ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键

ELLMAN 试剂测定自由巯基

试验基于的原理：

5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)

5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm 没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB ）[1]。TNB 2-在412nm 有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。

S

S NO 2

NO 2

-

OOC

-

OOC

+

SH S -S

NO 2

NO 2

-

OOC

-

OOC

+

S

DTNB TNB 2- 根据文献记载，TNB 的吸光系数在13.6*103M -cm -~14.25*103M -cm -之间[3,4]。吸光度测量的最灵敏范围在0.2-0.7之间。A=εbc ，其中A 为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol ·cm ）]。以吸光度下限0.2来计算（吸光系数取14.15*103M -cm -），需要TNB 的浓度为c=0.2/（14.15*103LM -cm -*1cm ）=1.4*10-5mol/L (1.4*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml. 我们的条件可以达到这个检测限度。

ELLMAN 试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：

1. EDTA 的适量加入有助于TNB 显色的稳定和成梯度线性关系[5]。

2. 在不同缓冲液中，TNB 的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm 的吸收也不

同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。另外，TNB 的分光光度法分析对SDS 很敏感[6]。 3. DTNB 随着pH 的升高，降解速度加快。在pH7.0，其降解速度为0.02%/h ，在

pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH 12时，15min之内会完全降解[7,8]。

4.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4].

试验方案

主要材料：

1.材料

PEG-G-CSF 批号：080229 浓度4.32mg/ml

G-CSF 批号：080126 浓度6.9mg/ml

10k超滤膜PALL

2.试剂

Sequencing Grade Modified Trypsin,Promega，lot#237826。20 ug/小瓶。加入20 ul

50mM NH4HCO3，pH7.8溶解，配成1 ug/ ul的酶液。

1M DTT 刘春凤提供

TFA（三氟乙酸）：TEDIA Lot# 705114

乙腈：Fisher Scientific Lot# 055848

Starter kit for MALDI-TOF MS：BRUKER DALTONICS，Lot NO

2007-208241-001(including α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid(HCCA),peptide

calibration standard,protein calibration standard I,protein calibration standard Ⅱ)

PEG肽段反相分离流动相

A液：0.1%TFA/H2O

B液：0.1%TFA/90%乙腈/H2O

3.仪器

质谱仪：BRUKER DALTONICS MALTI-TOF-TOF autoflexⅢ(厂内编号

KC2007-011)

Beckman 22R台式离心机（厂内编号AM-039）

Beckman DU-800 紫外分光光度计（厂内编号KC2007-005）

恒温循环仪：JULABO F12-ED（厂内编号KC2008-003）

反相柱：Symmetry C18 5um 300à 4.6*150mm，Lot NO 020*******，内部编号1655

高压液相仪器：，（UV/Visible Detector）

试验过程：

一、缓冲液替换

PEG-G-CSF和G-CSF进行缓冲液替换，超滤替换缓冲液为50mM NH4HCO3，pH

7.8。使用50mM NH4HCO3作为空白对照，样品用50mM NH4HCO3稀释一倍

后在DU-800 紫外分光光度计上测浓度。

PEG-G-CSF的浓度约6.29mg/ml，G-CSF的浓度约10.81mg/ml。

二、酶切处理

1）取37ul G-CSF,共400ug，加入125.5ul 50mM NH4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。

取63.ul PEG-G-CSF,共400ug，加入152ul 50mM NH4HCO3稀释为终浓度为

2mg/ml。

2）按质量比1：40往PEG-G-CSF中加入Trypsin 10ul，往G-CSF中加入Trypsin

10ul，同时各加入1ul 1M DTT使终浓度为5mM。另做一空白对照，往300ul 50mM

NH4HCO3中加入Trypsin 15ul。

37℃反应，开始时间为。

三、肽段反相分离

G-CSF Trypsin+DTT 反相分离

收样：

PEG-G-CSF Trypsin+DTT 反相分离

收集到之间的信号峰，交由崔文喜冻干

四、ELLMAN试剂测定自由巯基

由于收集到的PEG肽段已经是自由巯基，所以可以跳过还原二硫键这一步。

根据我们所查找到得文献，采用的参数如下：

反应缓冲液：0.10M 磷酸钠+0.001M EDTA ，pH 7.27

温度：25℃

在这些参数下，摩尔吸收光系数为14.15±0.09*103LM-cm-[9].

1)标准曲线

用反应缓冲液配制10umDTT，20 umDTT，40 umDTT，80 umDTT，160 umDTT，

320 umDTT。用缓冲液配制10mM 的ELLMAN试剂。准备两个比色皿。

①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收值，吸收值调

节到0.

②加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ul ELLMAN试剂到样品管中，在

412nm测定吸收值A DTNB。

③加入100ul蛋白质溶液到对照管中，加入100ul蛋白质溶液到样品管中，混匀，

3~5min后测定吸收值，直到值不再增加，记为A final。

④A412nm=A final-（3.1/3.2）(A DTNB-A buffer),制作标准曲线。

2）样品巯基测定

①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收值，吸收值调

节到0.

②加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ul ELLMAN试剂到样品管中，在

412nm测定吸收值A DTNB。

③加入100ul蛋白质溶液到对照管中，加入100ul蛋白质溶液到样品管中，混匀，

3~5min后测定吸收值，直到值不再增加，记为A final。

④A412nm=A final-（3.1/3.2）(A DTNB-A buffer)，根据标准曲线测定巯基。

参考文献：

1)THEODOREW.T et al.Sensitive Quantitative Analysis of Disulfide Bonds in Polypeptides and Proteins. ANAL YTICAL BIOCHEMISTRY 138, 18 1- I88 ( 1984).

