麻黄碱对支气管平滑肌细胞增殖的影响_景红娟

收稿日期:2007-07-12;修回日期:2007-09-25

作者简介:景红娟,女,博士在读,主要从事动物电生理和离子通道方面的研究。

麻黄碱对支气管平滑肌细胞增殖的影响

景红娟1

,汪长东,宋 苏,甘 露,何光源

(华中科技大学分子生物物理教育部重点实验室,武汉 430074)

摘 要:在前人工作的基础上,采用一种更简省的方法分离培养支气管平滑肌细胞;并且利用显微镜观察和MTT 的方法,研究了麻黄碱对支气管平滑肌细胞形态和增殖的影响。结果表明:麻黄碱对支气管平滑肌细胞的形态没

有明显影响,但是对平滑肌细胞的增殖有一定的抑制作用,并进一步阐述了麻黄碱治疗哮喘等呼吸系统疾病的作用机理。

关键词:麻黄碱;哮喘;细胞增殖中图分类号:Q 25,Q 47,Q 952

文献标识码:A

文章编号:1008-9632(2008)03-0027-03

麻黄(Ephedra Sinica ),是亚洲中部的一种长绿灌木。麻黄作为中药在中国已经有5000多年的历史,在中国古代的汉代,麻黄就被用来治疗普通感冒、支气管炎、哮喘和关节炎

[1]

。麻黄的功效主要是由地上部分

的生物碱引起的,麻黄碱是麻黄中主要的生物碱成分,占生物碱总量的80%。传统的观念认为:麻黄碱可以直接激动肾上腺素受体,或通过促进肾上腺素能神经末梢释放去甲肾上腺素而间接激动肾上腺素受体,对A 和B 受体均有激动作用,从而舒张支气管,达到治疗哮喘和咳嗽的目的。本文从支气管平滑肌入手,研究麻黄碱对支气管平滑肌细胞的影响,首次从细胞增殖角度阐述麻黄碱治疗哮喘的作用机理1 材料与方法

111 药品与试剂 麻黄碱由中国药品生物制品检验所提供;胎牛血清(FBS)购自武汉三利生物技术有限公司;D M E M /F12粉剂培养基为G i bco 产品;胰蛋白酶(T yr psi n)是Am resco 公司分装的药品;四唑盐(MTT )由B io m ol 分装。

112 主要仪器 全内反射荧光显微镜(O l y mpus 公司),酶标仪(TECAN 公司的S UNR I SE ),离心机,水浴锅等。

113 支气管平滑肌细胞的获取及培养

取SP 级出生4d 之内的W istar 大鼠(购自湖北省防疫站),75%酒精消毒后使其窒息死亡,用手术器械剖开胸腔和咽喉将肺部和气管一起取出,放在预冷的D-H anks 溶液中,沿气管小心分离出气管及下游支气管,纵向剪开气管,剥去粘膜层,粘膜下层和浆膜层。

肌层剪碎,用0125%胰蛋白酶,3815e 水浴消化2h 左右。1000r/m i n 离心5m i n 后,弃上清。加入10%FBS 的D M EM /F12培养基,在37e ,5%CO 2培养箱培养,待用。

114 形态学观察

将培养的原代支气管平滑肌细胞(5~10代),消化后,按照1@105

/mL 的细胞密度将其分装在6孔板中,培养过夜后,每孔加入400L L 麻黄碱母液(1mg /mL),终浓度为300L g /mL ,对照孔加入等量的PBS 溶液,继续培养24h 后镜检观察。115 M TT 法

将上述培养的支气管平滑肌细胞,消化后以1@105

/mL 的细胞密度,每孔种100uL 于96孔板中。每孔加入45L L 麻黄碱母液(1mg /mL ),终浓度为300L g /mL ,对照组加入等量的PBS 溶液。测量时,待测孔和对照孔每孔分别加入10L L 的M TT 储液(5m g MTT 干粉溶于1mL 无血清的D M EM 中,0122L m 滤膜过滤除菌),37e 培养箱中孵育4h ,细胞内出现蓝紫色晶体;用移液枪小心吸出上层溶液后,每孔加入100L L 二甲亚砜(DM SO ),吹打后置37e 培养箱5m i n ,使细胞内的蓝紫色晶体完全溶解;酶标仪以空白对照调零后,在570n m 处测OD 值,每天测3孔,取平均值;绘制细胞生长曲线;因为细胞数量和570n m 处OD 值成正比,所以麻黄碱对支气管平滑肌细胞增殖的抑制率=OD 570(麻黄碱)/OD 570(对照)@100%。2 结果

211 支气管平滑肌细胞

27

a 1支气管平滑肌细胞(@100);

b 1支气管平滑肌细胞(@400)

图1 支气管平滑肌细胞

F i g 1M orph of b ron ch i al s m oot h m uscl e cells

图1所示就是分离培养48h 后的支气管平滑肌细胞。a 是放大100倍镜下的细胞图片,可见细胞长势良好,基本铺满培养瓶的底部,细胞呈梭形、长条形、三角形或不规则形状,是平滑肌细胞的典型特征;b 是400倍显微镜下的细胞照片,可见细胞轮廓明显,呈现清晰

的梭形。

212

麻黄碱对支气管平滑肌细胞形态学的影响

a 1加入PBS 后的支气管平滑肌细胞(@100);

b 1加入麻黄碱后的支气管平滑肌细胞(@400)图2 麻黄碱对支气管平滑肌细胞形态的影响

Fig 2E ffects of eph edri n e on the morph of b ronch i a l s m ooth m uscle cell s

从图2可以看出来,培养的平滑肌细胞(5~10代),由于细胞骨架纤维的解体,细胞的形状变的更加不规则。图a 所示的是对照,图b 是麻黄碱作用24h 后的照片,对比a 、b 两图,我们可以看出:麻黄碱对支气管平滑肌细胞的形态没有影响,细胞依旧呈梭形、圆形、三角形或不规则形状。

213

麻黄碱对支气管平滑肌细胞增殖的影响

时间(h )

图3 麻黄碱对支气管平滑肌细胞增殖的影响F i g 3Infl uen ces of eph edri ne on t h e proli ferati on of bronch i al

s m ooth m uscle cells

图3表明:麻黄碱作用72h 后,对支气管平滑肌细胞生长抑制率为1215%;作用96h 后,抑制率为1912%。另外,支气管平滑肌细胞的生长曲线与细胞系的S 型生长曲线不同。如图3所示,支气管平滑肌细胞传代后不经过潜伏期直接进入对数生长期,而且48h 后,同样没有平台期直接进入细胞生长的衰退期。

3 讨论

首先,本文改进了获取原代支气管平滑肌细胞的方法,同以往的方法相比

[2]

,该方法更加俭省,不需要

添加胶原酶、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白等,仅需要一种胰蛋白酶即可,节约了试验成本。而且,如图1所示,得到的支气管平滑肌细胞长势很好,48h 后即可基本铺满培养瓶底部。

另外,麻黄含有的生物碱种类主要有以下几种:麻黄碱(ephedri ne),伪麻黄碱(pse udoephedri ne),甲基麻黄碱(methylephedrine),甲基伪麻黄碱(m ethlpseudo -ephedri ne),去甲麻黄碱(norephedri ne),去甲伪麻黄碱(norpse udoephedri ne)。总生物碱占麻黄最大含量的1%~2%,其中麻黄碱的含量最为丰富[1]

