病原细菌
植物病原细菌学授课教师：张立新
植物病原细菌学是植物病理学的一个分支，其研究对象是引起植物病害的病原细菌。迄今已鉴定出约1600余种细菌中，约有300余种引起植物病害，已知细菌引起的植物病害在500种以上，细菌性青枯病、软腐病和马铃薯环腐病为世界性重要病害。
课程内容涵盖了植物细菌性病害的症状与常规诊断方法、细菌的细胞结构及其功能、植物病原细菌的分类、以及病原细菌的分离和鉴定技术等。
马铃薯青枯病、花生青枯病、马铃薯环腐病、马铃薯环腐病、大白菜软腐病、梨火疫病、水稻细菌性条斑病（内检病害）、柑桔溃疡病（内检病害）、香蕉细菌性枯萎病（外检病害）、兰花细菌性褐斑病（外检病害）
第一节绪论
一、植物病原细菌
原核生物杆菌以革兰氏阴性为主好氧菌和兼性好氧菌种类相对较少
二、植物病原细菌学
跨细菌学和植物病理学两个学科，研究内容反映两个学科相结合的特点：有关细菌学研究方面（形态、染色反应、培养性状、生长与营养、生理生化特征、血清学特征、噬菌体特征、遗传和变异以及鉴定和分类学）更多地反映细菌学的共同特点。有关病理学研究方面如致病生化机制、细菌病害的防治策略和防治技术，除反映植病学的共同特点外，更考虑作为植病的一种特殊类型，反映细菌病害的特殊规律。
两方面的任务：1）通过病原学的研究，丰富和完善植物病原学和细菌学；
2）在植病学和细菌学交叉的基础上促进植物病原细菌学的发展。
三、植物病原细菌学发展简史
1. 国外
从16世纪随资本主义发展而发展起来。
A.V.列文虎克（1632－1723荷兰）用自制160倍显微镜观察牙垢、雨水、井水等，观察到“活的小动物”，描述了细菌形态和运动规律。著名微生物家L.Pasteur（巴斯德1822－1895法国）尤在发酵工业方面成就为世人瞩目。对蚕和人畜病害也有研究，为传染病的病原学说奠定了基础。
R. Koch（柯赫1853－1910，德国）证明炭疽杆菌的病原性（1876）。他还创造了许多研究微生物的方法，如众所周知的柯赫氏法则（纯培养方法）。
De Bary （荻巴利，1831－1888德国）主要研究植物病原微生物，建立了植物病害的微生物观点。是历史上最伟大的真菌和植物病原学先驱之一。后期（1887年前后）也在细菌病害方面著书立说。
细菌病害传统上被认为是Thamas Jonathan Burill最先发现的，但也有人主张是Emil Mitscherlich第一个发现由细菌引起植物病害。
Emil Mitscherlich（德国化学家）本来研究发酵的，但他在1850年发现由马铃薯块流出的液体能降解马铃薯块的细胞壁，发现了“活的有生命的液体”。
Thamas Jonathan Burill（1839－1916，美国），他是第一个对梨火疫病进行研究的人，该病是最早被人研究的细菌病害。1868年，他从德国进口显微镜，注意到“从树枝上分泌出的粘绸褐色物质是活动的颗粒组成”，1979年进行简单的接种试验成功，对这种细菌定名为Micrococcus amylovora。当时纯培养技术还没有解决，最终没有解决该问题的病原性问题。
J.C. Authur（纽约试验站的植物学家）对梨火疫病进行详细的研究，分离（过滤）培养、接种致病。
1891年M.D.Waite（美国农业部）对梨火疫病的流行做了大量工作，证明病菌由花到花是可以由昆虫传染的。
Wakker（荷兰）分离鉴定证明Xanthomonas hyacinthi引起风信子一种病害，这也是最早研究的另一种细菌病害。
E.F.Smith（美国）被誉为植物细菌病害的奠基人和美国植物病原细菌学之父。发表100多篇细菌病害的文章，许多植物病害都是经过他或其实验室研究后才确定为细菌病害。并于1905、1911、1914年发表三卷《植物细菌病害》巨著，并在1920年写成了《植物细菌病害导论》，这是植物细菌病害的第一部教科书。
直到1951年C.Elliot发表《植物细菌手册》，这50年被称为大量发现植物病原细菌的鼎盛时期。
2. 中国植物病原细菌学研究
余大绂是我国植物病原细菌学研究的元老和先驱。1930年发表了我国第一篇细菌学论文“黄瓜萎蔫病细菌Erwiniatracheiphila”。1936年他在云南发现了一种蚕豆茎枯病，病原为新种，并定名为Pseudomonas fabae Y u，1936，是我国第一个以中国人报道的植物病原细菌新种。1956年他和方中达联合发表了《中国植物病原细菌名录》，其中记载了42种植物细菌病害。
1935年，黄亮对“南京地区大白菜和其他蔬菜软腐病的调查研究”，证实我国有两种软腐细菌存在。
1981年方中达发表了《中国植物细菌病害名录补志》。
目前国内植物病原细菌研究热点：植物病原细菌的致病机理和致病性分子遗传、植物病原细菌与寄主之间的互作关系。
四、植物病原细菌学对植物病理学发展的影响
1. 病原物致病机制
1）侵入机制
2）致病因子：降解酶的致病作用、毒素的致病作用、植物激素
2.致病相关基因
五、研究现状和展望
1分类：系统分类方法仍在不断完善中
2生态学：研究在自然界存活和增殖规律，对预测病害的发生和流行具有重要的意义。
3细菌病害的生理生化学
4寄主……病原细菌互作：植物病原细菌在非寄主植物（如烟草、菜豆）上引发过敏反应的现象导致植物病理学家对一般性识别机理的研究。
5寄主和病原物共同进化
第二节植物细菌病害诊断、病原细菌的细胞结构及其侵染
一、植物细菌性病害的症状
菌原体病害的症状特点：病株矮化或矮缩，枝叶丛生，叶小而黄化。因此丛生、矮缩、小叶与黄化相结合是诊断菌原体病害症状时必须掌握的关键。
细菌病害的症状特点：病植物表现的症状类型主要有坏死、萎蔫、腐烂和畸形等4类，褪色或变色的较少;有的还有菌脓(ooze)溢出。
1、腐烂：萝卜黑腐病、甘蓝软腐病、大白菜软腐病、马铃薯黑胫病
2、坏死：造成斑点、焦枯、溃疡
1）斑点（角斑、圆形晕斑、溃疡斑、穿孔型）菜豆细菌性疫病
2）焦枯：最多是叶枯，枝枯（梨火疫病）水稻白叶枯病
3）溃疡：柑桔溃疡病
3 、变色：柑桔黄龙病
4、肿瘤或畸形：果树根癌病等枣疯病
5、萎蔫（急性萎蔫，慢性萎蔫）番茄青枯病、马铃薯和番茄青枯病
二、植物病原细菌的细胞结构
原核生物概念：原核生物是指含有原核结构的单细胞微生物。它没有真正的细胞核，它的遗传物质分散在细胞质中，没有核膜包围，细胞质中含有小分子的核蛋白体（70S），但没有内质网、线粒体等细胞器。包括细菌、放线菌和菌原体等。
1. 形态和结构
1）细菌
形态：大多为杆状，大小为0.5-0.8×1-3μm，少数为球状(0.5-1.3μm)（观察：100 ×10-40X）
结构：绝大多数有鞭毛、无芽孢，细胞壁有粘质层，但很少有荚膜，大多G-（细胞壁不光滑），少数G+
革兰氏染色：用结晶紫染色和碘液处理后，再用酒精或丙酮洗后，不褪色的是G+（保留紫色），洗后褪色的是G-（褪色，复染成红色）。2）菌原体（无细胞壁）杆状细菌、球状细菌、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、芽孢杆菌
革兰氏阳性和阴性细菌细胞壁成分的主要区别
成分
占细胞壁干重的（%）
革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌
肽聚糖含量高（50~90）含量低（5~45）
磷壁（酸）含量较高（＜50）无
类脂质一般无含量较高（约20）
蛋白质无含量较高
革兰氏阴性细菌的细胞壁由于肽聚糖含量少，由肽聚糖组成的网络结构疏松，网孔较大，因此当酒精脱色时，结晶紫和碘复合物也随之被抽提出来，当菌体复染后，就呈红色。
革兰氏阳性细菌的细胞壁由于肽聚糖含量高，网络结构紧密，网孔小，酒精脱色时无法把结晶紫和碘复合物抽提出，故菌体保持紫色。这些特性是由细胞壁的理化性质决定的。
细菌鞭毛（flagellum）是着生在细胞表面的细长、波曲的丝状结构，由基体、钩形鞘和鞭毛丝三部分组成，是细菌的“运动器官”。除鞭毛外，有些细菌的细胞表面还着生一些比鞭毛更细、更短的、中空的丝状结构，叫纤毛。纤毛不是细菌的“运动器官”鞭毛和纤毛均由蛋白质组成。
2. 细菌的营养、生长繁殖及菌种保存
细菌的营养：? 光能无机自养型、? 光能有机异养型、? 化能无机自养型、? 化能有机异养型——植物病病原细菌
植物病原细菌细菌的代谢：无氧发酵有氧呼吸——EMP途径和三羧酸循环相结合。
细菌的代谢产物：糖发酵试验、吲哚试验、硫化氢试验、V.P.试验（产生3-羟基丁酮试验）
细菌的生长繁殖及人工培养：
繁殖方式为裂殖，一分为二，细胞质和DNA先复制，后平均分配到子细胞中，繁殖速度快，一般在适宜条件下，每20分钟就可分裂一次。
植物病原细菌大部分可以人工培养，在进行人工培养时必须配制培养基，配制时必须注意以下几个问题：
（1）培养基中要有碳源、氮源和其他化学元素，实验室常用的有葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、磷酸二氢氨、硫酸镁、磷酸氢二钾、氯化钙等。
（2）注意各种营养物质的配比，只有在适当浓度与配比条件下，细菌才长得好。
（3）注意pH值，一般在pH值在微碱性与中性之间细菌生长较好，即pH 7－7.2。
（4）在细菌的人工培养中，还要注意温度，一般的植物病原细菌最适生长温度为25℃－28℃。
细菌菌种保存：目的是使菌种不混乱、不死亡、不污染并稳定保持其原有特性。
? 转管保藏法、? 液体石蜡油保藏法、? 无菌水保藏法、? 真空冷冻干燥保藏法
3.细菌的遗传和变异
（一）遗传物质
基因组：核质DNA（主）；质粒DNA
细胞分裂时，基因组同步分裂，然后均匀地分配到两个子细胞中，从而保证亲本的各种性状能稳定地遗传给子代。
（二）遗传变异现象及概念
细菌在一定的培养条件下生长繁殖，通过DNA的自我复制，将各种性状相对稳定地传给子代，这些性状在亲代与子代间表现相同，称为遗传性。
在细菌繁殖过程中，当外界环境条件发生变化或细菌遗传物质结构发生了某些改变时，细菌原有的性状也随之发生相应的改变，这种现象称为细菌的变异性。
（三）细菌变异的类型与机理
变异的类型：表现型变异和遗传性变异。
变异的机理：基因突变：自然突变率10-5。（质粒缺失或突变）? 基因的转移和重组：转化，转导，接合，转座因子。
4.细菌的细胞结构与功能
(1) 胞外多糖（extracellular polysaccharides, EPS）
位置：细胞的最外层
作用：防止细菌干燥保护细菌免受外界侵害为细菌聚集矿物元素和营养在寄主-病原细菌相互作用中起重要作用
结构特征：多个亚单位组成的多聚糖，包括异聚糖类和同聚糖类。
同聚多糖：β-1,2-葡聚糖（根瘤菌）、纤维素（土壤杆菌、根瘤菌）、果聚糖（欧文氏菌、假单胞菌）、藻酸盐（荧光假单胞菌）
异聚糖：酸性多聚体（包括中性糖、糖醛酸、非碳水化合物置换基团）
在决定植物病原细菌致病性中的作用
青枯假单胞（Ralstonia solanacearum）：EPS产量与细菌致病性强弱正相关，是引起萎蔫的重要因素。
甘蓝黑腐黄单胞（Xanthomonas campestris pv. campestris）：EPS是调节致病性的生化因子之一。
梨火疫欧氏杆菌（Erwinia amylovora）：产生果聚糖和amylovoran。果聚糖可能在病害初期起作用
Amylovoran在细菌定殖过程中起重要作用。
在寄主-病原菌识别中的作用：寄主植物识别细菌的主要组分是脂多糖；丰富的胞外多糖对寄主的识别作用有遮掩作用。
（2）脂多糖
位置：细菌的外壁层，内接细胞壁肽聚糖，外连胞外多糖或荚膜多糖。
特点：革兰氏阴性细菌特有结构、决定细菌的免疫学特性、决定对噬菌体的敏感性、影响与寄主的相互关系
结构特征：极为复杂的分子，分子量在10000 u以上。
功能：
1）血清学反应：脂多糖的O侧链区又称为O抗原区，是脂多糖的独特部分，在细菌血清学反应中起决定作用。
2）吸附与识别：如大白菜软腐病菌（Erwiniacarotovora pv. carotovora），大白菜幼根上有
LPS的吸附位点。
3）与噬菌体吸附的关系：G－细菌的提取物含有LPS，它的O抗原部分和核心区都可以吸附噬菌体并使其钝化，还可以诱导噬菌体释放出核酸。
4）障碍功能：G－细菌的细胞壁外层对于某些物质进入菌体的环境中是一道障碍。细胞壁外层的脂多糖在这种障碍功能中起着主要的作用。
（3）细胞壁
成分：肽聚糖
功能：○1肽聚糖是决定细胞形状的主要因素○2溶菌酶催化的溶菌作用，即破坏了肽聚糖纤维的完整性○3青霉素对含肽聚糖原核生物的生长繁殖的致命影响，也在于抑制肽聚糖合成的最终步骤即肽链交联。○4分子筛作用
三、植物病原细菌的寄生性和致病性
