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斑马鱼实验报告

斑马鱼实验预习报告

一、实验目的

1、了解斑马鱼形态结构特点

2、掌握斑马鱼的分类地位

3、掌握斑马鱼胚胎发育过程并探究其胚胎发育的影响因素

二、实验内容

1、斑马鱼的外部形态观察

2、写出斑马鱼的分类地位

3、设计实验探究斑马鱼胚胎发育的影响因素

三、实验操作

1、观察斑马鱼的形态

斑马鱼(zebra fish)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼（Brachydanio rerio），原产于印度、孟加拉国。斑马鱼(B. rerio)，是淡水水族箱观赏鱼，原产於亚洲，体长约4公分(1.5吋)，具暗蓝与银色纵条纹。

体长4～6厘米。体呈纺锤形。背部橄榄色，体侧从鳃盖后直伸到尾未有数条银蓝色

纵纹，臀鳍部也有与体色相似的纵纹，尾鳍长而呈叉形。雄鱼柠檬色纵纹；雌鱼的蓝色纵纹加银灰色纵纹。

2、斑马鱼的分类地位

动物界

脊索动物门

脊椎动物亚门

硬骨鱼纲

辐鳍亚纲

真骨鱼总目

鲤科

短担尼鱼属

3、设计实验

斑马鱼的胚胎发育经过受精卵、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、胚层分化及出膜几个时期。

实验猜想：影响斑马鱼胚胎发育的因素有水温、营养成分、氧气等

实验方法：控制变量法（探究其他条件相同时，不同温度对斑马鱼胚胎发育的影响）

参考：https://www.wendangku.net/doc/a09705195.html,/view/48428.htm#2

https://www.wendangku.net/doc/a09705195.html,/news/P1P44I6045195.html

病毒性病害防治药剂大汇总

病毒性病害防治药剂大汇总病毒性病害是农作物病害中一类特殊的病害，具有病情复杂、难以防治的特点，号称“植物癌症”，其主要症状类型有花叶、变色、条纹、枯斑或环斑、坏死、畸形等。常见的病毒性病害有烟草花叶病毒病、番茄花叶病毒病、辣椒花叶病毒病、小麦花叶病毒病、水稻黑条矮缩病、番茄病毒病、烟草病毒病等。这类病害危害大、分布广、无特效农药，近年来，围绕着香菇多糖、葡聚烯糖、寡聚酸碘、氨基寡糖素、盐酸吗啉胍、宁南霉素等成分开发防治病毒性病害的制剂成为开发的热点。表 1 常见的防治病毒性病害的已登记的农药产品香菇多糖主要是从伞菌科真菌香菇的子实体中提取纯化得到的β-1,3-葡聚糖，为香菇的重要药用成分，于1968年首次提纯获得。 1.1 理化性质

棕色液体，无可见悬浮物和沉淀；密度(20℃)1.13g/mL；不可燃；对包装材料无腐蚀性；无热爆炸性；闪点＞150℃；pH：4.0～6.0，稀释稳定性(稀释20倍)合格，低温稳定性和热贮稳定性合格，常温2年贮存稳定，不能与碱性物质混用。研究表明，香菇多糖的主链和侧链的有序构象是单一螺旋构象，胶体结构的结合区域会形成多螺旋构象，其立体结构为右手心三度螺旋，晶格为六角形。香菇多糖的一级结构具有β-(1→3)连接的吡喃葡聚糖主链，在主链中葡萄糖的C6位上含有支点(每5个葡萄糖有2个支点)，其侧链是由β-(1→6)键和β-(1→3)键相连的葡萄糖聚合体组成，在侧链上也含有少数内部β-(1→6)键的葡聚糖。 1.2 毒性 10%香菇多糖母药和1%香菇多糖水剂大鼠经口LD50雌雄性动物均＞4 640 mg/kg；大鼠经皮LD50雌雄性动物均＞2 000 mg/kg；对家兔皮肤、眼均无刺激性；豚鼠皮肤变态反应(致敏性)试验未出现红斑、水肿及其他皮肤过敏症状，按照我国农药致敏率强度分级标准评定为弱致敏物。1%香菇多糖水剂属低毒杀菌剂。环境生物安全性评价：10%香菇多糖母药对蜜蜂急性触杀毒性LD50＞80.00 μg/蜂，为“低毒级”；对蜜蜂经口毒性LC50(4 8h)＞2.00×103 mg/L，为“低毒级”；对斑马鱼急性毒性LC50(96 h)＞100 mg/L，为“低毒级”；对家蚕急性毒性LC50(96 h)＞2.00×103 mg/L，为“低毒级”；对

斑马鱼(Danio rerio)的资源管理：综述

斑马鱼（Danio rerio）的资源管理：综述Christian Lawrence 摘要斑马鱼最近成为了一个卓越的生物医学研究的模型的脊椎动物。它作为人类疾病和发展的模型，这个同样令人喜欢的特征为它受欢迎做出了贡献；即繁殖力高，体积小，迅速的繁衍周期，在早期胚胎发育早期的光学透明性，也有许多其他学科的研究者长期致力于它的研究，包括动物行为，鱼类生理，水产毒理学。尽管如此，严谨的饲养斑马鱼的技术还是不够发达。虽然斑马鱼有一个相当大的身体，都和畜牧业有直接或间接的关系，这个信息有许多不同的来源，而且它很少被应用到发展中国家的标准协议。这项综述是尝试把可利用的与斑马鱼生物学和文化相关的科学资料整合到一个这项领域的概述，可以用于研究中的这个重要的动物模型的使用效率的改善。这个综述还强调了在那些领域需要做进一步的研究。

目录 1.简介 2.斑马鱼的自然历史 2.1 喜好的栖息地及分布2.2 繁殖和行为 2.3 寿命 2.4 食性 3.斑马鱼文化 3.1 水化学 3.1.1 温度 3.1.2 PH值 3.1.3 硬度 3.1.4 盐度 3.1.5 溶氧 3.1.6 含氮废物 4.营养，食性和饲养方法4.1 营养需求 4.2 食性 4.3 饲养

5.繁殖和养殖技术 5.1 繁殖 5.2 养殖技术 5.3 产卵率 6.幼体培育 6.1 幼体生物学 6.2 食性和营养 6.3 水质 6.4 生长率和存活率 7.成体培育 7.1 保持密度 7.2 遗传育种计划 8.总结致谢参考文献