。麻黄作为

一味中药,可用来缓解呼吸系统疾病如:支气管炎和哮

喘

[1,3]

。有文献报道:气道改型(air w ay re m oldeli ng)是

一种在哮喘和慢性阻塞型肺疾病(c hronic obstructive

pul m onar y disease)中观察到的病态特征[4]

。哮喘以黏

液腺肥大、皮下组织纤维化和气道平滑肌增厚为特征。另外,哮喘患者的气道平滑肌增殖多发生在大的气道中,而慢性阻塞型肺疾病患者的平滑肌增厚多发生在小气道中

[5,6]

。可见,平滑肌细胞增殖是引起哮喘和慢

性阻塞型肺疾病的关键因素。本文研究结果表明:麻黄碱对支气管平滑肌细胞的形态没有明显影响,但对其增殖有一定的抑制作用,这也是麻黄碱治疗哮喘的一个作用机理。另有文献报道,在哮喘和慢性阻塞型肺疾病中观察到的气道平滑肌增殖部分是由多肽生长因子如血小板生长因子(PDGF )、表皮生长因子(EGF )、胰岛素类生长因子(I GF -1)、基本的成纤维细胞生长因子(bFGF )介导的

[7]

。这些生长因子依赖

增殖反应相关的MAP 激酶和P I-3激酶(细胞增殖反应的下游目标)激活,M AP 激酶和P I -3激酶能够被M 受体(muscari n ic rece ptor)激活,再通过胆碱类激活p42/p44M AP 激酶,从而开启细胞的增殖活动。如:M 受体刺激与多肽生长因子相互作用,在人

[8]

和牛

[9]

的

气道平滑肌细胞中协同诱导有丝分裂。但是,有文献报道:乙酰甲胆碱和PDEF 在牛支气管平滑肌中协同诱导的有丝分裂,与乙酰胆碱和EGF 在人类气道平滑肌细胞中一样

[8]

,通过协同激活p70S6激酶,而不是

28

p42/p44M AP激酶。尽管P KC的活性与p42/p44MAP 激酶相关,然而,PKC通过其他途径的激活,仍然参与协同作用。因此,麻黄碱是通过抑制p42/p44M AP激酶途径还是通过抑制p70S6激酶途径来抑制细胞的增殖,还有待试验的进一步确证。

总之,麻黄碱能直接作用于A、B两种受体,发挥拟肾上腺素作用,也能促使肾上腺素能神经末梢释放出化学递质,间接地发挥拟肾上腺素作用。具有松弛支气管平滑肌、兴奋心脏、收缩血管、升高血压等作用。本文从细胞角度入手,验证了麻黄碱对支气管平滑肌细胞的形态没有明显影响,但是对支气管平滑肌细胞的增殖有一定的抑制作用,这对麻黄碱治疗哮喘等呼吸系统疾病提供了新的试验支持。

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The i nfl uences of ephedri ne on proliferation of bronchial

smooth muscle cells

JING Hong-juan,WANG Chang-dong,SONG Su,GAN Lu,HE Guan-yuan

(K ey Labo ra tory o fM o l ecular B i ophysicsM i n istry o f Educati on,Hua zhong U niversity of

Sc ience and T echno l ogy,W uhan430074,Ch i na)

Abstract:On the bas i s of research work prev i ou sl y,a m ore conven i en t and econo m i calm et hod w as u sed t o is olat e t he bronch i al s m oot h mu scl e cell s (BSM C s).B y m eans ofm icroscope ob servati on andM TT m et hods,t he effects of eph edri n e on app earance and proliferati on of BSM C s w ere stud ied.Re-su l ts sho w ed that eph edri ne had no obvi ou s i n fl u ences on t he m orph of BS M C s,bu t ephed ri ne i nh i b it ed t he p roliferati on of BS M C s.The furt her progress t o el uci date t he m ec h an i s m of ephedri n e treat ed on asthma and other diseas es of res p iratory apparat u s w as made.

K eywords:ephedri n e;ast hm a;cell p roliferati on

(上接26页)A cute toxicity research on the antitu m or protei n produced

by B acillus cereus ZH-14

Z HOU W en-w en,N IU T ian-gui

(Coll ege o f Food Sc ience and N utriti onal Eng i neeri ng,Chi na A gr i cultural U niversity,B eiji ng100083,China)

Abstract:Th e antit um or p rotei n produced by B acillus c ere u s Z H-14had4316%i nh i b iti on ratio of proliferati on of S-180solid t um or cells i n v itro1 To verif y whether itw as s afe or not,an acute tox i city experi m en tw as carri ed ou t1The results ofH orn c s m ethod s h o w ed t h at LD50of the an tit um or p rotei n w as h i gh er t han21500mg/kg and t he protei n bel onged to t h e p racti cal non-t oxic1The li ve cells of the Z H-14s trai n h ad no ac u te toxic eff ectw it h the b io-m ass of l ess t han2103@109cf u/mL1M ax i m al tolerance of experi m entalm i ce w as29518ti m es as m any as the reco mm end ed dose i n hum an1The li ve cell s of the b i o m ass of2103@107cf u/m L and2103@106cf u/mL sped t he body w ei ght i ncrease ofm ice1Th e res earch provi d ed m any exp eri m en t a lbases f or cli n ical treat m ent1