1）寄生性：绝大多数的植物病原细菌都不是专性寄生菌，寄生性是有差别。寄生性有强有弱，寄生性强的可以侵染植物绿色组织；寄生性弱的大多侵染贮藏器官或抵抗弱的部位。另外，植物病原细菌的寄生专化性也有差别。
2）致病性：病原物所具有的破坏寄主并引起病害的特性。致病性易丧失。
○1毒素：主要破坏寄主细胞的半透性，造成原生质中不溶性物质转变为可溶性而外渗，造成细胞水分、养分向间隙外渗，引起腐烂或斑点症状，初期水渍状症状。
○2酶：果胶酶：分解细胞壁，引起崩解，多引起腐烂。蛋白酶：使寄主细胞失活、坏死，引起坏死症状。水解酶：分解碳水化合物造成细胞死亡，引起斑点。
○3多糖类物质许多细菌可产生高分子量的多糖物，阻塞导管，引起萎蔫。
○4激素引起畸形，癌肿。
四、植物病原细菌的侵染及传播
（一）侵染来源
1．种子和无性繁殖材料（块根、块茎、种苗）
2．带菌的土壤和肥料：青枯菌、根癌土壤杆菌
3．病株残体（土壤、肥料）
4．杂草和其它作物：
5．昆虫介体
（二）侵入途径
? 自然孔口侵入：假单胞杆菌和黄单胞杆菌。
? 伤口侵入：根癌土壤杆菌、格兰氏染色阳性棒形杆菌、软腐果胶杆菌。
（三）细菌侵入后的蔓延
细菌侵入寄主组织后，不能直接侵入寄主细胞，先在组织的细胞间隙繁殖或在导管中繁殖，当寄主细胞受到损伤或死亡后，再进入细胞。（四）传播途径
○1雨水（露）：植物病原细菌最主要的传播途径。
○2灌溉水
○3介体：类菌原体：介体昆虫。
○4人类活动（人为传播）：种子、苗木调运；农事操作（工具带菌、伤口）——马铃薯环腐病—切刀传染；稻白叶枯病、细条病——种子调运
第三节植物病原细菌的分类
一、细菌在生物界中的位置
1. 二界分类系统（动、植物界）
2.1886年E.Haeckel提出了三界分类系统：加原生生物界，包括原生动物、藻类、真菌和细菌
3. 1969年R.H.Whittaker提出了五界分类系统：原核生物界；原生生物界；植物界；真菌界；动物界
4.T.Cavalier －Smith（1981、1988）根据基础细胞结构如线粒体嵴的形态将细胞生物分为8界。
细菌总界（Empire Bacteria）
1．真细菌界（Kingdom Eubacteria）2．古细菌界（Kingdom Archaebacteria）真核总界（Empire Eukaryota）3．原始动物界（Kingdom Archezoa）4．原生动物界（Kingdom Protozoa）5．植物界（Kingdom Plantae）6．动物界（Kingdom Animalia）7．真菌界（Kingdom Fungi）8．假菌界（Kingdom Chromista）
二、细菌分类系统及演化
1、细菌的分类系统
国际上比较完整的细菌分类系统有三个：《细菌和放线菌的鉴定》、《细菌分类学》、《伯杰细菌鉴定手册》，其中《伯杰手册》被微生物学家普遍采用。原因有：1）具有广泛的影响力；2）实用性强；3）反映了作者希望将细菌分类从实用的人为分类向科学的系统分类的努力。
2、分类的演变
《伯杰手册》第一版将许多植物病原细菌归属于Phytomonas，后因与原生动物的一个属名同而舍弃。
1）1894年Migula建立假单胞菌属（Pseudomonas）
2）1939年Dowson从假单胞菌属中分离出Xanthomonas
3）1920年Conn建立Erwinia
4）1942年建立Agrobacterium
5）革兰氏阳性菌归入Corynebacterium
1948年《伯杰手册》第六版接受上述属名
6）由于细胞壁化学成分分析和遗传学特性用于研究革兰氏阳性菌的分类，Cummins提出将棒形细菌从Corynebacterium 移出，归入短小杆
菌（Curtobacterium）、红球杆菌（Rhodococcus）、节杆菌（Arthorbacter）和棒形杆菌属（Clavibacter）
1984年《伯杰系统细菌学手册手册》接受上述属名
7）1987年将葡萄黄单胞菌（Xanthomonas ampelina）移入一新属——嗜木质菌属（Xylophilus）
8）1987年J.M.Well将一类只寄生于木质部的革兰氏阴性菌建立一新属——木质部菌属（Xylella）
3 细菌主要类群的划分和植物病原细菌
（一）细菌门类划分（被分为4门，7纲，35组群）
1）薄壁菌门：主要由革兰氏阴性菌（G-）组成，2层壁，内薄外厚，肽聚糖少只局限于内层
2）厚壁菌门：主要(G+)菌组成，一层壁，肽聚糖量高
3）软壁菌门:主要由支原体类细菌组成，无壁，不含肽聚糖，菌体四周由单位膜包围
4）疵壁菌门:一类没有进化的原始细菌，也称古细菌。
菌体细胞壁中既无肽聚糖，又无胞壁酸。1978年N.E.Gibbons和R.G.E.Murray根据比较细胞学、细胞化学和16srRNA的研究结果，提出了在门下建纲的建议：
暗细菌纲厚壁菌纲
薄壁菌门无氧光细菌纲厚壁菌门
产氧光细菌纲放线菌纲
软壁菌门: 柔膜菌纲疵壁菌门:古细菌纲
1994年出版的伯杰细菌鉴定手册将原来四个门的细菌分类35个组群，组内还分若干亚组。
4 植物病原细菌属、种及其以下分类
1）植物病原细菌的属：近年来由5－6个属增加到15－20个属，主要原因：（1）新组合的形成；（2）新属建立；（3）原核生物新类型发现；（4）偶遇性病原菌
目前，提出以rRNA同源性或16SrRNA寡聚核苷酸相似性作为分属的依据。
2）植物病原细菌的种
细菌种：由一些具有许多共同特征的菌系组成的群体，通常这些菌系和其它菌系有很大区别。或一个具有高度的表现型相似性和在许多重要特征方面与有关菌系存在一定差异的组群。
菌系：由分离获得的纯培养物的单个菌落繁衍的后代组成。
参考菌系：又称典型菌系，是一个种的核心，由它以及和它相似的其它菌系组成种。
3）亚种下分类单元
亚种：是命名法规中承认的最低分类阶元且具有合法的名称。亚种是种下在次要性状方面具有稳定变化的组群，这些组群的划分可以具有遗传学依据。
变种：在亚种以下某一生物学性状有明显稳定变化的群体，在植物病原细菌中称这些变种为生物变种、血清变种等。
致病变种：表示一种细菌在一系列细菌学特征方面具有总体相似性，但也不排除在少数特征上存在差别，重要的是它们对不同寄主植物表现不同的致病性。
三、植物病原细菌的细菌命名
1. 命名法则：
1）国际系统细菌学委员会（ICSB）起草的《核准的细菌名录》：1980年1月1日起使用……以亚种为最低分类单元；
2）1980年国际植物病理学会的植物病原细菌分类委员会列出的《植物病原细菌致病变种名录》和典型菌系，并提出了命名致病变种的国际标准。
2. 命名（双名法）
亚种命名：属名＋种名＋subsp. ＋亚种名＋定名人＋定名时间
致病变种命名：属名＋种名＋pv. ＋致病变种名＋定名人＋定名时间
属名、种名、亚种（或致病变种）名斜体，定名人和定名时间可省略
例如：胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种（Eruiniacarotovora subsp. Atrosepitica）
油菜黄单胞菌柑桔致病变种（Xanthomonas campestris pv. citri）
如发表新种或新致病变种，则在学名之后分别加sp.nov或pv.nov
四、植物病原细菌重要属及代表性细菌病害
植物病原原核生物重要属
门属名病原菌代表种
薄壁菌门1. Agrobacterium土壤杆菌属 A.tumefacians蔷薇科根癌病
2. Acidovorax嗜酸菌属 A.avenae燕麦条纹病
3. Burkholderia伯克氏菌属 B.cepacia洋葱腐烂病
4. Erwinia欧文氏菌属 E.amylovora梨火疫病
5. Liberobacter韧皮部杆菌属L.asaticum柑桔黄龙病
6. Pantoer 泛生菌属P.ananas菠萝腐烂病
7. Pseudomonas假单胞菌属P.syringae丁香疫病
8. Rhizobacter 根杆菌属R.daucus胡萝卜瘿瘤病
9. Rhizomonas根单胞菌属R.suberifacrens莴苣栓皮病
10. Xanthomonas黄单胞菌属X.campestris甘蓝黑腐病
11. Xylella木质部小菌属X.fastidiosa葡萄皮尔斯病
12. Xylophilus嗜木质菌属X.ampelinus葡萄溃疡病
厚壁菌门Arthrobacter节杆菌属 A.ilicis 冬青叶疫病
Bacillus芽孢杆菌属 B.megaterium小麦白叶条斑病Clavibacter棒形杆菌属 C.michigmeusic番茄溃疡病Curtobacterium短小杆菌属 C.flaccumfaciens菜豆萎蔫病Rhodococxcus红球菌属R.fascrans香豌豆带化病
软壁菌门Streptomyces链丝菌属S.scabies马铃薯疮痂病Spiroplasma 螺原体属S.citri柑桔僵化病Pyhtoplasma植原体属P.aurantifolia柑桔丛枝病
（一）薄壁菌门植物病原细菌主要属薄壁菌门植物病原细菌主要属
1、土壤杆菌属（Agrobacterium）
菌体杆状，0.6-1.0x1.5-3.0μm, 单生或成对，鞭毛周生1-6根；土壤习居菌，好气性；G－, 无芽孢；菌落圆形，光滑、质地粘稠、不产色素；过氧化氢酶阳性，氧化酶通常也是阳性反应；G+C57-63mol%
除放射状土壤杆菌外，土壤杆菌属细菌从伤口侵入植物根冠、根和茎部，引起冠瘿、发根和茎瘿瘤。
土壤致病菌系，从伤口侵入植物后，致病的Ti质粒的一部分T-DNA，可以转入并整合到寄主基因组中。
Ti质粒功能：控制细菌的致病性、控制对细菌素agrocin84的敏感性和寄主范围、作为高等植物遗传工程的优良基因载体
（1）根癌土壤杆菌(A. tumefaciens)：模式种。寄主广泛，可侵害90多科300余种双子叶植物，尤以蔷薇科为主，引起桃、苹果、葡萄、月季的根癌病。癌肿是由病菌产生的激素引起的。
（2）发根土壤杆菌(A. rhizogens)
（3）悬钩子土壤杆菌(A. rubi)
（4）放射性土壤杆菌(A. radiobacter): 非致病菌。
土壤杆菌属的的许多菌株能产生细菌素，如土壤杆菌素K84是从澳大利亚土壤中分离的放射性土壤杆菌K84菌株产生的，在世界上许多国家被成功地用于果树冠瘿病的生物防治。
代表性细菌病害：土壤杆菌冠瘿病该属侵染植物常引起植物过度生长，主要形成肿瘤和发根症状。症状的不同，不决定于细菌的种，而是决定于细菌所带有的质粒类型：菌株带有Ti质粒引起冠
瘿症状，带Ri质粒引起发根症状。
2．假单胞菌属（Pseudomonas）
Migula 1894年建立，占植物病原细菌的一半。菌体短杆状或略弯，单生，0.5-1x1.5-5.0μm, 鞭毛极生1-4根或更多；广泛分布于江湖河水、土壤；G－, 无芽孢；严格好气性；菌落圆形，过氧化氢酶阳性，氧化酶多数为阳性；G+C58-70mol%
常见的假单胞植物病原细菌主要有3类：
1）溶果胶的荧光假单胞细菌：一类弱寄生菌。引起马铃薯和贮藏期蔬菜的腐烂
2）丁香假单胞类型的细菌：包括许多致病变种，这些致病变种不但可用致病性进行鉴定，还可用生理生化试验来鉴别。
此外，大多数丁香假单胞的致病变种具有冰核活性，所以冰核活性也可用于初步鉴定这类细菌。
3）青枯假单胞：（现为劳尔氏菌属）根据寄主范围不同，可划分小种：
? 小种1：为害烟草和番茄等茄科作物；
? 小种2：为害香蕉
? 小种3：为害马铃薯和番茄，对其它茄科作物致病力不强
植物病原假单胞菌：是否产生荧光素
? 荧光群：在KBA培养基上产生荧光素，不积累PHB，不能利用D-阿拉伯糖
? 非荧光群：不产生荧光色素，通常积累PHB，能利用D-阿拉伯糖
鉴定植物病原荧光假单胞菌：掌握寄主植物和典型症状的资料（引起各种症状，包括肿瘤、腐烂、枯萎、退绿、和坏死）；在肉汁胨培养基和金氏B（KBA）培养基上观察：菌落大小、果聚糖形成、氧化酶和荧光色素
鉴定植物病原非荧光假单胞菌多数非荧光假单胞菌能积累聚－β-羟基丁酸盐（PHB）
假单胞菌属中有14种非荧光菌
与植物有关的细菌：
? 玫瑰红假单胞菌（P.rhodos）
? 嗜温假单胞菌(P.mesophilica)
? 嗜麦芽假单胞菌(P.maltophilia)
代表性细菌病害：农作物青枯病病原：青枯病假单胞菌（Pseudomonas solanacearum）
（一）分类上的变化
青枯病菌是一个复杂的群体，在寄主范围、地理分布、致病型流行学、生理特征方面都有很大的不同。种下单元的分类有多种方法，但以小种和生化型为主。
小种分类系统强调对不同寄主致病性，划分为3个小种：
?小种1：感染番茄、烟草等茄科及其他多种作物
?小种2：只侵染三倍体香蕉和蝎尾蕉属植物。?
