酶切体系及PCR体系

酶切反应体系

1．反应体系尽可能的小。

2．酶切缓冲液为整个体系的十分之一，本实验室内切酶为NEB公司，缓冲液的选择，可参照该公司的使用说明。

3．内切酶的用量为反应体系的十至二十分之一（若为双酶切，则两种酶的总量占总反应体系的十至二十分之一），酶用量过大可能反而不利于酶切（因为内切酶中含有甘油）。4．DNA总量不宜大于2-3ug，否则在进行琼脂糖凝胶电泳时，会产生拖尾现象。

5．一般酶切温度为37℃水浴1-2h (小样鉴定1-2h，如要酶切回收，应切5-8h,特别是单酶切的载体，一定要切全,还应加去磷酸酶1-2h)。

6．一般小样鉴定为20ul总体系（酶一般用0.5ul），酶切回收为50-100ul总体系(酶一般用2-3ul，酶切3-4h后，可补加酶1ul)。

7．一般65℃水浴15分钟，灭活内切酶（也可不灭或，因为加入溴酚蓝后酶就失活了）。8．用0.8-1.2%的琼脂糖凝胶电泳。

PCR反应体系

1．反应体系一般为20-25ul

2．摸板：菌液2-5ul,质粒0.5-1ul,病毒DNA3-5ul

3．引物：25umol/l 各0.5ul

4．dNTP : 0.5ul

5．10X Buffer: 如含Mgcl2的为总体系的十分之一（2-2.5ul）,如不含Mg cl2，应加入Mgcl2溶液1.5ul

6．Taq酶：0.5ul

7．加入Milli Q水，补齐至20-25ul

PCR参数

1．95-96℃3-5 min

2. 95-96℃30-40 Sec

3. (TM-5℃)一般为45-60℃30-40 Sec

4．72℃ 30-180 Sec（一般一分钟为1000个碱基）5．72℃链延伸10 min

6. 10℃保存

以上只用于普通PCR，一般为鉴定用。

KOD-Plus PCR反应体系

1．应体系一般为50ul

2．摸板：菌液2-5ul,质粒0.5-1ul,病毒DNA3-5ul 3．引物：25umol/l 各1-1.5ul

3．2 mM dNTP s : 5ul

4．KOD-Plus Buffer: 为总体系的十分之一5ul 5．KOD-Plus酶：1ul

6．25 mM MgSO45ul

7．加入Milli Q水，补齐至50ul

PCR 参数：

变性：94℃2-4 min

94℃15-30 Sec

结合：（TM-5℃），30-40 Sec 延伸：

68℃, 1 min/Kb

68℃, 10 min

保存：10℃30h

以上用于PCR回收基因，或GC含量较高的基因。