1.简介在过去的二十年里，斑马鱼已成为一个研究遗传学和发展的重要的脊椎动物模型，近来，也包括人类疾病和筛查治疗药物。大量的有利的性质，包括它体积小，快速的发展和繁殖速度，早期发展过程中的光学透明性，比较容易的遗传选育和与人类相似的遗传特点，而且它将很有可能在其他领域的研究中刺激经济的增长，特别是它的基因组草案的进一步完善和令人振奋的用来做扩展研究的可利用的工具和方法。鉴于斑马鱼作为一个相当重要的实验模型，伴随着的是它大量使用和相关培育设施的建立和维修的大额的经济耗费，在一定程度令人惊讶的是它的畜牧业不发达。当与其他的养殖鱼类相比，像罗非鱼，斑点叉尾鮰和鲤鱼，公开的饲养标准完全不符合要求。在有关养殖技术的信息交流中，众多的研究机构之间的房屋斑马鱼养殖技术已经基本不存在，和任何已经取得的进展都非常孤立，没有同行业内人士的利益评价。这种情况的一个不幸结果是，许多斑马鱼的设施可能运作在一个次级水平，当调查人员初次接触这个模型，在为新建立的养殖设施制定一个标准的作业程序，没有科学严谨的资源可以咨询时，这个情况只会进一步加剧。尽管公布的饲养标准缺乏，斑马鱼任然是一种非常好的研究动物。很久以前，它作为一种发展模型出现，斑马鱼是研究各种鱼类各方面生物学的材料。多年来，研究人员利用这些具体实际的优势，现在用

全氟辛烷磺酸对斑马鱼脂代谢和糖代谢毒理作用研究-遗传学专业毕业论文.pdf

温州医学院硕士学位论文全氟辛烷磺酸对斑马鱼脂代谢和糖代谢毒理作用研究摘要全氟辛烷磺酸(Perfluorooctanesulfonic acid，PFOS)是一种应用广泛的全氟化表面活性剂。现有的研究表明：PFOS已经广泛渗透到地球的各种环境介质中，甚至包括地球的两极；是一类具有全身多脏器毒性的环境污染物：包括遗传毒性、雄性生殖毒性、神经毒性、发育毒性和内分泌干扰作用等。但是目前还鲜见其在糖脂代谢上的研究，在水生生物中的研究和数据更是匮乏。我们以野生型AB系斑马鱼为研究对象，研究在低剂量、长时间暴毒下，PFOS是否以及如何影响脂类、糖类代谢。实验可分为两个部分：成鱼实验：亲代斑马鱼，自8hpf开始暴露于一系列不同浓度(0，0．02，0．1，0．5I．tM)的PFOS中。暴露150天，固定其中的一部分，用于制备组织病理切片，以观察其内脏组织结构；固定另一部分内脏，用于制备透射电镜超微切片，研究PFOS暴露对肝细胞和小肠上皮细胞超微结构的影响。暴露180天，从各PFOS暴露组分别选取成熟的雌雄斑马鱼繁殖F1代，并且分为持续暴毒组和清水脱毒组继续养殖至50dpf，分别制备病理切片观察组织结构；检测暴露180天后，亲代斑马鱼的各项血液生化指标，包括血糖，血清甘油三酯，血清总胆固醇；同时检测斑马鱼的基本生长指数：肥满度和肝脏指数。．仔鱼实验：运用荧光定量PCR技术，分别检测96hpf急性窗口期暴毒斑马鱼样本代谢相关基因的表达变化和F1代脱毒斑马鱼样本相关基因的表达变化。利用IPA构建两个信号通路，分析基因间的调控关系。研究发现了较为明显的由PFOS引起的各种体内糖脂代谢的紊乱现象：HE 染色的病理切片表明，暴露时间150天的亲代0．51xM组雄鱼普遍存在肝脏脂肪化积累现象；由亲代0．1斗M PFOS暴露组所产脱毒50天养殖的F1代，雌鱼和雄鱼都出现了明显的肝脏脂肪累积，脂肪化程度比在亲代中稍低。对暴露时间达180天的斑马鱼进行血糖、血清甘油三酯和总胆固醇的检测，表明血糖受影响不大，只在O．1“M组雄鱼有小幅上升；血清甘油三酯，随着PFOS暴露浓度的升高有显著降低的趋势；血清总胆固醇，在雌鱼和雄鱼中检测的结果有明显差异。对同时期鱼进行生长指数的测定结果，肥满度在0．51xM组显著升高和肝体指数在各暴露组显著降低，表明PFOS对斑马鱼基本代谢状况确实存在影响。对暴露150天的斑马鱼肝脏和小肠进行透射电镜超微切片，发现了脂肪化程度严重的肝细胞(雄鱼)：在超微结构上，细胞内可见大大小小的脂滴，肝糖原降低，且部分细胞核因脂质的挤压而发生变形；细胞内胆小管的微绒毛变稀疏、排列紊乱；细胞间胆小管数量下降；线粒体嵴模糊；肝细胞超微结构中与物质运 1

斑马鱼动物模型的应用介绍

斑马鱼动物模型的应用斑马鱼（Danio rerio）属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼，原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有斑马一样暗蓝与银色相间的纹条而得名。斑马鱼个体小，易于饲养，成体长4-5cm，雄鱼体修长，雌鱼体肥大。可在有限空间里养殖相当大的群体，可满足样本需求量大的研究。斑马鱼发育迅速，在28.5℃培养条件下受精后约40min完成第一次有丝分裂，之后大约每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形成，相当于28d的人类胚胎，幼鱼孵出后约3个月达到性成熟。雌雄鱼通过调控光周期控制14:10（光照:黑暗）产卵时间，成熟鱼每周可产卵一次，一尾雌鱼每次可产卵100-300枚。胚胎体外受精，体外发育，胚体透明，易于观察。受精卵直径约1mm，易于进行显微注射和细胞移植等操作。一、斑马鱼的品系经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库-ZFIN （http://zfin/org）里有相关的资料可供查询和下载。目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB 品系、Tuebingen（Tu）品系、WIK 品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tu。AB 品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因，用于基因组测序前敲除该致死突变基因。WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。此外，还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。二、斑马鱼突变品系的筛选斑马鱼突变的方法主要有三种：已基亚硝脲（ENU）化学诱导、γ或χ射线照射和插入诱变。ENU是一种DNA烃基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，诱导产生的突变率为0.1%-0.2%，涉及单个基因的突变。射线照射导致染色体大片段的缺失或染色体重排，产生突变率达1%。插入诱变是以逆转录病毒为载体，用显微注射法将目的基因片段导入斑马鱼受精卵，整合到基因组中，干扰正常基因表达。射线照射产生的突变率是ENU 化学诱导的10倍，但由于突变涉及多个基因，突变的表型是受若干基因调控的结果，不利于基因功能的分析，因此，ENU化学诱导法是斑马鱼突变的主要方法。研究含有纯合致死