K eywords:Ba cillus cere u s;an titu m or;acute tox i city;LD

50

29

一氧化氮对气道平滑肌细胞钾通道的影响

·７０国外医学呼吸系统舒册２００２年第２２卷第２期 一氧化氮对气道平滑肌细胞钾通道的影响 Ｒ酤Ａ 华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸内科（武汉４３００３０）高亚东综述熊盛道徐永健审校 摘要一氧化氨可通过ｃＧＭＰ途径和ｃＧＭＰ非依赖性途径，作用于气道平滑肌上高电导钙依赖性钾通道的ａ亚单位，使通道蛋白磷酸化或共价修饰，开放概率增加。～氧化氨（ＮＯ）对其它钾通道也有类似作用。钾通道开放可使钾离子外流，细胞膜趋于复极化或超极化，从而降低平滑肌张力。深入了解ＮＯ开放钾通道的机制可能为哮喘的治疗提供新的途径。 关键词一氧化氮；气道平滑肌；钾通道 气道平滑肌（ＡＳＭ）是气道对外界刺激的主要效应器，ＡＳＭ细胞质量和数量的改变可能是气道高反应性的原因…。人类ＡＳＭ细胞膜上表达多种不同类型的钾通道，包括高电导钙依赖性钾通道（Ｂｋｅａ），４－氨基吡啶（４一ＡＰ）敏感的延迟整流钾通道（Ｋｄｒ）。ＡＴＰ敏感的钾通道（ＫＡｒｖ）等ＬｌＪ。这些通道参与ＡＳＭ细胞静息膜电位的形成，介导ＡＳＭ对舒张剂和收缩剂的反应。一氧化氮（ＮＯ）是一种主要的内皮依赖性舒张因子，参与多种生理、病理过程。除可调节ＡＳＭ张力外，还能抑制ＡＳＭ细胞的ＤＮＡ合成和细胞增殖，因而在质量和数量两方面影响ＡＳＭ的特性，在气道重塑中有重要意义＿２ｊ。ＮＯ通过多种细胞内信号转导途径降低气道平滑肌的张力，其中有两条途径涉及到激活钾通道１３』。本文就ＮＯ激活钾通道的特点及内在机制作一综述。 １ＮＯ对高电导钙依赖性钾通道的作用 １．１作用特点Ｎｏ可对多种不同组织和器官的平滑肌细胞钾通道产生作用。平滑肌细胞膜Ｂｋｃａ通道对膜电压和细胞内钙离子浓度变化敏感，膜去极化和细胞内钙离子浓度上升（钙火花）可激活钾通道，Ｋ＋短暂外流，使细胞膜复极化，从而抑制兴奋收缩耦联。因而，Ｂｋｃａ通道被看成是平滑肌张力的负反馈调节因子＿４一。ＮＯ主要影响ＡＳＭ细胞Ｂｋｃａ通道的开放概率，对单通道电导无影响Ｌ３，５Ｊ。Ｙａｍａｋａｇｅ等采用细胞吸附式膜片钳技术对急性分离的猪ＡｓＭ细胞研究发现，ＮＯ供体硝普钠可使Ｂｋ∞通道开放概率增加】３倍，单通道电流也有所增加，对电导无影响，其机制是使通道短开放事件增加，平均关闭时间下降；另一种ＮＯ供体ｓ亚硝基一Ｎ．乙酰青霉胺（ＳＮＡＰ）可显著松弛乙酰胆碱收缩后的人气管平精肌条，Ｂｋｃａ通道特异性抑制剂ＣｈＴＸ（ｃｈａｒｙｂｃｌｏｔｏｘｉｎ）和钾通道非特异性抑制剂四乙铵可显著削弱这种松弛作用，说明Ｎｏ对ＡＳＭ细胞的松弛反应是由钾通道介导的∞Ｊ。 除外源性ＮＯ外，内源性Ｎ０也可开放钾通道，这种作用可被一氧化氯合酶（Ｎｏｓ）抑制剂抑制。Ｅｌｌｉｓ等用组胺预先收缩豚鼠气管环，电场刺激下气管环内非肾上腺能非胆碱能神经元能释放Ｎｏ，松弛气管环；ＮＯＳ竞争性抑制剂Ｌ＿硝基一Ｎ一精氨酸（Ｌ—ＮＮＡ）可使实验组气管环最大松弛反应下降到对照组的（４１二９）％。／３ｋｃｍ通道特异性抑制剂ｉｂＴｘ（ｉｂｅｒｉｏｔｏｘｉｎ）下降到（２１ｉ８）％，联合应用Ｌ—ＮＮＡ和ｉｂＴｘ下降到（１ｉ１）％．说明内源性Ｎｏ部分通过Ｂｋｃａ通道发挥作用ＭＪ。在单通道水平，ＮＯＳ非竞争性抑制剂氮蓝四唑（ＮＢＴ）能可逆性抑制大鼠脑血管平滑肌细胞上Ｂｋｃａ通道的开放，其具体的作用机制尚不清楚‘“。目前还无Ｎｏｓ在单通道水平对气道平滑肌细胞Ｂｋｃａ通道作用的报道。 多种因素可影响ＮＯ对钾通道的开放作用。①胞外Ｋ＋浓度。狗股静脉平滑肌条分别用前列腺素Ｆ２ａ（ＰＧＦ２ａ）和氯化钾（６０ｎｖ－ｎ０１）收缩后，ＮＯ对氯化钾组的松弛作用明显低于ＰＧＦ２ａ组，说明ＮＯ的平滑肌松弛作用是通过钾通道起作用，降低细胞膜内外两侧的Ｋ＋浓度差可抑制钾通道活性【８Ｊ。②过氧化物的形成。ＮＯ在体内的半衰期很短，很快与超氧阴离子结合成过氧化理硝基，后者可逆性抑制平滑肌细胞的Ｂｋｃａ通道活性Ｌ９＿９。因此超氧化物歧化酶可能减少过氧化物的形成，延长ＮＯ半衰期，从而增强ＮＯ的钾通道开放作用。③温度也可能对ＮＯ的钾通道开放作用产生影响＿ｌ…。 Ｂｋｃａ通道在ＮＯ松弛ＡＳＭ中的地位还存在争议。Ａｂｄｅｒｒａｈｒｎａｎｅ等认为Ｂｋｃａ通道是ＡＳＭ细胞上最重要的一类钾通道，ＮＯ对ＡＳＭ的松弛作用５０％由Ｂｋｃａ介导…３。这与Ｅｌｌｉｓ等的研究是一致的。６Ｊ。而Ｃｏｒｏｒｎｐｔ等对人和豚鼠ＡＳＭ的研究却有不同发现２｜。ＣｈＴｘｌｌ００ｎＭ）、ｉｂＴｘ（１００、３００ｎＭ）和四乙铵（１ｍＭ）不影响或轻度抑制硝普钠对人支气管平滑肌的松弛作用，而ＣｈＴＸ（１００ｎＭ）和ｉｂＴｘ 　万方数据

抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法

抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法 09级生科3班余振洋200900140156 一、【实验原理】 1．关于恶性肿瘤和抗肿瘤药物： 恶性肿瘤是一种常见病，严重威胁着人类的生存质量，被称为人类健康的第一杀手。多年来人类一直在不断的进行抗肿瘤药物的研究，抗肿瘤药物的筛选是整个研究过程中很重要的个环节，而进行药物的筛选首先离不开合理的筛选方法和系统。寻找选择性强、对实体瘤有效的新型抗肿瘤药物，是摆在抗肿瘤药物研究人员面前的重要任务。世界各国对抗肿瘤药物的筛选都非常重视，投入了大量的人力、物力、财力，每年都有大量的化合物(合成药、天然产物和微生物发酵产物)待筛，抗肿瘤药物筛选方法的发展经历了一个探索的过程。 8O年代中期以前，普遍采用的筛选方法是以体内小鼠白血病／淋巴瘤模型P388和L1210为基础的 J，所有化合物在进一步的临床研究之前必须通过这种小鼠肿瘤模型的筛选。即小鼠白血病P388和L1210作为第一轮初筛，能通过第一轮初筛的化合物才能被允许进入第二轮筛选。这种方法有一个很明显的缺陷就是一些在临床上有活性的药物将被筛选掉，无法保证所有具有抗肿瘤作用的药物都能通过筛选。鉴于以前的筛选方法存在较大的缺陷，1985年之后以NCI为首的一些研究单位普遍开始采用针对疾病的筛选方法来代替针对化合物的筛选方法，即放弃体内小鼠筛选，代之为体外代表各种常见实体瘤的人类肿瘤细胞株筛选。这种筛选系统是一种高通量的抗肿瘤筛选体系，其主要优势有两点：其一是多种细胞株初筛有可能筛选出对特殊的人类肿瘤或对特殊组织亚型有活性的物质；其二是这种体外筛选尤其适合于复杂天然产物提取物中有效成份的证实，过去动物筛选需较大量的天然产物，而现在天然产物的需要量就大大减少，可以指导有效成份的进一步分离纯化，使得从天然产物中发现新的抗肿瘤药物更加便利。 2．关于筛选方法： 下面为现阶段较为普遍采用的一些抗肿瘤药物的筛选方法的实验原理。 1）以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物 端粒是染色体特殊结构，起着保护染色体的完整和稳定性的作用，端粒酶是一种核糖核蛋白返转录酶，由RNA和蛋白质组成，可以以自身的RNA为模板合成端粒末端。已发现在正常的体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶活性是阴性，而在人体恶性肿瘤组织和人的肿瘤细胞株中都表达了很高的活性。因此，认为端粒酶与恶性肿瘤的发生发展有密切的关系，有可能成为肿瘤治疗的靶点。 2）应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物 快速荧光素测定法是一种近几年发展起来的应用非常广泛的体外药物敏感性测定方法，其原理为采用一些特殊的荧光染料，对细胞的特定成份进行染色或标记。或通过细胞酶的作用使无荧光性的材料分解或转换为荧光材料，通过测定荧光强度从而测定出活细胞的量。现在普遍采用一种特殊的荧光染 FDAL1u(Fluoreseein diacetate)，在正常情况下它不具有荧光，但当它加人到具有完整细胞膜的肿瘤细胞的营养液中时，由于细胞分泌的水解酶的作用，FDA