小种3：主要侵染马铃薯及番茄，而在其他茄科植物上致病性很弱。
在生化型方面，Hayward根据对3种双糖和醇的利用情况，将供试菌株分为4个生物型（生物变种）。
利用糖、醇、产酸试验生物变种Ⅰ生物变种Ⅱ生物变种Ⅲ生物变种Ⅳ
乳糖－＋＋－
麦芽糖－＋＋－
纤维二糖－＋＋－
甘露醇－－＋＋
山梨醇－－＋＋
卫茅醇－－＋＋
4. 欧文氏菌属（Erwinia）
菌体短杆状，0.6-1.0x1.5-3.0μm, 多双生或短链状，鞭毛周生多根；兼性好气性；G-, 无芽孢；菌落圆形，隆起灰白色；G+C 50-58mol% 该属大多数种是植物病原菌，引起植物坏死、溃疡、萎蔫、流胶、叶斑及软腐症状。
amylovora群：引起坏死或萎蔫，利用有限范围的碳水化合物，需要生长因子，包括解淀粉（E.amylovora）、野梧桐（E.mallotivora）、流黑（E. migrifluens ）、栎（E. quercina ）、生红（E. rubrifaciens ）、柳（E. salicis）、嗜微管束欧文氏菌（E. tracheiphila）7个种。herbicola群：不需生长因子，不产生果胶酶，菌落大多产生黄色素。包括草生（ E.herbicola）、凤梨（E.ananas）、噬夏孢子（E. uredovora ）、斯氏欧文氏菌（E. ctewartii）4个种
carotovora群：产生果胶酶，使植物组织的薄壁细胞浸离降解。主要病原菌包括菊欧文菌（E. chrysanthemi）、胡萝卜欧文菌（E. carotovara）、灼兰欧文菌（E.cypripedii）、大黄欧文菌（E. rhapontici ）。
常见种：
1.菊欧文菌（E. chrysanthemi）引起多种亚热带植物和观赏植物软腐病。
2.胡萝卜欧文菌（E. carotovara）: 俗称大白菜软腐病菌，寄生范围很广，包括十字花科、禾本科、茄科等
20多科的数百种果蔬和大田作物。
代表性细菌病害：欧文氏杆菌软腐病
（一）一般发生情况
欧文氏杆菌能引起多种植物和植物组织软腐病。十子花科蔬菜、马铃薯软腐病、水稻细菌性基腐病是我国发生的由欧文氏杆菌引起的重要植物细菌性病害，在田间或运输过程和贮藏期都会引起植物或植物组织发生软腐，造成严重的损失。
（二）马铃薯软腐病
1 病原：胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora）G－，周生鞭毛、兼性厌气，生长适温为27－30℃，菌落白色。
该种下分为3个亚种，重要的是前两个。
? 胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种（E. carotovora subsp. atroseptica）
? 胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种（E. carotovora subsp. carotovora）
? 胡萝卜软腐欧文氏菌甜菜亚种（E. carotovora subsp. betavasculorum）马
（三）大白菜软腐病
在田间包心期开始发病，严重时叶柄基部和心髓组织完全腐烂，腐烂组织有腥臭味。贮藏期可引起烂窖。
1. 病原：胡萝卜软腐欧文氏菌
2. 越冬和侵染源：在病株和病残体中越冬。?带菌昆虫危害植物时可将病菌带进植物体内。?土壤中细菌除通过昆虫传播外，还可从植物幼根的微伤口侵入，并可在微管束内长期潜伏。
（四）水稻细菌性基腐病
? 在移栽后至抽穗期发生。? 主要症状为茎基部变黑腐烂，并伴有恶臭。苗期发病可形成枯心和枯稍，造成“枯心死”和“剥皮烂”两种类型的症状。? 在成株期造成枯孕穗和枯白穗，茎基部灰褐色软腐，根系浅，极易拔起。
5. 黄单胞杆菌属（Xanthomonas）
菌体直杆状，0.4-0.7x0.7-1.8μm, 单极生鞭毛；绝对好氧；G-；菌落一般为黄色、光滑或粘稠；产生黄单胞菌色素（Xanthomonadins）；G+C 63-71mol%。绝大多数成员为植物病原细菌。
V anterin(1995)归属20个种，120个致病变种。
典型种：油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris(Pammel 1895) Dowson 1939)。
? 胞外多糖：许多菌系有荚膜，在培养基上形成质地粘稠菌落，产生大量的荚膜多糖。胞外多糖在植物致病过程中起植物毒素的作用。? 色素：所有种都产生黄色素，在鉴定中是一个重要特征。
? 呼吸链：绝对好氧菌。
? 致病性：引起多种类型症状，如叶、茎部坏死斑，腐烂和系统性萎蔫等。
? 多数病原菌通过它们寄主植物的种子传播。黄单胞杆菌属五个种的主要鉴别特征
区别特征X.albilineans
白纹黄单胞
X.ampelina
白杨黄单胞
X.axonopodis
地毯草黄单胞
X.campestris
油菜黄单胞
X.fragariae
草莓黄单胞
36℃下生长＋－＋＋－NA上(含葡萄糖)
产生粘绸菌落
－－－＋＋牛乳蛋白水解－－－＋－阿拉伯糖－＋－＋－
纤维二糖－－－＋－
海藻糖－－＋＋－
除上述五种外，其余均归为X.campestris的致病变种
重要种：
1. 油菜黄单胞菌（X. campestris）模式种。
?油菜黄单胞菌油菜致病变种（X. campestris pv. campestris),引起十字花科蔬菜黑腐病。
?油菜黄单胞菌柑桔致病变种（X. campestris pv. citri），引起柑桔溃疡病。
2. 水稻黄单胞菌（X. oryzae）: 包括2个致病变种。
?水稻白叶枯病原菌（X. oryzae pv. oryzae）
?水稻细菌条斑病原菌（X. oryzae pv. oryzicola）
分离和鉴定
? 分离：新鲜病组织，生长慢，需培养2～3 d；在肉汁胨培养基上，菌落圆形，光滑、全缘、隆起、质地粘稠。
? 鉴定：细菌形态，革兰氏染色，鞭毛特点、代谢类型、过氧化氢酶和氧化酶反应，特别是细菌的黄色素是一个重要特征。
代表性细菌病害：水稻白叶枯病
（一）症状类型：是一种维管束病害，系统侵染水稻植株，病菌常通过水孔和伤口侵入，最终到达木质部导管，引起叶枯和凋萎症状。叶枯症状最常见，最初在叶上形成水渍状条纹，然后纵向扩展1－2周后转为黄白色，可能在叶尖或叶缘产生菌脓。凋萎症状常发生在秧苗期和移栽后，病叶变灰绿色，沿中脉卷曲萎蔫，延至叶鞘和幼苗生长点，导致枯心。
（二）病原
1. 菌系分化
病原最初为油菜黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonasoryzae pv.oryzae）,现为水稻黄单胞菌（X. oryzae）。有菌系分化，据在不同品种上致
病性，日本分为5个小种，菲律宾分6个小种，中国分为8个小种。
2. 水稻白叶枯病菌与水稻条斑病菌的比较
G+Cmol%为64.6－65％，具有很高的DNA-DNA同源性，不能分为两个亚种，但在致病性和表型特征上存在明显差异，认为两个变种。通过下列特征区分：
?①症状特征：前者引起水稻叶枯或极性凋萎症状，后者叶片条斑症状。②蛋白质SDS-PAGE图谱③特异性PCR检测④致病小种专化型的单克隆抗体⑤DNA杂交
6.韧皮部杆菌属（Liberobacter）
电镜下观察菌体梭形或短杆状，G－不能人工培养，存在于韧皮部，称为韧皮部难养菌（Phloem fastidiousbacteria, PFB）或韧皮部局限菌（phloem-limited bacterium,）。过去称为类细菌。
包括两个种：
1. L. asaticum引起柑桔黄龙病。引起黄梢和青果。
2. L. africanum引起青果病（citrus greening）。
（二）厚壁菌门植物病原细菌的主要属
植物病原棒形细菌
①革兰氏阳性菌
②严格好气
③过氧化氢酶阳性，氧化酶阴性
④产酸弱而慢，生长速率慢
⑤引起植物萎蔫、密穗、瘿瘤等症状
⑥最初属于棒杆菌属，后来将植物病原棒形细菌从棒杆菌属中移出，并分别归入棒形杆菌属、短小杆菌属等4个属。
1984年《伯杰系统细菌学手册》最终将棒形细菌划分为：
?棒形杆菌属（Clavibacter）：主要是植物病原棒形细菌
?短小杆菌属（Curtobacterium）：美国冬青节杆菌为唯一致病菌
?红球菌属（Rhodococcus）：引起系统性病害，表现萎蔫、密穗、花叶等。该属包括5个种和7个亚种。
?节杆菌属（Arthrabacter）：包含5个种，其中大多数是从植物上分离的。
?棒杆菌属（Corynebacterium）：主要包括人和动物的病原菌。
分离和鉴定
分离：一般从新鲜的病植物材料分离，可采用肉汁胨培养基。但木质部棒形杆菌只能在SC培养基上生长。
鉴定：当从具有特征性症状的已知寄主的新鲜病斑分离病原菌时，根据寄主植物、症状类型以及细菌形态和革兰氏染色反应比较容易鉴定。
1 .棒形杆菌属（Clavibacter）
?菌体多形态：棒状，不规则棒杆状，常排列成Y型或V型;0.4-0,75x0.8-2.5μm, 无鞭毛，不运动。?好氧；G+,无芽孢；G+C 67-78mol% ?生长缓慢，菌落不透明；都是植物病原菌，引起系统性病害，表现萎蔫、蜜穗、花叶等症状。
典型种：密执安棒形杆菌（Clavibactermichiganense (Smith) Davis）
该属的成员原来都属于棒杆菌属，由于它们和模式种（白喉杆菌）的差异较大，亲缘关系较远，所以细菌学家将植物病原细菌从中移出并建立了棒形杆菌属，棒杆菌属仍保留，其成员都是人和动物的病原细菌。
目前棒形杆菌属包含5个种和7个亚种。
密执安棒形杆菌密执安亚种（C. michiganensesubsp. michiganense）：引起番茄细菌溃疡病。
密执安棒形杆菌环腐亚种(C. michiganense subsp. sepedonicum)：引起马铃薯环腐病。
小麦棒形杆菌（C. tritici）：引起小麦密穗病。
代表性细菌病害：马铃薯环腐病
马铃薯环腐病于1906年在德国首次发现。我国20世纪50年代最先发现于黑龙江省，其后在马铃薯产区都有发生。是马铃薯上最重要的病害之一。
（一）病原：为棒形杆菌属，密执安棒形杆菌环腐亚种（Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicum）。
菌体短杆状，无鞭毛，不运动。菌落白色,圆形。自然条件下只侵染马铃薯，在人工条件下可侵染番茄、茄子等茄科植物。
（二）症状：维管束病害，田间发病一般在开花之后。初期症状为叶脉间褪绿，以后逐渐变黄变枯。萎蔫从叶片边缘开始，枝叶坏死，维管束变褐。贮藏期可引起烂窖。
2. 芽孢杆菌属（Bacillus）
?菌体直杆状，0.5-2.5x1.2-10μm, 鞭毛周生多根。?能运动，老龄菌体产生芽孢，好气或兼性厌气。?一般为G+, 多数菌过氧化氢酶阳性，G+C 32-39mol%。?菌落扁平，灰白色，边缘不整齐，有缺刻或波纹，较粘稠。常分离到，加快病组织的腐烂或坏死，少数可单独侵染而致病。
?大部分芽孢杆菌不是植物病原菌，有的可以产生细菌素或毒素，用作生物防治的材料。
芽孢杆菌属的鉴定
? 细菌的运动性
? 芽孢的形态及其在菌体中的位置：芽孢染色法；做超薄切片，用透射电子显微镜观察。
? 厌氧性试验
? 致病性测定：植物致病的芽孢杆菌较少。
? 其它的碳水化合物、柠檬酸等物质的利用试验
（三）软壁菌门植物病原生物主要属
?菌体无细胞壁，只有一层原生质膜包围在菌体的四周。与植物病害有关的统称为植物菌原体，包括螺原体属和类支原体菌。能穿透细菌过滤器，对青霉素不敏感，对四环素敏感。菌体形态多形性，如圆形、椭圆形、哑铃形、梨形等。? 在固体培养基上的菌落很小，煎蛋状，直径1mm左右，常在主菌落周围形成更小的卫星菌落。菌体没有鞭毛，一般不能运动。
菌原体的繁殖：从圆形、椭圆形或线条分枝体上二分裂法或缢缩断裂法繁殖。
1. 螺原体属（Spiroplasma）
菌体的基本形态为螺旋形，繁殖时可产生分枝，分枝亦呈螺旋形。生长繁殖时需要提供甾醇。菌体无鞭毛，但在培养液中可以做旋转运动。兼性厌氧菌。
传病介体：叶蝉、飞虱等。?