斑马鱼简介

它是发育生物学家的得力助手，是医学研究的后起之秀，是环境监测的哨兵，是指示兵，是药物研发的新宠，它就是脊椎类模式动物明星斑马鱼（zebrafish，Danio rario）。一、斑马鱼基本特点：原产地：热带淡水鱼，原产于喜马拉雅山南麓的印度、巴基斯坦、孟加拉和尼泊尔等南亚国家。成鱼体长3-100px，略呈纺锤形，头小而稍尖，吻较短，身躯玲珑而纤细，因其体侧具有像斑马一样纵向的暗蓝色与银色相间的条纹而得名。 http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL3530/DEVO_03/ch03f09.jpg 斑马鱼是体外受精发育，胚体透明。胚胎发育快，受精后3天左右孵化出膜，天左右开口进食，约3个月达到性成熟，寿命可达2年以上。斑马鱼可常年产卵，繁殖周期3-4天，一对成年斑马鱼每次可产卵200-300枚，受精率通常在70%以上。养殖温度一般在23-31℃，15℃左右仍可存活，最佳养殖温度在25-28摄氏度之间，pH值在6.8~7.8，硬度在2~6之间。二、斑马鱼作为模式生物的起源和发展 1938年，美国布朗大学Roosen-Rung教授首次报道斑马鱼发育形态学研究成果。1950年代，美国罗格斯大学K. Kenneth Hisaoka教授首次报道斑马鱼毒理学研究成果。1972年，美国俄勒冈大学George Streisinge教授开始斑马鱼发育生物学研究和模式动物建立工作。1989年，美国俄勒冈大学Monte Westerfield教授出版斑马鱼研究圣经The Zebrafish Book第一版。1998年，首个斑马鱼模式生物数据库ZFIN成立（https://www.wendangku.net/doc/a09705195.html,）。1998年，全球第一家斑马鱼药物研发

物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法

《水质物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》编制说明（征求意见稿）国家环境保护总局南京环境科学研究所 2008年03月

目次 1．任务来源及工作过程 (1) 1.1任务来源 (1) 1.2工作过程 (1) 2．修订本标准的必要性及法律依据 (2) 2.1 必要性及目的意义 (2) 2.2 修订本标准的法律依据 (3) 3．标准修订的原则与技术路线 (3) 3.1 标准修订的原则 (3) 3.2技术路线 (5) 4．标准适用范围 (5) 4.1 试验方法选择 (5) 4.2 试验用鱼选择 (6) 5. 标准的主要内容说明 (6) 5.1 方法原理 (6) 5.2 试剂和材料 (6) 5.3 仪器设备 (7) 5.4 干扰及消除 (8) 5.5 样品 (8) 5.6 试验步骤 (9) 5.7 结果计算 (10) 6. 参考文献 (10)

1．任务来源及工作过程 1.1任务来源本标准由2006年国家质检总局（国质检财函[2007]971号）和2007年国家质检总局（国质检财函[2007]9909号）和国家环保总局2006 年（环办函（2006）371 号）下达编制任务，由国家环境保护总局南京环境科学研究所负责起草，项目编号为992号。本标准是在已颁布的GB/T 13267-91《水质物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》文本基础上修订的。 1.2工作过程国家环境保护总局南京环境科学研究所为本标准的修订单位，根据标准修订要求成立了标准编制组，主要成员如下：表1 编制组主要成员名单姓名职称专业备注周军英研究员环境生物项目负责人，制定方案韩志华助研环境毒理主要人员，组织实施、执笔人单正军研究员环境毒理主要人员，审定石利利研究员环境化学主要人员，审定卜元卿助研环境毒理主要人员，具体实施其他略参加人 1.2.1 标准开题论证标准修订任务下达后，国家环境保护总局南京环境科学研究所即投入了前期的调研工作，并于2007年2月12~13日在南京召开了《水质物质对淡水鱼（斑马鱼）急性毒性测定方法》标准修订开题论证会。会议邀请了浙江大学、南京大学、沈阳化工研究院等与标准制订有关的各方面专家5人，专家组认真听取了承担单位的汇报，详细审阅了承担单位提交的开题报告材料，经过充分讨论，提出了专家组意见。专家组肯定了标准编制原则、技术路线并提出了专家组修改意见，标准修订组根据专家意见对方案进行了修改和补充。

斑马鱼的胚胎发育与影响因素

鲁东大学生命科学学院学院20 10 －20 11 学年第二学期学院______________ 专业_____________ 年级________ 班________ 学号 _____________姓名______________ 密封线学生须将文字写在此线以下《发育生物学》课程论文课程号：2522080

.关键词：斑马鱼；发育；葡萄糖；溶液浓度；温度；TCDD 一、斑马鱼简介斑马鱼(zebra fish)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼。斑马鱼是一种常见的热带鱼。斑马鱼体型纤细，成体长3-4cm，对水质要求不高。孵出后约3个月达到性成熟，成熟鱼每隔几天可产卵一次。卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。发育温度要求在25-31℃之间。斑马鱼由于个体小，养殖花费少，能大规模繁育，且具许多优点，吸引了众多研究者的注意。经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库里有相关斑马鱼的资料可供查询和下载，方便了研究。斑马鱼的细胞标记技术、组织移植技术、突变技术、单倍体育种技术、转基因技术、基因活性抑制技术等已经成熟，且有数以千计的斑马鱼胚胎突变体，是研究胚胎发育分子机制的优良资源，有的还可做为人类疾病模型。斑马鱼已经成为最受重视的脊椎动物发育生物学模式之一，在其它学科上的利用也显示很大的潜力. 二、斑马鱼的发育过程 1〕卵子的发生斑马鱼卵子发生过程中乱母细胞的发育是不同步的。在卵子发生早期，核内许多小核仁开始富集，其数目在接下来的时期中可以达到1500个，他们分布在和的外围和靠近内部核膜。斑马鱼卵子发生过程一般分为5个时期，即StageⅠ-Ⅴ;有时也将StageⅡ和Ⅲ作为一个时期将卵子发生分为4个时期。各个时期的基本特征是： StageⅠ是原始滤泡生长阶段，乱母细胞没有卵黄，是一个有细胞质包围着升值滤泡的圆形球体。其染色体去浓缩并出现灯刷装状表型，此时DNA高度延伸，形成一个具有典型形态学上的包含RNA和蛋白质的恻环。染色体的这一构型被认为有利于母源性基因的转录激活，其出现与斑马鱼卵母细胞中RNA合成的高速率是一致的。在这时期，卵母细胞和滤泡细胞的微小突起（microvilli）开始伸展并延伸到彼此的区域。一旦形成，这些连接包含粘附连接、细胞桥粒和间隙连接，它们可能与滤泡细胞和卵母细胞间的交流和卵母细胞附近小分子的吸收有关。同时，卵黄膜组分开始在滤泡细胞和卵母细胞之间富集；其他结构，如线粒体、高尔基体和内质网等富集，反映了产生大量产物的需要。 StageⅡ卵母细胞的特点是富集了大量蛋白质和油脂，对于卵子激

