白假丝酵母菌伪足现象的鉴定

白假丝酵母菌

选题的目的和意义： 白假丝酵母菌为机会致病菌，存在于人的皮肤，口腔，上呼吸道，阴道及皮肤黏膜。当机体免疫力下降或长期使用抗生素引起的菌群失调等情况出现时，可引起皮肤、黏膜感染，内的染所致疾病的困难程度日益增大。[2]。白假丝酵母菌有两种生长状态，游离状态和生物膜状态。生物膜是一种粘附于生物或非生物表面的微生物菌落，它们包裹于自身产生的细胞外基质中，是微生物在生长过程中为适应生存环境而形成的一种于浮游细胞相对应的存在形式[1]。感染白假丝酵母菌后多有生物膜的形成。生物膜细胞对多数抗真菌药物有明显的耐药性，因此由白假丝酵母菌感染引起的疾病已构成临床医生和患者棘手的问题【3】。 壳聚糖是氨基多糖的天然高分子物质，壳寡糖(COS)是壳聚糖的降解产物。与壳聚糖相比，壳寡糖分子量小、易溶于水，极易被人体吸收。因此壳寡糖具有更独特的功能性质和生物活性。抗菌作用是壳寡糖的主要生理功能之一。 本次实验就是来研究壳寡糖对白色念珠菌游离菌和生物膜菌的杀菌作用，以降低临床中真菌感染后难以治愈的困难。 实验方案： 1材料与方法 1.1 菌株分离、培养、鉴定及细菌悬液的制备取疑似真菌感染患者的分泌物（100例），直接涂片革兰染色，镜下观察并初步鉴定；标本立即接种于沙堡琼脂培养基，挑取可疑菌落涂片，革兰染色确认为酵母样真菌后，转种CHROMagar白假丝酵母菌显色培养基，翠绿色为白假丝酵母菌。从沙氏培养基上挑取单菌落实验菌株接种在YPD液体培养基上，37℃摇床培养24h,收集对数期生长状态的细胞，用PRMI-1640培养液配置浓度为1×107cell/ml，OD520nm=0.38的菌悬液。[4] 1.2 壳寡糖溶液取平均相对分子质量为2000的壳寡糖，将壳寡糖溶于无菌蒸馏水分别配成浓度为 2.5、5、10、20、40g/L的溶液，高压消毒后备用。 1.3配制菌液：将100μL10％牛血清PRMI-1640培养液加入无菌6孔板中，37℃孵育24h，无菌PBS冲洗3遍。加入100μL标准悬菌液，对照组加入等体积培养液，37℃培养2h,无菌PBS冲洗3遍，洗去未粘附细胞。【5】 1.3.2 壳寡糖对白假丝酵母菌的抑制试验：在六孔板(2号）1-5孔中加入48h培养后的生物膜，然后加入3ml分子量为2000的壳寡糖溶液，浓度依次为2.5、5、10、20、40g/L,第6孔加入3ml无菌蒸馏水。作用时间为30min,弃去壳寡糖溶液，用无菌蒸馏水冲洗三次。加100μLPRMI-1640，每孔加入10μLCCK-8，避光容器内孵育2h后用酶标测450nm下的OD值。【6】 再次取一个新的六孔板（3号），操作如上，将生物膜换成2h培养得到的游离菌。 预期结果： 病原菌分离培养结果：可以分离出白假丝酵母菌,出现表面光滑，带有浓厚酵母气味的典型类酵母菌落。 壳寡糖对白假丝酵母菌的抑制试验:比较两组中1-5孔和第6 孔的OD值，可明显看出6号孔OD值大于1-5的OD值，说明壳寡糖对白假丝酵母菌生物膜的形成有抑制作用 研究现状：綦成、张春燕、亓庆国[1]对白色念珠菌进行了生物膜形成的定量分析和形态学观察，实验表明，白色念珠菌可以在玻片上形成典型的城市的生物膜结构，形成过程经过了

