 45秒，55℃ 40秒，72℃ 1分钟为第二步30/40个循环
3、72℃ 10分钟
4、取出后4℃保存，5分钟后-20℃保存或走电泳
④琼脂糖凝胶电泳：约小时
1、配制× TBE电泳缓冲液300 ml
2、配制凝胶浓度%（40ml ×TBE加胶），微波炉中火2分钟溶解胶，冷却至60℃加入溴乙锭2μl（10mg/ml的终浓度μ
g/ml），充分混匀
3、将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳
4、加样8μl PCR反应产物+2μl溴酚兰，空一格加DNA marker
5、电泳50-80V ，电场强度不宜高于5V/cm
6、在紫外灯下观察,DNA 存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存。
电泳缓冲液(5×TBE贮存液)：Tris 54g、硼酸、 EDTA
20ml 、加蒸溜水至1000ml。使用时，将5×TBE稀释10倍成×TBE就可以在电泳时使用(工作浓度)。
上样缓冲液(6×缓冲液，4℃保存)：%溴酚蓝、%二甲苯青FF、30%甘油
琼脂糖凝胶配制：（%）琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉加热至沸腾(如果首次煮胶，一定要煮透，以不出现泡沫为标志)，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min(可以放入4度冰箱加快琼脂糖凝固)后现进行电泳。%同上，将琼脂糖的量改为。
试剂：
1、DEPC水：吸出1ml DEPC放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配成1‰DEPC水，并充分振荡混匀备用。
2、75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存。(DEPC水需先高压，高压时注意：1.装DEPC水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；2.高压时间在40-45分钟，所以水要适当多加一点；3.高压结束后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出)。
3、异丙醇：放入棕色瓶中。
4、氯仿：放入棕色瓶中。
5、轻质石蜡油
Trizol：一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
DEPC：焦碳酸二乙酯，是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂
随机引物、Oligo(dT)、基因特异性引物：用于反转录的引物可视实验的具体情况选择
M-MLV、AMV（配10×RT-buffer）：逆转录酶
RNasin：RNA酶抑制剂
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（dATP、dGTP、dTTP、dCTP、dUTP）
Taq酶（配10×PCR-buffer、MgCl2）：DNA聚合酶
Primer（上游、下游）
Marker：是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA 分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。
附：TBE（Tris硼酸缓冲液）
引物设计步骤与要点
引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp. ③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 ④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm 应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5. ⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 3、用Oligo验证评估引物 ①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze 菜单中各种强大的引物分析功能了。
荧光定量PCR引物设计
荧光定量PCR引物设计专业的定量PCR设计软件beacon Designer 有时一对100分的引物扩增效率特别低换了一对貌似很烂的引物结果溶解曲线却长得很漂亮扩增效率也蛮高。个人认为这个跟你选择的位置有关看引物Tm值相差是否很高适当降低反应退火温度看看是否有效看所扩增片段GC含量以及产物Tm是否很高比方水稻基cDNA扩增常常用到GC buffer。看所用扩增基因是否为组织特异性表达看RNA是否完整是否降解反转录过程是否完整设好内参正对照最后所有这些都满足还是没扩增出来重新设计引物吧1设计的时候尽量靠近基因的3端这样能最大限度地保证扩增效率2尽量跨越内含子这样可以保证检测有无基因组污染3两条引物的Tm值不要相差太大4产物长度保证在80200bp之间最长300 bp。.如果想同时检测很多对基因的变化最好设计的时候记录下产物的Tm值这对你后面的实验设计读板温度很有帮助。保证在产物Tm80以上一般Tm80以下的峰都是引物二聚体对于水稻等GC含量比较高的基因组产物Tm不要高于94个人观点。如果同时检测很多对基因的表达量变化我会尽量调整所有产物的Tm值与内参产物的Tm相差不太大这样方便实验操作和最后的分析。3相对错配来说我认为dimer和harpin对realtime PCR的影响更大当然也别错配得太邪门了非来一条跟产物出峰在相同位置或者比产物峰还高的错配就死了引物的3端不要有错配。5一
般我们用Primer Premier设计软件我一般先让软件自动搜索正义链或反义链的引物找到一条评分是100的再在它左右合适的位置手动搜索有没有合适和它配对的评分也比较高的 引物一般5分钟之内可以搞定一个基因。实时定量PCR引物设计的具体要求1、引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性。最好位于编码区5端的300-400bp区域内可以用DNAMANAlignment软件看看结果。2、不能形成2级结构。 3、引物长度一般在17-25bp之间上下游引物不能相差太大。 4、GC含量在40-60之间45-55最佳。 5、碱基要随机分布尽量均匀。 6、引物自身不能有连续4个碱基的互补。 7、引物之间不能有连续4个碱基的互补。 8、引物5?6?7端可以修饰。 9、3?6?8端不可修饰而且要避开ATGC rich 的区域避开T/C A/G连续结构2-3个。10、引物3端要避开密码子的第三位。11、引物整体设计自由能分布5端大于3?6?7端。12、定量产物长度80-150bp最好最长是300bp。实时定量PCR完全手册方法简介所谓的实时荧光定量PCR 就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR 反应中引入了一种荧光化学物质随着PCR 反应的进行PCR 反应产物不断累计荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环收集一个荧光强度信号这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化从而得到一条