斑马鱼

新型模式动物斑马鱼在分子生物学和医学中的应用举例摘要：斑马鱼由于其独特的生物学特性作为一种新型的模式动物在医学、分子生物学、发育生物学、环境监测和毒性检测等方面在国内外得到了广泛的应用。本文概述了其在分子生物学和医学中的具体应用两例，展示了其在实验动物学中诱人的发展前景。关键词：斑马鱼、模式动物斑马鱼(又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼，Brachydanio rerio)，鲤科，原产自印度、孟加拉国。体长为4-6cm。雌雄鉴别较容易，雄鱼的蓝色条纹偏黄，间以柠檬色条纹；雌鱼的蓝色条绞偏蓝而鲜艳，间以银灰色条纹，身体比雄鱼丰满粗壮，各鳍均比雄鱼短小。饲养容易，对水质要求不严，水质为中性，水温以22～26℃为宜。耐热性和耐寒性都很强，可在10℃以上的水中很好地生长，属低温低氧鱼。可与其他小型鱼混养，对食物不挑剔，各种动物性饲料，干饲料均可，很少患病。繁殖比较容易，繁殖水温以24℃为宜。每尾雌鱼每次产卵约300余粒，体型较大者有时可产上千粒。卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。受精卵约经36h孵化，两天后仔鱼卵黄囊消失，可游动摄食。发育温度要求在25-31℃。幼鱼三个月可达性成熟。斑马鱼凭借自身优势，已成为理想的脊椎动物模型。实例一：“绿色”胰岛β细胞发育转基因斑马鱼模型[1]。第一:克隆表达载体,挑选酶切鉴定后阳性的克隆作注射准备。第二：显微注射，即让外源性DNA片段进入斑马鱼基因组。第三：生殖系转基因系的筛选和建立，即蔡斯体视荧光显微镜下筛选胰岛位置特异性表达绿色荧光蛋白(GFP)的胚胎．建立生殖系稳定遗传的Fl代胰岛β细胞转基因斑马鱼系。第四：应用PCR和WISH证实为转基因斑马鱼系。第五：形态学观察，荧光显微镜下观察荧光标记并拍摄得到荧光标记物于胚胎侧面和背面的整体分布图。第六：应用化学遗传学方法破坏斑马鱼胰岛β细胞，模型建立。斑马鱼的应用为高通量筛选具有胰岛β细胞保护和再生作用的药物(包括中药、草药、小分子化台物等)提供了理想的动物疾病模型，为糖尿病这一核心病机的治疗带来了机会。实例二：flk—GFP斑马鱼模型[2]，它是研究抗血管生成药物的理想动物模型。方法如下：成年flk一GFP转基因斑马鱼交配，产卵，待分裂至16—256细胞期时，将鱼卵随机置于96孔培养板(U底)中。实验组，每孔载入3个胚胎及鱼水(速溶海盐40 g加蒸镏水1000 mL)200μl，于4 hpf(hourpost fenilized,受精后小时数)时，自化合物库中加样，使加药后终浓度为10μmol·L-1；28℃培养箱中,培养至24 hpf；于倒置荧光显微镜下，观察flk—GFP转基因斑马鱼的血管生成情况。于同一培养板中，留出一列孔，不予加药，作为对照组。近年来随着肿瘤发病机制研究的不断深入，分子靶向药物的研究成为肿瘤治疗学研究的热点之一。血管生成抑制剂就是其中一类。斑马鱼通过血管芽的发育形成血管，与哺乳动物的血管形成途径需要相同的生物活性物质。flk—GFP转基因斑马鱼是一种在血管内皮细胞表面表达GFP的转基因动物，研究者可以在多孔板中观察斑马鱼胚胎的血管生成发育过程，从而能直接快速地筛选出影响血管形成过程和形状的化合物。因而，flk—GFP斑马鱼已成为研究血管生成独特的模式生物。斑马鱼不仅在分子生物学和医学中得到广泛应用，在发育生物学、遗传学、毒性评价、胚胎毒性技术中都有应用[3]。如由于斑马鱼胚胎发育迅速、具有透光性，各器官正处于发育形成阶段，对水质污染和受压状态非常敏感，可用来监测水质的细微变化；能耐受的氧含量范围宽，所需溶液少，尤其适用于代谢物的检测；胚胎的急性毒性实验与成鱼具有很好的相关性，完全可以替代成鱼用于急性毒性检测；OECD也将斑马鱼胚胎检测技术列为测定和评价化学品毒性，尤其是致畸性的标准方法，并制定了详细的操作指南(OECDTG212)。此外，斑马鱼已经作为人类疾病研究模型，而且也被认为是人类基因组计划中功能染色体组研究的理想模型。以上综述可见，斑马鱼的发展前景是十分诱人的，它将在更宽广的领域得到更深入