2) W. L. ANDERSON AND D. B. WETLAUFER .A New Method for

Disulfide Analysis of Peptides. ANAL YTICAL BIOCHEMISTRY 67.493-502 ( 1975).

3) Ellman, G.L., Arch. Biochem. Biophys., 74, 443. (1958).

4) Peter Eyer,et al. Molar absorption coe?cients for the reduced Ellman reagent: reassessment.. Analytical Biochemistry 312 (2003) 224–227

5) W. L. ANDERSON AND D. B. WETLAUFER .A New Method for Disulfide Analysis of Peptides. ANAL YTICAL BIOCHEMISTRY 67.493-502 ( 1975).

6)Sigma 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 产品说明书。

7) Riddles, P.W. et al., Anal. Biochem., 94, 75 (1979)

8) Danehy, J.P, Elia, V.J. and Lavelle, C.J., J. Org. Chem., 36, 1003 (1971).

9) P.W. Riddles, R.L. Blakeley, B. Zerner, Ellmans reagent:5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)—a reexamination, Anal. Bio-chem. 94 (1979) 75–81.

羟基自由基的测定方法

羟基自由基(.OH)是最活跃的一种活性分子，也是进攻性最强的化学物质之一，几乎可以与所有的生物分子、有机物或无机物发生各种不同类型的化学反应，并伴有非常高的反应速率常数和负电荷的亲电性。羟基自由基是目前所知活性氧自由基中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基，可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化损伤，使细胞坏死或突变，羟基自由基还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬等有关。羟基自由基由于其寿命短，反应活性高，存在浓度低，目前尚未有专一、有效的方法可以精确测定羟基自由基的含量，其测定方法也成为一项国际性的难题。本文对近几年出现的羟基自由基检测方法进行了综述。 1电子自旋共振法 电子自旋共振法或电子顺磁共振法主要研究对象为未成对的自由基或过渡金属离子及其化合物。自旋捕捉(spin trapping)技术的出现为化学反应中自由基中间体及生命活动过程中短寿命自由基的检测开辟了新的检测途径[[1]]。此方法是利用捕捉剂与自由基结合形成相对稳定的自旋加合物(spin adducts)，然后进行ESR测定。 2HPLC法 HPLC法可用于间接测定自由基。测定过程中必须先选择合适的化合物捕集被测体系中的自由基，使之生成具有一定稳定性，且能被液相色谱分离与检测的产物，然后用HPLC进行测定。1）、采用二甲基亚砜捕集羟基自由基的HPLC测 2）、采用水杨酸捕集羟基自由基的HPLC测定方法 3化学发光法 化学发光法是一种灵敏、准确的检测自由基的方法，其原理是利用发光剂被活性氧自由基氧化成激发态，当其返回到基态时放出大量光子，从而对发光起放大作用。且自由基产生越多，发光值就越大。通过函数换算间接反应系统中自由基的量。与ESR和HPLC法相比，具有操作简便、设备成本较低、测定快速等优点。4氧化褪色光度法 6极谱法 7毛细管电泳-电化学检测法 8胶束电动毛细管色谱法

理化检验(全)

第一章绪论 食品理化检验概念：是卫生检验专业中的一门重要专业课程，是以分析化学、营养与食品卫生学、食品化学为基础，采用现代分离、分析技术，研究食品营养成分与食品安全有关成分的理化检验原理和方法的一门科学，也是一门学科交叉、应用性很强的学科。 第二章食品样本的采集、保存和处理 **1 食品样本的采集原则及方法。 ①所采集样品对总体有充分的代表性； ②采样过程中应设法保持食品原有的理化性质，防止待测成分的损失和污染。 注意：首先样本容量应达到一定的要求；此外，采样时应尽量使处于不同方位、不同层次的个体样品都有均等的被采集的机会。 **2 食品样品的保存原则。 ①稳定待测成分 ②防止污染 ③防止腐败变质 ④稳定水分 即净、密、冷、快。 3 食品样品的前处理方法。 原则： ①消除干扰因素； ②完整保留被测组份； ③使被测组份浓缩，以获得可靠的分析结果。 主要内容： ①除去非食用部分 ②除去机械杂质 ③均匀化处理

**4 湿法消化中常用的氧化性强酸有哪几种？这几种强酸各自有何特点？ ①高氯酸：冷的高氯酸无氧化性，加热后是强的氧化剂。氧化性比硝酸和硫酸强，对还原性较强的有机物如酒精、甘油、脂肪、糖类和次磷酸及其盐因反应剧烈而发生爆炸，几乎可以分解所有有机物，但一般不宜单独使用。 ②硝酸：沸点较低，易挥发，氧化能力不持久，常与其他酸配合使用。 ③硫酸：沸点高(338℃)，热的浓硫酸具有一定的氧化性，对有机物有强烈的脱水作用，并使其碳化，进一步氧化成二氧化碳和水。 5 何谓湿消化法和干灰化法？有何特点？（无机化处理的主要方法） 湿消化法：指在适量的食品样品中，加入氧化性的强酸，然后在一定温度条件下反应，破坏食品中的有机物，使待测的无机成分释放出来，形成不挥发的无机化合物的方法。 优点：有机物分解速度快，加热温度较干灰化法低，可减少待测成分的挥发损失。 缺点：试剂用量大，有时空白值比较高，消化过程中会产生大量有害气体。 干灰化法：食品样品放在坩埚中，先在电炉上加热使样品脱水、炭化，再置于500-600℃的高温炉中灼烧灰化。使样品中的有机物氧化分解成二氧化碳、水和其他气体而挥发，留下无机物供测定。 优点：能处理较多的样品，提高检出率；不加试剂，空白值较低；适用范围广，操作简单。缺点：灰化时间长、敞口高温导致被测成分挥发（通常550～600℃4h）；坩埚对被测成分的吸留致使某些成分的回收率低。 6 提高干灰化法回收率的措施 ①采用适宜的灰化温度。 500～550℃，不超过600℃ 低温灰化技术（抽真空，＜150 ℃），成本高 ②加入助灰化剂（如KOH，MgO等）: ③还可采用促进灰化和防止损失的措施：如加盐酸或水溶解灰分，解除对炭粒的包裹；加 硫酸稳定铅、镉等金属；加硝酸提高灰分的溶解度等。但需注意酸的量不可过多，以防酸雾损坏灰化炉。 7 干扰成分的去除的主要方法 第三章食品的营养成分分析 1掌握恒重、粗蛋白、粗脂肪、总脂肪、还原糖、膳食纤维、灰分的概念；