酵母菌的分离纯化

酵母菌的分离纯化-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN

酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵 第一部分酵母菌的分离纯化 一、实验目的 应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。 二、实验原理 酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为酵母菌生长迅速，容易分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。 三、器材和用品 1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。 2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。分装三角瓶；试管斜面1支/组 3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为左右，再分装试管9ml2支/组。 4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等。 四、实验方法 1、接种：取果皮（不需冲洗）或土壤5克，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h，可见培养液变浑浊。 2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1m l，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h。 3、镜检：用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液，混合均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原，故菌体不着色。 4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。 5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分

单味中药抑制白假丝酵母菌作用的研究进展

（1.浙江中医药大学，浙江杭州 310053；2.浙江中医药大学第二附属医院，浙江杭州310005） 摘要：外阴阴道假丝酵母菌病的高发病率、高复发性、西药耐药现象以及药物的不良反应日益增加，因此临床上急需寻找一种对白假丝酵母菌有独特性抑制作用的新药。就单味中药抑制白假丝酵母菌作用的研究作一综述。 关键词：单味中药；白假丝酵母菌；外阴阴道假丝酵母菌病 中图分类号：r285.5文献标识码：a文章编号：1673-7717（2011）03-0580-02 progress in the study of single chinese herb inhibiting candida albicans zhou xiao-mei1,ning yu-mei1 （1.zhejiang chinese medical university，hangzhou 310053，zhejiang，china； 2.the secondafiliated hospital of zhejiang chinese medical university， hangzhou 310005 ， zhejiang，china） 收稿日期：2010-10-09 基金项目：浙江省中医药科技计划项目（2004c055） 作者简介：周笑梅（1984-），女，浙江瑞安人，硕士研究生，研究方向：妇科肿瘤宫颈疾病研究。 通讯作者：宁玉梅（1965-），女，河南人，主任医师，硕士研究生导师，研究方向：妇科肿瘤宫颈疾病研究。 白假丝酵母菌亦称白色念珠菌，是人体的正常菌群,也是常见条件致病性真菌。近年来,随着放疗、化疗、免疫抑制剂及广谱抗菌素的广泛应用等,极易造成免疫功能低下者体内环境平衡紊乱,菌群失调,使白假丝酵母菌感染呈上升趋势,已跃居真菌感染的第一位。为此,白假丝酵母菌感染的治疗引起国内外学者的高度关注。 外阴阴道假丝酵母菌病（vulvovaginal candidiasis,vvc）是由假丝酵母菌引起的最常见的外阴阴道炎，其病原体80%～90%是白假丝酵母菌。目前临床上治疗此病的西药虽然疗效确切，但是日益严重的耐药现象、复发率的逐年上升以及现有药物的不良反应等仍然困扰着诸多临床工作者。中草药在抗白假丝酵母菌感染的预防和治疗中的应用克服了上述问题,因此探讨有效的中药对白假丝酵母菌抑制作用有重要意义，并为白假丝酵母菌感染的治疗提供有益的线索。本文就国内外学者对单味中药抑制白假丝酵母菌作用的研究作一综述。 1 中医病因病机 外阴阴道假丝酵母菌病归属于中医“阴痒”、“带下”的范畴。先代各家对其病因病机、治疗方法均有详实的论述和较为丰富的临床治疗经验。隋?巢元方在《诸病源候论?妇人杂病诸候》详述了阴痒的病因病机，内为脏气虚，外为风邪虫食所为。《傅青主女科?带下》认为“带下俱是湿证”。现代学者认为该病是由于外内二因共致,外因为寒湿外袭,阻滞带脉,带脉失约,流注下焦;内因为脾肾两虚,运化失职,湿浊内留,蕴而生菌。又认为其常因脾虚不运,湿浊内生,下注会阴,湿蕴化热;或外感湿热之邪,循经下注,侵蚀阴中所致。总而言之，湿浊下注为病机关键。治当清利湿热，杀虫止痒。 2 单味中药抑制白假丝酵母菌作用的分述 2.1 黄芩中药黄芩为唇形科植物黄芩的干燥根味苦，性寒，归肺胆脾大肠小肠经，其主要有效成分为黄芩苷。中医认为黄芩具有清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎等功效。 我国的研究人员对黄芩苷抗白假丝酵母菌作用机制做了很多的研究［1-4］。熊英等应用同位素掺入技术表明，黄芩苷对白假丝酵母菌标准株及从临床白念珠菌性阴道炎患者的宫颈