斑马鱼性腺促熟及早期发育模式

年月日姓名：专业年级：同组者科目：发育生物学实验题目：斑马鱼性腺促熟及早期发育模式一【目的要求】 1、通过实验操作掌握斑马鱼性腺促熟和产卵调控技术 2、通过斑马鱼早期发育的观察，巩固对硬骨鱼胚胎发生的认识二【实验材料】（一）器材培养缸、控温棒、解剖镜、显微镜 (二)试剂经太阳晒过至少一天的自来水（三）动物斑马鱼（Danio sp.）三【实验内容】（一）亲鱼培育和性腺促熟挑选体长大于4厘米的斑马鱼放养于鱼缸中，水温保持在28℃左右，放养数量根据鱼缸中水体体积而定，密度5尾\L左右。饲喂亲鱼用的饲料有活性饲料和配合饲料两种，直接购自于观赏鱼市场，要求每天投喂4次，及时清除残饵，隔天换水，快到繁殖季节时将雌雄分养，加强管理。（三）繁殖繁殖前一天中午，将雌雄合养于繁殖缸里，要求雌雄比例为2:1。由于斑马鱼有食卵的习性，为防止亲鱼吞噬鱼卵，可用网孔为2-3毫米的网将亲鱼限制在繁殖缸的上半部活动，以防止亲鱼吞吃鱼卵。一般次日凌晨到中午可以产卵和受精，受精卵便沉降于缸底，将繁殖后的亲鱼及时转移至别的培养缸中，吸取缸底受精卵，剔除异物以及眼观有白色小斑点、畸形异常卵。（三）斑马鱼胚胎发育模式孵化期间，培养用水温度控制在25-28℃，每天要及时清除败育卵，并换水1-2次。按时观察记录斑马鱼胚胎的早期发育过程，绘制斑马鱼的胚胎发育模式图。 1、受精卵：斑马鱼的卵呈圆球形，橙黄色、微透明，直径0.8-0.9 mm。在水中，受精卵卵膜(壳膜)迅速膨胀，出现透明的卵周隙，在壳膜上可以看到呈漏斗状的卵膜孔。 2、卵裂：卵子受精后，细胞质迅速向动物极流动，并集中形成帽状的胚盘。卵裂即在胚盘范围内进行，卵裂属于不全裂，盘状卵裂。第一次分裂为经裂，分裂沟自上而下，但不到达底部，结果分为两个相等的不完整分裂球。第二次分裂仍为经裂，分裂面与第一次垂直，仍是不完全分裂，于是分成大小相似的四个分裂球。第三次分裂亦为经裂，两个分裂面在第一次分裂面两侧，并与第一次分裂面平行，形成两排，每排四个，共八个分裂球。第四次分裂仍为经裂，两个分裂面在第二次分裂面的两侧，并与第二次分裂面平行，分裂为四排每排有四个分裂球，共形成十六个分裂球。第五次分裂，有经裂也有纬裂，分裂面己不整齐，分裂球大小也不一致。以后几次分裂，分裂球愈分愈小。 3、囊胚期：由于细胞不断分裂，数目增多，细胞体积逐渐变小，分裂球层次增加，同时在胚盘与卵黄之间产生一空腔，即为胚盘下腔，此时称囊胚期，又分为囊胚早期、中期和晚期，也称高囊胚、中囊胚和低囊胚。 4、原肠胚期：囊胚晚期后，细胞逐渐向植物半球下包，胚盘变扁，开始进入原肠期。当胚盘下包到卵黄的一半时，胚环最大，背唇呈新月状，此即胚盾开始，即原肠早期。胚盘继续下包到胚胎的三分之二时，由于细胞不断集中于胚环的一处，致使该处呈一盾状隆起即

生理学实验--斑马鱼视动反应讲义

斑马鱼视动眼动反应实验目的：观察视觉行为学的表现掌握评判视觉功能的行为学手段实验原理：行为学虽是一门古老的学科，但至今仍是神经生理研究中不可或缺(indispensable)的一个活跃领域。经典行为学实验一般不依赖或很少需要精密的测量仪器，而是靠我们去观察和思考。眼动(optokinetic response, OKR)和视动(optomotor response, OMR)反应均是视觉刺激诱发的运动行为。脊椎动物从低等的鱼、蛙到高等的灵长类和人都有此行为反应。此现象无需学习训练就易诱导、较稳定、易观察，所以作为一种客观指标广泛运用于视觉功能的检测和评价。脊椎动物为了获得对运动图像刺激在视网膜上稳定清晰的成像，通过视觉通路和相应的运动神经参与做出生理性行为的适应调整从而能够对视觉刺激做出良好反应，这些表现涉及视动、眼动或视动性头震颤(Optokinetic head nystagmus, OKHN)。如果行为学的表现不正常，可以推测它们的固有神经连接出现异常。斑马鱼具有脊椎动物类似的视觉通路，经典的视觉行为学有眼动反应和视动反应。眼动(光动)反应：斑马鱼在光适应一段时间后会对移动的光栅进行注视，试图确保移动视觉图像能稳定地高分辨地呈现在视网膜上。如果光栅是在一个围绕幼鱼的圆筒上移动时(图1)，斑马鱼的眼睛就会一直追随光栅直到其眼睛不能再转动，然后有一个急速的眼颤动(ocular nystagmus)以回复到最初水平。之后又进行下一个追随反应，如此循环。周围视觉环境周期性运动时引起的有规律的眼或头追踪运动(慢相运动)即为眼动反应或视动性头震颤。五天龄(5dpf) 的幼鱼视觉系统就已非常成熟(viewed in Bilotta, 2001)，适合行为学检测。该行为学指标常用于筛选与视功能相关的不同遗传背景或操作的幼鱼。视动反应：视动反应是指斑马鱼对移动的目标有一种追逐的行为。当将成年斑马鱼放在一个圆形光栅的内部时，斑马鱼对光栅的追随行为会表现为一种圆周性运动(图2)。图1 眼动反应装置图2 成鱼视动反应装置