KATP通道开放剂对气道平滑肌细胞增殖表达及SOCS3／5免疫失衡的影响

KATP通道开放剂对气道平滑肌细胞增殖表达及SOCS3／5免疫失 衡的影响 目的研究ATP敏感性钾通道（KATP通道）开放剂对气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖过程的影响，以及细胞因子信号转导抑制蛋白3/5（SOCS3/5）表达变化与转化生长因子-β1（TGF-β1）分泌释放水平的关系。方法体外构建增殖型ASMCs原代培养细胞模型，分为ASMCs组、AngⅡ·ASMCs组、淋巴细胞（L）组、ASMCs+L组和AngⅡ·ASMCs+L组。Real-time PCR检测细胞中SOCS3 mRNA及SOCS5 mRNA表达的差异；ELISA法检测上清液中TGF-β1的释放水平。观察KATP通道开放剂尼可地尔（NCR）干预的影响。结果与ASMCs组比较，AngⅡ·ASMCs组TGF-β1的表达水平明显升高（P＜0.01）；NCR作用于细胞后各组ASMCs表达TGF-β1与格列本脲（GLI）比较明显减少（P＜0.05）。与ASMCs+L组比较，AngⅡ·ASMCs+L组SOCS3 mRNA表达增加，而SOCS5 mRNA表达减少（P＜0.05）。NCR可以下调SOCS3的表达，上调SOCS5的表达。结论KATP通道开放可以通过抑制ASMCs增殖而调控TGF-β1分泌表达；SOCS3和SOCS5可能是哮喘气道重塑的特异性免疫治疗中的重要靶点。 标签：KATP通道开放剂；气道平滑肌细胞；细胞因子信号转导抑制因子；哮喘 细胞因子信号转导抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）是近年来新发现的一类负向调节因子[1]，参与多种细胞因子信号转导过程，其中SOCS3和SOCS5作为SOCS家族的重要成员，可能与哮喘等免疫性疾病的发生、发展有关，并有望成为这类疾病的治疗靶点。有研究说明[2]，ATP敏感性钾通道（KATP通道）开放剂对哮喘的气道重塑可以产生有益的作用，其机制尚未见系统性的研究报道。本研究利用在体外原代培养的哮喘大鼠气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells，ASMCs），建立增殖型ASMCs模型，探索KATP 通道开放剂的作用是否与逆转气道平滑肌细胞增殖有关，以及对SOCS3/5免疫失衡的影响，为治疗哮喘等免疫失衡疾病建立新的方法提供理论基础。 1 材料与方法 1.1 实验材料 淋巴细胞分离液，购自碧云天；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记羊抗兔二抗，购自武汉博士德生物工程有限公司；α-肌动蛋白（α-SMA）单抗，购自Boster；SOCS3/5引物，上海生工；大鼠转化生长因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）ELISA试剂盒，购自伊莱瑞特生物科技有限公司；高糖DMEM培养基，购自美国Gbico BRL公司；地塞米松（dexamethasone，DEX）注射液，浙江仙据制药股份有限公司；尼可地尔（nicorandil，NCR），日本Tohoku Nipro医药公司；血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）、Ⅰ型胶原酶（collagenase Ⅰ）、格列本脲（glibenclamide，GLI）均购自Sigma公司。

支气管哮喘时的气道重构

近代认为支气管哮喘是一种特殊的气道炎症，主要表现为气道高反应与变异性较大的可逆性气流阻塞，据此已将哮喘划出慢性阻塞性肺疾病(copd)的范畴，通常认为后者有不可逆气道损伤和持久的肺功能损害。但亦有大量的临床资料显示，二者病理生理改变和临床表现有诸多相似或重叠，copd气流阻塞可能有部分可逆，而相当多的哮喘患者，即使用正规的支气管扩张剂或糖皮质激素治疗，亦表现程度不同的不可逆气流阻塞。 一、气道重构的形态学研究 环绕或位于平滑肌内侧的胶原沉积可使平滑肌收缩时发生更为严重的气道狭窄，而基质中弹力蛋白降解可削弱气道壁对平滑肌收缩的抗力［5］。非哮喘患者及正常人因年龄等因素其气道外径、腔截面积、平滑肌长度等差异很大，但气道内径和壁面积维持相对恒定。而在哮喘患者，气道壁面积明显增加、气道内径缩小［6］。 1.细胞外基质(em)：哮喘气道重构最重要的组织学改变，表现为em，特别是基底膜增厚与透明样变。基底膜虽仍保持完整，但其宽度和密度增加。电镜发现其致密层结构正常，但网状结构显著增加。用各种抗胶原抗体作免疫组化研究证实，网状结构的增厚来源于胶原ⅲ、ⅴ以及少量的胶原ⅰ和纤维连结蛋白(fn)，而层粘连蛋白(laminin)和胶原ⅳ含量正常［7］。 研究表明，气道慢性炎症可激活某些细胞，使其释放生长因子及其他致纤维化因子，诱导成纤维细胞转化为成肌纤维细胞，使细胞增殖加速并合成、分泌细胞外基质成分，特别是胶原纤维，此种改变是em增厚的主要原因［8-10］。 以上病理学发现来源于严重哮喘患者的尸检标本、哮喘患者因其他原因切除肺叶标本、纤维支气管镜(纤支镜)活检标本以及动物实验。 此外，x线胸片亦能反映气道壁增厚，而高分辨率ct(hrct)更为敏感。有报道hrct测出90%的哮喘患者有气道壁增厚［13］。paganin等［14］报道hrct肺扫描显示72%的哮喘患者有异常发现，包括粘液嵌塞、小叶萎陷、支气管扩张、支气管壁增厚、腺泡型肺不张。用甲基泼尼松治疗2周后粘液嵌塞、小叶萎陷等消失，而气道壁增厚仍存在。但亦有报道用hrct测定中间支气管壁厚度和外径，在有无气流阻塞的哮喘患者之间，以及与正常人比较差异均无显著性，提示hrct作为定量分析手段尚嫌不够敏感［15］。 二、气道重构与肺功能损害 综合近年研究资料归纳如下： 1.哮喘与其他因素(吸烟、慢支炎等)合并存在，单独即可造成慢性持久的阻塞性损害，表现为fev1、峰流速(pef)、用力呼气中期流速(25%～75%)不可逆降低，而气道重构是引起此种改变的主要原因。 2.哮喘患者与相同年龄、性别的非哮喘对照者比较，其fev1随年龄增长下降速率更快。schachter等［16］测定成年男性哮喘患者fev1年平均下降24ml，而非哮喘男性下降6.3ml。fev1降低越严重，下降的速率越快，谓之“奔马效应”。 哥本哈根市心脏研究中心在一项大规模(10952例)流行病学调查中发现：在5年的观察期中，fev1降低速率增加仅见于初次诊断的哮喘患者，而在慢性哮喘患者，fev1年均下降值与其他人群基本一致，提示严重的气道重构和阻塞在疾病的早期阶段即已发生。与美、澳学者的结果不同，在于此项研究发现若fev1已重度降低，则治疗后几乎无逆转，但尔后维持稳定或缓慢下降［17］。 3.部分慢性哮喘患者虽已接受积极的治疗，如长疗程、大剂量使用口服或局部吸入糖皮质激素，气流阻塞仍持续进展。分析其失败原因与未在疾病初发时，即在明显气道炎症和损伤阶段及早治疗有关［18］。个别情况亦与持续接触过敏原如职业性接触与饲养宠物等有关［2］。 三、气道重构与气道高反应性(bhr) 气道重构与bhr直接相关，此时气道壁的厚度与气道开始收缩的阈值呈反比关系，轻微的刺激即可引起明显的收缩反应，而轻度的支气管收缩亦引起气道阻力的明显增加［7］。气道平滑肌增生，使支气管对刺激的收缩反应更强烈。此外，em增厚及弹力蛋白降解可造成肌肉收缩力与环绕气道的肺实质的弹性回缩力的不相称，从而扩大肌肉收缩效应。 气道壁增厚时，导致气道阻塞所需的肌肉收缩力较小［4］。另一方面，单纯气道壁的增厚