生物化学实验五 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定

实验五酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 一、目的要求 学习和掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法；了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 二、实验原理 酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 三、器材与试剂 1〉材料 酵母粉。 2〉器材 乳钵、150ml锥形瓶、水浴锅、量筒、吸管、洗耳球、漏斗、滴管、试管、试管架、烧杯、离心机、滤纸、试管夹。 3〉试剂 (1) 0.04mol/L氢氧化钠溶液。 (2)酸性乙醇溶液：将0.3ml浓盐酸加入30ml的乙醇中。 (3)95%乙醇。 (4)乙醚。 (5)

1.5mol/L硫酸溶液。 (6)浓氨水。 (7) 0.1mol/L硝酸银溶液。 (8)三氧化铁-浓盐酸溶液： 将2ml 10%三氧化铁溶液(用FeCl 3·6H 2O配制)加入到400ml浓盐酸中。 (9)苔黑酚乙醇溶液： 溶解6g苔黑酚于100ml 95%乙醇中。 (10)定磷试剂。 a.17%硫酸溶液： 将17ml浓硫酸(比重 1.84)缓缓加入到83ml水中。 b. 2.5%钼酸铵溶液：将2.5g钼酸铵溶于100ml水中。 c.10%抗坏血酸： 将10g抗坏血酸溶于100ml水中，储于棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄色或棕色则失效。 临用时将上述3种溶液与水按比例混合：17%硫酸溶液︰ 2.5%钼酸铵溶液︰10%抗坏血酸︰水=1︰1︰1︰2(体积分数)。

四、实验步骤 1〉RNA提取 将10g酵母悬浮于90ml 0.04mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150ml 锥形瓶中。在沸水浴上加热30min后，冷却。(3000r/min)离心10分钟，将上清液缓缓倾入30ml酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，(3000r/min)离心5分钟。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次，每次10ml。乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至漏斗中过滤。沉淀即为粗RNA，可在空气中干燥。作鉴定或测定含量用。 2〉鉴定 取200mg提取的RNA，加入 1.5mol/L硫酸溶液10ml，在沸水浴中加热10min制成水解液并进行组分的鉴定。 (1)嘌呤碱： 取水解液1ml加入过量浓氨水，然后加入约1mL 0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。 (2)核糖： 取一支试管加入水解液1mL、三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液 0.2ml。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。 (3)磷酸： 取一支试管，加入水解液1ml和定磷试剂1ml。在沸水浴中加热10min，观察若溶液变成蓝色，说明有磷酸存在。 五、结果处理

实验 酵母RNA的分离及组分鉴定

※实验六酵母RNA的分离及组分鉴定 【实验目的】 了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 【实验原理】 酵母核酸种RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 鉴定依据：磷酸与定磷试剂反应产生蓝色物质。核糖与苔黑酚作用产生绿色物质。嘌呤碱与硝酸银能产生白色的嘌呤碱银化合物沉淀。 【实验器材】 150 ml锥形瓶、水浴、量筒、漏斗及抽虑瓶、吸管7、滴管8、试管及试管架9、烧杯、离心机、漏斗 【试剂和材料】 1、0.04 mol/L氢氧化钠溶液； 2、酸性乙醇溶液：将0.3毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中； 3、95%乙醇； 4、乙醚； 5、1.5 mol/L硫酸溶液； 6、浓氨水； 7、0.1 mol/L硝酸银溶液； 8、三氯化铁浓盐酸溶液：将2 ml 10% 三氯化铁溶液（用FeCl3·6H2O配制）加入到400 ml浓盐酸中； 9、苔黑酚（地衣酚）乙醇溶液：溶解6 g苔黑酚于100 ml 95% 乙醇中（可在冰箱中保存一个月）； 10、定磷试剂：（1）17% 硫酸溶液：将19 ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加入到83 ml 水中（2）2.5% 钼酸铵溶液：将2.5 g钼酸铵溶于100 ml水中（3）10% 抗坏血酸溶液：10 g抗坏血酸溶于100 ml水中，贮棕色瓶保存（溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失败，需纯化抗坏血酸）。临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。17% 硫酸溶液：2.5%

