实验十一激素对血糖浓度的影响【目的】1.掌握血糖的测定原理及方法
实验十一激素对血糖浓度的影响
【目的】
1.掌握血糖的测定原理及方法。
2.掌握血糖的正常范围及意义。
3.熟记胰岛素及肾上腺素对血糖浓度的影响并解释其作用机制。
【原理】
人和动物体内的血糖浓度均维持在一定范围内。这是由于体内存在多种激素及调节物质，在它们的共同作用下，使糖酵解、糖氧化、糖原合成与分解、糖异生、脂肪合成与分解等代谢途径协同进行。胰岛素可通过以下几种途径降低血糖：①促进肌肉、脂肪细胞的载体转运葡萄糖人内；②抑制蛋白激酶A，继而使糖原磷酸化酶活性降低：激活糖原合酶脱磷酸酶，从而使糖原合酶活性升高，加速肌肉、肝脏的糖原合成；③通过第二信使间接激活丙酮酸脱氢酶，加速丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA；④抑制磷酸烯醇式丙酮酸激酶活性，促进氨基酸进入肌肉合成蛋白质，从而降低糖异生；⑤抑制脂肪动员，促进糖有氧氧化。肾上腺素的作用与胰岛素相反，起升高血糖的作用。肾上腺素升高血糖的作用迅速而明显，它通过与肝和肌肉细胞膜受体结合而激活磷酸化酶，产生级联放大效应，从而加快糖原的分解、肝释放葡萄糖、肌肉输出乳糖供肝糖异生等，最终导致血糖升高。
本实验观察家兔在注射胰岛素和肾上腺素前后空腹血糖浓度的变化。血糖含量的测定采用葡萄糖氧化酶法。首先用钨酸钠及盐酸沉淀血清中的蛋白质，制备血滤液。在葡萄糖氧化酶的催化作用下，血滤液中的葡萄糖被氧化成葡萄糖酸，并产生1分子过氧化氢；过氧化氢被偶联的过氧化物酶催化放出氧，氧将试剂中的4-氨基安替吡啉偶联酚(还原性氧受体)的酚氧化，生成红色的醌类化合物，其颜色深浅与葡萄糖的含量成正比，此溶液与经同样处理的标准葡萄糖溶液进行比色测定，即可求出血糖含量。
葡萄糖氧化酶
葡萄糖——————>葡萄糖酸+H202
过氧化物酶
H20——————>H20+02
O2+4-氨基安替吡啉偶联酚——————>醌类化合物（红色）
葡萄糖氧化酶法测定血糖的特异性较高，能干扰测定结果的物质较少，如溶血样本血红蛋白浓度达lOg／L、黄疸样本胆红素浓度达342Um以及样本中所含的少量尿素、肌酐、甘油三脂等均不影响测定结果。
人空腹血糖正常范围约为3.9-6.1mM(70~110mg／d1)。
糖尿病、颅内高压等可引起血糖升高，胰岛细胞增生或癌瘤可使胰岛素分泌过多，导致低血糖。
【器材】
仪器：台秤、5415D型离心机、恒温水浴箱、TU—1800分光光度计、吸量管、比色杯、大试管、可调式移液器、
耗材：家兔两只(体重2~2.5kg)、一次性注射器及针头、一次性小试管、2mlEp管、200ul 吸头。
【试剂】
1、3.8％柠檬酸钠(抗凝剂)
柠檬酸钠 3．8g
加H20 定容至100ml
2、肾上腺素(1mg／m1)
3、胰岛素(40U／m1)
4、蛋白沉淀剂
无水磷酸氢二钠 10g(O.07mM)
钨酸钠 10g(32mM)
1M盐酸 125ml(125mM)
加H20 定容至1000ml
5、标准葡萄糖原液(1m g/m1)
准确称取葡萄糖1g
0.2％苯甲酸溶液定容至1000ml
充分混匀，置于4℃冰箱保存，此液甚稳定。
6、标准葡萄糖应用液（0.05mg/ml）
取标准葡萄糖溶液10ml
加H20 定容至2000ml 充分混匀。
置于4℃冰箱保存，0.2％苯甲酸稀释液可在室温下长期保存。
7、酶酚混合试剂(又称血糖单一试剂，公司购买)
8、75％酒精
9、二甲苯
【操作】
1—3步全班可只做一份
1.取正常家兔两只，实验前预先饥饿16小时，称重。
2.耳缘静脉取血：去毛，用75％酒精擦耳缘静脉，使血管充血(亦可用二甲苯擦拭以达到扩张血管的目的)。分别用一次性注射器耳缘静脉取血2ml，分别置于含抗凝剂的一次性试管
中(每m1全血约加0.15ml 3.8％柠檬酸钠)，边收集边混匀，以防凝固。用干棉球压迫血管止血。一次性试管标明胰前、肾前。
3.注药：取血后，于家兔腹部皮下注射药物。其中一只注射胰岛素，剂量为每公斤体重1.5U(1.5U／kg)；另一只注射肾上腺素，剂量为每公斤体重0.4mg(0.4mg/kg)，并记录注射时间，30分钟后再取血，置于标有胰后、肾后标记的一次性试管中，混匀备用。
4.血滤液制备(四人一组)：取4支2.0mlEp管，分别标明胰前、肾前、胰后、肾后。每支离心管中，加入蛋白沉淀剂1.9ml，分别加入全血0.1ml。充分混匀，室温静置5分钟。10000rpm，离心2分钟。将上清(血滤液)分别转移至1.5ml Ep管中备用，同样标明胰前、肾前、胰后、肾后。
5.血糖测定(两人一组) ‘
1) 取大试管6支，按下表操作(单位：m1)：
2) 混匀，37℃水浴保温15分钟；冷却后，于505nm测定各管光密度值。
3) 计算血糖浓度：
计算出注射胰岛素后血糖降低百分率和注射肾上腺素后血糖升高百分率。
【结果及分析】
【注意事项】
1.注意取血方向，因静脉是回心血，取血时针头应向着耳尖方向，并从近心端开始。
2.注药时不要将针头扎入脏器、大血管、或膀胱。
3.血糖测定时，各管应同时加入酶酚混合试剂，避免因反应时间不同而丧失可比性。
【思考题】
1.制备血滤液的目的是什么?
2.为何要使家兔预先饥饿?
3.为何临床上可用血清作为测定血糖的样本?在检测时应注意什么?
4.酶酚混合试剂中含有哪些酶?它们的作用各是什么?