水通道蛋白1、3在糖尿病心肌病大鼠心肌组织的表达及意义
水通道蛋白1、3在糖尿病心肌病大鼠心肌组织的表达及意义
（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
作者：王海英高宇高长斌王清
【摘要】目的探讨水通道蛋白1、3 (AQP1、3)在糖尿病心肌病状态下的表达及生理作用。方法取糖尿病心肌病模型大鼠心肌组织及正常大鼠心肌组织，应用免疫组织化学方法检测AQP1、AQP3 在心肌组织中的表达及分布。结果AQP1、AQP3广泛分布于正常及糖尿病心肌组织中，糖尿病心肌较正常心肌的免疫组化阳性指数有所降低(P0.05)。结论AQP1、3在糖尿病心肌病心肌组织中的表达较正常组织降低，可能在糖尿病心肌病的发生和发展中发挥重要的生理作用。
【关键词】水通道蛋白;糖尿病心肌病;心肌
水通道蛋白(AQPs)是与转运水有关的一系列具有同源性的内在膜蛋白家族，广泛存在于动植物和微生物中，在机体不同组织和部位执行着不同的生物学功能。AQP家族成员在泌尿、呼吸、神经、消化等系统的组织定位和生理功能研究已取得了一定进展〔1，2〕，但
AQPs在心肌组织的研究甚少，尤其在糖尿病心肌病状态下的表达和生理功能缺乏系统研究。本研究在建立糖尿病心肌病大鼠模型基础上，通过检测AQP1、3在心肌组织的表达，进一步了解AQP1、3与糖尿病心肌病的关系。
1 材料与方法
1.1 动物与主要试剂雌性4周龄Wistar大鼠60只，体重(200±10)g，购自吉林大学实验动物中心。链脲佐菌素(STZ )购自美国Sigma 公司;心肌酶试剂盒、即用型SABC试剂盒购自北京中山生物科技股份有限公司;AQP1、3兔抗大鼠多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。
1.2 方法
1.2.1 大鼠糖尿病心肌病模型复制60只大鼠随机分为糖尿病大鼠(DMR，35只)和正常大鼠(CTR，25只)。参照文献方法〔3〕，DMR给予高糖高脂饲料(10%猪油、20%蔗糖、70%常规饲料)喂养,4 w末给予STZ 25 mg/kg (用枸橼酸钠缓冲液溶解，pH4.5)腹腔注射，每周重复1次，再连续4 w，CTR仅给予枸橼酸钠缓冲液(pH4.5)腹腔注射，末次血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病模型动物。DMR继续高糖高脂饲料再喂养6 w。
1.2.2 生化指标测定血糖使用强生血糖仪经尾静脉采血测定。心肌酶〔天冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸磷酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)〕由全自动生化分析仪测定，按试剂盒说明书进行操作。
1.2.3 心肌组织病理学检查按照常规病理学方法进行固定、包
埋、切片，将切片作HE染色。
1.2.4 心脏组织免疫组织化学染色标本以4% 多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片。石蜡切片用梯度酒精脱蜡至水后，0.01 mmol/L PBS洗2次，滴加3%过氧化氢，室温孵育10 min，PBS洗3次，切片置修复液中微波炉加热10 s，PBS洗2次。滴加封闭液，置于湿盒中封闭60 min，分别加入1∶100稀释的AQP1、3多克隆抗体(Ⅰ抗)，4℃过夜。用PBS洗3次后滴加SABC试剂免疫组化染色，DAB 显色，苏木素轻度复染，封片。阴性对照组用未被免疫的兔血清1∶200稀释，替代Ⅰ抗，余步骤同上。所有切片在光学显微镜下观察，取染色良好(阳性细胞染色清晰、背景染色很低)的组织切片进行照相，并在低倍镜下找到阳性细胞较为密集的区域，图像分析系统测量AQP1、3阳性产物面积及阳性产物强度灰度值，然后将上述数值依据赵景民等〔4〕的方法转化成免疫组化阳性指数，即:免疫组化阳性指数=阳性面积/测量组织面积×阳性强度灰度值，取其平均值(x±s)作为阳性细胞表达率。