酵母菌的分离筛选方法

酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 葡萄糖 50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L L L MgSO41g/L FeSO4 L 酵母膏 L 孟加拉红 L （富集用） ★乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用蔗 糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱布 过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培养 用）（富集用） ★麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素L 121℃ 20min （分离保存 用） 灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨L 葡萄糖10g/L L L 孟加拉红L 氯霉素L 琼脂15g/L PH自然 （分离纯化用）

★豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾L 硫酸镁 L 硫酸亚铁L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然 一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。 实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。 3.筛选：

白假丝酵母菌种分布及耐药分析

白假丝酵母菌种分布及耐药分析 【摘要】目的了解院内白假丝酵母菌种分布及耐药情况，为临床抗真菌治疗提供依据。材料与方法采用沙氏培养基进行真菌分离，用atb expression全自动鉴定仪及其配套的鉴定板（法国梅里埃公司）结果 1.2008年10月~2011年3月临床各种送检标本中所分离的880株，其中痰标本中检出率最高为792株占90%。2. 在各年龄段白假丝酵母菌分布中，70岁以上老年患者检出率最高占75.5%。3. 呼吸内科检出率最高320株占36%。4. 两性霉素b对白假丝酵母菌敏感性最好。结论白假丝酵母菌感染越来越多，加强真菌分离及药敏试验合理用药，有助于患者的治疗。 【关键词】白假丝酵母菌耐药率药物敏感性实验 中图分类号：r446.5 文献标识码：b 文章编号：1005-0515（2012）1-336-02 白假丝酵母菌是人体重要的条件致病性真菌[1]，广泛存在于人体多部位，当机体抵抗力下降，可引起人类真菌感染。近年来由于广谱抗生素、免疫抑制剂、激素、抗肿瘤药物的广泛应用、以及器官移植、介入等治疗手段的普及，导致真菌感染呈上升趋势，而抗真菌药物的使用，又导致耐药现象的出现[2]。对此，我总结了沈洲医院2008年10月~20011年3月临床标本中白假丝酵母菌的分布及耐药情况。 1 实验材料 1.1 菌株来源 2008年10月~2011年3月临床各种送检标本中所

分离的880株白假丝酵母菌（患者首次分离株）。 1.2 仪器与试剂 atb expression全自动鉴定仪及其配套的鉴定板（法国梅里埃公司），沙保弱氏培养基由贝瑞特有限公司提供。五种抗菌药物为氟康唑，伊曲康唑，伏立康唑，两性霉素b，5-氟胞嘧啶。 2 实验方法 2.1 菌株培养与鉴定将标本接种于沙氏培养基，经35℃，18-24h 培养，分离纯菌。采用atb expression全自动鉴定仪及其配套的鉴定板（法国梅里埃公司）。 2.2 药物敏感性实验采用最小抑菌浓度（mic）法，用atb药敏板进行药敏试验。 3 结果 3.1 白假丝酵母菌来源分布临床送检的各种标本包括痰、尿、咽试子等。其中痰标本中检出率最高为792株占90%。具体情况见表1。 表1 白假丝酵母菌来源分布 ( n=880 ) 3.2 白假丝酵母菌临床分布情况见表2。 表2 白假丝酵母菌感染的科室分布（n=880） 3.3 各年龄段白假丝酵母菌检出率对比见表3。 表3 各年龄段白假丝酵母菌检出率对比（n，%） 3.4 白假丝酵母菌药物敏感性实验情况在白假丝酵母菌药物敏感性实验中，我们选择了5种药物，其中包括作用于细胞膜的唑类