自由基及检测方法

ESR 电子顺磁共振（EPR）或称电子自旋共振（ESR）现象最早发现于1944年。它利用具有未成对电子的物质在磁场作用下吸收电磁波的能量使电子发生能级间的跃迁的特征，对顺磁性物质进行检测与分析。 自旋捕集方法是将不饱和的抗磁性化合物（自旋捕集剂）加入反应体系,与反应体系中产生的各种活性高、寿命短的自由基结合形成相对稳定的自旋加合物,以适于ESR检测其原理是利用适当的自旋捕捉剂与活泼的短寿命自由基结合,生成相对稳定的自旋加合物,可以用电子自旋共振波谱法检测自旋加合物的数量,利用自旋加合物的数量来计算原来自由基的多少。 H： V： ESR测自由基是怎么被检测的（细胞，组织，溶液？体内，体外？） (MGD)2 - Fe2 +,是含有10mmol·L- 1MGD 和2mmol·L- 1FeSO4的溶液。 体外捕集：处死后取组织（血液、细胞），加入捕集剂，ESR测定 体内捕集：腹腔注射捕集剂，处死取组织（血液、细胞），ESR测定 腹腔注射几乎没有检测到自由基信号，或者信号很弱，而处死后样品加捕获剂则可以检测到自由基信号。 通用捕获剂 典型的自旋捕捉剂是亚硝基化合物或氮氧化合物，把足够量的自旋捕捉剂加入到产生自由基的体系中，自旋捕获剂就会快速地和任何出现的自由基反应，最后给出稳定的可检测的氮样氧自由基加合物。所形成的自由基加合物的ESR 谱上有被捕自由基基因给出的超精细分裂,可鉴别被捕自由基通用自旋捕获剂所形成的自由基加合物对自由基结构变化相当敏感， ESR 技术检测O-2 O-2可以与1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸钠(Tiron)(钛铁试剂)快速反应生成一种称之为“Tiron 半醌自由基”的自旋加合物，比较稳定，可在室温下应用电子顺磁共振波谱仪(EPR)进行检测，从而解决了生理条件下水溶液中寿命极其短暂的O-2·的定性和定量问题 ESR 技术检测·OH DMPO作自由基捕获剂对自由基结构变化相当敏感,可以提供自由基结构的详细信息。它与·OH产生的自旋加合物的ESR谱表现出特别容易识别的特征谱线。在溶液中容易形成的自我捕集产物二聚体自由基不会干扰实验结果。 ESR 技术检测血红蛋白结合的一氧化氮 在组织或血液中，一氧化氮大多与氧或过渡金属反应生成了硝酸盐或亚硝酸盐以及一氧化氮与金属的配合物。一氧化氮与血红蛋白的结合速率常数非常高，而且能够得到有特征的ESR 波谱。利用这一性质，我们可以用血红蛋白作为一氧化氮的捕集剂检测一氧化氮自由基。但是，HbNO 极易氧化，这就限制了这种方法在富氧条件下的应用。 ESR 技术检测生物体系产生的一氧化氮 一氧化氮与含金属蛋白反应产生的亚硝酰的金属配合物，往往会抑制细胞中许多重要的酶，对细胞产生毒害作用。目前应用较多的捕集剂的有Fe2+- (DETC)2，它可与一氧化氮形成稳定的单亚硝酰-铁配合物MNIC，给出特征的ESR 波谱。但由于Fe2+-( DETC)2不溶

ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键审批稿

E L L M A N试剂法测定 自由巯基和二硫键 YKK standardization office【 YKK5AB- YKK08- YKK2C- YKK18】

ELLMAN试剂测定自由巯基试验基于的原理： 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。 S S NO2NO2 -OOC-OOC + SH S- S NO2 NO2 -OOC -OOC + S DTNB TNB2- 根据文献记载，TNB的吸光系数在*103M-cm-~*103M-cm-之间[3,4]。吸光度测量的最灵敏范围在之间。A=εbc，其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。以吸光度下限来计算（吸光系数取*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=（*103LM-cm-*1cm）=*10-5mol/L *10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为*10-5mol/L*18790g/mol=L=ml. 我们的条件可以达到这个检测限度。 ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：

1.EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系[5]。 2.在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm 的吸收也不 3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。另外，TNB的分光光度法分析对 SDS很敏感[6]。 4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。在，其降解速度为%/h，在 5.pH值，其降解速度为%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH 12 时，15min之内会完全降解[7,8]。 6.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4]. 试验方案 主要材料： 1.材料 PEG-G-CSF 批号：080229 浓度ml G-CSF 批号：080126 浓度ml 10k超滤膜 PALL 2.试剂 Sequencing Grade Modified Trypsin,Promega，lot#237826。20 ug/小瓶。 加入20 ul 50mM NH4HCO3，溶解，配成1 ug/ ul的酶液。 1M DTT 刘春凤提供 TFA（三氟乙酸）：TEDIA Lot# 705114 乙腈：Fisher Scientific Lot# 055848 Starter kit for MALDI-TOF MS：BRUKER DALTONICS，Lot NO 2007-208241-001(including α-Cyano-4-hydroxycinnamic