斑马鱼常见病

斑马鱼常见鱼病鱼病种类很多。按照发生原因得不同，大体分为两类：一类就是非感染性疾病，一类就是感染性疾病。两类疾病对斑马鱼得健康均可形成严重得危害。其中以感染性疾病造成得危害较为严重，常常可形成大规模得爆发或感染，严重影响斑马鱼得质量与实验结果得准确性。斑马鱼属于鲤科鱼类。感染鲤科鱼类动物得病原均有可能感染斑马鱼。本章将对斑马鱼中常见疾病及可能得应对方法做一个简单得介绍。第一节细菌性疾病 1、分支杆菌病病原：海分支杆菌（M、marinum）、脓肿分支杆菌（M、abscessus）、龟分支杆菌(M、Chelonae)、偶发分支杆菌(M、Fortuitum)、草分支杆菌(M、Peregrinum) 与嗜血分支杆菌(M、Haemophilum)等。分支杆菌属就是一类细长或略带弯曲得需氧杆菌，该属细菌一般不易着色，需要进行抗酸性染色，此外染色时需要加温或者延长染色时间。该病能引起鱼结核病。临床症状与病变：溃疡、出血、头部周围充血、鱼鳞凸起，鱼鳍磨损，皮肤或者鳃苍白等。内脏器官会有白色结节出现（图3、1）。图3、1分支杆菌感染病理图。左侧，宝刀鱼头肾组织感染分支杆菌产生得白色肉芽肿；中间，分支杆菌感染产生得肉芽肿切片（其切片内含有空腔得巨噬细胞）；右侧，分支杆菌感染雨肠道切片得抗酸染色（抗酸菌染色呈红色，非抗酸菌染色呈蓝色）显微观察与诊断：诊断时根据上诉症状，再取内脏中得小结节做涂片，进行抗酸染色后如发现长杆形得抗酸菌，基本就可以确诊。也可根据分支杆菌16S rDNA基因保守序列设计引物，PCR扩增一段924bp得特异性片段，对其测序就可快速得出鉴定结果。防治：一般来说分支杆菌感染很难用抗生素进行根治，有文献报道50 ppm卡拉霉素对其有一定得控制作用。此外，优化饲养条件对其预防也有一定作用。 2、细菌性败血症病原：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、温与气单胞菌(Aeromonas sobria），河弧菌生物变种（Vibrio fluvialis），产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)，豚鼠气单胞菌（A、caviae）等气单胞菌属。气单胞菌属均为革兰氏阴性菌，其中就是嗜水气单胞菌能产生外毒素，具有溶血性、肠毒性及细胞毒性。临床症状与病变：体表及内脏充血, 出血, 突眼, 腹部膨大,有淡黄色或红色腹水, 肝、脾、肾肿大, 花肝, 脾紫黑色, 严重贫血等。

斑马鱼常见疾病

斑马鱼常见疾病烂鳍病/病尾病（嗜水气单胞菌）多由饲水不良，水质长期浑浊，受新水刺激过多，或鱼儿互相撕咬导致细菌感染。感染的迹象: 最初，鳍的边缘出现轻微的不透明的外观。然后膜一片片地脱落，暴露出鳍刺，鳍刺开始依次裂开。当裂缝到达身体时，受侵害的鱼通常都会死亡。感染详述: 引起烂鳍病的细菌可能经常出现，特别是嗜水气单胞菌，荧光假单胞菌和鳗弧菌，它们只在恶劣的环境里侵害不健康的鱼。这些细菌能引起一系列的症状，如斑点、区域发炎和溃疡。细菌传染引起的损伤使受侵害的鱼容易受到来自其他病原体如真菌、病毒和寄生虫的侵害。推荐的治疗方法: A，在100千克的水中放呋喃西林粉0.2克进行浸洗消毒，多次用药后可缓解病情。 B，在100千克水中放痢特灵3~5片，浸洗病鱼30分钟。 C，在100千克水中放土霉素5~8片浸洗消毒，可预防感染此病。 D，用低浓度的高锰酸钾溶液浸洗消毒。 E，用庆大霉素浸洗，在100厘米X50厘米X35厘米的水族箱中放2支。对于如此多的疾病，除非环境条件很满意，任何化学药物治疗都不是完全有效的。有几种以苯氧基乙醇、聚-氯-苯氧基乙醇或呋喃那斯为基础的专用处理剂，假如治疗不被耽误的话，它们可能有效。杀菌的化学药物如氯化苯甲烃胺（新洁尔灭），也能使用。对于冷水鱼类的治疗，水温至少应该升高到16度。对付烂尾如果一时找不到鱼药，可到药店去买泻痢停（肤腩睉酮），找一小缸药浴，40CM缸加8片（慢慢搓溶于水），同时充气。若是热带鱼将水温升到30摄氏度，隔天补加一半药片，效果极佳。一般一周内会康复。烂鳃病患烂鳃病多由寄生虫寄生或细菌感染引起，故有寄生虫烂鳃病和细菌性烂鳃病两种。（1）寄生虫烂鳃病：其病原体是指环虫或车轮虫，它们交互感染，鳃部明显浮肿，鳃盖张开困难，严重时，鳃丝局部溃烂，以至鳃软骨外露，鱼体呼吸困难，最终死亡。防治方法：可选用晶体敌百虫0.5-0.8克，放在10千克水中，浸洗病鱼10-15分钟。也可选用晶体敌百虫0.2克、硫酸铜0.2克、亚硫酸铁0.2克，混合放入10千克水中，浸洗病鱼10-15分钟。或选用晶体敌百虫0.2--0.3克溶于水中，泼洒在1吨饲水中，每周用药1-2次，可有效杀死水中的寄生虫。（2）细菌性烂鳃：其病原体是水霉菌,病鱼鳃丝严重失血,鳃丝发白,严重时有絮状菌丝粘附,死亡率极高。防治方法：可选用食盐50克、小苏打50克，混合放在10千克水中，浸洗病鱼15-20分钟。也可选用0.7克孔雀石绿，放在100克水中，浸洗病鱼15-30分钟。（3）粘孢子虫性烂鳃：其病原体是粘孢子虫，鳃丝会出现许多肉眼可见的灰白色点状或胞囊，由小变大破坏鱼鳃，当胞囊一旦破裂，无数个孢子虫进入饲水，重新侵入健康鱼的鳃部，鳃丝失血导致大批死亡。粘孢子虫引起的烂鳃病比较少

