16SrRNA

关于细菌的16srRNA和16srDNA

分子生物学技术的应用使肠道微生态学的研究取得了突破性的发展。目前研究最多的是16S rRNA。

近几年来国外学者采用不同的分子生物学方法对细菌的16SrRNA进行研究，得到了广泛的细菌

16SrRNA序列库。使用该方法可以检测肠道中常规方法不能培养或生长缓慢的细菌。rRNA分子在生物体中普遍存在，生物细胞rRNA分子的一级结构中既具有保守的片段，又具有变化的碱基序列。在生物进化的漫长过程中,rRNA分子保持相对恒定的生物学功能和保守的碱基排列顺序,同时也存在着与进化过程相一致的突变率,在结构上可分为保守区

(conserveddomain)和可变区(variabledomain),保守的片段反应了生物物种间的亲缘关系，而高变片段则能表明物种间的差异，那些保守的或高变的特征性核苷酸序列则是不同分类级别生物（如科、属、种）鉴定的分子基础。研究rRNA基因序列可以发现各物种间的系统发生(phylogenesis)关系。细菌rRNA按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23SrRNA。

其中位于原核细胞核糖体小亚基上的16SrRNA长约1540bp,结构和碱基排列复杂度适中,较易于进行序列测定和分析比较。16SrDNA是细菌染色体上编码

16SrRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成[62]。因此可用PCR扩增其相应的rDNA片断，来快速、灵敏地检测样品中是否存在某些细菌或致病菌，或进行细菌多样性分析，尤其是那些人工无法培养的微生物。Woese(1980)在比较200多种原核生物和真核生物的16S(或18S)rRNA/rDNA的核苷酸序列谱后,定义建立了古细菌界(包括产甲烷菌、极端嗜盐菌和极端嗜热菌),将生物界重新划分为3主干6界系统,即古细菌、真细菌和真核生物3个主干,真核生物又包括原生动物、真菌、植物和动物4界。因为古细菌虽然细胞结构和真细菌相似,但在脂类和细胞壁分子结构上有较大差异,16SrRNA碱基序列分析结果也表明古细菌与真细菌之间的同源性差异不小于原核和真核生物之间的差异。现在人们已经认同16SrRNA/rDNA基因序列可用于评价生物的遗传多态性

(geneticdi-versity)和系统发生关系

（phylogeneticrelation-ship),在细菌分类学中可作为一个科学可靠的指标。在分类鉴定一些特殊环境下的微生物时,由于分离培养技术的限制,难以获得它们的纯培养进行生理生化学等指标的分析,这样

16SrRNA/rDNA序列分析的优越性就体现出来了。近来许多研究人员从环境微生态系统中直接分离提取出16SrRNA/rDNA并进行序列分析,研究了包括哺乳动物肠道、沼泽淤泥和反刍动物瘤胃等许多复杂系统的微生物组成情况,并发现了一些传统培养法研究未发现的新种类。

DGGE（Denaturing Gradient Get

Electrophoresis, DGGE）技术是由Fischer和Lerman于1979年最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术。它的分辨精度比琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳更高,可以检测到一个核苷酸水平的差异。1985年Muzyers等首次在DGGE中使用“GC夹板”和异源双链技术,使该技术日臻完善。为了避免建立基因文库的繁杂劳动,Muyzer等(1993)将遗传指纹技术(geneticfingerprinttech-niques)引进了微生物生态学研究中,在经过样品DNA分离和PCR扩增获得16SrDNA片段后,通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)直接获得

16SrDNA片段组成图谱(即遗传指纹),进而得到待研究体系的微生物组成信息。

细菌的16S rRNA的序列有10个保守区和9个高变区（V1-V9）之分，其中保守区为所有细菌共有，细菌间无差别，能反映生物物种的亲缘关系，可变区具有属或种的特异性，序列则随菌间的亲缘关系不同而有一定的差异，所以能揭示生物物种的特征核酸序列，被认为是最适于细菌系统发育和分类鉴定的指标，利用这一特性设计引物来进行物种鉴定。