硫醇是环氧树脂固化剂

硫醇是环氧树脂固化剂的最要品种，主要用于胶粘剂领域。环氧树脂固化剂品种繁多，包括常温和加热固化剂2大类，能满足大部分场合使用要求。但在低温速固化领域，只有硫醇较适用，它在快速修补胶及冬季作业场合有很大优势，其他同化剂无法替代。由于硫醇同化剂的生产技术要求较高，国内尚无生产，一般为进口产品，如美国的3-800牌号应用较为普遍。为填补国内空白，广州川井电子材料有限公司采用制备多元硫醇酯并进而扩链的方法，制备出了硫醇固化剂，并在固化性能方面作了应用研究。 一、实验部分 1、主要原料 β-巯基丙酸：工业品，德国Brunobock公司；季戊四醇：工业品，瑞典柏斯托公司；甲苯和对甲苯磺酸：化学纯，广东西陇化工厂；环氧树脂828(EEW：190)，工业品，shell 公司；1，8-二氮杂-双环十一烯-7(DBu)：工业品，日本Appollo公司；苄基二甲胺及DMP-30：工业品，台湾长春树脂厂。 2、固化剂的合成 (1)反应原理 β-巯基丙酸与季戊四醇反应如下： 此处的关键点在于控制A(SH)4用量，尽可能的使A(SH)4分子上有1个巯基与环氧基反应；专家强调：否则容易造成凝胶使扩链反应失败。 a.在装有机械搅拌、温度计、回流冷凝管的2000mL三口烧瓶中，加入136g(1.0mol)季戊四醇，466g(4.4mol)β-巯基丙酸，300mL甲苯和1.90g对甲苯磺酸，回流反应5h自然冷却，用去离子水洗涤到中性，减压蒸馏得无色油状液体季戊四醇四巯基丙酸酯以A(SH)4表示)，重427g，产率96.7%。 b.取78gA(SH)4和22g环氧树脂828置于烧瓶中，加热到100℃反应4h冷却，得黏稠状

ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键

E L L M A N试剂法测定自 由巯基和二硫键 This manuscript was revised by the office on December 22, 2012

E L L M A N试剂测定自由巯基 试验基于的原理： 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。 DTNBTNB2- 根据文献记载，TNB的吸光系数在13.6*103M-cm-~14.25*103M-cm-之间[3,4]。吸光度测量的最灵敏范围在0.2-0.7之间。A=εbc，其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。以吸光度下限0.2来计算（吸光系数取14.15*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=0.2/（14.15*103LM-cm-*1cm）=1.4*10-5mol/L(1.4*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为 1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml. 我们的条件可以达到这个检测限度。 ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有： 1.EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系[5]。 2.在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm的 吸收也不 3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。另外，TNB的分光光度法分析对SDS 很敏感[6]。 4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。在pH7.0，其降解速度为 0.02%/h，在 5.pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在 pH12时，15min之内会完全降解[7,8]。 6.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4]. 试验方案 主要材料：

3_巯基_2_丁醇的合成

化学试剂,1999,21(5),309;317 3-巯基-2-丁醇的合成 田红玉3　孙宝国　徐理阮 (北京轻工业学院化工系,北京100037) 32巯基222丁醇是合成食用香料2,32丁二硫醇的副产物之一,同样是一种具有葱肉香的香料化合物[1],主要用于肉类、家禽类及烧烤食品中。与一般的香料化合物相比,它具有更宽的可使用质量分数范围((01002～20)×10-6)。它既可以作为一种香料单独使用,又可以作为一种组分与其他香料化合物复配使用。 32巯基222丁醇的合成可以采用2,32环氧 丁烷为原料。2,32环氧丁烷属于环氧化合物,文献[2]中较全面地论述了该类化合物的化学性质。环氧化合物在含硫的亲核试剂进攻下容易进行开环的亲核加成,这些亲核试剂包括硫化氢、硫醇、苯硫酚、硫氰酸盐、硫脲等多种含硫化合物。文献[3]报道了1,22环氧丙烷与硫氢化钾的乙醇溶液反应,得到了12巯基222丙醇。本文根据这些文献,用2,32环氧丁烷与硫氢化钠的乙醇溶液反应,生成32巯基222丁醇。反应方程式如下: C CH 3 O H CH CH 3 +N aH S C 2H 5OH C CH 3OH H C SH H CH 3 1　实验部分111　仪器与试剂 岛津I R 2400型红外光谱仪;Q P 25000型质谱仪;硫元素分析采用钡盐滴定法。 实验所用的试剂均为市售化学纯试剂。1.2　实验操作1.2.1　硫氢化钠的制备 在250mL 的四口圆底烧瓶上安装温度计、搅拌器和回流冷凝管,回流冷凝管连接氯化钙干燥管,再连接一碱液吸收装置,烧瓶的另一口安装导气管。往烧瓶中加入100mL 无水乙醇, 然后迅速加入5g 切成小块的洁净的金属钠,搅拌,使钠完全溶解,用冰水浴降温,保持温度在0～5℃。往装有硫化钠的烧瓶中滴加稀硫酸,生成硫化氢气体,经过氯化钙干燥管、安全瓶导入钠的乙醇溶液中至饱和。1.2.2　32巯基222丁醇的制备 将14g (012m o l )2,32环氧丁烷滴加至11211制备的硫氢化钠溶液中,同时搅拌,并通入硫化氢气体,保持温度在25℃,反应6h 。将反应混合物倒入3倍体积的水中,用醋酸中和至中性,用二氯甲烷(60mL ×3)萃取,合并有机相,用无水硫酸钠干燥后,常压蒸馏,除去二氯甲烷,减压蒸馏,收集41～43℃ 797.4Pa 的馏分。产品为无色液体,产率5616%。 I R ,c m -1 :3400(s ),2960(s ),2920(m ),2860(m ),2550(w ),1450(m ),1375(m ),1350～1260(m ),1150(m )。硫元素分析,实测值(计算值),%:S 30130(30119)。质谱:106(分子离子峰),91,88,73,45(基峰),62,61。2　结果与讨论 211　我们发现在2,32环氧丁烷与硫氢化钠溶 液反应过程中,导入硫化氢可以明显提高产率至5616%,与文献[3]中12巯基222丙醇的产率相比,提高了25%以上。 212　温度对2,32环氧丁烷与硫氢化钠溶液反应也有很大的影响,反应温度过高,产率会明显下降,因为温度升高会降低硫化氢在乙醇溶液中的溶解度,从而降低起反应作用的H S -的浓度。温度太低,反应速度下降,产率也略有下降,研究表明,反应温度最好控制在20～25℃,反应时间为6h 。 (下转第315页) 9 03第21卷第5期 田红玉等:32巯基222丁醇的合成