酵母菌的分离与纯化

酵母菌的分离与纯化 土壤是微生物生活的大本营，是寻早有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同图样中各类微生物的含量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。放线菌一般在较干燥、偏碱性、有机质较多的土壤中较多；霉菌在含有机质丰富、偏酸性、通气性较好的土壤中较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在酒曲、面肥、水果表皮、果园土壤中数量多些。（一）菌源 1土样用无菌的采样小铲在橘树果园中取土壤表层下1~10cm土壤10g，装入灭菌的牛皮纸袋内。封好袋口，记录取样地点、环境及日期。图样采集后应及时分离，饭不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥的条件下，以减少其中菌相的变化。 2面肥 （1）面粉500克，白酒100克，水250，和好静置发酵就可以了。冬季10个小时。（2）在温水中兑一点酒，倒入适量面粉拌匀后放入绝缘保温盛器（陶瓷，砂锅）中，用布将整个盛器盖好置于温度较高处，6小时后即成面肥。 *以上方法做出的面肥只能保存几天，不宜放置太久。 3水果果皮 桔子和葡萄等的果皮上含有数量较多的酵母菌，既可单独作为菌源也可以和果园土壤作为混合菌源。 （二）酵母菌的分离 1制备菌悬液 称取菌源1g，加入盛有99ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中。振荡20min，即成10-2的菌源悬液。再一次稀释成10-4、10-5、10-6三个稀释度。 2涂布法分离 取融化并冷却至45~50度左右的豆芽汁葡萄糖培养基，每皿分别倾注约12ml培养基到培养皿内。注意，温度过高易将菌烫死，皿盖上冷凝水太多也会影响分离效果；低于45度培养基易凝固，平板高低不平。呆平板冷却后，用无菌移液管分别吸取上述已经制好的菌源稀释液10-4、10-5、10-6三个稀释度菌悬液各0.1ml，依次滴加于相应编号的豆芽汁葡萄糖培养基平板上。每个稀释度做2~3个平行皿。左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，再火焰旁右手持无菌玻璃涂棒将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散。注意，切忌用力过猛，这样会将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。3培养 接种后，平版倒置于30度恒温箱中，培养2~3天，观察结果。 4纯化 用接种环挑取单个单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落。 酵母扩培方案 一、培养基制备 (一)麦芽汁培养基的配制 1．培养基成分 新鲜麦芽汁一般为10-15波林。 2．配制方法 (1)用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6-12h，置于15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。 (2)取一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化，直

酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵3(DOC)

酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵 吴英玲 10197020 10生物创新班 摘要：酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内 4 ℃下保存。用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。 关键词：酵母菌分离鉴定固定化酒精发酵 Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentation ability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。 前言 酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸

酵母菌的分离纯化实验方案

酵母菌的分离纯化 ?实验目的 1.了解培养基的配置与灭菌技术； 2.无菌操作技术； 3.工业微生物的分离与纯化技术； 4.工业微生物的检测及保藏。 ?基本原理 1、培养基是人工配置的用于培养、分离、鉴定和保存各种微生物的营养基质。也适合微生物在生命活动中积累各种代谢产物。由于微生物种类不同，营养类型各异以及实验目的不同，因此培养基的种类也很多。不同微生物对营养的要求不同，在配置时根据微生物对PH 的要求选择合适的PH。由于本次实验主要是分离纯化酵母菌，所以配置的培养基是适合酵母菌生长麦芽汁平板培养基，同时添加抗生素抑制霉菌及其它菌的生长。 2、接种和培养过程中必须保证不被其它微生物所污染，关键在于严格进行正确的无菌操作，但是绝对无菌是不可能的，只能人工创造相对无菌的环境。所以本次实验无菌操作是在超净工作台的酒精灯火焰旁进行。 3、把特定微生物从混杂的微生物群体中分离出来而获得某一种或某一株微生物的过程叫微生物的分离与纯化。首先根据其生长特性设计只利于此菌生长的条件，再根据各种稀释法使他们在固体培养基上单独长成菌落。分离纯化的方法通常有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法和平板划线。此次实验采用梯度稀释涂布平板法。 4、微生物检测项目最常用的是细胞数的检测，方法比较多，主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法（CFU）、光电比浊计数法等。本次实验设计酵母菌的数量检测，选用显微镜直接计数法和平板菌落计数法。 实验器材 仪器设备 恒温水浴锅、电热干燥箱、蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温摇床、水浴锅、电炉、铜锅、酒精灯、接种环、电子天平、研钵、光学显微镜、血细胞计数器 玻璃器皿 烧杯、锥形瓶、大小试管、培养皿、漏斗、三角涂棒、吸管、试管架、玻璃涂棒、盖玻片 试剂与材料 苹果、大麦芽、琼脂、蒸馏水、碘液、抗生素、染色液 其它 纱布、滤纸 ?实验内容及操作步骤 (一)、样品的选择 酵母菌一般在果园的土壤中或者水果的表面含量较多，因此选择苹果为样品。 （二）、样品的处理 制备苹果悬液 1.首先将1g苹果在研钵中磨细，放入装有10ml生理盐水和玻璃珠的100ml三角瓶中去。

11白假丝酵母菌侵入机体引起感染的主要原因是

11. 白假丝酵母菌侵入机体引起感染的主要原因是 A. 致病力增强 B. 对抗生素不敏感 C. 易产生耐药变异 D. 机体免疫力下降 E. 侵入数量多 12. 新生隐球菌致病物质主要是 A. 荚膜多糖 B. 芽生孢子 C. 细胞壁 D. 假菌丝 E. 侵袭性酶 13. 不能侵害指甲的皮肤癣菌是 A. 毛癣菌属 B. 表皮癣菌属 C. 许兰毛癣菌 D. 絮状囊皮癣菌 E. 小孢子癣菌属 14. 关于皮肤癣真菌的致病特点，错误的是 A. 一种皮肤癣菌可引起不同部位感染 B. 同一部位感染也可由不同皮肤癣菌引起 C. 为一种条件致病性真菌 D. 常侵犯角质蛋白丰富的部位 E. 引起的真菌病最多

15. 不能侵犯毛发的皮肤癣菌属是 A. 表皮癣菌 B. 须毛癣菌 C. 小孢子癣菌 D. 许兰毛癣菌 E. 堇色毛癣菌 16. 表皮癣菌属不能引起哪种癣病? A. 体癣 B. 甲癣 C. 足癣 D. 手癣 E. 毛发癣 17. 深部感染的真菌不包括 A. 荚膜组织胞浆菌 B. 厌酷球孢子菌 C. 皮炎芽生菌 D. 小孢子癣菌 E. 巴西副球孢子菌 18. 成年人常见的癣病不包括 A. 手足癣 B. 甲癣 C. 体癣 D. 股癣 E. 头癣

19. 下列哪种病毒可引起人类皮肤粘膜疣状病变 A. HPV B. HAV C. HIV D. HSV E. CMV 20. 被狂犬咬伤的伤口，下列哪项处理不正确 A. 立即用20%肥皂水清洗伤口 B. 用70%酒精及碘酒涂擦伤口 C. 使用大量抗生素 D. 局部注射高价抗狂犬病病毒血清 E. 注射狂犬病疫苗 答案：11.D 12.A 13.E 14.C 15.A 16.E 17.D 18.E19.A 20.C

酵母菌的培养与分离

. . . 微生物学大实验 实验指导 编者： 生物技术教研室 2007.3

目录 实验一酵母菌的培养与分离‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥2 实验二酵母菌的鉴定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥7 实验三酵母菌耐受能力的测定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥19 实验四酵母菌发酵工艺条件的优化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥22 实验五耐高温酵母菌株的诱变选育‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥24 实验六酿酒酵母细胞固定化与酒精发酵‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥27