柑桔僵化病的螺原体（S. citri）: 引起柑桔僵化病和辣椒脆根病。
玉米矮缩病的螺原体（S. kunkelii）：玉米、高粱等。
病原物寄生于韧皮部筛管组织中，常选用幼嫩多汁部位的筛管组织进行分离。
2. 类支原体菌（MLO’S），现为植原体是一类引起植物“黄化类型”病害的非螺旋形支原体菌体的形态为多形性，圆形、椭圆形等，与支原体属类似，故将其归为一类，称为类菌原体（Mycoplasma-like Organisms, 或MLO’S）。引起泡桐丛枝、紫莞黄化、枣疯病等。
目前对该病害的主要诊断方法：直接观察病组织筛管中病原物的存在。
第四节植物病原细菌的鉴定
植物细菌病原的确定应根据以下原则和步骤：
?①通过显微镜的检查，在染病组织中有细菌存在；②分离病原细菌并获得纯培养③人工接种测定致病力能产生原先所表现的症状；④自接种后发病的组织上进行再分离，所获得菌种⑤与原先菌种进行比较是一致的。在细菌鉴定中，由于体积比真菌小，构造简单，而种类又多因此当获得细菌的培养后尚需进行：①形态染色①培养特征的观察③生理生化反应的测定
有的还需进行：①血清学检验②噬菌体测定③寄主范围的试验植物病原细菌鉴定的步骤
一、显微镜检查喷菌现象（bacteria exudation,BE）
1. 首先要根据症状类型的特点选取：
?叶、茎、果实的斑点、溃疡和软腐，选取病健交界处?微管束，选取变色（但轻微）的微管束瘿瘤，选取幼嫩组织
2. 以灭菌剪将病斑剪下，略带健康组织，大小约0.5～1公分左右，放在灭菌载玻片中央，加无菌水1d。
3. 然后以灭菌剪或解剖针将病斑自中心撕破，加上灭菌盖玻片，静置约10min，有云雾状自破口处涌出。细菌溢细菌溢
二、分离
1. 分离方法（划线分离法、平皿稀释法）
2. 不同症状类型病原细菌的分离
1）斑点型：如棉花角斑病，首先用灭菌剪刀剪取新鲜的典型病斑，约1cm见方，在70％乙醇中浸一下立即取出然后进行表面消毒，表面消毒剂可以采用0.1％升汞，15″-2 min。或0.5％的次亚氯酸盐如漂白粉2 min。消毒时间的长短应根据叶片或组织的厚薄，大小与质地，初次分离可以多试几个时间。消毒后用灭菌水洗涤，如病斑过大可将健康组织部分剪去一些，将病斑放在另一个培养皿的灭菌水中，剪破中心或以灭菌玻璃棒研碎病组织静置，俟细菌游出，然后用划线法或稀释法进行分离培养。病斑中有失绿晕环，病斑看起来很大，但细菌在组织中心数量并不多，可以将此类病斑先投入牛肉汁中繁殖，培养24h，液体混浊后再进行分离培养。如烟草野火病
2) 萎蔫型
茄青枯病
将茎部剪成1－2寸长，表面用70％酒精轻拭，在火焰上表面消毒，以灭菌刀纵剖，则自中心髓部至各部分均可看清，选择轻微变色病部，以灭菌刀切出薄片或以解剖针挑出病健交界处分离。可以不再消毒。如果茎部较粗，也可以在表面消毒后用解剖刀横断茎部，用夹子或手紧压茎部横断面，挤出溢脓或汁液，分离。
3) 肿瘤组织
草本绿色茎上的软瘤比较容易分离果树或木本的大而坚硬的本质瘤不易分离，可以将木本瘤磨碎接种在向日葵、番茄等幼株上长出瘤后再进行分离。由于细菌位于表皮细胞和木质部之间，因此应用酒精棉花擦拭表面，在火焰上表面消毒，再在灭菌皿中实行解剖：以灭菌刀剥离或切下瘤的外表层，如有木质部可将其刮去，剩下的壳状组织放于另一有较多水（约5ml）的培养皿中，以灭菌玻棒将其捣碎，静置12h, 最好24h，划线或稀释分离。
4)腐烂组织较简单，选择近病部交界处以接种环挑取少量腐烂组织，稀释后划线分离
5)种子带菌的分离
选择病种子，以0.1％升汞液表面消毒1－2min，灭菌水洗涤，再将此种子在70％酒精中浸几分钟，洗涤2－3次，取出放在研钵中磨碎，稀释培养。
3 细菌的纯化
在低倍显微镜下挑取分离出的典型单菌落平板划线培养（2皿），如此重复1－2次，，最后，在均匀一致的平板中，挑取典型菌落移植在斜面培养基上培养，长成后在4度保存菌种。4 细菌菌种保存（在减少污染的前提下降低细菌的代谢活动）
1）定期转管：土壤、假单胞杆菌每月1次，黄单胞和棒形细菌2 －3周1次。
2）液体悬浮
3）矿物油：使液体石蜡超过培养基顶端1cm，冰箱保存，至少可保持活力几个月。保存好氧菌效果较好
4）冷冻干燥：目前最好法，可保持活力数年以上
5）其它：超低温、瓷珠保存和明胶片保存三、植物病原细菌的培养
1. 培养基的种类
? 按组成分为自然、合成、半合成
? 根据用途分基本（又称营养）、特殊培养基
? 根据培养方式：液体、固体
2. 基本培养基的制备与调节
牛肉膏3g、蛋白胨5g、水1000ml。
将水加热至60度左右，将牛肉汁、蛋白胨加入溶化，搅拌。冷却后调节pH7.2，分装灭菌。
四、致病力测定和人工接种的方法分离后应首先确定细菌致病性最可靠的致病性试验是在原寄主植物上完成柯赫氏法则，其他方法只能作为参考。
烟草过敏性反应曾被认为是一种致病性试验方法，但这种方法的局限性很大：不是所有的植物病原细菌都能在烟草上产生过敏性反应，这一试验在黄、假单胞菌上适用，但对土壤、欧氏杆菌不适用。有些细菌的野生菌株不引起烟草过敏反应，而突变后可引起。
1. 常规致病力测定的步骤
细菌繁殖：通常培养在固体培养基上，菌龄24－48h；
菌悬液：0.85％盐水配，光电比色计、计数板计数
植物选择：①首先应选择分离的植物与品种；②也可选寄主范围内的代表植物；③有的可选择指示植物接种部位选择：原则上发病器官接种。腐烂细菌在储藏器官、根癌细菌在生长点、萎蔫型在导管上发病快
接种前后的管理：注意保湿
2. 人工接种的方法
①喷雾接种（普通、高压喷雾）-------对于从气孔、水孔等孔口侵入的，造成叶斑类型的细菌。
②刺伤接种-------主要用于伤口侵入茎和肉质器官的腐烂类，接种效果较好，也用于焦枯、坏死、萎蔫等
③注射接种--------可用于萎蔫、叶斑、肿瘤等症状类型
④磨擦接种--------对叶斑类病害
⑤浸泡接种--------对萎蔫型和苗期病害
⑥切伤接种--------腐烂类除针刺接种外，也可用此法3. 致病力的快速测定
利用某些敏感或指示作物
1）烟草过敏性反应：特别是假单胞和解淀粉欧氏杆菌，而黄单胞杆菌只有一些变种能在烟草上产生过敏反应。
测定方法：配制107－108CFU/ml菌悬液；从烟叶下表皮注入叶肉细胞间，24－48h表现枯斑为阳性反应，3d出现黄斑为阴性反应。实验要设阴性和阳性对照。黄单胞菌属多用番茄或辣椒测定过敏性反应。接种方法同上。烟草过敏性坏死反应
2）利用离体的组织测定
马铃薯软腐试验：用于测定马铃薯软腐病原细菌的致病性以及某些细菌的果胶酶活性对于荧光假单胞菌的鉴定有价值。
果实接种试验：桃、李、杏、樱桃果实适合筛选油菜黄单胞菌桃、李致病变种（产生水渍状病斑）
柠檬可用于多数丁香假单胞菌丁香致病变种（黑凹斑）菜豆荚接种试验：菜豆晕疫病病原菌有致病力的菌系产生水渍斑，无致病力和对照形成坏死斑；丁香假单胞丁香致病变种接种3－5d出现红褐色坏死边缘中心下陷病斑；油菜黄单胞菜豆致病变种产生水渍斑。致病性测定确定其是致病菌后，通常按细菌学性状进行鉴定：
根据表型特征：细菌形态、染色反应、鞭毛特性、代谢类型、细菌与氧气的关系、致病性以及生理生化特性等。血清学、噬菌体反应等也常用于病原细菌的鉴定。
五、植物病原细菌的染色
（一）革兰氏染色
1. 原理：
? 革兰氏阳性菌：壁厚、肽聚糖含量高
? 革兰氏阴性菌：壁薄、肽聚糖含量低
2. 染色过程：
固定－结晶紫染色1 min－碘液处理1 min－95酒精褪色30 s－番红O复染10 s革兰氏阳性革兰氏阴性
3. 快速方法
? Cerny据氨基酶颜色反应（G+无此酶、G-有，反应后呈黄色）3％KOH试验（G-壁被分解，粘绸；G+壁不分解）（二）鞭毛染色鞭毛位置和数目是分属的重要依据
1.染色的方法与步骤
2.不同属细菌鞭毛的着生方式和数目六、培养特征
实验课介绍
七、生理生化反应
实验课中介绍
八、血清学反应二、实验内容和方法二、实验内容和方法
（一）碳素化合物的利用
1.产酸和产气试验
1）接菌培养：一般每5 mL培养液接种0.1mL 108 CFU/ml菌悬液，适温下培养3-4周。
2）结果观察：产酸：培养液变为黄色产碱：培养液变为蓝色CK：培养液为草绿色变色产气：杜氏发酵小玻管出现空隙
CK：杜氏发酵小玻管不出现空隙产气A yers培养基：碳素化合物产酸试验
（1）配方：NH4H2PO41.0ｇ，氯化钾0.2ｇ，MgSO4.7H2O 0.2ｇ，蒸馏水1000 ｍL，溴百里酚兰（1.6%酒精溶液）1.5 mL; 1%碳素化合物。
单糖（葡萄糖、半乳糖）；双糖（麦芽糖、乳糖）；多糖（淀粉）；醇（甘露醇）。
有的细菌不产酸和气，有的只产酸不产气，少数植物病原细菌既产酸又产气
（2）配制过程：将NH4H2PO4 、氯化钾、MgSO4.7H2O溶于蒸馏水，调节pH7.0后加入溴百里酚兰，最后加入碳素化合物（也可分别灭菌后加入）
（3）分装：将上述培养基分装于试管中，每管10 mL左右。测定气体产生时，加上杜氏发酵小玻管后灭菌。
2.甲基红(MR)和VP(产3-羟基丁酮)试验
1）接菌培养：一般每5mL培养液接种0.1mL108CFU菌悬液，适温下培养1周。
2）甲基红试剂配制：甲基红0.1g溶解于300ml的95%酒精中，然后用蒸馏水稀释至500ml。
3）MR试验结果观察：取上述培养液5ml，加甲基红试剂2~3滴，呈明显红色为阳性，呈黄色为阴性。
4）VP试验结果观察：每毫升加0.1mL40%KOH溶液, 置48-50℃水浴处理2h，充分摇动后观察结果。在4h内出现红色者为阳性反应。（二）氮素化合物的分解
1.硝酸盐还原
1）接菌：在培养液中接菌后培养1周
2）Griess-Llosvary试剂测定法试剂A：对氨基苯磺酸8.0g ，5mol/L 醋酸（286.0ml冰醋酸加715.0ml水）1000ml
试剂B：二甲基-α-萘胺6ml，5mol/L醋酸1000ml测定亚硝酸，每试管加试剂A和试剂B各1ml如呈红色，表示有亚硝酸根。
2.硫化氢产生
1）醋酸铅滤纸条的制备：将滤纸剪成5mm×50mm的小条浸在5%醋酸铅溶液中，空气中干燥后，在120℃烘箱中灭菌1h。
2）接菌：将细菌接种于试管中的培养液中后，用上述制备的滤纸条夹在棉花塞和试管壁之间，使纸条悬在培养液面上，但不要碰到培养液，25℃培养2周。
3）结果观察：纸条变黑表示有硫化氢产生，为阳性反应。
3.吲哚产生
1）草酸滤纸条的制备：将滤纸剪成5mm×50mm的小条浸在饱和草酸溶液中，空气中干燥后，在120℃烘箱中灭菌1h。
2）接菌：将细菌接种于试管中的培养液中后，用上述制备的滤纸条夹在棉花塞和试管壁之间，使纸条悬在培养液面上，但不要碰到培养液，适温培养1周。
3）结果观察：纸条变淡红色表示有吲哚产生，为阳性反应。（
三）大分子化合物的利用
1.明胶液化
1）接菌：采用穿刺法接菌后，放在适温中培养1-3周。以不接菌试管为对照。
2）结果观察：将经过培养的接菌试管取出后，放在4℃冰箱中，看其是否凝固，如不凝固，则说明明胶分解而导致液化，为阳性反应。
2.石蕊牛乳反应
1）接菌：将培养基接种细菌于28℃培养1-3周，以不接种的石蕊牛乳做对照。
2）结果观察：
A.酸的产生：石蕊牛乳变成粉红色，表示从乳糖产酸
B.凝固：产酸达到pH4.7发生凝块，如产气凝块断裂；凝乳酶的作用而凝固，凝块收缩与乳清分离。
C.胨化：牛乳变清，往往从表层开始
D.碱的产生：石蕊牛乳变蓝色，胨化时常呈碱性
E.石蕊还原：石蕊变为无色
3. 淀粉水解试验
1）接菌：将细菌接种于淀粉琼脂平板上，适温下培养24-48小时。
2）结果观察：在平板上加碘液后，培养基为深兰色，菌落周围有无色透明圈者为阳性。四、细菌的好氧性和厌氧性测定蛋白胨 2.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钾0.2 g 琼脂 3.0 g 蒸馏水1000.0 ml pH 7.4~7.8溴百里酚兰（1.6％酒精溶液 1.5 ml）待培养基融化，并调pH后，装于试管中，每支试管装9 ml 灭菌。培养基凝固后，用接种针蘸细菌悬浮液针刺接种，一直刺到管底。分别在培养2、4和7 d 后观察记录。好氧性细菌，只在开管的上部生长；兼性厌氧性细菌，则在开管的上下部都能生长；厌氧性细菌，则只能在开管的下部和闭管中生长。（
五）其他生理生化试验
1.氧化酶试验
1）试剂：1%二甲基对苯二胺盐酸盐或1%四甲基对苯二胺盐酸盐。
2）测定方法：
A. Kovacs：在培养皿内放一张滤纸，滤纸上加3-4滴试剂使其湿润，用牙签挑取24h菌苔涂在滤纸上，60秒内变成紫色为阳性反应，60秒后或不便色为阴性。
B.滤纸条法：用滤纸条蘸少许菌苔，加1d试剂，立即呈粉红色为阳性2.过氧化氢酶（接触酶）试验
1）试剂：3%过氧化氢
2）测定方法：挑取固体培养基上培养24-48h的菌苔，置于干净玻片上，滴加过氧化氢。
3）结果观察：在半分钟内有大量气泡产生的为阳性，不产生气泡的为阴性。
1. 抗原与抗体
抗原：能引起免疫反应的异体物质称为抗原
抗体：是在抗原刺激下产生的特异球蛋白，又称免疫球蛋白，能识别相应抗原，并与抗原进行特异性结合。
血清反应：抗原和抗体在生物体内和体外都能发生免疫反应。细菌分类鉴定中常在体外采用血清中的抗体进行，含有特异性抗体的血清称抗血清或免疫血清，这种反应又称血清反应。
特异性抗原：在细菌的抗原中，有些是细菌种、亚种或型等所特有的，称为特异性抗原，可用于细菌鉴定与分群分型。