ELLM试剂法测定自由巯基和二硫键

E L L M试剂法测定自由巯基 和二硫键 Prepared on 22 November 2020

ELLMAN试剂测定自由巯基试验基于的原理： 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。 DTNBTNB2- 根据文献记载，TNB的吸光系数在*103M-cm-~*103M-cm-之间[3,4]。吸光度测量的最灵敏范围在之间。A=εbc，其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。以吸光度下限来计算（吸光系数取*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=（*103LM-cm-*1cm）=*10-5mol/L*10- 8mol/ml)，需要蛋白浓度为*10-5mol/L*18790g/mol=L=ml. 我们的条件可以达到这个检测限度。 ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有： 1.EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系[5]。 2.在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm 的吸收也不 3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。另外，TNB的分光光度法分析对 SDS很敏感[6]。 4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。在，其降解速度为%/h，在

5.pH值，其降解速度为%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH12 时，15min之内会完全降解[7,8]。 6.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4]. 试验方案 主要材料： 1.材料 PEG-G-CSF批号：080229浓度ml G-CSF批号：080126浓度ml 10k超滤膜PALL 2.试剂 SequencingGradeModifiedTrypsin,Promega，lot#237826。20ug/小瓶。加 入20ul50mMNH4HCO3，溶解，配成1ug/ul的酶液。 1MDTT刘春凤提供 TFA（三氟乙酸）：TEDIALot#705114 乙腈：FisherScientificLot#055848 StarterkitforMALDI-TOFMS：BRUKERDALTONICS，LotNO2007- 208241-001(includingα-Cyano-4- hydroxycinnamicacid(HCCA),peptidecalibrationstandard,proteincalibratio nstandardI,proteincalibrationstandardⅡ) PEG肽段反相分离流动相 A液：%TFA/H2O B液：%TFA/90%乙腈/H2O 3.仪器 质谱仪：BRUKERDALTONICSMALTI-TOF-TOFautoflexⅢ(厂内编号 KC2007-011)

ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键

ELLMAN试剂测定自由巯基 试验基于的原理： 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自 2- 吸光度 0.2来计算-*1cm） 1.4*10 1. 2. 不 3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。另外，TNB的分光光度法分析对SDS很敏 感[6]。 4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。在pH7.0，其降解速度为0.02%/h，在 5.pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH 12 时，15min之内会完全降解[7,8]。

6.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4]. 试验方案 主要材料： 1.材料 PEG-G-CSF 批号：080229 浓度4.32mg/ml G-CSF 批号：080126 浓度6.9mg/ml 小瓶。 NO B液：0.1%TFA/90%乙腈/H2O 3.仪器 质谱仪：BRUKER DALTONICS MALTI-TOF-TOF autoflexⅢ(厂内编号 KC2007-011) Beckman 22R台式离心机（厂内编号AM-039） Beckman DU-800 紫外分光光度计（厂内编号KC2007-005）

恒温循环仪：JULABO F12-ED（厂内编号KC2008-003） 反相柱：Symmetry C18 5um 300à 高压液相仪器：，（UV/Visible Detector） 试验过程： 一、缓冲液替换 PEG-G-CSF和G-CSF进行缓冲液替换，超滤替换缓冲液为50mM NH4HCO3， 稀释 中加入

半胱氨酸

半胱氨酸 科技名词定义 中文名称：半胱氨酸 英文名称：cysteine;Cys 定义：学名：2-氨基-3-巯基丙酸。一种脂肪族的含巯基的极性α氨基酸，在中性或碱性溶液中易被空气氧化成胱氨酸。L-半胱氨酸是蛋白质合成编码氨基酸，哺乳动物非必需氨基酸和生糖氨基酸。 D-半胱氨酸存在于萤火虫的萤光素酶中。符号：C。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；氨基酸、多肽与蛋白质（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 百科名片 半胱氨酸，一种生物体内常见的氨基酸，人体必须的氨基酸之一。分子式：cysteine HSCH2CH（NH2）COOH，为含硫α-氨基酸之一，遇硝普盐（nitroprusside）呈紫色（因SH而显色），存在于许多蛋白质、谷胱甘肽中，与Ag+，Hg+，Cu+等金属离子可形成不溶性的硫醇盐（mercapti－de）。即R －S－M′， R－S－M″－S－R（M′，M″各为1价、2价金属）。 目录 基本信息 使用说明 技术指标 合成过程 代谢过程 相关产品 基本信息