耐高温酒精酵母菌的选育及发酵条件的研究 实验一酵母菌的培养与分离 一、实验目的 学习培养和分离酵母菌的技术和方法 二、基本原理 大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.5－6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。 利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离之。 三、实验主要内容和要求 （一）本次实验的方案由同学们自己制定，实验包括： 1．马铃薯葡萄糖培养基, 乳酸马铃薯葡萄糖培养液的配制。 2.菌株的筛选,根据一定的生产目的并从特定的样品筛选出高产酒精的适宜的酵母菌株。 3.酵母菌的分离,要求接种一次, 28-30℃，培养24小时，转接一次，28-30℃，培养24小时，并用镜检的方法独立判定所分离菌株是否为酵母菌。 4.用划线分离法对酵母菌进行纯化，要求每组挑取单个菌落，连续划线分离4代，镜下为单一纯菌株，每组扩繁10支斜面菌种，备用。 四、实验的准备 1、甘蔗、成熟葡萄或苹果等果皮、0.1%美蓝染液、1ml的无菌吸管、无菌培养皿等。 2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基： 原料：马铃薯（200克）、葡萄糖（20克）、琼脂（15-20克）、蒸馏水（1000ml）。 配制方法： （1）先将马铃薯去皮，切片，称200克并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml ，制成20%的马铃薯汁。 （2）在20%的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，补足水分并在115℃条件下高压灭菌20分种。 （3）加入葡萄糖，制成培养酵母菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。

酵母菌的分离纯化

微生物学课程设计专业：生物技术 姓名：符英康 学号：1040521125

从土样中分离纯化酵母菌 一、实验目的 1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理玉方法 2、学习、掌握微生物的鉴定方法 3、对提取的图样进行微生物的分离、纯化培养、并进行简单的形态鉴定 二、实验原理 1、基本思想: 酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4.5-6.0.酵

母菌生长迅速，容易分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。 2、基本路线: 采样→稀释→接种→鉴定→纯化→保藏 菌种 三、器材和用品 1、器材： 小铁铲和无菌纸或袋、培养皿、载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、量筒、滴管、吸水纸、无菌水试管、烧杯、三角瓶、电炉、玻璃棒、接种环、恒温培养箱、高温灭菌锅、移液枪（枪头）、天平、滤纸、pH试纸等。无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、显微镜、接种环等。 2、试剂： a、美兰染液。

b、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g （煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。分装三角瓶；试管斜面1支/组。 c、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml 乳酸，pH为5.5左右，再分装试管9ml2支/组。 四、实验方法 1、采集土样带上小铁铲和无菌袋到果园土、菜园土等地采集较细碎土壤。 2、样品稀释在无菌纸上称取样品5g，放入100mL无菌水的三角瓶中，手摇10分钟使土和水充分混合。用1mL无菌吸管吸取0.5mL注入4.5mL无菌水试管中稀释。 3、分离在上述样品稀释液中，吸取lmL，接种灭菌了的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，倒置于37℃温箱中培养48小时。 4、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1ml，注入另装有乳酸马铃薯葡萄糖培养液

微生物实验十七、酵母RNA的提取及组份鉴定

一、实验目的 1. 了解并掌握稀碱法提取核酸的原理和方法。 2. 学习使用血球记数板测定微生物数量的方法。 3. 了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。 二、实验原理 核酸是一类不稳定的生物大分子，在制备过程中很容易发生降解。因此，要使制得的核酸尽可能保持其在生物体内的天然状态，制备核酸必须采用温和的条件。酵母核酸中RNA含量较多，RNA达 2.67- 10.0%,而DNA含量仅为 0.03- 0.516%,酵母核酸的提取方法较多,工业上一般选用成本较低、适宜于大规模操作的稀碱法和浓盐法。稀碱法是用1% NaOH溶液，将细胞壁溶解，用酸 中和,升高温度使蛋白质变性,将蛋白质与核酸分离,然后除去菌体,将pH 调至RNA 的等电点（pH 2.5）,使核酸沉淀出来。稀碱法的优点是抽提时间短,但核酸在此条件下不稳定,容易分解。 血球计数板法主要计数酵母、原生动物等个体较大的微生物,是计数一定容积中的细胞总数的常用方法。其型号分为X B.K. 25.和X B.K. 16. 两种,前者是一个大方格分成25 个中方格,而每个中方格又分成16 个小方格；后者为一个大方格分成 1 6个中方格,而每个中方格又分成25个小方格。但无