共同抗原：有些抗原是一类或一属细菌所共有的称为类、属抗原或共同抗原。同时含有两类抗原的细菌能刺激肌体产生相应的两类抗体。细菌的抗原物质有多种类型按细菌结构可分荚膜、鞭毛、菌毛和菌体抗原。
在植物病原细菌研究中应用的抗原可分3种类型
①非纯化抗原②纯化抗原③已鉴定的纯化抗原
2.血清反应的基本特征
?①具有高度特异性②灵敏度很高
3.血清反应的主要类型
凝集性反应：包括凝集反应和沉淀反应
标记抗体技术：包括酶标记抗体、荧光标记抗体和同位素标记抗体。
单“克隆”抗体技术：特异性很高二、实验内容和操作方法二、实验内容和操作方法
(一)血清学反应
1. 凝集反应
凝集反应用于测定血清中抗体含量时，将血清连续稀释（一般用倍比稀释）后，加定量的抗原；测抗原含量时，将抗原连续稀释后加定量的抗体。
（1）玻片凝集反应：细菌鉴定的快速测定法
A. 方法：用新鲜细菌加生理盐水配成浓细菌悬浮液。在干净的载玻片上加2滴细菌液，再在其中的1滴细菌液中加一滴抗血清并充分混匀，另一滴则不加抗血清作对照。
B. 结果观察：3-5min后可见原来均匀悬浮的细菌凝集成团，对照则不发生这种变化。
（2）试管凝集反应：测定抗血清的效价试管凝集试验是一种定量试验。用已知抗原测定受检血清中有无某种抗体及其滴度，以辅助诊断
或作流行病学调查。抗原抗体反应时，出现明显反应终点的抗血清或抗原制剂的最高稀释度称为效价。
（3）A. 方法：按图示方法稀释抗血清
0CK 1mL1:5抗血清1 2 3 4 5 6 7 8 91mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL1mL1mL生理盐水1mL生理盐水每试管再加入1mL细菌悬浮液(约109CFU/mL)，
充分混合后，放在56℃水浴中2 h后取出，在冰箱中放1夜记载结果。
++++ 完全凝集，上部液体完全澄清+++ 液体几乎透明，有明显凝集，管底有明显的伞状沉淀；++ 液体中等混浊，管底有中等量的伞状沉淀，振荡时呈小絮片状。计算抗血清效价+ 液体透明度不明显，管底有少许不明显的伞状沉淀- 无凝集，液体混浊2. 沉淀反应（1）环状沉淀反应：常作为抗原的定量试验用小型的试管，分别先后加入抗原和抗体，在二层液面交界处出现白色环状沉淀。
（2）絮状沉淀反应：在试管中混合抗原和抗体，在电解质下形成抗原-抗体复合物的沉淀。在抗原-抗体比例最适时，沉淀物出现最快、最多
（3）琼脂双扩散：常用于抗原的比较和鉴定
A.琼脂板的制备：用生理盐水配成0.8%-1.0%的琼脂，再加入0.15%的NaN3，加热溶化后倒入直径6 cm的培养皿，使琼脂板的厚度约3 mm。然后用打孔器在琼脂上打孔，孔间距离相等，孔径一般5 mm
B.方法：中间小孔加入抗血清，周围孔加入待测的抗原。放在密闭容器内保湿，并于27-30℃保持1d以上，观察沉淀带的出现，并记载结果。
九、噬菌体及其应用
目前，噬菌体多用于病害流行学的研究，用于细菌鉴定的较少。但确实已发现有些植物病原细菌的种可用来鉴别同一种细菌的不同菌系。多价噬菌体：寄主范围广，可侵染一个属中不同种的细菌；在研究细菌的亲缘关系上有一定意义。
单价噬菌体：寄主范围窄，只侵染同一种细菌的个别菌系。一般植物病原细菌鉴定利用单价的专化性噬菌体
二、实验内容和操作方法
（一）培养基的配制
1.牛肉膏蛋白胨培养基(NA)：分离和培养最常用
（1）配方：牛肉膏3ｇ，蛋白胨10ｇ，NaCl 5ｇ，琼脂20ｇ，蒸馏水1000 ｍL。
（2）配制过程：将牛肉膏、蛋白胨、NaCl 溶于蒸馏水后，调节pH7.2，加入琼脂溶化后分装于三角瓶和试管。
2. Hugh和Leifson（HL）培养基：细菌的好氧性和厌氧性测定
蛋白胨 2.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钾0.2 g 琼脂 3.0 g 蒸馏水1000.0 ml pH 7.4~7.8 溴百里酚兰（1.6％酒精溶液 1.5 ml）
待培养基融化，并调pH后，装于试管中，每支试管装9 ml 灭菌。培养基凝固后，用接种针蘸细菌悬浮液针刺接种，一直刺到管底。分别在培养2、4和7 d后观察记录。
好氧性细菌只在开管的上部生长；兼性厌氧性细菌，则在开管的上下部都能生长；厌氧性细菌，则只能在开管的下部和闭管中生长。
3.Ayers培养基：碳素化合物产酸试验
（1）配方：NH4H2PO41.0ｇ，氯化钾0.2ｇ，MgSO4.7H2O 0.2ｇ，蒸馏水1000 ｍL，溴百里酚兰（1.6%酒精溶液）1.5 mL; 1%碳素化合物。单糖（葡萄糖、半乳糖）；双糖（麦芽糖、乳糖）；多糖（淀粉）；醇（甘露醇）。
有的细菌不产酸和气，有的只产酸不产气，少数植物病原细菌既产酸又产气
（2）配制过程：将NH4H2PO4 、氯化钾、MgSO4.7H2O溶于蒸馏水，调节pH7.0后加入溴百里酚兰，最后加入碳素化合物（也可分别灭菌后加入）
（3）分装：将上述培养基分装于试管中，每管10 mL左右。如果测定气体产生，加上杜氏发酵小玻管后灭菌。产酸时培养液变黄，产碱时变蓝，产气则小玻管内培养液被部分排出，出现空隙。
4. MR和VP试验：对葡萄糖的分解能力
（1）配方：蛋白胨5ｇ，葡萄糖5ｇ，磷酸氢二钾5ｇ，蒸馏水1000 ｍL。
（2）配制过程：将蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钾溶于蒸馏水，调节pH7.0-7.2，每管分装5mL即可。
5. 硝酸盐还原
（1）配方：硝酸钾1.0ｇ，蛋白胨5.0ｇ，酵母膏3.0ｇ，蒸馏水1000ｍL，pH7.0-7.2
（2）配制过程：将硝酸钾、蛋白胨、酵母膏称好后，溶解于蒸馏水后，调节pH。
6. 半胱氨酸培养液：测定产H2S能力
（1）配方：蛋白胨10ｇ，硫酸钠0.1g，半胱氨
酸0.1g，蒸馏水1000ｍL。
（2）配制过程：将半胱氨酸、蛋白胨、硫酸钠称好后，溶解于水中，调节pH7.0-7.3即可。
7. 吲哚试验
（1）配方：蛋白胨20.0ｇ，磷酸氢二钠2.0g，葡萄糖10.0g，蒸馏水1000ｍL。
（2）配制过程：将蛋白胨等称好后，溶解于蒸馏水，调节pH7.0-7.2即可。
8. 明胶液化
（1）配方：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0ｇ，明胶10-12%，蒸馏水1000ｍL。
（2）配制过程：将牛肉浸膏、蛋白胨溶解于蒸馏水中，调节pH7.0-7.2后，将明胶溶解于此溶液中，即可分装于试管中。
9. 淀粉水解试验
（1）配方：牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨17.5ｇ，淀粉1.5 g，琼脂15-20 g，蒸馏水1000 ｍL。
（2）配制过程：将牛肉浸膏、蛋白胨、淀粉称好后，溶解于蒸馏水中，加入称好的琼脂，待融化后调节pH7.0-7.2。
10. 石蕊牛乳反应
（1）配方：脱脂牛乳1000 ｍL ，石蕊液（4%）15-20 mL。
（2）配制过程：提前配制石蕊液植物病原细菌的分类和鉴定技术
一、传统分类法
细菌分类的常用性状包括：细菌的形态、革兰氏染色反应、细胞壁的结构和组成、内生孢子的有无、鞭毛的有无和着生方式、细菌细胞的内含物、色素的产生、营养要求等。细菌学性状目前仍然是许多实验室在细菌鉴定方案中对种、属甚至科等阶元进行特征描述的基本内容。
二、数值分类
把试验中得到的生物之间性状的相似和差异程度用数值表示，同时用数值表示生物之间分类上的距离。
前提：1）假设实验所用的每一特征都具同等分量；
2）应尽可能多地使用不同特征，以使在表型特征方面对所取样的生物具有代表性。
优缺点
Ⅰ最大优点：比较了大量菌株的大量性状，结论比较可靠。Ⅱ最大缺点：不分轻重地把所有性状等量齐观。
1. 关于菌株选择：可一次研究成百上千个菌株，一般不少于50个，每一个菌株称作操作分类单位OTU。一般，选择的菌株应包括不同时期和不同条件下所分离的并在致病性上有所不同的菌株，但所用菌株必须是经过鉴定和定名。在菌株准备中最关键的是要保证菌株的准确和纯化。
2. 关于试验的选择：
包括常规和特殊的试验项目，项目一般100－200个是适当的，40个以下是不宜的。重复性差、误差大于10－15％、没有鉴别价值的试验尽量不用。
3. 研究步骤
1）数据分析系统的选择：可两种方法计算相似程度。两细菌菌株相似系数与配对系数的计算：相似系数Sj：只包括正反应性状而不包括负反应性状配对系数Ss：两者都包括Sj＝a/（a+b+c）；Ss＝（a+d）/（a+b+c+d）a：两菌株均为正反应的性状数；b：菌株1为正反应，菌株2为负反应的性状数；c：菌株1为负反应，菌株2为正反应的性状数；d：两菌株均为负反应的性状数
2）数据整理与分析对研究的所有菌株都按两两配对方法计算出它们之间的相似（或配对）系数，然后将每个相似（或配对）系数绘制成相似度矩阵草图，再把相似度高的菌株列在一起整理出相似度矩阵正图，最后通过聚类分析将数据转成树状图。一般认为，植病细菌可在80％相似度上建立种，65％的相似水平上建立属。数值分数没有系统分类学的进化含义，但为类的区分提供较为客观与稳定基础。
数值分类鉴定法
Ⅰ定义（任欣正，1994）是指借助数值方法，根据分类单元的性状状态将它们归类成同型种，并从基本数据得出种系发育的推论。
Ⅱ鉴定系统（Biolog, Vitek-AMS, Microscan, Enterotube, MIDI, Sensititte, Autosceptor, Crystal等）Biolog鉴定系统
Ⅲ植物和环境细菌上应用多
Ⅳ原理：根据细菌对95种碳源的利用情况，以四唑紫为指示剂，将其代谢指纹经计算机处理后与数据库已知的细菌比较，从而得到鉴定结果
Ⅴ缺点：标准菌株信息有限，容易误诊
V itek-AMS鉴定系统
医学上应用较多，可鉴定18000多种细菌。其系列主要有V itek30, V itek60,
V itek120及半自动鉴定仪ATB expressiion全自动鉴定过程：从接种、培养、读数到报告的全过程自动完成，利用负压将菌液加入测试卡各孔，机封口，置孵箱孵育，阅读器以665 nm波长每小时将测试卡拉出1次对各孔底物进行光扫描，动态观察变化，计算机将判读结果与标准数据库比较得出鉴定结果。
三、化学分类法
1.胞壁组分：
①肽聚糖：革兰氏阳性菌变化大，在属和种的分类中具有重要意义。
②胞壁酸：革兰氏阳性菌中与胞壁结合的胞壁酸只在一些种中发现
③特殊氨基酸的种类及其旋光异构体的存在可作为种、属分类的依据。
2.细胞脂肪酸：膜上极性双层脂带可作分类鉴定指标
3.异戊二烯醌：含有两种基团即萘醌和苯醌。目前萘醌类型主要用于棒形细菌的分类和鉴定，泛醌多见于革兰氏阴性细菌的鉴定。
4.多胺：重要性是因为它在细菌中普遍存在和在质和量方面的变化。多胺分型已经在假、黄单胞菌和变型细菌的分类中用于进行属和种水平的分类。
5.其他方法：热解质谱法、傅里叶变换红外广谱合法紫外共振曼光波法是用来检测细菌细胞的总化学组分即所谓全细胞指纹的理想方法。化学分类鉴定法
①脂肪酸甲基脂分析（FAMEs）②全细胞水解液糖型分析③磷酸类脂成分分析④枝菌酸分析⑤醌类分析⑥光合色素成分分析FAMEs分析分析步骤
①在适合的培养基上活化细菌②抽提脂肪酸③制备脂肪酸甲基脂④薄层层析（TLC）或气相色谱（GC）分析⑤结果经鉴定系统软件获得缺点
不同属（科）的细菌的FAMEs可能重叠，区分亲缘关系较远的细菌比较困难四、分子生物学和遗传学方法
四、分子生物学和遗传学方法
分类的依据是细菌基因组的结构特征并以此划分系统发育树上的分类界元和界定分类系统中的重要组群。?细菌染色体DNA G+C mol%含量测定
①核酸杂交②16s rRNA序列分析③ITS序列分析④PCR分析⑤限制性酶切片断长度多太性分析（RFLP）⑥核酸序列分析1. DNA碱基组成即G+C含量
细菌基因组的基本特征：
①环状双螺旋
②DNA,A=T,C=G.：高等动、植物G+C含量范围窄，原核生物的变化范围虽很宽（25－75％），但对一个种是相对稳定的。研究发现DNA 的碱基组成即G+Cmol％对细菌分类是一个非常有用的特征。G+C mol%：是指细菌DNA水解产物中鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）在总核酸碱中所占的摩尔百分比，简称为G-C。
GC含量作为分类参数的特点：①测定容易②方法简便且适用性广③重现性较遗传表型高④细菌的GC含量分布范围广
G+C mol%作为分类参数的依据：①每一种生物的DNA都有其特定的G+C mol%，生物种之间的亲缘关系越远，其G+C mol%含量差别就越大②细菌中G+C mol%含量比较稳定，不受菌龄的影响，不因外界条件的改变而改变
测定G+C含量的方法重要有两种：
1）热变性方法：随着DNA双螺旋加热后，两个单链分开，260nm紫外吸收值有所增加，即增色效应。热变性温度定义为增色50％时的温度。
2）浮力密度测定法：当将DNA分子在氯化铯或蔗糖的梯度溶液中离心时，不同G+C含量的DNA分子就会在梯度管中的不同位置上形成区带。在这个区带的位置上DNA分子的密度与该处氯化铯分子的密度相等，其区带中点的DNA密度即叫做它的浮力密度。浮力密度
＝1.660＋0.098（G+C）
3）液相色谱法：将4种碱基洗脱下，根据峰面积计算研究表明：1）同一种细菌不同菌株G+C含量大致相同，菌系之间的变化