半胱氨酸 cysteine(Cys) 1名称：cysteine 2缩写：Cys 3分子量：157.5 一种生物体内常见的氨基酸，可由体内的蛋氨酸（甲硫氨酸，人体必需氨基酸）转化而来，可与胱氨酸互相转化。 HSCH2CH（NH2）COOH，(C3H7NSO2)为含硫α-氨基酸之一，遇硝普盐（nitroprusside）呈紫色（因SH而显色），存在于许多蛋白质、谷胱甘肽中，与Ag+，Hg+，Cu+等金属离子可形成不溶性的硫醇盐（mercapti－de）。即R－S －M′， R－S－M″－S－R（M′，M″各为1价、2价金属）。半胱氨酸是属于非必需氨基酸。在动物体内是从蛋氨酸和丝氨酸经过胱硫醚而合成。无机硫黄（来自硫酸盐）导入到半胱氨酸，在植物和细菌中，从硫酸经过3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸和亚硫酸还原生成的硫化氢通过和O- 乙酰丝氨酸或丝氨酸反应而生成。半胱氨酸的分解是在厌氧条件下通过脱硫氢酶的作用分解成丙酮酸和硫化氢和氨，或是通过转氨基作用，经由中间产物β-巯基丙酮酸分解成为丙酮酸和硫黄，在氧化条化条件下，氧化成半胱氨酸亚硫酸后，可经转氨基作用分解成为丙酮酸与亚硫酸，以及由脱羧基作用分解成为亚牛磺酸、牛磺酸等。此外，[1] 是不稳定的化合物，容易氧化还原，与胱氨酸相互转换。还可与有毒的芳香族化合物缩合成硫醚氨酸（mercapturic acid）而起解毒作用。 半胱氨酸 半胱氨酸是一种天然产生的氨基酸，在食品加工中具有许多用途，它主要用于焙烤制品，作为面团改良剂的必需成分 半胱氨酸是一种还原剂，它可以促进面筋的形成，减少混合所需的时间和所需药用的能量，半胱氨酸通过改变蛋白质分子之间和蛋白质分子内部的二硫键，减弱了蛋白质的结构，这样蛋白质就伸展开来。 使用说明

二硫键检测方法

2.3.1.4 MBP-Permatin蛋白中半胱氨酸残基及二硫键数目的测定 L半胱氨酸可于5,5-二巯基双-2硝基甲苯(DTNB)发生硫醇-二硫化物交换反应,在碱性条件下反应显黄色,在412 nm处有强烈吸收峰。该反应可特异地检测-SH,从而定量检测L半胱氨酸含量。 分析MBP标签氨基酸序列可知,该标签蛋白中不含有半胱氨酸,故不影响原核表达的Permatin中半胱氨酸残基的数目。采用DTNB 方法测定样品的巯基数，其方法的主要步骤为： 1）样品先用8 M尿素37℃处理4 h； 2）游离巯基数的测定: 向未经尿素处理的1.0 ml样品(0.38 mg/ml)中加入2 ml Tris-Gly(0.086 M Tris, 0.09 M Gly, pH 8.0)，加入50μl DTNB(10 mM DTNB, 200 mM Tris-HCl, pH 8.0)，5 min后测定412 nm 处的吸光值; 3) 总的巯基数的测定: 向经尿素处理的0.5 ml样品中加入2 ml Tris-Gly，加入50μl β-巯基乙醇（β-ME），37℃温浴1h，加入10 ml 12%三氯乙酸（TCA），37℃温浴1 h，11000 rpm离心30 min，用5 ml 12% TCA重悬沉淀两次，以彻底去除β-ME，最后用2ml Tris-Gly重溶沉淀，加入50μl DTNB溶液，5 min后测定412 nm处的吸光值。 利用公式：μmol SH/g=73.53×A412×D/C进行计算。其中A412是412 nm处的吸光值, D为稀释倍数，C为蛋白浓度, 73.53是一个系数,由106/1.36 x 104得到。

王安右 2-氨基-5-己巯基-1,3,4-噻二唑的合成

分类号论文编号 本科生毕业论文2-氨基-5-己巯基-1，3，4-噻二唑的合成 姓名：王安右 院系：生物与化学 年级专业： 2010级应用化学 指导教师：李映晖（副教授） 2014年5月

诚信承诺书 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 作者签名： 日期：

关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解兴义民族师范学院有关保留、使用学位论文的规定，同意学院保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权兴义民族师范学院可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文和汇编本学位论文。 (保密论文在解密后应遵守此规定) 作者签名： 导师签名： 日期：

目录 摘要................................................................ I Abstract........................................................... I I 第一章绪论 (1) 1.1主要研究内容、选题意义 (1) 1.1.1主要研究内容 (1) 1.1.2选题意义 (1) 第二章实验部分 (2) 2.1 实验原理 (2) 2.2实验药品 (2) 2.3 实验仪器 (2) 2.4实验内容 (2) 2.4.1 1-溴己烷的合成 (2) 2.4.2 2-氨基-5-巯基-1,3,4-噻二唑的合成 (3) 2.4.3 2-氨基-5-己巯基-1,3,4-噻二唑的合成 (3) 2.5 目标化合物的结构表征 (4) 第三章结果与讨论 (5) 3.1 2-氨基-5-己巯基-1,3,4-噻二唑的合成 (5) 3.2 温度对反应的影响 (5) 3.3 时间对反应的影响 (6) 第四章结论 (7) 参考文献 (7) 致谢 (8) 附录 (10)