手把手教你PCR引物设计来自小木虫
PCR引物设计的黄金法则 1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 6. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过
PCR引物设计过程
PCR引物设计过程 （一）设计引物前应的准备工作： 1．准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分 2．对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用3．准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数 据及两种酶是否可以配用 （二）引物的结构：5’—保护碱基+酶切位点+引物配对区—3’1．两个酶切位点 2．酶切位点的保护碱基 3．5’端保护碱基 4．3’端保护碱基 5．引物配对区 （三）设计引物所要考虑的问题 1．酶切位点 两个酶切位点应是载体上的，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，否则往往导致两个酶都切不好。因此，两个酶切位点要紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点，最好隔四个核苷酸。且不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。2．酶的选择
最好使用双酶切效率高的，但两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切，最好使用具有共同buffer，且较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），这样可以省钱。 3．Tm的计算。 Tm是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA 的溶解是没有作用的。因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。设计引物的时候，先不管5'端的修饰序列，把互补区的Tm控制在55度以上（我喜欢控制在58以上，具体根据PCR的具体情况，对于困难的PCR，需要适当提高Tm），再加上酶切位点和保护碱基，这样的引物通常都是可用的，即使有小的问题，也可以挽回。 Tm温度高的引物就比较容易克服3’发卡、二聚体及3'非特异结合等问题。简单的计算公式可以用2+4的公式。若你计算的Tm值达到了快90 ，不包括酶切位点。引物公司给你发的单子是包括酶切位点的。自己可以再估计一下。如你设计了带酶切位点的引物，总长分别为29、33个碱基，去掉酶切位点和保护碱基，分别为17、21个碱基。引物公司给的单子是70多度，实际用的只有50度，用55度扩的结果也差不多。
QRT-PCR引物设计protocol
QRT-PCR引物设计 概述： 在QRT-PCR过程中，由于涉及到模板定量，所以要求引物特异性强，并且不能扩增出基因组DNA（如果用DNA酶处理干净另当别论），所以要求跨外显子设计（可以不用考虑基因组DNA污染），或跨内含子设计（检验DNA酶是否处理干净，即无基因组DNA污染）。下面是自己在设计过程的一些心得体会，与大家分享之！ 要求： 1.上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62℃之间，上下游引物的Tm值相差最好不超 过2℃。 2.GC=30-80%； 3.应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3’端最好不 为G或/和C。引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。 4.PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可 以延长至300 bp）； 5.要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在； 6.而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好 是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响； 7.至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都可以的； 8.关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公 开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用； 9.避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。 设计方案： I. 跨内含子设计方案（尽量不采用，如果方法II没有合适的引物，在考虑I） 1.上下游引物分别在两个外显子上，如下图所示，这样设计的引物可以检验是否有基因组DNA污染； FP II．跨外显子设计方案（尽量采用这种方案设计） 1.上游（A）或下游（B）或上下游引物（C）跨在两个外显子上，如下图所示，这样设计的引物不能从 基因组DNA扩增,从而消除基因组DNA污染的影响（这要求目的基因具有较多的外显子，从而有较多的选择，引物本身质量可能不好，同时注意：引物在两个外显子上分布，在“内侧”要少些，<8bp 左右）。
PCR扩增的原理和操作步骤
PCR扩增反应的操作 第一节PCR扩增反应的基本原理 一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成 PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。 PCR基本原理: 是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3'末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA 得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适2+等。反应时先聚合酶、MgdNTP溶液、耐热Taq DNA量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5'→3'方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。 1．