细胞衰老与肿瘤的发生的研究进展

细胞衰老与肿瘤的发生的研究进展 广东药科大学公共卫生学院卫生检验与检疫15 戚嘉铭 【摘要】近几年，细胞衰老成为一种针对癌细胞永久性生长的治疗肿瘤新途径，一直是细胞生物学家的研究重点。研究发现，细胞衰老可以作为阻碍癌细胞致癌的抑制机制。原因在于癌基因诱导具有双向性，癌基因的活化可以诱导细胞衰老。但研究发现，细胞衰老同样可能促使癌细胞的增值。 【关键词】细胞衰老肿瘤癌细胞 细胞衰老是生物体中普遍存在的一种永久性生长抑制现象，能够防止老化的或非正常细胞的进一步生长，对抗细胞的无限增殖能力而对机体起到保护作用。因此，死亡的细胞衰老与无限增殖的癌细胞一直都是细胞生物学家们致力研究的重点。本文主要是描述探究决定细胞走向衰老还是转为癌细胞的因素的相关研究进展。 1、细胞衰老:一种阻碍癌细胞致癌的机制 在多种衰老细胞中,某些抑癌基因的过表达会引起细胞进入衰老程序,细胞绕过衰老途径是其永生化及癌变的必要条件,因而细胞复制性衰老是抑制肿瘤的一种可能机制.这样对衰老细胞的研究将为肿瘤的预防和治疗方法提供新的策略[12]。细胞衰老是人体防癌的机制之一,研究细胞衰老对于抗肿瘤是很有意义的,同时为打开抗肿瘤药物治疗和新药的研发提供了依据。 1961年,Hayflick在体外培养成纤维细胞的研究中发现,正常二倍体细胞在体外条件下增殖分裂50~70代即进入一种衰老的状态,无法进一步传代培养,但仍然存活.正常的动物细胞无论是在体内生长还是在体外生长,其分裂次数总存在一个"极限值",此值被称为"Hayflick"极限,亦称最大分裂次数[11].研究表明，恶性肿瘤细胞系会发生自发性老化,其程度与细胞系种类有关.短期饥饿培养会明显增加老化细胞所占的比率,提示饥饿诱发细胞老化可能是抗肿瘤治疗的又一快速、简单且有效的途径[13]。 2、癌基因诱导的双向性 在人部分的肿瘤中都发现有癌基因的活化，癌基因的活化被认为是导致肿瘤发生的重要原因。然而，在野生型细胞内，癌基因的活化可以诱导细胞衰老，称为癌基因诱导的细胞衰老(oncogene-induced senescence, OIS)[1]。癌基因诱导的衰老( OIS)是指癌基因突变所产生的异常增殖信号，通过MAPK和PI3 K信号通路，使细胞处于生长停

肿瘤的发生与发展

肿瘤的发生与发展 肿瘤的定义：肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致克隆性异常增生而形成的新生物，常表现为局部肿块。 过程：局部组织的细胞—基因突变—细胞异常增生—新生物—局部肿块 发病机制：肿瘤的发病是一个多因素、多步骤参与的过程。 恶性肿瘤的病因（尚未完全了解）， 1.环境因素：化学，物理，生物因素 2.机体因素 化学致癌 化学致癌物：目前认为凡接触引起人或动物形成肿瘤的化学物质，称为化学致癌物（chemical carcinogen）。目前发现对动物有致癌作用的化学物质已达2000余种，其中有些可能和人类肿瘤的形成有关 分类：1。作用分式：直接致癌物，间接致癌物，促癌物 2.与肿瘤的关系：肯定致癌物，可疑致癌物，潜在致癌物 ? 1.直接致癌物：进入机体后与细胞直接作用，诱导细胞癌变的化学物质。 ? 2.间接致癌物：进入体内经微粒体氧化酶活化，变成具有致癌作用的化学物质 ? 3.促癌物：能促进其他致癌物诱发肿瘤形成的化学物质 ? 4.肯定致癌物（defined carcinogen）经流行病学调查确定，临床医师和科学工 作者都承认对人和动物有致癌作用，其致癌作用具有剂量反应关系的化学致癌物。 ? 5.可疑致癌物（suspected carcinogen）具有体外转化能力，而且接触时间和发 病率相关，动物致癌实验阳性，结果不恒定，且缺乏流行病学方面的证据。 ? 6.潜在致癌物（potential carcinogen）是在动物实验中可获得某些阳性结果， 但在人群中尚无资料证明对人具有致癌性的物质。 １、化学致癌物的作用点：为细胞的癌基因和抑癌基因 ２、作用：使癌基因激活，抑癌基因失活。 １、累积作用:(summation effect) 是指两种或多种致癌物同时或相继作用于机体，其复合效应等于单独作用之和２、协同作用:(synergistiic effect) 机体同时暴露于几种致癌物中其致癌作用高于个单独致癌物作用之和 常见的化学致癌物：多环芳香烃类，芳香胺与偶氮染料，亚硝胺类 化学致癌例子。苯胺染料：膀胱癌，烟草：肺癌，黄曲霉素：肝癌 物理致癌 1.电离辐射是最主要的物理性致癌因素 2.放射性同位素：镭、铀、氡等放射性同位素 3.紫外线：皮肤癌，着色性干皮病 病毒致癌 1/3为DNA病毒，2/3为RNA病毒 ?一、乳头状瘤病毒与宫颈癌（HPV） ?二、乙型肝炎病毒与肝癌（HBV） ?三、EB病毒与鼻咽癌和Burkit肉瘤（EBV） ?四、HTL V与人类T细胞白血病（HTL V） 致瘤性DNA病毒

