测定菌体浓度的简便方法
第36卷第4期 2006年12月
工业微生物
Industrial Microbiology
Vol.36No.4
Dec.2006
作者简介:朱艳静(1963～),女,高级工程师。
电话:021-********-3041,E -mail :zhyj @gsy https://www.wendangku.net/doc/a416674516.html,
测定菌体浓度的简便方法
朱艳静, 李 宇
(上海市工业微生物研究所,上海 200233)
摘 要 为了简便地测定测定J IS L 1902标准所规定的菌液浓度,以单位体积菌落数与吸光度(ABS 值)的相关性,制成标准曲线,利用标准曲线快速准确地判断菌液浓度。
关键词:菌液浓度; 吸光度(ABS 值); 标准曲线; J IS (日本工业标准) 控制菌液浓度是测试抗菌率的关键一步,菌液浓度过高或过低,将影响测试结果,因此务必使其落在标准所规定的范围内。以往一般采取两种方法来测定菌液浓度。一为活菌计数法,此法能准确地判断菌液浓度,但有明显的滞后性,无法在第一时间内2确定其实际浓度,待结果出来后,再开始检测,菌的活性将有所下降,给实验室操作带来诸多不便;二为比浊法,此法能快速地判断菌液浓度,但为粗略的估计值,受限于各人肉眼的观察,误差较大,准确性不高。 本文根据日本工业标准:纤维制品的抗菌性试验方法(Japanese Industrial Standard :Testing for an 2tibacterial activity and efficacy on textile products )J IS L 1902单位体积菌落数与吸光度(ABS 值)的相
关性,制成标准曲线,快速准确地测算菌液浓度,便于实验的操作与预判,具有较强的实用价值。
1 材料与方法
1.1 菌种
大肠杆菌(Escherichia coli A TCC8099)1.2 试剂与仪器
蛋白胨(中国医药集团上海化学试剂公司)批号:F20040903
牛肉膏(国药集团化学试剂有限公司)批号:F20041102
氯化钠(太仓化工二厂)批号:20040310 Cary100紫外———可见光分光光度计1.3 培养基
营养细菌培养基NB 。
蛋白胨5g ,牛肉膏粉3g ,蒸馏水1000mL ,p H 6.8±0.2。
营养琼脂培养基NA 。
蛋白胨5g ,牛肉膏粉3g ,琼脂粉15g ,蒸馏水1000mL ,p H 6.8±0.2。1.3.1 对数生长期菌液的制备
取在规定保存代数之内的供试菌种,在火焰旁,挑取一铂金环,在营养琼脂培养基上划线,于37℃±1℃培养24h 后,在平板上挑取饱满的单菌落,置于20mL 营养细菌培养基中,振荡(110r/min ,振幅3cm )培养24h 。
1.3.2 稳定期菌液的制备
取培养好的对数生长期菌液0.4mL ,于20mL 营养细菌培养基中,再振荡培养4h ,即为稳定期菌液。1.4 吸光度(ABS 值)的测定
取培养好的稳定期菌液,按不同的设定稀释倍数(5、10、20、40倍),依次进行稀释,(稀释液为1/20NB ),在660nm 标准波长下,测得一组不同菌液浓
度的吸光度。(用空白1/20NB 进行测试前调零)。1.5 活菌计数
在无菌室内火焰旁进行操作。分别依次测定四个不同稀释倍数的菌落数。每个稀释倍数依次制定几个浓度梯度,用灭菌吸管各吸取1mL 注入平皿。注入约15mL ,45～50℃的营养琼脂培养基,随即转动平皿,使样品与培养基充分混合均匀,待培养基凝固后,翻转平皿,置37℃±1℃培养箱内培养24h 后,进行菌落计数。用肉眼观察,点出菌落数,记下各平皿的菌落数后,求出同一稀释度各平皿生长的
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平均菌落数。1.6 标准曲线的制作
运用生物统计OR G 数据分析软件,以吸光度ABS 值为横坐标,稳定期的菌液浓度为纵坐标绘制
标准曲线。2 结果与讨论
2.1 菌液浓度为107～108cf u/mL 标准曲线的制
作
(见表1;图1、2)。
表1 菌液浓度107～108cfu/mL 的ABS 值
第一次实验结果第二次实验结果菌液浓度
(cfu/mL )吸光度
(ABS 值)菌液浓度
(cfu/mL )吸光度
(ABS 值)2.5×107
0.0686
2.2×107
0.
07605.4×1070.1251 5.4×1070.15909.6
×1070.23628.7×1070.26921.5×108
0.4386
1.6×108
0.4616
图1 菌液浓度107～108cfu/mL 的ABS 值
(第一次实验结果)图2 菌液浓度107～108cfu/mL 的ABS 值
(第二次实验结果) 由图1、2,我们可以看到,将菌液浓度控制在107～108cfu/mL 时,标准曲线的回归系数可达0.99以上,准确度很高。
2.2 菌液浓度为105～106cf u/mL 标准曲线的制
作
(见表2;图3、4)。
因为最终所用的菌液浓度为105cfu/mL ,所以就考虑在制作标准曲线时,将其控制在105cfu/mL ,避免因再次稀释所产生的误差。同样,在同等条件下,重复两次实验。
表2 菌液浓度105～106cfu/mL 的ABS 值
第一次实验结果第二次实验结果菌液浓度
(cfu/mL )吸光度
(ABS 值)菌液浓度
(cfu/mL )吸光度
(ABS 值)9.5×105
0.0372 3.0×105
0.00021.7×1060.03117.5×1050.00363.3×1060.0523 1.5×1060.00697.5×106
0.1106
2.5×106
0.0099
图3 菌液浓度105～106cfu/mL 的ABS 值
(第一次实验结果)
图4 菌液浓度105～106cfu/mL 的ABS 值
(第二次实验结果)
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工 业 微 生 物
第36卷
由3、4图,可以看到,将菌液浓度控制在105～106cfu/mL 时,标准曲线的回归系数偏底,存在一定
的误差。
3 结论
经实验论证,在标准曲线制作时,菌液浓度为107～108cfu/mL ,其各个稀释倍数的活菌计数值与
所测的吸光度,在OR G 软件对数直角坐标系上呈
很强的相关性,其回归系数R 非常接近1。而采用菌液浓度为105～106cfu/mL 制作标准曲线,其相关性较差,回归系数R 不甚理想。因此,不宜直接采用较低浓度的菌液制作标准曲线。
鉴于各实验室条件差异;培养基产地、批号不同;操作人员与系统误差等原因,建议在同一实验室一旦有因素变化,应再进行一次标准曲线的制作。
An easy method for detecting concentration of bacterial suspension
ZHU Y an 2jing ,L I Yu
(Shanghai Institute of Industrial Microbiology ,Shanghai 200233)
Abstract In order to easily detect the concentration of the bacterial suspension ,the standard curve according to the colony forming units correlating the absorbency was made.The result showed that this standard curve could quickly judge the concentration of bacterial suspension.
K ey w ords concentration of bacterial suspension ;absorbency (ABS );standard curve ;J IS (Japanese Industrial Stan 2dard )
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