1.2.5 判定标准AQP1、3阳性细胞以细胞核和细胞质染成棕黄色为阳性结果。
1.3 统计学处理使用SPSS10.0软件，计量资料以x±s表示，采用t检验，进行组间比较。
2 结果
2.1 心肌酶的变化第14周末检测血清CK、LDH、AST的水平，DMR组血清CK、LDH、AST的水平均显著高于CTR组(P0.01)。
见表1。表1 两组大鼠血清心肌酶的变化(
2.2 心肌组织的病理组织学变化CTR组心肌纤维、心肌细胞排列整齐，细胞核大小均一，胞浆染色均匀。DMR组心肌细胞排列紊乱，细胞核大小不规则，纤维断裂，部分胞浆浓缩深染。见图1。
2.3 AQP1、3在心肌分布的变化AQP1 在CTR组的心肌组织主要分布于血管内皮细胞、心肌细胞的胞膜上，以血管内皮细胞最为明显;在DMR AQP1的特异性染色明显减少。AQP3 在正常大鼠心肌中分布于心肌细胞的胞膜上，在糖尿病心肌中较正常心肌的特异性染色明显减少。见图2。
2.4 免疫组化阳性指数比较DMR组心肌组织血管及上皮细胞AQP1表达的阳性指数较正常心肌组织明显减少，两组比较有显著性差异(P0.05);DMR组心肌组织血管及上皮细胞AQP3表达的阳性指数较正常心肌组织有所减少，两组比较有统计学差异(P0.05)。见表2。表2 两组大鼠免疫组化阳性产物强度灰度值及阳性指数的比较
3 讨论
糖尿病心肌病是糖尿病引起心脏微血管病变和心肌代谢紊乱所致的心肌广泛局灶性坏死。本研究首先建立2型糖尿病心肌病模型，观察到糖尿病造模成功后6 w处死的糖尿病大鼠较正常大鼠心肌酶明显升高，心肌细胞有损害，心肌的形态学观察结果显示呈现早期心肌病的改变，说明已成功建立糖尿病心肌病模型。
AQP1是第1个被鉴定的AQP，分布几乎遍及全身各组织，是惟一在内皮细胞表达的水通道，主要与水的转运和腺体的分泌有关;
而AQP3在许多组织的上皮细胞基底膜也有较强的表达〔5〕。本研究通过免疫组化方法，证明心肌组织中存在AQP1、3的广泛分布，AQP1在正常心肌主要分布于血管内皮细胞、心肌细胞的胞膜上，以血管内皮细胞最为明显，而AQP3分布在心肌细胞的胞膜上。
糖尿病心肌病的发病机制复杂，尚未完全阐明。近年来炎症学说备受关注，认为2型糖尿病是自身炎症性疾病，先天免疫系统的激活可能是2型糖尿病和动脉粥样硬化发生的共同机制之一〔6〕。有研究表明，炎症反应时TNFα和干扰素γ等致炎细胞因子表达增加，会影响AQPs的表达，造成细胞膜水通透增加，引起细胞水肿变性〔7〕。本实验通过两组大鼠免疫组化阳性产物强度灰度值及阳性指数比较，结果表明AQP1、3在糖尿病心肌病心肌中较正常心肌的表达明显减少，为进一步研究AQPs与糖尿病心肌病发生、发展的关系提供了理论基础。
【参考文献】
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6 朱大龙.炎症与2型糖尿病〔J〕.中国糖尿病杂志，2006;14(1)：735.
7 Jennifer E,Kevin S,Carissa M.Decreased expression of aquaporin(AQP)1 and AQP5 in mouse lung after acute viral infection〔J〕.Am J Respir Cell Mol Biol,2000;22(1):3444.