一般不超过3％2）同一个属的种，G+C含量的跨度一般不超过10％3）G+C含量在分类上只具有否定权，不具有绝对的肯定权（碱基比例相同不一定序列相同）有人主张将G+C含量的测定与少数几个关键生化试验相结合，则可以很快鉴定一些细菌。
2. DNA同源性：多用于亲缘关系较近细菌间比较
变性：双链DNA在一定条件下，互补的双链分开。
复性：适当条件下分开的双链重新配对组成双链
DNA杂交：不同细菌的DNA分子变性后令其复性。或异源DNA单股螺旋重新结合成双股的过程。
同源性：DNA-DNA或DNA-RNA中的相同序列
1）复性速率法：目前最常用。操作简单，重复性好。
原理：当变性的DNA（超声波处理）在溶液中复性（杂交）时同源DNA的复性速率比异源的要快，而且同源性越高复性速率越快。用分光光度计在260nm测定。
2）羟基磷灰石法：将标记和未标记的DNA在毛细管中进行杂交，如互补则所有标记的DNA单链都与未标记的杂交。通过羟基磷灰石分析柱双链被吸附，洗下后测定放射性强度，根据公式算出杂交百分率和同源性。不同水平的DNA同源性，代表不同水平的分类单元：同源性在60％以上……同一种在60－70％和70％以上……同种内不同亚种在20－60％……同属中不同种小于20％……不同属相似性越高，种群间差异越小。
3. DNA-RNA重配试验，常用DNA-rRNA杂交DNA-rRNA可以测定出属以上细菌的细微相似性因为DNA复制RNA是分段进行的，所以rRNA编码只占细菌DNA的一小部分，同时rRNA比染色体DNA整体有着高的多的保守碱基序列。
4. rRNA同源性：作为研究细菌系统发育的理想材料已为细菌学家普遍接受。主要原因有：rRNA存在所有的细菌中；功能稳定；组成保守；结构富于变化
5. DNA限制性片断长度多态性（RFLP）分析
6. 蛋白质分析法：
核酸杂交定义：核酸杂交技术根据碱基互补配对原理，将两条不同来源的单链核酸进行复性以鉴定菌株间的亲缘关系，包括DNA-DNA
（Southern杂交）、DNA-RNA、RNA-RNA（Northern杂交）等。
DNA-DNA杂交适用于种水平研究，DNA-RNA杂交用于属及属以上水平的分类。mRNA寿命短，难提取，其反应的同源性与DNA-DNA 杂交类似，很少应用。rRNA数量多，稳定，易提取，多用于RNA同源性研究。核酸杂交同源性小于20％为不同菌属；20％～60％为属内紧密相关的种；60％～70％为同种内不同亚种；大于70％为同一亚种。
核酸杂交分为液相杂交和固相杂交
液相杂交在溶液中进行，时间短，需要的探针分子的量较少固相杂交目标核苷酸序列或探针分子被固定在硝酸纤维素膜或尼龙膜上，优点是可以分析各种不同纯度的核酸，可同一时间处理和定量多个样品，应用广。
固相杂交法是将待测菌株双链核酸解成单链固定在硝酸纤维素滤膜等固相支持物上，置入含有经同位素或非同位素标记物（生物素、荧光素、地高辛等）标记、酶切并解链的参照菌株的单链核酸（探针）液中复性，形成新的双链核酸。对于同位素标记探针的，测定杂合双链的相对放射性强度来确定菌株间的同源性程度对于非同位素标记探针的，杂交后通过酶催化底物显色反应或用荧光显微镜和荧光仪检测杂交结果一、核酸探针标记的方法
一、核酸探针标记的方法
A. 根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针；
B. 根据是否使用放射性标记物的与否，可分为放射性标记探针和非放射性标记探针；
C. 根据是否存在互补链，可分为单链和双链探针；
D. 根据放射性标记物掺入情况，可分为均匀标记和末端标记探针。1 1、双链、双链DNA DNA探针探针分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，双链DNA探针的合成方法主要有下列两种：切口平移法和随机引物合成法。
A.切口平移法（nick translation nick translation）当双链DNA分子的一条链上产生切口时，E.coliDNA聚合酶I就可将核苷酸连接到切口的3’羟基末端，同时该酶具有从5’至3’的核酸外切酶活性，能从切口的3’端补上核苷酸从而使切口沿着DNA链移动，用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。
注意：
a. 3H，32P及35P标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用[α-32P]dNTP。
b. DNA酶I的活性不同，所得到的探针比活性也不同。DNA酶I活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。
B.随机引物合成法随机引物合成法随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探针。合成产物的大小，产量，比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，产物平均长度为400~600个核苷酸。
利用随机引物进行反应的优点是：
a. Klenow片段没有5’至3’外切酶活性，反应稳定，可以获得大量有效探针。
b. 反应时对模板的要求不严格，用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。
c.反应产物的比活性较高，可达4×109cpm/ug探针。
d.随机引物反应还可以在低溶点琼脂糖中直接进行。
2、其它标记方法
A. 末端标记DNA探针：可利用Klenow片段及T4DNA聚合酶进行3’末端标记。可利用T4酶多核苷酸激酶进行5’末端标记
B. 单链DNA探针：采用单链探针则可解决这一问题
单链DNA探针的合成方法主要有下列两种：①以M13载体衍生序列为模板，用Klenow片段合成单链探针；②以RNA为模板，用反转录酶合成单链cDNA探针。
二、分子杂交
分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用标记的探针和被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。
根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：
（1）Southern杂交：DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。
（2）Northern杂交：RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后用探针杂交，被检对象为RNA，探针为DNA或RNA。根据杂交所用的方法，另外还有斑点（dot）杂交和菌落原位杂交等。
Southern杂交：
1.概述：
Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，它包括下列步骤：
A. 酶切DNA，凝胶电泳分离各酶切片段，然后使DNA原位变性。
B. 将DNA片段转移到固体支持物（硝酸纤维素滤膜或尼龙膜）上。
C. 预杂交滤膜，掩盖滤膜上非特异性位点。
D. 让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针。
E. 通过自显影或其它显色反应检查目的DNA所在的位置。
1 1、Southern杂交概述
Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多因素，包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA 量以及探针与目的DNA间的配对情况等。常见的固体支持物有硝酸纤维素滤膜或尼龙膜二种，用硝酸纤维素滤膜所得的结果背景较低但易破裂。尼龙膜较耐用，但所得的结果背景较高。
1 1、Southern杂交概述
将DNA从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有3种：
A. 毛细管转移：本方法由Southern发明，故又称为Southern转移（或印迹）。毛细管转移方法的优点是简单，不需要其他仪器。缺点是转移时间较长，转移后杂交信号较弱。
B. 电泳转移：该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用，可直接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大，温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时，才采用电泳转移。
C. 真空转移：有多种真空转移的商品化仪器。该法的优点是快速，在30分钟内就能从正常厚度（4-5mm）和正常琼脂糖浓度（<1%）的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂，并且在洗膜不严格时，其背景比毛细管转移要高。
毛细管转移装置示意图
杂交反应条件及参数优化不同的反应条件对杂交结果的影响如下：
A. 根据杂交液的体积确定杂交的时间：一般来说使用较小体积的杂交液比较好，因为在小体积溶液中，核酸重新配对的速度快、探针用量少，从而使滤膜上的DNA在反应中起主要作用。
B. 根据所用的杂交溶液确定杂交的温度：一般来说，杂交相为水溶液时，则在68℃杂交，而在50％甲酰胺溶液中时，则在42℃下杂交。
C. 选用不同的封闭试剂：如Denhardt’s试剂、肝素或一种由5％脱脂奶粉组成的BLOTTO，与Denhardt’s试剂相比，BLOTTO价格便宜，使用方便，同样可获得满意的结果，但它不能用于RNA杂交。一般而言，尼龙膜Denhardt’s试剂比用BLOTTO能得到更高的信噪比。杂交反应条件及参数优化杂交反应条件及参数优化
D. 在杂交过程中加入其他化合物，如反应体系中加入10%硫酸葡聚糖或10％PEG，杂交速度可增加约10倍。
E. 根据探针与被检测目标之间的同源程度选择清洗的程度，如具有很高的同源性可选用严紧型洗脱方式(低浓度SSC)，反之则选用非严紧型洗脱方式(高浓度SSC)。洗脱通常在低于杂交体解链温度12-20℃的条件下进行.
F. 在水溶液中杂交时，用6XSSC或6XSSPE溶液的效果都一样。但在甲酰胺溶液中杂交时，应该用具有更强缓冲能力的6XSSPE。16s 16s rRNA rRNA序列分析序列分析细菌核糖体中含有23s、16s和5s 三种类型的rRNA，其中16s rRNA基因序列作为生物系统发育指标较适合依据：16s rRNA为细胞所共有，分子大小适合操作，功能同源且最古老，既含保守序列又含可变序列5s rRNA含核苷酸少，携带的遗传信息不足以用于分类研究23s rRNA含有的核苷酸量大，分析较困难基本原理
?提取细菌样品中的总DNA
?用16s rRNA通用引物PCR扩增得到16s rRNA序列
?PCR产物克隆到质粒载体上，测序
?序列分析（BLAST）
一般认为两个细菌的16s rRNA同源性大于99％，且染色体DNA杂交值大于70％，在基因水平上则认为是同一种细菌多个细菌的16s rRNA 基因序列经多序列联配、比对后可以建立起一个系统进化树，用于表达各细菌之间亲缘关系的远近。
ITS序列分析
定义
ITS区域又称转录间隔区，位于原核生物23s rDNA、16s rDNA和5s rDNA之间，包括一些tRNA基因和非编码区域。
目前研究较多的ITS区域是16s-23s rDNA区间（IntergenicSpacer Region, ISR），其序列特性包括：不同种间的16s-23s rDNA ISR拷贝数是不同的，不同种或同一个种的不同型之间的16s-23s rDNA ISR长度不同。16s-23s rDNA ISR在拷贝数目、长度及序列上的差异，为它在
细菌分类和鉴定中的作用提供了基础。16s-23s rDNA ISR鉴定技术存在的缺陷
… 16s-23s rDNA ISR的核酸数据库数据相对较少，
不利于数据分析
…它的不同拷贝之间大小比较相近，不易区分开
…不能对所有的菌株进行鉴别（如大肠杆菌的不同血清型）
PCR分析
定义
PCR（聚合酶链反应）是一种由特定寡核苷酸（引物）介导的特异基因或克隆序列的体外酶促扩增技术。
常用于细菌鉴定的方法
?重复序列间-PCR（rep-PCR）
?PCR-ELISA
?随机扩增DNA多态性（RAPD）
?扩增片断长度多态性（AFLP）
?荧光探针实时定量-PCR（fluorescent real-time quantitative –PCR, FQ-PCR）
1、PCR技术的基本原理
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与目标序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链（以便它与引物结合，为下轮反应作准备）；
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
2 The procedure of PCR
5’
5’
3’
3’
d.