改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞解读

改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞 [ 11-03-31 14:28:00 ] 作者：吴海亚，戴元荣，尹娟编辑：studa20 【摘要】目的：改进大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCS)的培养方法，了解其生长特性，为研究气道疾病提供体外研究模型。方法：大鼠麻醉后迅速分离支气管树，去除内外膜并用0.2%I型胶原酶消化后，采用改良组织贴块法培养ASMCS，应用形态学和抗SMα-action免疫细 胞化学法鉴定平滑肌细胞。结果：采用改良组织贴块法培养2～6 d，细胞开始从组织块周围长出，5～8 d在组织块附近出现“谷-峰”结构，9～12 d可融合。传代细胞经SMα-action免疫组化SP法染色阳性率达95%以上。结论：改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞具有简便、易行、产量高、纯度高的优点，为研究气道疾病提供良好的体外研究模型。 【关键词】气道;平滑肌;细胞培养;组织贴块法;大鼠 气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCS)是气道的重要结构细胞之一，具有重要的生理作用。ASMCS的异常是呼吸道疾病的重要病理特 征之一，其增生、肥大是气道重塑的关键[1]。Hirst等[2]认为应将平滑肌细 胞作为研究哮喘的标靶。体外培养ASMCS是研究细胞生物学行为、疾病发病机制及其防治手段的基础。本研究采用改良组织贴块法培养出ASMCS，报告如 下。 1 材料和方法 1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠购自上海实验动物中心，体重250～350 g。饲养于温州医学院实验动物中心SPF级实验室，饲养温度25 ℃，相对湿度70%，昼夜照明12/12 h。 1.2 主要仪器和试剂 倒置显微镜(NIKON TS100 日本尼康公司);5% CO2培养箱(美国Thermo);25 mL无菌培养瓶(美国Corning公司);RPMI 1640培养基(美国HyClone公司);优级胎牛血清(杭州四季青公司);0.25%胰蛋白酶、0.02% EDTA溶液(美国GIBCO 公司);青链霉素(北京索来宝生物科技有限公司);D-Hanks液(上海捷瑞生物有 限公司);I型胶原酶(美国Sigma公司);SMα-actin单克隆抗体(美国Sigma公司);小鼠免疫组化试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)。 1.3 细胞培养 1.3.1 原代培养：10%水合氯醛(500 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，在75%酒 精溶液中浸泡1 min消毒皮肤(避开口鼻)，取出大鼠并固定于洁净手术台上，

PGE2对气道平滑肌细胞分泌和凋亡影响的研究

四论著四 D O I :10.3760/c m a .j .i s s n .1673-436X.2012.018.003基金项目:浙江自然科学基金立项课题(Y 2110862),金华市科技局立项重点课题(2011-3-019)作者单位:321007金华职业技术学院医学院分子生物中心实验室 通信作者:胡野,E m a i l :h u y e 2580@s i n a .c o m P G E 2对气道平滑肌细胞分泌和凋亡影响的研究应延风 陈浩浩 金耀建 屠平光 胡野 ?摘要? 目的 前列腺素E 2(p r o s t a g l a n d i nE 2,P G E 2)通过调控气道平滑肌细胞(a i r w a y s m o o t h m u s c l e c e l l s ,A S M C s )的迁移二分泌二增殖功能,对哮喘气道重塑有关键性影响三研究P G E 2对A S M C s 凋亡及其分泌白介素4(i n t e r l e u k i n4,I L -4)二白介素10(i n t e r l e u k i n10,I L -10)和γ-干扰素(i n t e r f e r o n -γ,I F N -γ)的影响,对阐明P G E 2通过调控A S M C s 分泌T h 1/T h 2细胞因子对气道炎症发挥作用机制有重要意义三方法 用大鼠气道平滑肌细胞株与终浓度为10-9~10-6的P G E 2共培养2 4h ,分6组,共4个浓度梯度三用A n n e x i nV -E G F P /P I 双染细胞凋亡检测试剂盒在流式细胞仪测定凋亡率,同时用I L -4二I L -10和I F N -γE L I S A 试剂盒在酶标仪检测其浓度三每4个复孔为1组, 实验重复2次,数据为8孔的平均值三结果 应用不同浓度的P G E 2后A S M C s 各组细胞凋亡率与对照组相比无明显变化三但I L 分泌与P G E 2有显著的量效关系,I L -4和I L -10随P G E 2浓度下降而分泌量显著下降,但I F N -γ随P G E 2浓度下降而分泌量呈升高趋势,两者呈分离现象(空白对照二阴性对照二10-9P G E 2二10-8P G E 2二10-7P G E 2二10-6P G E 2组, I L -4分别为6.77?1.58二9.24?2.45二38.17?11.33二29.27?11.12二26.05?9.49二21.11?7.21;I L -10为4.8?1.06二6.35?2.11二71.89?12.03二43.68?11.25二28.89?8.75二24.31?6.67;I F N -γ 为2.17?1.97二3.25?1.48二10.63?4.75二13.4?5.57二15.47?6.16二19.54?6.35)三结论 P G E 2能调 控A S M C s 分泌细胞因子,随着浓度梯度增加能促进T h 1型细胞因子I F N -γ分泌,同时抑制T h 2型细胞 因子I L -4二I L -10分泌,但对A S M C s 凋亡无显著影响三认为在正常状态下P G E 2的分泌与维持气道内 T h 1/T h 2的平衡有关三?关键词? 气道平滑肌细胞;前列腺素E 2;白介素;γ-干扰素;凋亡E f f e c t o fP G E 2o n s e c r e t i o n f u n c t i o na n d a p o p t o s i s o f a i r w a y s m o o t hm u s c l e c e l l s Y I N GY a n -f e n g ,C H E N H a o -h a o ,J I N Y a o -j i a n ,T U P i n g -g u a n g ,HU Y e .D e p a r t m e n t o f M o l e c u l a r B i o l o g y C e n t r a l L a b o r a t o r y ,J i n h u aC o l l e g e o f P r o f e s s i o n a l a n dT e c h n o l o g y ,J i n h u a 321007,C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r :HUY e ,E m a i l :h u y e 2580@s i n a .c o m ?A b s t r a c t ? O b j e c t i v e A i r w a y r e m o d e l i n g i sc l o s e l y r e l a t e dt o m i g r a t i o n ,p r o l i f e r a t i o n ,s e c r e t i o n f u n c t i o no f a i r w a y s m o o t h m u s c l ec e l l s (A S M C s ).P r o s t a g l a n d i nE 2(P G E 2) h a v ear e g u l a t o r y r o l e i n t h e s e f u n c t i o n s .T oc u l t u r e w i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n g r a d i e n to fP G E 2a n d A S M C si nv i t r oa n dt o s t u d y A S M C s s e c r e t i o nf u n c t i o n so f i n t e r l e u k i n4(I L -4)a n di n t e r l e u k i n10(I L -10)a n dI n t e r f e r o n -γ(I F N -γ),a n d a p o p t o s i s o fA S M C s ,t h i s i s f a v o r a b l e t ou n d e r s t a n dA S M C s i mm u n e r e g u l a t i o nm e c h a n i s m i na s t h m a ,a n d t h e r e g u l a t i o nr o l eo fP G E 2.M e t h o d s T h e r a t a i r w a y s m o o t h m u s c l e c e l l s a n d t h e f i n a l c o n c e n t r a t i o no f 10-9~10-6P G E 2w e r e c u l t u r e d f o r 24h o u r s ,d i v i d e d i n t o 6 g r o u p s ,a n d 4c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t .F l o w c y t o m e t r i c w e r e u s e d d e t e r m i n a t i o n o fa p o p t o s i s w i t h A n n e x i n V -E G F P /P I d o u b l e s t a i n i n g a p o p t o s i s d e t e c t i o nk i t ,U n i t e dS t a t e sB i o -R a d680e n z y m em a r k i n s t r u m e n tw e r eu s e dd e t e c t i o n o f i t s c o n c e n t r a t i o nw i t h I L -10,I L -4,I F N -γE L I S Ak i t .4c o m p l e xh o l e s i n t o1g r o u p s ,t h e e x p e r i m e n t w a s r e p e a t e d2t i m e s ,a v e r a g e d a t a f o r 8h o l e s .R e s u l t s T h e r ew e r e n o s i g n i f i c a n t c h a n g e s i nA S M C s c e l l a p o p t o s i s r a t e a f t e r a p p l i c a t i o no f t h e d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o fP G E 2c o m p a r e dw i t h t h e c o n t r o l g r o u p .B u t i n t e r l e u k i n s e c r e t i o n a n dP G E 2h a s s i g n i f i c a n t d o s e -e f f e c t r e l a t i o n s h i p .W h e nP G E 2c o n c e n t r a t i o nw e r e d e c r e a s e d ,t h e s e c r e t i o n o f I L -4a n d I L -10d e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y ,b u t t h e I F N -γs e c r e t i o nw a s i n c r e a s e d .四 3731四国际呼吸杂志2012年9月第32卷第18期 I n t JR e s p i r ,S e p t e m b e r 2012,V o l .32,N o .18

