考马斯亮蓝法测蛋白质含量
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量
一、标准曲线
一般用分光光度法测物质得含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质得含量。因此,制作标准曲线就是生物检测分析得一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法
1、凯氏定氮法
2、双缩脲法
3、Folin-酚试剂法
4、紫外吸收法
5、考马斯亮蓝法
三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作
(一)、试剂:
1、考马斯亮蓝试剂:
考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0、01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4、7%(W/V)乙醇,8、5%(W/V)H3PO4。
2、标准蛋白质溶液:
纯得牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0、15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
(二)、器材:
1、722S型分光光度计使用及原理()。
2、移液管使用()。
(三)、标准曲线制作:
1、
2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug),在坐标轴上绘制标准曲线。
1)、利用标准曲线查出回归方程。
2)、用公式计算回归方程。
3)、或用origin作图,测出回归线性方程。即A595nm=a×X( )+6
一般相关系数应过0、999以上,至少2个9以上。
4)、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上得点应该在直线两侧。
(四)、蛋白质含量得测定:
样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品得A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品得A595nm值在0、1—0、05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算。
(五)、注意事项:
1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥,避免温度变化。
4、对照:用被测物质以外得物质作空白对照。
药品得配制(磷酸缓冲液得配制)
一、药品得配制步骤
(一)、实验准备:
1、准备所需得药品与玻璃仪器。
2、洗涤。(怎样洗涤算干净？)
(二)、计算:
1、百分比浓度计算:
1)、G/V比
例如配1% NaCl,称1g NaCl溶于100ml 水。
2)、V/V比:
例如配75%乙醇100ml,75%×100%=100%×X, X=75ml。取75ml无水乙醇,加25ml蒸馏水。
乙醇:乙醚:丙酮=2:1:2配500ml,各取200 ml,100 ml,200 ml混合。
3)G/V比:用得较少,如计算灰分中某种元素如Fe得含量。
2、摩尔浓度计算:注:药品得分子量一般在标签中注明。
1)、0.1M或0、1mol/L NaCl配100ml。
M=质量/体积(L)称取NaCl0、1×0、1×40=0.4g 摩尔数=G(g)/摩尔质量2)、0、1mMNaCl配100ml
mM=毫摩尔数/体积(L) 称取NaCl0、1×0、1×40=0.4g
毫摩尔数=G(mg)/摩尔质量
3)、0、1uNaCl配100ml
mM=微摩尔数/体积(L) 称取NaCl0、1×0、1×40=0、4mg
微摩尔数=G(ug)/摩尔质量称取NaCl0、1×0、1×40=0、4ug
3、混合溶液配制得计算:
如配3uMEDTA,2.25mM NBT以及60uM 溶液100ml,用50mM磷酸缓冲液配制。
注意:1、分别标定体积计算
2、分别配制再混合,但总体积不能为100ml
(三)、标量:
1、根据需要选择不同量程得天平根据要求去不同精度得测量器,如量筒或移液
管。
2、电子分析天平得使用。
(四)、溶解:
1、根据药品配置要求选择溶剂。蒸馏水,双蒸水,无离子水等。
2、只能用烧杯溶解。注意加入溶剂只能加入总体积得2/3左右,剩余溶剂洗涤烧
杯三次左右,直到洗涤干净。
小常识:药品标签中一般标识有药品得溶解性能与分子式,可根据分子式与所学得常识判断药品得结构与性质特点(包括溶解性质)。
如酸碱两性物质得配制(AA、蛋白质、核苷酸等)如果溶解性能不好可以用稀酸或稀碱促进溶解,但pH应在被要求得范围内。
3、加热促进溶解,但注意应在配制得范围内有得药品还需水溶加热较好。如:配
0、1%得淀粉,水裕加热(温度在80-90。C),过量会糊化。
(五)、定容:
1、用容量瓶定容;
2、用玻璃棒引流或用小漏斗;
3、用溶剂加入到接近刻度,然后用滴管加入到刻度。要求刻度与液体凹面相切为
止(眼睛可视);
4、上下窑洞容量瓶几次,混合均匀即可。(注意不再定容了,防止溶液漏掉。)
(六)、装入试剂瓶,贴上标签。
标签应注明以下内容:药品浓度、名称、配制人、配制日期等。
(七)、清理实验场所。
二、磷酸缓冲液得配制。
(一)、配制0、2mol/L即0.2M pH=6、8得磷酸缓冲液。用磷酸氢二钠—磷酸二氢钠做缓冲液。
选用药品:Na2HPO4·12H2O(碱)与NaH2PO4·12H2O(酸)配缓冲液100ml。书中说明。
(二)、计算:
1、注:书中有注明配置得量。
2、计算:Na2HPO4·12H2O称取71、64×0、1=7.164g
NaH2PO4·12H2O称取31、21×0、1=3.121g
3、含有不同结晶水得换算。
书中配1/15mol/L得缓冲液配1L,书中用Na2HPO4·2H2O需要11.87g/L但用Na2HPO4·12H2O需多少g？
11、87=(178/358)×X,X=23.87g。
(三)、分别配制缓冲液各100ml(根据需要确定配制得量)。
即:0.2M Na2HPO4·2H2O与NaH2PO4·2H2O100ml。
(四)、按书中得量配制取量再混合。
如:pH=6、8,分别去缓冲对49ml与51ml。
(五)、用pH试纸ceni索赔得缓冲液得pH值,检测配置就是否准确。
(六)如配50mM pH =6、8得缓冲液100ml ,以您配制得母液稀释即可。
计算:50×0、1=0、2×1000×X (L);X =0.025L;
取0.2M pH=7、2得缓冲液25ml,用蒸馏水定容至100ml即可。