IFA

间接免疫荧光试验主要试剂与配方

(1) 透化液：含0.5 % TritonX-100的0.1 mol/L PBS (pH 7.2)；

(2) 封闭液(50 mL)：含10% 正常羊血清、5%BSA的0.1 mol/L PBS (pH 7.2)；

(3) 固定液：4%多聚甲醛；

(4) 清洗液：含0.5%的Tween-20 的0.1 mol/L PBS (pH 7.2)；

(5) 抗体稀释液：用封闭液或0.1 mol/L PBS (pH 7.2)稀释；

(6) 封片液：荧光抗猝灭剂。

参照李艳红等[7]的方法进行。

（1）取2 μL家蚕微孢子虫（1×108 个/mL）于1.5mL离心管中，取30-50uL 4 °C保存的4%的多聚甲醛将孢子悬起，固定10~15 min；

（2）3000rpm离心5min，去除残留液体，用清洗液洗三次，每次5min；

（3）加入透化液30-50uL，混匀，室温放置20-30min；

（注：不同的处理时均在固定后进行。碱处理---采用的是0.1M NaOH 于28°C水浴孵育30min，300rpm离心5min，弃上清，用清洗液清洗三次以上；孢子空壳的处理---按照发芽结合密度梯度离心法进行[8]）

（4）3000rpm离心5min，去除残留液体，用清洗液洗三次，每次5min；

（5）加入50uL 封闭液，混匀，室温放置60min，期间注意避免沉淀；

（6）3000rpm离心5min，去除残留液体，用清洗液洗三次，每次5min；

（7）将抗体经封闭液1:500稀释后，加入离心管中，混匀，室温放置60min，期间注意避免沉淀；

（8）3000rpm离心5min，去除残留液体，用清洗液洗三次，每次5min；

（9）加入10~20 μL的FITC标记的和Alexa647标记的二抗（工作浓度V/V=1: 100），混匀，室温放置60min，期间注意避免沉淀；

（10）3000rpm离心5min，去除残留液体，用清洗液洗五次，每次5min；

（11）滴加DAPI室温染色20~30 min；

（12）加入5-10uL封片液，取1uL均匀涂于载玻片，待其接近干燥盖上盖玻片。置荧光显

微镜下观察，同时设阴性对照。