CRISPR(Cas9) System斑马鱼基因敲除-实验流程3

1、gRNA模板扩增：（以gRNA质粒为模板，扩增片段大小为100bp多） 40ul体系，利用保真性>= Extaq的酶扩增4管；可以通过胶回收纯化扩增模板（四管过同一个回收柱子），或通过沉淀纯化（附件1）; 沉淀回收模板前，要进行利用5ul电泳检测是否扩增出目的条带；以上模板皆用20ul DEPC水回溶(,反复洗柱子两次)。 2、gRNA合成： 10ul 反应温度37 3、gRNA纯化 a.加入1ul DNase I，37℃处理15min； b.加入1ul 0.5 M EDTA 8.0，65℃处理10min； c.加入57.5ul DEPC water 和 7.5ul 3M sodium Acetate solution(pH 5.2); d.加入等体积（即77ul）酚氯仿（1:1 mix）；12000rpm，15min； e.吸取上部水相到新的PCR-tube，加入等体积氯仿，12000rpm，15min； f.重复操作e； g.收集水相到new-PCR-tube，加入2倍体积无水乙醇；-20℃沉淀至少30min； h.12000rpm，15min，去除液体，留下白色gRNA沉淀； i.70%乙醇洗3次（每次12000rpm，6min）； j.去除70%，自然干燥，10-20ul DEPC water溶解；-80℃保存。注意：以上为RNA操作，请使用灭菌未开封的tips and tubes，尽量不说话，避免RNA酶污染。以上合成与纯化过程为KIT说明书翻译得到，如使用与本实验室不同KIT，请阅读相关说明书。 4、Cas9 template 准备（酶切4h，40ul体系）将zf-cas9-vector 线性化，即XbaI 单酶切；酶切2 tube，2.3或2.5ug/tube；过同一个胶回收柱子；20ul DEPC water 回溶，洗涤柱子两边，-20℃保存。 5、cas9-mRNA 合成 20ul 反应温度37℃，时间4.5h。纯化： A．加入1ul DNase I，37℃处理15min； B．20ul反应体系，加入30ul LiCl； C．冰浴或-20℃沉淀至少30min； D．4℃,12000rpm,15min; E．100ul 70%乙醇洗2次（每次12000rpm，6min）； F．10ul DEPC water溶解；-80℃保存。注意：RNA样品根据每次用量的多少分装保存，避免反复冻融，降解。一般1ul/tube保存。

斑马鱼

斑马鱼斑马鱼(zebra fish)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼（Brachydaniorerio），原产于印度、孟加拉国。斑马鱼(B. rerio)，是淡水水族箱观赏鱼，原产于亚洲，体长约4公分(1.5吋)，具暗蓝与银色纵条纹，蓑鮋属鱼类是海水水族箱观赏鱼，鳍棘有剧毒，体具色彩丰富的垂直条纹。有些种类称为蓑鮋(lion-fish)或称狮子鱼、火鸡鱼。由于其基因与人类87%相似，因此广泛应用与生命科学的研究，2009年研究表明，它可能为盲人和耳聋带来福音。中文学名：斑马鱼别称：蓝条鱼、花条鱼、蓝斑马鱼、印度鱼、印度斑马鱼二名法：Daniorerio界：动物界门：脊索动物门Chordata纲：辐鳍鱼纲Actinopterygii 目：鲤形目Cypriniformes科：鲤科Cyprinidae 属：（鱼丹）属Danio种：斑马鱼 D. rerio 简介斑马鱼(zebra fish)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼（Brachydaniorerio），原产于印度、孟加拉国。(里面常见的蓝斑马讲解）是两个非近缘鱼类类群，即鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)短鱼丹属(Brachydanio)淡水鱼类和鮋形目(Scorpaeniformes)鮋科(Scorpaenidae)蓑鮋属(Pterois)海水鱼类的统称。斑马鱼(B. rerio)，是淡水水族箱观赏鱼，原产於亚洲，体长约4公分(1.5吋)，具暗蓝与银色纵条纹，蓑鮋属鱼类是海水水族箱观赏鱼，鳍棘有剧毒，体具色彩丰富的垂直条纹。有些种类称为蓑鮋(lion-fish)或称狮子鱼、火鸡鱼。斑马鱼是一种常见的热带鱼。斑马鱼体型纤细，成体长3-4cm，对水质要求不高。孵出后约3个月达到性成熟，成熟鱼每隔几天可产卵一次。卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。发育温度要求在25-31℃之间。斑马鱼由于个体小，养殖花费少，能大规模繁育，且具许多优点，吸引了众多研究者的注意。经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库里有相关斑马鱼的资料可供查询和下载，方便了研究。斑马鱼的细胞标记技术、组织移植技术、突变技术、单倍体育种技术、转基因技术、基因活性抑制技术等已经成熟，且有数以千计的斑马鱼胚胎突变体，是研究胚胎发育分子机制的优良资源，有的还可做为人类疾病模型。斑马鱼已经成为最受重视的脊椎动物发育生物学模式之一，在其它学科上的利用也显示很大的潜力. 特征体长4～6厘米。体呈纺锤形。背部橄榄色，体侧从鳃盖后直伸到尾未有数条银蓝色纵纹，臀鳍部也有与体色相似的纵纹，尾鳍长而呈叉形。雄鱼柠檬色纵纹；雌的斑马鱼蓝色纵纹加银灰色纵纹。繁殖方法喜在水族箱底部产卵，斑马鱼最喜欢自食其卵，一般可选6月龄的亲鱼，在25厘米X25厘米X25厘米的方形缸底铺一层尼龙网板，或铺些鹅卵石，繁殖时产出后即落入网板下面或散落在小卵石的空隙中。选取2~3对亲鱼，同时放入繁殖缸中，一般在黎明到第二天上午10时左右产卵结束，将亲鱼捞出。其卵无粘性，直接落入缸底，到晚上10时左右，没有受精的鱼卵发白，可用吸管吸出。繁殖水温24℃时，受精卵经2~3天孵出仔鱼；水温28℃时，受精卵经36小时孵出仔鱼。雌鱼每次产卵300余枚，最多可达上千枚。水温25℃时，7~8天的仔鱼开食，此时投喂蛋黄灰水，以后再投喂小鱼虫。斑马鱼的繁殖周期约7天左右，一年可连续繁

斑马鱼原位杂交实验方案

斑马鱼全胚胎原位杂交技术 Form Dr. Kevin 第一节原位杂交技术的历史 Joseph G. Gall被誉为现代细胞生物学的一位奠基人，他在染色体结构和功能领域作出了杰出贡献，并发明了原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）。自Gall同他的研究生Mary Lou Paudue和Susan Gerbi 在1969年利用放射性标记DNA在爪蟾组织切片中检测基因表达后，原位杂交技术逐渐发展为一种能使研究人员在一个染色体上定位并确定出基因和特殊的DNA序列的强大方法，推动了分子生物学的巨大进步。 Kathleen H. Cox于1984年发明了用单链RNA探针进行原位杂交的技术。ISH技术在斑马鱼中的应用始于Westerfield等利用该技术在斑马鱼切片中检测基因的表达。同年, Nusslein-Volhard等将Cox 建立的RNA 原位杂交技术进行了改进, 用地高辛（digoxin）标记的RNA 在斑马鱼胚胎中检测基因表达。2008 年, Bernard Thisse等将该技术进一步优化, 使之更敏感, 也提高了基因表达检测的分辨率，我们在这里介绍的整胚原位杂交技术主要参照Thisse实验室2008年版本（Thisse, C. and Thisse, B., 2008, High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. protoc. 3 : 59 – 69）。第二节原位杂交技术的原理原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。整胚原位杂交（whole-mount in situ hybridization）不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位。整胚原位杂交指在胚胎组织或细胞结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测组织中相应的基因片段相结合（杂交），所形成的杂交体(Hybrids）经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。该技术不仅可以用于检测基因的时空表达, 为研究该基因功能以及基因分类提供线索，还可以应用于高通量药物筛选或突变体筛选中, 以特异表达的基因标记作为筛选的重要依据。（图5.1）