NTPs
Taq
Primers
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
component
denaturation
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
(94℃)extension
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
3’
5’ 3’
Taq
Taq
5’
5’
anneal
(72℃)
(50℃)5’3’
5’ 3’
5’
3’ 5’
3’
5’
5’ 3’
3’
5’ 3’
5’ 3’
2 cycles
4 copies
3 cycles
8 copies
5’
3’ 5’
3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’
3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’
3’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’3’10×反应缓冲液（含Mg2＋）5.0 μldNTP混合物，10 mmol/L 1.0 μl
上游引物，20 μmol/L 1.0 μl
下游引物，20 μmol/L 1.0 μl
模板DNA 1.0 μl
Taq plus DNA聚合酶，5 U/μl 0.5 μl
加双蒸水至终体积为50 μl
3 反应体系
取一0.5 ml PCR薄壁管，依次加入以下试剂：M 1 2 3 4 3kb
2kb
2.7kb
0.8% agrose gel electrophoresis of full length PCR product
from Y160
M: DNA marker; 1: Y160; 2:positive control; 3 4: CK-4
PCR反应操作注意事项：
植物细菌性病害和病原细菌分类研究进展
植物细菌性病害和病原细菌分类研究进展 彭炜 （四川省农业管理干部学院，中国成都610072） 摘要迄今为止已经描述的植物病原细菌约有30个属和650个种，其中我国记录的细菌约150种以上。本文主要讨论植物病原细菌分类的历史演变与发展，简要描述生产上造成显著危害的黄单胞菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、土壤杆菌属、棒形杆菌属及支原体等6类主要细菌及其所致病害，并对已经发现并证实的植物细菌性病害种类作出粗略的统计，这些数据对于研究植物病原细菌的系统分类学和植物病害信息数据库查询系统具有重要的参考价值。 关键词：植物细菌性病害；细菌分类；种类/属；真细菌；植原体 Advances in classification of plant bacterial diseases and the pathogenic bacteria Peng Wei Sichuan College of Agricultural Administration and Sciences, Chengdu, China Abstract. About 650 species of plant pathogenic bacteria in 30 genera have been reported around the world amongst which 150–200 species have been recorded in China. In the present paper we review the historic development in plant bacterium classifiction and bacterial disease studies. The 5 most important plant pathogenic bacteria are described and they include Xanthomonas, Pseudomonas, Ewinia, Agrobacteria, Clavibacter and Mycoplasma. These data are important and can be useful in studies on systematics of plant bacteria and on construction of plant bacterial disease information platforms. Keywords. plant pathogenic bacteria; systematics; species and genera; eubacteria; phytoplasmae ———————————————————— 作者简介：彭炜(1955-)，四川省资中县人，研究员，主要从事植物保护专业教学、科研及行政管理等工作。
各类细菌性感染的治疗原则及病原治疗
第四部分各类细菌性感染的治疗原则及病原治疗 急性细菌性上呼吸道感染 急性上呼吸道感染是最常见的社区获得性感染，大多由鼻病毒、冠状病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒等病毒所致，病程有自限性，不需使用抗菌药物，予以对症治疗即可痊愈。但少数患者可为细菌性感染或在病毒感染基础上继发细菌性感染，此时可予以抗菌治疗。 医院获得性肺炎 常见的病原菌为肠杆菌科细菌、金葡菌，亦可为肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、厌氧菌等。重症患者及机械通气、昏迷、激素应用等危险因素患者的病原菌可为铜绿假单胞菌、不动杆菌属及甲氧西林耐药金葡菌等。 【治疗原则】 1.应重视病原检查，给予抗菌治疗前先采取痰标本进行涂片革兰染色检查及培养，体温高、全身症状严重者同时送血培养。有阳性结果时做药敏试验。 2.尽早开始经验治疗。首先采用针对常见病原菌的抗菌药物。明确病原后，根据药敏试验结果调整用药。 3.疗程根据不同病原菌、病情严重程度、基础疾病等因素而定。宜采用注射剂，病情显著好转或稳定后并能口服时改用口服药。 【病原治疗】 见表4.5。 表4.5 医院获得性肺炎的病原治疗 病原宜选药物可选药物备注 金葡菌 甲氧西林敏感苯唑西林、氯唑西林第一代或第二代头孢菌素，林可霉 素，克林菌素有青霉素类过敏性休克史者不宜用头孢菌素 类 甲氧西林耐药万古霉素或去甲万古霉素磷霉素，利福平，复方磺胺甲噁唑 与万古霉素或去甲万古霉素联 合，不宜单用 肠杆菌科细菌第二代或第三代头孢菌素单用或联 合氨基糖苷类氟喹诺酮类，β内酰胺酶抑制剂复方，碳青霉烯类 铜绿假单胞菌哌拉西林，头孢他啶，头孢哌酮、 环丙沙星等氟喹诺酮类，联合氨基 糖苷类具有抗铜绿假单胞菌作用的β内酰 胺酶抑制剂复方或碳青霉烯类+ 氨基糖苷类 通常需联合用药 不动杆菌属氨苄西林／舒巴坦，头孢哌酮/舒巴 坦碳青霉烯类，氟喹诺酮类重症患者可联合氨基 糖苷类 真菌氟康唑，两性霉素B 氟胞嘧啶（联合用药）
病原微生物名词解释
1.微生物（microorranism ,microbe）：是存在于自然界的一群体形微小、结构简单、肉眼直接看不见，必须借助于光学显微镜 或电子显微镜放大数百倍、数千倍，甚至数万倍才能观察到的微小生物 2.肽聚糖（peptidoglycan）：是细菌细胞壁的主要成分，原核细胞所特有的物质，G+菌由聚糖骨架，四肽侧链和五肽交联桥三部 分组成，G-菌由肽聚糖骨架、四肽侧链两部分组成 3.脂多糖（LPS）：是G-菌的内毒素。LPS由三部分组成（由内到外），1）脂类A是内毒素的毒性部分和主要成分，与致病性有关 2）核心多糖3）特异多糖，G-菌的菌体抗原 4.细菌L型：细菌在体外受到各种直接或间接地理化或生物因素影响后，导致细胞壁肽聚糖直接被破坏或合成被抑制，进而形成一 种细胞壁缺失或缺陷的细菌，称为细菌L型 5.原生质体：革兰阳性菌由于其细胞壁主要由肽聚糖构成，细菌变成细菌L型后，细胞壁完全缺失，细菌原生质仅被一层细胞膜包 裹，称为原生质体 6.原生质球：革兰阴性菌因其细胞壁肽聚糖含量较少，且有外膜保护，一般将源于革兰阴性菌的细菌L型称为原生质球 7.中介体（mesosome）：细菌细胞膜向胞浆内凹陷，并折叠成囊状物内含管状、板状或泡状结构，称作中介体，多见于G+菌，又 有拟线粒体之称 8.质粒（plamid）:是细菌染色体外的遗传物质，为双股闭合环状DNA分子，可独立于染色体外并且自行复制，可整合到染色体上。 经人工抽提后可变成开环状或线状 9.异染颗粒：细菌细胞浆中含有的颗粒，因其嗜碱性较强染色着色深，可染成与细菌其他部分不同的颜色，故称异染颗粒。可作为 鉴别细菌的根据，如白喉棒状杆菌 10.荚膜（capsule）:某些细菌在其细胞壁外层包裹着一层排列有序且不易被洗脱的粘液物质，厚度约200mm 11.粘液层（alim layer）:若细菌细胞表面粘液性结构松散，排列无序且易被清除者，称粘液层 12.鞭毛（flagellun）:在许多细菌在菌体上附有细长并呈波状弯曲的丝状物，称为鞭毛 13.菌毛（fimbria 或pllus）:许多革兰阴性细菌和少数革兰阳性细菌菌体表面存在着数量众多比鞭毛更细、更短而直硬类似毛发 样的丝状物，称为菌毛 14.芽孢（spore）:很多革兰阳性菌在一定条件下，胞浆脱水浓缩，在菌体内部形成具有多层膜包裹的圆形或卵圆形的小体，称为芽 孢，是细菌代谢处于相对静止状态、维持生存，具有特殊抗性的休眠结构 15.繁殖体（vegetative form）：与芽孢相比，未形成芽孢而具有繁殖能力的菌体称为繁殖体 16.IMViC试验：吲哚（I）、甲基红（M）、VP(Vi)和枸橼酸盐（C），利用这四种试验常用于鉴定肠道杆菌，合称IMViC试验 17.遗传（heredity）：子代与亲代的生物学性状基本相同，且代代相传 18.变异（variation）:子代与亲代以及子代与子代之间的生物学性状出现差异 19.BCG卡-介：Calmette和Guerin于1908年将有毒的牛结核分枝杆菌在含胆汁、甘油、马铃薯的培养基上，经过13年传230代， 终于获得了一株毒力减弱但仍保持免疫原性的变异株，即卡介苗BCG，用于结核病的预防 20.多重耐药性（mutiple resistance）：有的细菌表现为同时对多种抗菌药物产生耐受性即多重耐药性 21.S-R变异株：菌落由光滑型（S型）变为粗糙型（R型），称为S-R变异。变异是因为失去细胞壁脂多糖的特异性多糖而引起的。 变异时不仅菌落特征发生变化，且细菌多种性状也发生了变化，如毒力 22.致病岛（pathogenicity island）:众多致病染色体上还存在一段分子量很大，载有多个毒力基因并可移动的DNA片段，称致病 岛 23.噬菌体（phage）:是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒 24.毒性噬菌体（virulent phage）：能再宿主菌细胞内复制繁殖，产生许多子代噬菌体，并最终使细菌裂解的噬菌体，称为毒性噬 菌体 25.培养基：由人工方法配制而成的专供微生物生长繁殖使用的混合营养物质制品 26.菌落：在固体培养基中，单个细菌生长繁殖所形成的细菌集团 27.溶原状态：染色体上带有前噬菌体的细菌称为溶原细菌，而细菌的这种状态叫做溶原状态 28.溶菌性周期：毒性噬菌体在敏感宿主细胞内以复制方式进行增殖，其增殖过程包括：吸附、穿入、生物合成、成熟与释放4个阶 段。从吸附至细菌溶解称为噬菌体复制周期或溶原性周期 29.噬斑：噬菌现象在液体培养基中，可使浑浊菌变为澄清，在固体培养基上，若用适量的噬菌体和宿主混合后接种培养，培养基表 面可出现无细菌生长区，即噬斑 30.溶原性周期：有些噬菌体感染细菌后不增殖，不裂解细菌，其核酸整合到细菌染色体上，并与之一起复制传代 31.温和噬菌体（temperate phage）：有些噬菌体感染细菌后不增殖，不裂解细菌，其核酸整合到细菌染色体上，并能与染色体一 起复制传代。这类噬菌体称为温和噬菌体又称溶原性噬菌体 32.前噬菌体（prophage）:整合在细菌染色体上的噬菌体基因称为前噬菌体 33.溶原型细菌（lysogenic bacterium）：染色体上带有前噬菌体的细菌称为溶原性细菌 34.转位因子（Transposon）：转位因子是存在于细菌染色体或质粒DNA分子上的一段特异性核苷酸序列片段，它能在DNA分子中移 动，不断改变它们在基因组中的位置，能从一个基因组转移到另一个基因组中 35.突变：是由于遗传物质的结构突然改变而引起的细菌性状的遗传性变异 36.回复突变：细菌由野生型变为突变型是正向突变。突变型经过又一次突变又可恢复野生型的表型，这一过程叫做回复突变 37.基因转移：外源性遗传物质由供体菌转移至受体菌的过程为基因转移 38.基因重组：转移的外源性DNA整合于受体菌DNA中称基因重组，使受体菌获得某些供体菌的特性 39.转化（transformation）：转化是受体菌直接摄取供体菌游离片段并整合到自己基因组中，从而获得新的性状 40.转导（transduction）：以温和噬菌体为载体，将供体菌的一段DNA转移到受体菌内，使受体菌获得新的性状 41.完全转导：供体菌DNA片段进入受体菌后，只有少数能与受体菌染色体重组并同染色体一起复制，称为完全转导 42.流产转导：供体菌DNA片段进入受体菌后，绝大多数游离于受体菌胞浆内，不能复制，被称为流产转导 43.溶原性转换（lysogenic conversion）：溶源性细菌因染色体上整合有前噬菌体，从而获得新的遗传性状，称为溶原性转换 44.接合（conjugation）：细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质（主要是质粒DNA）从供体菌转移给受体菌，使受体菌获得 新的遗传性状
植物病原细菌学复习题2016
植物病原细菌学思考题: 1.名词解释：质粒；消毒；灭菌；无菌；无菌操作；转化；转导；接合；转换；突变； 质粒；病原(pathogen)、细菌(bacteria)、类立克次体(rickettsia like organism)、植原体(phytolasma)、感病植物(suscept)、感病性(susceptibility)、病原性(pathogenicity)、毒力(virulence)、病症(symptom)、接种(inoculation)、传播(dissemination)、植物检疫( plant quarantine )、综合防治(integrated control)；植物病原细菌的致病变种、植物病原细菌的生理小种、柯赫氏法则、过敏性反应 2.细菌的基本结构有哪些?各有什么功能? 与真核细胞结构有何差异？ 3. 细菌的特殊结构有哪些?各有什么功能? 4. 革兰阳性菌和革兰阴性菌胞壁结构有何不同? 5. 革兰氏染色的理论依据是什么？ 6. 细菌的化学组成有那几类？ 7. 细菌正常生长繁殖需要哪些条件？ 8. 描述细菌的生长曲线。 9．用的热力灭菌方法有哪些？其适用范围如何？ 10．压蒸汽灭菌法和巴氏灭菌法的条件是什么? 11．紫外线杀菌的机理是什么？ 12．过滤除菌法常用于哪些材料的除菌？ 13．细菌变异的表现形式有哪些？举例说明。 14．简述细菌可通过何种方式获得新的性状?（遗传物质交换机制） 15．植物病原性细菌及细菌病害的特性为何? 16．試述细菌对植物寄主侵入的方法 17．请说明f.sp.(forma speciales)、pv.(pathovar)、physiological race所代表的意义。18．試述植物病原生理小种( physiological race )之成因。 19．重要病害及其防治法:水稻白叶枯病、番茄青枯病的病因、病症、传播方式及其防治法20．植物病原细菌的命名原则。 21．传统细菌分类之外的分类方法（略详细）。 22．如何证明你发现的病害为细菌性病害？ 23．为害植物的病原细菌属、主要细菌属的区别（列表）、写出10种主要细菌病害拉丁学名。24．病原细菌鉴定的程序和内容。 25．请写出近些年变动前后的细菌学名。 26．植物病原细菌鉴定涉及的主要研究项目。 27．简单叙述科学技术发展对细菌分类的影响。 28．如何证明细菌的运动性。 29．细菌如何保存。 30．以西瓜细菌性果斑病为例说明细菌病害的侵染循环。 31．请叙述不同细菌病害的病原分离技术。 32．植物病原细菌细胞的结构。 33．植物细菌性病害的主要症状。 34．请你写出研究一种细菌病害的研究方案。 35．试论植物细菌病害的综合防治（以一种细菌性病害为例）。 36．种子带菌病害的综合防治。 37．请以一种细菌病害为例介绍其分子生物学研究进展。