二硫键检测方法

. 2.3.1.4 MBP-Permatin蛋白中半胱氨酸残基及二硫键数目的测定 L半胱氨酸可于5,5-二巯基双-2硝基甲苯(DTNB)发生硫醇-二硫化物交换反应,在碱性条件下反应显黄色,在412 nm处有强烈吸收峰。该反应可特异地检测-SH,从而定量检测L半胱氨酸含量。 分析MBP标签氨基酸序列可知,该标签蛋白中不含有半胱氨酸,故不影响原核表达的Permatin中半胱氨酸残基的数目。采用DTNB 方法测定样品的巯基数，其方法的主要步骤为： 1）样品先用8 M尿素37℃处理4 h； 2）游离巯基数的测定: 向未经尿素处理的1.0 ml样品(0.38 mg/ml)中加入2 ml Tris-Gly(0.086 M Tris, 0.09 M Gly, pH 8.0)，加入50μl DTNB(10 mM DTNB, 200 mM Tris-HCl, pH 8.0)，5 min后测定412 nm 处的吸光值; 3) 总的巯基数的测定: 向经尿素处理的0.5 ml样品中加入2 ml Tris-Gly，加入50μl β-巯基乙醇（β-ME），37℃温浴1h，加入10 ml 12%三氯乙酸（TCA），37℃温浴1 h，11000 rpm离心30 min，用5 ml 12% TCA重悬沉淀两次，以彻底去除β-ME，最后用2ml Tris-Gly重溶沉淀，加入50μl DTNB溶液，5 min后测定412 nm处的吸光值。 利用公式：μmol SH/g=73.53×A412×D/C进行计算。其中A412是412 nm处的吸光值, D为稀释倍数，C为蛋白浓度, 73.53是一个系数,由106/1.36 x 104得到。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！ 精品

重氮化反应 氨基变巯基

Organic Syntheses, Coll. Vol. 2, p.580 (1943); Vol. 12, p.76 (1932). THIOSALICYLIC ACID [Benzoic acid, o -mercapto-] Submitted by C. F. H. Allen and D. D. MacKay. Checked by Roger Adams and A. E. Knauf. 1. Procedure Caution! Recently it was reported to us that workers, following the procedure in Coll. Vol. II, pg 580 (diazotization of anthranilic acid and its reaction with sodium disulfide) but substituting 2,3-dimethylaniline for anthranilic acid, experienced a serious explosion upon addition of the diazonium salt solution to the disulfide solution. We urge that extreme caution should always be exercised in the handling of diazonium salts even when they are in solution. In a 4-l. beaker, 290 cc. of water is heated to boiling, and 260 g. (1.1 moles) of crystallized sodium sulfide (Na 2S·9H 2O) and 34 g. of powdered sulfur are dissolved by heating and stirring. A solution of 40 g. of sodium hydroxide in 100 cc. of water is then added and the mixture cooled, first in cold water, and finally by a freezing mixture of ice and salt. In a 2-l. beaker, set in a freezing mixture and provided with a stirrer and a thermometer for reading temperatures to 0°, are placed 500 cc. of water, 137 g. (1 mole) of anthranilic acid , and 200 cc. of concentrated hydrochloric acid ; the stirrer is started and the mixture cooled to about 6°. Meanwhile 69 g. (1 mole) of sodium nitrite is dissolved in 280 cc. of hot water and the solution cooled in ice; portions are then placed in a separatory funnel of convenient size, supported in such a way that the lower end of the stem extends beneath the surface of the anthranilic acid solution. When the temperature has fallen to 5°, the nitrite solution is run in; about 500 g. of cracked ice is added at such a rate as to keep the temperature below 5°. This takes about ten minutes (Note 1). A drop of the solution should give an immediate blue color with starch-iodide paper. The stirrer and thermometer are now transferred to the alkaline sulfide solution, the temperature of which must be below 5°. The diazo solution is added over a period of twenty to thirty minutes along with 950 g. of ice to prevent the temperature from rising above 5°. When addition is complete, the water

蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析解析

第２０卷第６期２００８年６月 化 学进展 ＰＲＯＧＲＥＳＳＩＮＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖ０１．２０Ｎｏ．６Ｊｕｎｅ，２００８ 蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析＊ 仇晓燕１’２ 崔 勐１ （１．中国科学院长春应用化学研究所长春质谱中心 刘志强１ 刘淑莹Ｈ‘ 长春１３００２２；２．中国科学院研究生院 北京１０００３９） 摘 要 二硫键是一种常见的蛋白质翻译后修饰，对稳定蛋白质的空间结构，保持及调节其生物活性有

着非常重要的作用。因此，确定二硫键在蛋白质中的位置是全面了解含二硫键蛋白化学结构的重要方面。在众多实验方法中，现代质谱技术因其操作简单、快速、灵敏等优点而成为分析二硫键的重要手段。本文介绍了目前主要的定位二硫键的方法以及质谱在二硫键定位分析中的应用与进展。 关键词 二硫键定位质谱串联质谱三羧乙基膦稳定同位素标记 中图分类号：０６５７．６３；Ｑ５１ 文献标识码：Ａ文章编号：１００５．２８１Ｘ（２００８）０６．０９７５—０９ ＰｒｏｔｅｉｎＤｉｓｕｌｆｉｄｅＢｏｎｄＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄＩｔｓＡｎａｌｙｓｉｓｂｙＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｑｉｕ Ｘｉａｏｙａｎｌ＇２ ＣｕｉＭｅｎ９１Ｌｉｕ劢ｉｑｉａｎ９１ＬｉｕＳｈｕ乒ｎ９１‘‘ （１．ＣｈａｎｇｃｈｕｎＣｅｎｔｅｒｏｆＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＣｈａｎｇｃｈｕｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｐｐｌｉｅｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２２，Ｃｈｉｎａ；２．ＧｒａｄｕａｔｅＳｃｈｏｏｌｏｆｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００３９，Ｃｈｉｎａ） ＡｂｓｔｒａｃｔＤｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄｓ

【CN110194950A】一种单粒子双发射比率荧光探针的制备方法及其应用【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910382734.3 (22)申请日 2019.05.09 (71)申请人 中国科学院合肥物质科学研究院 地址 230031 安徽省合肥市蜀山湖路350号 (72)发明人 蒋长龙　杨亮　王振洋　张淑东　 刘变化　 (74)专利代理机构 安徽省合肥新安专利代理有 限责任公司 34101 代理人 乔恒婷 (51)Int.Cl. C09K 11/02(2006.01) C09K 11/88(2006.01) B82Y 20/00(2011.01) B82Y 30/00(2011.01) G01N 21/64(2006.01) (54)发明名称 一种单粒子双发射比率荧光探针的制备方 法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种单粒子双发射比率荧光 探针的制备方法及其应用，其中单粒子双发射比 率荧光探针的制备方法是首先利用法制 备羧基化包埋红色CdTe量子点的氧化硅，然后表 面共价偶联氨基化的蓝色碳点，构建双发射比率 荧光探针。本发明比率荧光探针结合金纳米粒子 构建的荧光猝灭体系能用于荧光增强型检测农 药福美双，基于金纳米粒子与碳点之间荧光共振 能量转移使得蓝色荧光猝灭，红色荧光的氧化硅 做内标，加入福美双后，由于金纳米粒子与硫原 子强的键合作用导致其团聚，蓝色荧光恢复，实 现蓝色荧光关闭再打开的过程，从而实现对福美 双的检测。本方法灵敏度高，选择性好、抗干扰性 能力强，检测限低， 亦可用于实际样品的检测。权利要求书2页 说明书5页 附图3页CN 110194950 A 2019.09.03 C N 110194950 A

ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键

E L L M A N试剂法测定自由巯基和二硫键标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]

E L L M A N试剂测定自由巯基 试验基于的原理： 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。 DTNBTNB2- 根据文献记载，TNB的吸光系数在13.6*103M-cm-~14.25*103M-cm-之间[3,4]。吸光度测量的最灵敏范围在0.2-0.7之间。A=εbc，其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。以吸光度下限0.2来计算（吸光系数取14.15*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=0.2/（14.15*103LM-cm-*1cm）=1.4*10-5mol/L(1.4*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为 1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml. 我们的条件可以达到这个检测限度。 ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有： 1.EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系[5]。 2.在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm的 吸收也不 3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。另外，TNB的分光光度法分析对SDS 很敏感[6]。 4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。在pH7.0，其降解速度为 0.02%/h，在 5.pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在 pH12时，15min之内会完全降解[7,8]。 6.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4]. 试验方案 主要材料：

HPLC 柱后衍生方法测定10 种氨基甲酸酯类农药

HPLC柱后衍生方法测定10种氨基甲酸酯类农药 氨基甲酸酯类农药由于具有杀虫谱广，用量少、药效快等优点而得到广泛的应用。但是这类杀虫剂一旦进入人体内，可生成具有致癌作用的亚硝酸化合物，故而氨基甲酸酯类农药并不是绝对安全的。鉴于此，农业部于2008年制定了的新《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》（NY/T 761-2008）。其中氨基甲酸酯类农药的检测种类增加到10种。本文参考新标准，使用岛津快速色谱柱shim-pack XR-ODS （3.0mmI.D.×75mmL. 2.2 μm），建立了针对10种氨基甲酸酯类农药的检测方法，供相关检测人员参考。 ■实验部分检测原理 采用高效液相色谱柱后衍生方法测定氨基甲酸酯类农药。样品经ODS柱分离后，氨基甲酸酯类化合物与氢氧化钠发生水解反应生成甲胺。甲胺与邻苯二甲醛(OPA)和2-巯基丙酸(MEPA)反应生成一种异吲哚产物，可用荧光检测器定量。 试剂与仪器 标准品：准确称量单一标准品，使用甲醇配置成1000 mg/L的标准溶液。取一定量单标配置成10 mg/L混标母液，然后逐级稀释成不同浓度的混标。母液保存于-28℃。 试剂：甲醇，HPLC级；纯水，Milli-Q 超纯水仪制备得到；氢氧化钠，AR；硼酸，AR；2-巯基丙酸和邻苯二甲醛(OPA)，购自国药集团化学试剂有限公司；一级反应试剂：称取1.0g氢氧化钠，溶于500mL水中；二级衍生试剂：称取15mg邻苯二甲醛(OPA)，溶于50mL甲醇中，得到A液；称取3.34g硼酸和0.18g氢氧化钠，溶于400mL纯水中，得到B 液；将A液和B液混合，过滤，脱气后加入11μL 2-巯基丙酸，混合，使用当天配制。所有试剂和样品需用0.45μm以下滤膜过滤。 仪器：Shimadzu氨基甲酸酯柱后衍生系统。具体配置为：输液泵LC-20AD×2和LC-20AB，脱气机DGU-20A5，自动进样器SIL-20A，检测器RF-10A XL，柱温箱CTO-20A，化学反应箱CRB-6A，控制器CBM-20A，工作站LC-Solution。 色谱条件 色谱柱：Shimadzu Shim-pack XR-ODS 75mmL.×4.6mm I.D., 2.2μm；流动相：A相－水，B相－甲醇；流速：1.0mL/min；柱温：42℃；进样量：5μL；波长：Ex=330nm，Em=465nm；一级反应温度100℃，流速0.5mL/min；二级衍生温度50℃，流速0.5mL/min。梯度洗脱程序如表1所示： Time B Conc. 0.00 8 5.00 8 6.00 35 11.00 45 15.00 80 16.00 80 16.01 8 18.00 Stop 表1梯度洗脱程序