模板DNA的变性 模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA 在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。 2．模板DNA与引物的退火 将反应混合物温度降低至37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA 模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显着短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为1～2min。3．引物的延伸 DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72℃条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40～60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的DNA 都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个
PCR技术(包含引物设计)
聚合酶链式反应（PCR） 原理： DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性 - 退火(复性）- 延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板 - 引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的?半保留复制链?，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR技术分类（常用） （1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA 序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，
荧光定量PCR引物设计说明
荧光定量PCR引物设计 专业的定量PCR设计软件：beacon Designer 有时一对100分的引物扩增效率特别低，换了一对貌似很烂的引物，结果溶解曲线却长得很漂亮～扩增效率也蛮高。个人认为这个跟你选择的位置有关 看引物Tm值相差是否很高，适当降低反应退火温度，看看是否有效 看所扩增片段GC含量以及产物Tm是否很高，比方水稻基cDNA扩增常常用到GC buffer。 看所用扩增基因是否为组织特异性表达 看RNA是否完整是否降解，反转录过程是否完整 设好参正对照 最后，所有这些都满足还是没扩增出来，重新设计引物吧， （1）设计的时候尽量靠近基因的3'端，这样能最大限度地保证扩增效率 （2）尽量跨越含子，这样可以保证检测有无基因组污染 （3）两条引物的Tm值不要相差太大 （4）产物长度保证在80～200bp之间，最长300 bp。.如果想同时检测很多对基因的变化，最好设计的时候记录下产物的Tm值，这对你后面的实验设计读板温度很有帮助。保证在产物Tm80以上（一般T =80以下的峰都是引物二聚体）， m 对于水稻等GC含量比较高的基因组，产物Tm不要高于94(个人观点)。如果同时检测很多对基因的表达量变化，我会尽量调整所有产物的Tm值与参产物的Tm 相差不太大，这样方便实验操作和最后的分析。 （3）相对错配来说，我认为dimer和harpin对realtime PCR的影响更大（当然，也别错配得太邪门了，非来一条跟产物出峰在相同位置或者比产物峰还高的错配就死了），引物的3'端不要有错配。 （5）一般我们用Primer Premier设计软件，我一般先让软件自动搜索正义链或反义链的引物，找到一条评分是100的，再在它左右合适的位置手动搜索有没有合适和它配对的评分也比较高的引物，一般5分钟之可以搞定一个基因。 实时定量PCR引物设计的具体要求
PCR的基本步骤及注意
（DNApolymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的（Thermusaquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂复制（类似PCR 前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年化学奖。 PCR原理 DNA的是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计，DNA 聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。 发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩扩增放大几百万倍。 [PCR反应体系与反应条件] 1.标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液10μl 4种dNTP混合物200μl 引物10～100μl 模板DNA ～2μg
PCR引物设计方法
如何设计PCR引物 查找目的基因序列并不能直接用于我们研究所用，因为查找到的基因序列只能算是基因的电子序列，并不是我们研究要用的现实中的序列，如何获得现实的基因序列呢？这就需要我们根据基因的电子序列来设计引物了，通过引物借助PCR方法才能获得我们的目的基因序列。接下来，我们(汉恒生物)将介绍一下PCR方法并讲述如何设计引物。 PCR（polymerase chain reaction），即聚合酶链反应，又称基因体外扩增技术，是由一对引物介导、能在体外对特定DNA 片段进行快速酶促扩增的技术。PCR能把很微量的遗传物质在数小时内扩增数百万倍达到检测水平．使原来无法进行分析和检测的许多项目得以完成。PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。 1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 2.避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 3.长度 寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T）Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。 4.G+C含量 G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 5.碱基随机分布
PCR引物设计原则