常见病原菌习题集
第五章常见病原菌 一、填空题 1.根据色素、生化反应的不同可将葡萄球菌分为____葡萄球菌、____葡萄球菌和____葡萄 ___ 球菌。 2.链球感染后引起的超敏性反应疾病有_________和_________。 3.脑膜炎奈瑟菌呈____形，通过______传播，引起的疾病是________。 4.人患肠热病后可获得______免疫力，其免疫以______为主。 5.霍乱弧菌有单根_____，可作穿梭氧运动，生长最适宜的PH_______。 6.常见致病的厌氧芽孢梭菌有_____、_______和______。 7.对受伤机会较多的人群可定期接种破伤风_______，对伤口较深或有泥土污染者应肌注破伤风_______进行紧急预防。 8.在牛奶培养基中有汹涌发酵现象的细菌是________。 9.结核分枝杆菌革兰染色不易染色，常用______染色，呈___色。 10.检测机体对结核是否具有免疫力，常用的体内皮肤试验是__________。 11.麻风分枝杆菌的传播方式是______，引起________。 12.铜绿假单胞菌为革兰染色____性菌，培养时能产生水溶性______色素。 13.异染颗粒是_______菌鉴别的主要特征。 14.鼠疫主要经______传播。
15.百日咳鲍特菌的传播途径是________。 二、选择题 1..判断葡萄球菌有无致病性的标志之一是（） A.透明质酸酶 B.链激酶 C.链道酶 D.血浆凝固酶 E.卵磷脂酶 2.乙型溶血性链球菌感染后，病灶扩散趋势明显主要是因为（） A.溶血毒素和杀白细胞素 B.透明质酸酶、链激酶和链道酶 C.红疹毒素和链激酶 D.链激酶、溶血毒素和链道酶 E.血浆凝固酶 3.下列哪种疾病是一种菌群失调症( ) A.假膜性肠炎 B.风湿热 C.急性肾小球肾炎 D.脓疱疹 E.流脑 4.对青霉素易产生耐药性的细菌是(） A.链球菌 B.金黄色葡萄球菌 C.肺炎链球菌 D.脑膜炎奈瑟菌 E.淋病奈瑟菌 5.下列哪种糖发酵试验可鉴别肠道致病菌和非肠道致病菌（） A.葡萄糖 B.乳糖 C.甘露醇 D. 蔗糖 E. 麦芽糖 6.一般不致病且能合成维生素B.K的细菌是（ ) Ａ.变形杆菌Ｂ.大肠埃希菌Ｃ.伤寒沙门菌Ｄ.痢疾杆菌 Ｅ.猪霍乱沙门菌 ７．霍乱病人大便的特征是（）
植物病原考试题
普通测试题（一） 一、名词解释（15分） 病害循环病原物的寄生性病害的三角关系侵染过程侵 染性病害 二、问答题（45分） 1．何谓单循环病害和多循环病害？二者在防治策略上有何不同？（7分） 2．柯赫法则包含哪些内容？如何用它诊断新病害？（8分）3．什么是局部侵染和系统侵染？（10分） 4．何谓病害循环？为什么说它是制订防治措施的重要依据？（10分） 5．真菌的营养体有哪些类型？（10分） 三、是非题（10分） 1．病部形成霉状物是真菌病害特有 的。（） 2．吸器是真菌菌丝产生的一种短小分枝，在功能上特化为专门 从寄主细胞内吸取养分的菌丝变态结 构。 （） 3．分生孢子器为一种无性子实 体。（） 4．喷菌现象为细菌病害所特有的特点。
5．细菌病害主要通过自然孔口、伤口和直接侵入等方式侵入植物体内。（） 6．疮痂和穿孔是细菌病害常见的病征。 7．SBMV为南方菜豆花叶病毒，自然状态下由蚜虫传 播。（） 8．蚜虫传播的病毒大多数是属于非持久性 的。（） 9．真菌的菌组织有薄壁组织和疏丝组织两 种。（） 10．以小麦条锈病为材料进行抗性调查时，判断抗感反应型的标准主要看有无过敏性坏死反应。 四、填空题（共20分） 1．病原物的侵染过程通常分 为、、和。 2．植物病原真菌分为亚门亚门、亚 门亚门亚门。 3．按照寄主抗病的机制不同，可将抗病性分 为和。按照抗病因素的性质，抗病性可分为和。 4.植物病害根据病原的性质分 为和。
5.植物流行性病害根据流行所需时间分 为、。 6.植物病害的症状分为病状和病征两类，其中病状主要有，病征主要 7.植物病毒的非介体传播方式 有。 8.病原物越冬越夏的场所主要 有。 9.真菌的无性孢子类型 有。 五、选择题（10分） 1．植物病毒的核酸类型主要为（）。 a. +ssRNA b. –ssRNA c. dsRNA d. dsDNA 2．由（）传播的病毒最可能是非持久性的。 a. 叶蝉 b. 蚜虫 c. 粉蚧 d. 飞虱 3．植物病原物的致病因素主要是（）。 a. 酶 b. 毒素 c. 病原物的代谢物 d. 生长调节物质4．植物受病原物侵染后其呼吸和光合表现一般为（）。 a. 呼吸减弱，光合增强 b.呼吸增强，光合减弱 c. 二者均增强 d. 二者均减弱 5．多循环病害的季节流行曲线形式为（）。 a. 抛物线 b. 双曲线 c. 直线 d. S型曲线
几种常用植物病原细菌分子检测方法
专论与综述 R evie ws 收稿日期: 20060220 修订日期: 20060418 基金项目: 国家自然科学基金项目(39970481);国家“863”计划项目(2001AA249021)3通讯作者E 2mail :jhguo @https://www.wendangku.net/doc/aa16420956.html, 几种常用植物病原细菌分子检测方法 尹燕妮, 黄艳霞, 葛芸英, 郭坚华3 (南京农业大学农业部病虫监测与治理重点开放实验室,南京 210095) 摘要 植物病原细菌(phytobacteria )是植物上一类重要的病原菌,这些细菌能引起多种农作物、经济作物、花卉、树木及牧草上的病害。它的快速检测是病害防治、预测预报及植物检疫必不可少的重要工作。其中,以PCR 为基础的分子检测技术的进步使植物病原细菌的检测更快速、灵敏和可靠。本文对近年来植物病原细菌分子检测技术进行介绍,尤其是应用广泛的ITS 2PCR (intergenic transcribed space 2PCR )、ARDRA (amplified ribosomal DNA restric 2 tion analysis 2PCR )、rep 2PCR (repetitive DNA 2PCR )和实时荧光定量PCR (real 2time quantitative PCR )技术,旨在促 进我国植物病原细菌研究的快速发展。关键词 植物病原细菌; 分子检测; PCR 中图分类号 S 432.42 Molecular diagnostic techniques for several commonly used phytobacteria Y in Yanni , Huang Yanxia , Ge Yunying , Guo Jianhua (Key L aboratory of Monitoring and M anagement of Plant Diseases and Pests ,M inist ry of A g riculture ,N anj ing A g ricultural Universit y ,N anj ing 210095,Chi na ) Abstract Phytobacteria are widespread and economically important plant pathogens.These bacteria cause severe diseases on many important plants such as field crop s ,economically important crops ,flowers ,trees ,and pasture.Rapid detection of phytobacteria provides a better f ramework for addressing important plant disease problems related to diagnosis and prediction of diseases ,and ultimate management of disease risks.The technology 2driven advances in PCR 2based methods make the detection of bacterial pathogens more rapid ,sensitive and reliable.In this paper ,the molecular diagnostic techniques were introduced ,especially ITS 2PCR ,ARDRA ,rep 2PCR and real 2time quantitative PCR techniques.It was aimed to promote the research of phytobacteria in China.K ey w ords plant pathogenic bacteria ; molecular detection ; PCR 传统病原细菌检测方法主要是依据症状、形态、生理生化反应和血清学等方法。这些方法耗时费力,且稳定性不高,不能直接从植物组织中检测出病原细菌。20世纪80年代基于细菌染色体分子检测方法的出现,尤其是PCR 方法的诞生及计算机辅助分析,使细菌的快速检测成为可能。细菌的分子检测方法大致可以分为非依赖PCR 及依赖PCR 两大类。非依赖PCR 的方法有两种,一种是全基因组DNA 2DNA 同源性比较或复性动力学,该方法较粗 略,现在一般不采用;另一种是限制性片段长度多态性(rest riction f ragment lengt h polymorp hism ,RFL P )分析,该技术存在操作繁琐、放射污染等缺 点,且细菌基因组较真核生物小,酶切后多态性不丰富,所以该方法一般不单独使用。PCR 是一种体外扩增核酸序列从而得到多个核酸拷贝的技术,以下主要介绍依赖PCR 的几种常用的检测方法。 1 ITS 2PCR ITS 2PCR 分析是利用保守的16S rDNA 和23S rDNA 序列,设计引物扩增转录间隔区(ITS )。16S rDNA 和23S rDNA 间的ITS 区域包括一些t RNA 基因和非编码区域。由于面临较小选择压力,ITS 区域比16S rDNA 和23S rDNA 的多态性丰富。使用通用引物扩增ITS 区域后,通过产生带的长度可
常见的病原性细菌
常见的病原性细菌 1、球菌 根据革兰氏染色性的不同，分成革兰氏阳性球菌（葡萄球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌）和革兰氏阴性球菌（脑膜炎球菌、淋球菌、卡他球菌、干燥奈氏球菌）两类。 对人类有致病性的球菌称为病原性球菌，由于这类球菌主要引起化脓性炎症，故又称为化脓性球菌。主要包括葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌及淋球菌。 葡萄球菌 是一群革兰氏阳性球菌，葡萄球菌在皮肤表面上可生存较久，常隐藏在毛囊、汗腺及皮脂腺内。在进行注射、外科手术时，如不严格消毒，易引起化脓性感染。 所致疾病： 局部感染：主要引起毛囊炎，痈，蜂窝组织炎，伤口化脓等，还可引起气管炎、肺炎、脓胸及中耳炎 全身感染：引起脑膜炎、心包炎、心内膜炎、败血症及脓毒血症等。主要由金葡菌引起。 食物中毒：食入含肠毒素的食物后，经2-6小时可发生急性肠胃炎 葡萄球菌性肠炎：正常人肠道中有少量金葡菌存在，当优势菌（大肠杆菌、脆弱类杆菌）因抗菌药物的应用而被抑制或杀灭后，抗药的金葡菌趁机繁殖而产生肠毒素，引起以腹泻为主的临床症状，其本质是一种菌群失调性肠炎。特点为肠黏膜被一层炎性假膜所覆盖，该假膜由炎性渗出物、肠粘膜坏死块和细胞组成。 链球菌 是化脓性球菌中另一大类常见细菌，少数可引起人类化脓性炎症，猩红热，丹毒，新生儿败血症，脑膜炎，细菌性心内膜炎和链球菌变态反应性疾病。 所致疾病：可分为化脓性（淋巴管炎，淋巴结炎，蜂窝组织炎，痈，脓疱疮等局部皮肤和皮下组织感染；还有扁桃体炎，咽炎，咽峡炎，鼻窦炎，产褥热，中耳炎，乳突炎等其他系统的感染） 中毒性（猩红热），变态反应性疾病（风湿热和急性肾小球炎） 奈瑟氏菌 革兰氏阴性双球菌。包括脑膜炎球菌、淋球菌、干燥奈氏球菌等 2、肠道杆菌 多数不引起疾病，为条件致病菌。少数（沙门氏菌和志贺氏菌）为肠道致病菌。
第十二章 病原性细菌(一)
课时授课计划 审签编号 授课时间及单元 授课专业及班级 组织教学：考勤、填写教学日志1 基本课题：第十二章病原性细菌第一节球菌 教学目标：1．列出常用化脓性球菌名称。 2．叙述葡萄球菌、链球菌、脑膜炎奈瑟菌主要生物学特性、致病因素和所致疾病。（重点、致病因素为难点） 教学内容教学设计时间（分）复习旧课： 4 1．简述病原菌致病因素及毒力。 2．细菌的基本形态有哪些？ 第十二章病原性细菌 第一节球菌 一、葡萄球菌属30
展示挂图及板图演示葡萄 球菌的形态及致病性。 二、链球菌属30 配合挂图讲解链球菌的形 态和致病性。 三、肺炎链球菌简介。10 四、奈瑟菌属20 （一）脑膜炎奈瑟菌 展示挂图及板图演示其 形态及致病性。 （二）淋病奈瑟菌自学。 五、球菌的微生物学检简单介绍。 查及防治原则 小结：比较五种化脓性球菌的生物学特性、致病性、微生物学 4 检验及防治。
布置作业与预习 1 作业：同小结内容。 预习：第二节肠道杆菌及弧菌属 课后分析 第十二章病原性球菌 第一节球菌 种类：革兰阳性球菌—葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌。 革兰阴性球菌—脑膜炎球菌、淋球菌。 化脓性球菌：对人类有致病作用的病原性球菌，因能引起化脓性炎症，故又称化脓性球菌。 一、葡萄球菌属 （一）生物学性状 1.形态与染色：
形态：球形大小：直径0.4~1.2um 排列：不规则染色性：G+ 特殊结构：无 2.培养特性及生化反应 （1）营养要求不高。 （2）需氧或兼性厌氧。 （3）最适温度为37℃，最适pH为7.4左右。 （4）耐盐性强，能在含10%~15%的NaCl培养基上生长。 （5）生长特性： 普通琼脂平板-中等大小、光滑型菌落，有脂溶性色素（金黄色、白色、柠檬色）。 血液琼脂平板-有些可有透明溶血环。 3.抗原构造与分类 （1）抗原构造： 复杂，有30多种，主要有磷壁酸、A蛋白、荚膜多糖等。 葡萄球菌A蛋白（SPA）：是葡萄球菌的表面抗原，存在与细胞壁表面。
第十二章 病原性细菌(三)
课时授课计划 审签编号 组织教学：考勤、填写教学日志1 基本课题：第三节厌氧性细菌第四节分枝杆菌属第五节其他病原性细菌教学目标：1．说出破伤风杆菌、结核分枝杆菌的形态、致病因素、所致疾病、防治原则及有关的生物学特性。（重点、难点） 2．分析结核分枝杆菌致病性与免疫性关系。（难点） 3．阐述卡介苗与结核菌素的应用原理和实际意义。（重点） 4．了解其他细菌。 教学内容教学设计时间（分）复习旧课：总结上次实验中存在问题。 4 第三节厌氧性细菌 一、厌氧芽胞梭菌属30 重点介绍破伤风杆菌， 其余几种厌氧菌自学。 二、无芽胞厌氧菌自学。 第四节分枝杆菌属 一、结核分枝杆菌 （一）生物学特性应用挂图演示其形态30 （二）致病性与致病性。
（三）免疫性与超敏反应应用临床实例分析结核20 杆菌感染、免疫与致病性之 间的关系。 （四）微生物学检查及防 治原则由其生物学特性及致病性10 引出微生物检查与防治原则。 二、麻风分枝杆菌自学。 第五节其他病原性细菌自学。 小结：1．描绘破伤风杆菌及结核分枝杆菌的形态。 4 2．说出破伤风杆菌的致病特点及预防。 布置作业与预习 1 作业：说出结核杆菌感染、免疫、变态反应三者之间的关系。 预习：第十三章病毒第一节病毒概述一、病毒的基本性状课后分析
第三节厌氧性细菌 指在厌氧条件下才能生长的菌群。分为芽胞厌氧菌与无芽胞厌氧菌两大类。其中厌氧菌梭菌与医学关系最为密切。 一、厌氧芽胞梭菌 共同特点： 1．革兰氏阳性大杆菌。 2．能形成芽胞，芽胞多大于菌体宽度，使菌体膨胀呈梭形。 3．厌氧。 （一）破伤风梭菌 1.生物学性状 （1）形态与染色：形体细长，有周鞭毛，无荚膜，芽胞呈圆形，比菌体粗，位于菌体顶端，呈鼓槌状。革兰氏阳性。 （2）培养特性：专性厌氧菌，最适温度为37℃，pH为7.4。营养要求不高，菌落呈“棉籽状”。在肉渣培养基中培养稍久可消化部分肉渣，微变黑，有腐败臭为味。 （3）抗原构造与分类：有O抗原、H抗原、外毒素抗原。 （4）抵抗力：芽胞抵抗力强，土壤中可存活数十年。 2.致病性 （1）致病条件：伤口窄而深，混有泥土和异物，或坏死组织、凝集块