斑马鱼胚胎发育过程中Mef2c的表达

万方数据

复旦学报（医学版）２００６年１月，３３（１）脏的发生与发育过程中的作用提供依据。材料和方法斑马鱼胚胎固定收集不同发育时期的ＡＢ野生型斑马鱼（购自俄勒冈大学，斑马鱼养殖系统从美国ＡｑｕａｔｉｃＨａｂｉｔａｔｓ公司引进）胚胎：６ｈｐｆ（ｈｏｕｒｓｐｏｓｔ—ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，受精后６ｈ）、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１７、２０、２４、３６、４８ｈｐｆ，用４％多聚甲醛溶液固定过夜（至少固定１２ｈ），保存于甲醇溶液中，置一２０℃备用。引物设计与合成首先根据Ｇｅｎｂａｎｋ数据库查得斑马鱼Ｍｅｆ２ｃｃＤＮＡ序列（Ｇｅｎｂａｎｋ：３０５７５），以包含密码子１３１９～２３８５位的基因序列为ＲＮＡ探针序列，探针序列总长１０６６ｂｐ。ＲＮＡ探针的引物序列（由上海赛百盛生物有限公司合成）为：Ｆｏｒ—ｗａｒｄ：５＇－ＣＴＣＡＡＡＴＡＣＧＧＡＡＡＡＧＣＴＡＣ一３７Ｒｅｖｅｒｓｅ：５＇－ＣＧＣＣＣＧＴＧＧＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＡＧ一３７。ＰＣＲ扩增以斑马鱼基因组总ＤＮＡ为模板，用以上两条引物特异扩增ＲＮＡ探针序列。扩增条件为：９５℃预变性２ｍｉｎ，９５℃变性４５Ｓ，５７℃复性４５Ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，重复３０个循环，最后７２℃延伸７ｍｉｎ。１％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。合成反义ＲＮＡ探针将纯化的扩增产物连接到ｐＧＥＭ—Ｔ载体（Ｐｒｏｍｅｇａ）中，然后转化到ＤＨ５ａ感受态菌株（博大泰克）中进行克隆。根据Ｈａｒｌａｎｄ的方法［４３抽提转染后的连接载体质粒（测序验证质粒中插入序列是否正确），ＮｏｔＩ内切酶（ＮＥＢ）酶切完全，以其为模板转录合成反义ＲＮＡ探针。整体原位杂交取不同发育时期的胚胎，用１×ＰＢＳＴ溶液洗去多余的甲醇溶液，将胚胎置于６５℃水浴进行预杂交３ｈ，然后加入所合成的反义ＲＮＡ探针６５℃水浴杂交过夜。多余的探针用０．２×ＳＳＣ溶液洗去，加入ａｎｔｉ—Ｄｉｇ—ＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）与反义ＲＮＡ探针结合过夜。未结合的抗体用１ＸＰＢＳＴ溶液洗去，再加入ＢＣＩＰ／ＮＢＴ／ＮＴＭＴ溶液显色３０ｍｉｎ，迅速用１ＸＰＢＳＴ溶液洗去多余的显色液，在显微镜下观察并记录结果。结果探针合成效果琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，本实验中设计的引物能够特异性地扩增目标基因片段。图１Ａ为特异扩增的ＲＮＡ探针序列电泳检测结果，扩增的ＲＮＡ探针序列大小约１０６６ｂｐ。图１Ｂ为酶切后电泳迁移率的改变，２、３泳道是未被酶切的质粒序列，４、５泳道是酶切后的质粒序列。酶切后质粒电泳速率要比未酶切质粒的速率要快。同时，我们将该序列测序后进一步验证（由上海赛百盛生物有限公司测序），连接至ｐＧＥＭ—Ｔ载体中的ＲＮＡ探针的序列是正确的。图ｌ凝胶分析ＰＣＲ结果（Ａ）和质粒酶切结果（Ｂ）Ｆｉｇ１ＧｅｌａｎａｌｙｓｉｓＰＣＲ（Ａ）ａｎｄｐｌａｓｍｉｄ（Ｂ）Ａ：１：ｍａｒｋｅｒ；２－５；ＲＮＡｐｒｏｂｅ．Ｂ：１：ｍａｒｋｅｒ；２－３：Ｍｅｆ２ｃＲＮＡ—ｐＧＥＭＴ；４－５：Ｍｅｆ２ｃＲＮＡ－ｐＧＥＭＴｃｕｔｂｙＮｏｔ－１斑马鱼整体原位杂交在斑马鱼胚胎发育早期，Ｍｅｆ２ｃ在胚体中没有自身的转录产物，仅少许从母体自带的Ｍｅｆ２ｃｍＲＮＡ存在，胚体染色呈现为弥散均染状态（图２：ａ，ｂ见封二）。当胚胎逐步发育到１３ｈｐｆ，Ｍｅｆ２ｃ在体节中开始表达，此时约已形成８个体节，表现为在背侧出现两条条带状的深染部位；同时，在心脏中的表达也开始出现，在靠近头侧部出现有深染的片状区域，代表早期的生心区的细胞中有Ｍｅｆ２ｃ表达（图２：ｃｌ，ｃ２见封二）。当胚胎发育至１５ｈｐｆ时，体节以及心脏中Ｍｅｆ２ｃ的表达更加明显，Ｍｅｆ２ｃ在体节的表达表现为各个体节之间能清晰区分，并表现为典型的Ｖ型结构；同时，心脏中的表达表现为生心区细胞开始集中，逐步靠近体轴开始形成心管结构，体现出染色更为集中，由片状染色转变成为线状（图２：ｄｌ，ｄ２见封二）。随着胚胎进一步发育，体节逐步完善，心管逐步形成，Ｍｅｆ２ｃ仍然保持较高的转录水平，体节中表现为随着体节的增多，Ｖ型染色的体节也随之增多；在心脏的表达呈现出明显的线管状结构（图２：ｅ，ｆ见封－－）。斑马鱼的胚胎发育随着时间的进展而逐步完　万方数据