气道平滑肌肥大细胞浸润与哮喘的关系

!!作者单位" 5"##3!西安’第四军医大学附属西京医院呼吸内科气道平滑肌肥大细胞浸润与哮喘的关系 谢柏梅!戚好文 !!!摘!要"!肥大细胞与气道平滑肌相互作用在哮喘气道高反应的产生中起重要作用(肥大细胞产生多种脂类介质) 趋化性细胞因子)细胞因子和酶类’它们与气道平滑肌细胞相互作用产生对收缩性刺激的高反应性和增生性’并且激活气道平滑肌细胞产生干细胞因子和其它趋化性细胞因子)细胞因子及生长因子’它们补充)分化和保持肥大细胞(哮喘气道的肥大细胞浸润是I 细胞依赖的’来自I 细胞及其它来源的I F !型细胞因子对循环及组织中肥大细胞前体的扩展起作用( !关键词"!肥大细胞-气道平滑肌-哮喘A )74<0,22&+1&24’)4&.+.1)&’()*73..4>3-702,&+)74>3)!L "2R /*(:-*’P "1/6(V -’>H -D /A B :-’B6. 4-=D *A /B 6A G F -C *5*’-’L *Q *’016=D *B /)’B %-@6&A B %F *)*B /A G F -C *5/)#’*O -A =*B G ’L */’5"##33’$%*’/!%974’)04"!’67:>?H 7=A 6;A NG ?;7H :B B ?6Q?=>R ?T ;G A A 7F G O ;H B :H A O B QU :?6=G 7?67H A 67>=U O 7A >7A ?=>R ?T F T <:>C >:;A Q O H :?S ?>=:7T A N B =<=QG :Q =?7A >;’H F :G A V =6:;’H T 7A V =6:;?6Q:6Y T G :;7F ?7G ?T =67:>?H 7R =7F )0_H :B B ;7A H ?O ;:F T <:>C >:?H 7=S =7T 7A H A 6;7>=H 7=S :;7=G O B =?6Q < >A B =N :>?7=A 6’7F :67F :?H 7=S ?7:Q )0_H ?6<>A Q O H :;7:G H :B B N ?H 7A >?6QA 7F :>H F :G A V =6:;’H T 7A V =6:;’?6Q E >A R 7F N ?H 7A >;7F ?7G ?T ?H 7=6>:H >O =7G :67’Q =N N :>:67=?7=A 6’?6Q >:7:67=A 6A NG ?;7H :B B ;@_?;7H :B B =6N =B 7>?7=A 6A N 7F :?=>R ?T ;=6?;7F G ?=;I C H :B B C Q :<:6Q :67’?6QI F !H T 7A V =6:;N >A G IH :B B ;?6QA 7F :>;A O >H :;?H 7=6G ?;7H :B B :P A GH =>H O B ?7=6E ? 6Q 7=;;O :<>:H O >;A >;@!C ,*( .’57"!_?;7H :B B -)=>R ?T ;G A A 7FG O ;H B :-);7F G ?!!无论是肥大细胞与哮喘的关系’ 还是气道平滑肌收缩在哮喘中的重要性均早已为人们所认识(然而传统观点中气道平滑肌只是对各种炎症介质的被动效应细胞(近年来’肥大细胞及气道平滑肌的研究新进展’ 更丰富了人们对肥大细胞)气道平滑肌及其相互作用在哮喘发生)发展中的认识( !!肥大细胞!D !!肥大细胞的生长发育及分型!肥大细胞是多功能) 广泛分布于组织并能分泌多种介质的一类细胞(由骨髓起源的4K 3/[分化而来/" C 30 ’在组织中发育成熟’以不成熟的前体细胞流通’人类肥大细胞 前体在4K 3/[M =7[ +H 39.[间循环’表达4K "3但不表达4K "/’ 这一点使其与单核细胞区分开//’20(干细胞因子%04+&在肥大细胞系的发展中发挥着重要作用’04+作用于细胞表面的04+受体H C V =7促进造血干细胞向肥大细胞分化(分泌型04+可明显促进肥大细胞增殖)组胺分泌及肿瘤坏死因子C 0%I (+C 0 &G 9()的表达(进入血液循环系统的为未成熟型肥大细胞’无颗粒形成’细胞表面无高亲和力受体’进入外周组织后继续成熟)分化为!个细胞 亚型"含类胰蛋白酶型%_4I &及含类胰蛋白酶及类糜蛋白酶型%_4I 4&细胞(肺组织中以_4I 亚型 为主’局限在哮喘气道平滑肌层中的肥大细胞是 _4I 4亚型/%0(当过敏性炎症反应时’I F !细胞分泌细胞因子’刺激肥大细胞成熟与增殖(而当刺激 因素消退后’增殖的肥大细胞通过多种途径%如凋亡或至脾脏&被清除( !D "!肥大细胞的表达及组织依赖亚型的调控因素!趋化性细胞因子可能对其中的每一步都起着重要作用(培养的人肥大细胞前体在培养/周时表达功能性的4h 49!’4h 49/)4493和4492’ 但到第$周成熟阶段时仅表达4493/50(这些受体的配体可 能对特殊组织部位的肥大细胞前体的补充起着作用"受体是由肥大细胞不同亚型选择性表达)不同亚型选择性补充还是由组织里一个共同的前体分化产生仍然不能确定(培养的人肥大细胞与鼻息肉肥大细胞均表达的4493在细胞内的储存通过+H 3 9’桥联作用被进一步上调/*0 ( 人肥大细胞前体与纤维原细胞共同培养产生_4I 4表型的成熟肥大细胞’ 由于纤维原细胞是4493配体44D ""的丰富来源’所以4493可能在 _4I 4表型分化中发挥作用/$0 (气道平滑肌也能 产生趋化性细胞因子’包括44D ""/" #0 (这是否与哮!%2!国际呼吸杂志!!##5年!第!5卷!第"期!’6789:;< =>’8?6@!##5’-A B @!5@(A @"