论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为1mm,则每一个大方格的面积为1mm2,盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为 0.1mm，所以计数室的容积为 0.1mm3 （万分之一毫升）。 核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光。RNA的紫外吸收高峰在OD260nm波长处。一般在OD260nm波长下，每毫升含1⑷RNA 溶液的吸光值为 0.022。故测定未知浓度RNA溶液OD260nm波长的吸光值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸等各组分，加入硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。磷酸与定磷试剂作用可以生成蓝色的钼蓝。核糖与地衣酚试剂反应呈鲜绿色。脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，而核糖无此反应。嘌呤碱与硝酸银反应能产生白色的嘌呤银化合物沉淀。 三、试剂和仪器设备 1. 材料与试剂 酵母粉； 0.04mol/LNaOH;酸性乙醇：将0.3mL浓盐酸加入到30mL乙醇中；95%乙醇； 1.5mol/L硫酸；浓氨水； 0.1mol/L硝酸银。 定磷试剂：17%硫酸： 将17mL浓硫酸（比重1084）缓缓倾入83mL水中； 2.5％鉬酸铵：

沙果和桃子中酵母菌的分离鉴定及其生物学特性研究

沙果和桃子中酵母菌的分离鉴定及其生物学特性研究 本试验利用常规分类学和WL培养基相结合的方法对沙果和桃子表面及发酵汁中的酵母菌进行初步分类。选择优质的酵母菌株进行发酵特性的研究。 筛选出具有代表性且性状优良的酵母菌株进行26SrDNA D1/D2区的 PCR/RFLP分析鉴定。研究结果表明：从内蒙古呼和浩特地区采集了两个沙果品种的20个样品,共分离出45株酵母菌,包括3个属,分别为Pichia(毕赤氏酵母属)、Candida (假丝酵母属)、Brettanomyces (酒香酵母属)；包括3个种,分别是Pichia sp.、Candida sake (清酒假丝酵母)、Brettanomyces intermedius(中间型酒香酵母)。 从内蒙古呼和浩特地区从市售水果店采集了五个桃子品种的50个样品,共分离出75株酵母菌,包括4个属,分别为Hanseniaspora (有孢汉逊酵母属)、Torulaspora(有孢圆酵母属)、Pichia (毕赤氏酵母属)、Saccharomycodes(类酵母属);包括4个种,分别是Hanseniaspora uvarum(葡萄汁有孢汉逊酵母)、Torulaspora delbruekii(戴尔有孢圆酵母)、Pichia kluyveri (克鲁维毕赤酵母)、Saccharomycodes ludwigii (路德类酵母)。从分离出的菌株中筛选8株酵母菌进行主要生物学特性分析。 耐受性试验结果表明,菌株D20和F1o具有相对突出的发酵性能,可以耐pH 值为2、糖浓度(w/w)为50、高温(℃)为41、S02浓度(mg/L)为330、酒精浓度(v/v)为16的环境中正常生长发酵。对菌株D20和Flo进行了酒精度和残糖量的酒精发酵试验,菌株Flo的酒精度为10.2%,D20的酒精度为9.5%。 残糖量试验结果,菌株Flo残糖量为2.3g/L,菌株D20的残糖量为3.3g/L。F1o的发酵性能较好于D20,但由于F1o和D20来源于不同样品,因此将两株菌同