引物设计原则 https://www.wendangku.net/doc/9b4027312.html,/st50195/Info_11672.html 最近更新时间：2011年4月26日 提供商：上海沪宇生物科技有限公司资料大小：0K 文件类型：下载次数：0次 资料类型：浏览次数：61次 相关产品： 详细介绍： PCR引物设计的原则 引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度(primer length)，产物长度(product length)，序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用?G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构(duplex formation and hairpin)的能值，在错配位点(false priming site)的引发效率，引物及产物的GC 含量(composition)，等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点： 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
PCR的基本步骤及注意
DNA聚合酶（DNApolymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermusaquaticus）分离出来的。它的特性就在 于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应 用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。 PCR原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。 发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高 温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便 它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单 链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板 --引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对 与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延 伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一 个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 编辑本段[PCR反应体系与反应条件] 1.标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液10μl 4种dNTP混合物200μl 引物10～100μl
PCR引物流程设计详解
本文目的：复制出IL-4基因片段 一、查找基因序列 1、进入NCBI主页，下拉选框选择Nucleotide，在搜索栏输入要查找的目的基因，即IL-4，点击搜索 2、在搜索结果选择灵长类（Homo sapiens） 2、在灵长类IL-4基因中选择需要的mRNA序列 3、查看基因的相关信息 外显子区域 CDs区域 4、点击FASTA格式，并将序列保存到文档 二、使用primer premier设计引物 1、建立新文件，将所得的序列复制进输入框内 2、点击搜索按钮，搜索引物 3、设置引物设计参数（因为在之前查找基因序列的时候获知，外显子区域分别为：1-200、201-248、249-425、426-618，又知在引物设计时引物位置最好跨越一个内含子，PCR产物长度通常为100-150bp，故设定上游引物位置为201-248，下游引物位置为249-425，产物长度为100-150bp） 4、确认条件后，显示搜索结果 4、双击选中得分最高的引物查看引物情况 （上图为上游引物情况，下图为下游引物情况） 5、将设计的上下游引物复制出来，保存到文档中 三、使用oligo对设计的引物进行评价
1、建立新文件，将从cnki上获得的cDNA复制进输入框，并点击accept接收 2、接收后显示出该序列的相关信息 3、点击edit按钮录入用primer设计的上游引物，每一次输入新数据后都需要点击accept按钮接收 4、同理，录入下游引物 5、分析上下游引物二聚体形成情况 6、分析上下游引物发卡形成情况 7、分析上下游引物GC% 8、检测上下游引物与PCR模板其它位置错配情况 9、分析PCR整体情况 四、引物特异性检验（primer blast） 1、进入NCBI主页，并选择blast 2、选择primer blast 3、在输入框内输入模板序列和上下游引物，并设定对比数据库，点击primer进行对比get 4、查看blast结果 Blast结果显示，尽管IL-4与其它基因有相似区，但是引物的3’端没有完全互补。故设计的引物能特异性的扩增出目的基因
PCR技术克隆目的基因全过程
实验：目的基因克隆（PCR技术） 【课前预习】 PCR (polymerase chain reaction) 反应的基本原理。 【目的要求】 1．学习和掌握PCR 反应的基本原理与实验技术方法。 2．认真完成每一步实验操作，详细记录实验现象和结果并加以分析和总结。 【基本原理】 类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4 分钟，2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。【实验用品】 1．材料：重组质粒DNA作为模板 2．器材和仪器：移液器及吸头，硅烷化的PCR 小管，DNA扩增仪(PE 公司)，琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机 3．试剂： ①10×PCR 反应缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0％Triton X-100。 ②MgCl2 ：25mmol/L。 ③ 4 种dNTP 混合物:每种 2.5mmol/L。 ④Taq DNA聚合酶5U/μl。 ⑤T4 DNA连接酶及连接缓冲液：
引物设计和PCR经验
primer5和Oligo结合设计引物步骤及心得 一、引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence,出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp. ③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 ④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物重查看的包括：T m 值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面和下游引物的T m 列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 3、用Oligo验证评估引物