细胞凋亡与肿瘤

细胞凋亡与肿瘤 巴桑卓玛 (西藏大学医学院基础医学研究所) 摘　要　细胞凋亡是一种进化保守的细胞死亡形式,不仅在正常的生理状态具有重要作用,而且与多种疾病的发生发展密切相关。近年来研究认为,细胞凋亡异常可能与肿瘤发生有关。凋亡调控基因已被看作是一类新的肿瘤发生相关基因。肿瘤的发生,是由于细胞增殖与细胞凋亡之间的平衡失调的结果,细胞凋亡在肿瘤生长过程中起负调控作用,因此研究抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡而对正常细胞影响不大是肿瘤治疗的新思路。 关键词　细胞凋亡　诱导　治疗　肿瘤 多细胞机体,包括人,均存在着细胞增殖与死亡的平衡,以维持机体的稳态,二者是一个矛盾的两个方面,此矛盾的运动发展推动着机体的生、老、病、死。传统的肿瘤研究者关注的首先是细胞的增殖。肿瘤细胞是永生性细胞,如何抑制肿瘤细胞的无限增殖能力,是他们首先考虑的问题。然而,机体还存在另一普遍现象,即死亡。细胞的死亡有两种形式,一种是病理性死亡,称为坏死(necrosis)。它是由于局部缺血、高热、理化因素及微生物的侵袭所致的细胞急速死亡。其重要的特点是细胞肿胀、溶解、释放出裂解产物,使周围组织产生炎症反应。另一种是生理性死亡———凋亡(apoptosis)。 1　细胞凋亡与一般的死亡有很大的不同,主要表现以下几个方面 形态学特征:细胞凋亡是细胞在生物体发育过程中,在一定诱导条件下接受指令而发生的程序化事件,是导致最终自我消亡的生命活动。发生时首先是染色质的凝集,嗜碱性染色增强,然后细胞核崩解,此时线粒体保持形态正常,最后细胞体积缩小,一部分细胞质和核碎片进入由膜包被的程序死亡小体,它们从细胞表面出芽脱落,并被组织专职巨噬细胞、上皮细胞吞噬。由于细胞内容物不泄漏,因而没有炎症反应。 生化特征:染色质降解,核小体间连接DNA部位被降解,产生寡聚核小体DNA 片段,即180-200bp整数倍的不同长度的DNA片断。 细胞凋亡的化学信号:在细胞程序死亡时出现快速持续的Ca2+浓度上升。如在胞质钙离子载体tributyrin和抗-CD3抗体诱导的胸腺细胞凋亡中就发现有钙离子浓度升高的现象。研究发现Ca2+增加与A TP一起作用于染色质,使原来折叠的很紧的染色质变松散,露出亲水部分,以便脱氧核糖核酸酶(Dnase)水解。Danson (1993)发现Ca2+可以参与Ca-calmokulin dependent phospatase作用,产生凋亡。Wornonicz提出Ca2+可以直接作用于核内转录因子引起凋亡。另外Ca2+还可活化

气道平滑肌细胞培养方法

【摘要】目的：探讨哮喘大鼠气道平滑肌细胞培养方法，了解其生长特性。方法：制作慢性哮喘大鼠模型，用酶解离法、组织贴块法分别培养哮喘大鼠气道平滑肌细胞，倒置相差显微镜观察其生长情况，用免疫组化SP法分析 SMα-action抗原的表达。结果：以酶解离法培养2～3 d可见细胞贴壁，7～9 d 可融合；以贴块法培养7～10 d组织块周围有细胞长出，10～14 d融合，传代 后细胞“谷峰”生长明显。SMα-action免疫组化SP法染色均呈阳性。结论： 两种方法均能培养出纯度较高的哮喘大鼠平滑肌细胞，其中酶解离法细胞产量高，纯度高，生长速度快，能为气道疾病细胞实验提供可靠的细胞模型。 【关键词】大鼠哮喘气道平滑肌细胞培养 支气管哮喘(简称哮喘）是儿童最常见的一种慢性炎症性疾病，气道重塑是引起慢性哮喘患者气道不可逆或部分不可逆阻塞的病理基础[1]，是诱发气道高反应性和哮喘慢性化的主要原因。平滑肌增生肥大是气道重塑的病理学特点之一[2]，故体外气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMC)培养是研究哮喘发病机制的重要手段。ASMC培养常用的培养方法有贴块法和酶解离法 [3-4]。本研究用以上两种方法培养哮喘大鼠气道平滑肌细胞，观察其生长特点，并进行比较。 1 材料和方法 1.1 实验动物和试剂 4～6周龄雄性SD大鼠，购自上海动物中心。DMEM 高糖培养基、0.25%胰蛋白酶/0.02% EDTA溶液、特级胎牛血清购自法国Biowest 公司；D-Hanks液、青链霉素购自杭州吉诺生物医药技术有限公司；I型胶原酶、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白（BSA)购自美国Biosharp公司；大鼠抗α-actin 单克隆抗体购自武汉博士德公司；SP免疫组化试剂盒(二抗)购自上海晶美生物 工程有限公司。 1.2 慢性哮喘大鼠气道重塑模型的建立参考李昌崇等 [5-6]的方法复制哮喘慢性模型，致敏阶段：第1天和第8天腹腔注射OVA/Al(OH)3混合液1.5 mL[内含OVA 1 mg和Al(OH)3 100 mg]；激发阶段：第15天开始以1% OVA生理盐水溶液雾化吸入，隔天一次，每次30 min，共60 d。 1.3 细胞培养 1.3.1 ASMC原代培养：组织提取步骤为：以10%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射处死大鼠，以75%酒精消毒表皮，从腹部至颈部依次剪开皮肤、肌肉，腹主动脉放血后剪开胸腔，自颈部至下迅速分离气管及肺部组织，剪去心脏，置入含100 U/mL青链霉素的4 ℃ D-Hanks液中，转入超净台，依次去除肺组织、支气管动静脉、脂肪和残存结缔组织，仅剩余气管、支气管。纵向剖开气管、支气管，用外科刀片小心刮除外膜及内膜至组织呈透明状态，用眼科虹膜剪将气 管段剪成1 mm或更小的组织块。 酶解离法（胶原酶-胰酶混合消化法）：将剪好组织块装入15 mL离心管中，加入配制好的I型胶原酶溶液2 mL（用D-Hanks液配制成含I型胶原酶2 mg/mL、