可行性报告
可行性报告
一．项目提出的目的及意义
糖尿病是常见病，其中90%以上是2型糖尿病，而约有80%的2型糖尿病患者是肥胖或身体质量指数超重者。传统的内科治疗不但效果不理想，还易导致生活质量下降。胰腺移植和胰岛细胞移植因移植排异、免疫抑制剂的副作用及手术并发症等诸多因素制约了其临床应用及效果。胚胎干细胞和胰腺干细胞，又分别受到伦理学争论及取材不便的影响。而糖尿病患者实施减肥手术不但可以减轻患者体重，同时血糖水平也能得到有效控制。近年来，减肥手术治疗糖尿病的疗效得到广大医师和患者的认可，但其治疗糖尿病的机制目前尚不完全清楚。本课题旨在进一步研究减肥手术治疗糖尿病的分子生物学机制，希望为治疗糖尿病提供一些新的途径。
二．与项目相关的国内外发展概况及市场需求分析
减肥手术从原理上大致可以分为3类，即限制型手术、吸收不良型手术、联合型手术。限制型手术的常见术式为可调式胃束带术(adjustable gastric band- ing, AGB)；吸收不良型手术的常见术式为胆胰旁路-十二指肠转为术；联合型手术的常见术式为胃旁路手术(Roux-en-Y Gastric Bypass, GBP)。其中GBP的治愈率最高，可达83%～95%，是目前临床治疗肥胖及2型糖尿病的首选术式。
减肥手术可以达到治疗2型糖尿病的目的，但其机制仍没有完整、确切的阐述。一些学者提出2型糖尿病患者中糖尿病的缓解与手术后体质量减轻和进食减少有关。但这一观点并没有得到多数学者的认可，通过实验他们认为，在减肥手术后患者血糖和血清胰岛素水平恢复正常远远早于体质量减轻，与术后进食减少也没有必然的关系。通过以上研究可以看出，在减肥手术后，体质量下降和进食减少可能使糖尿病缓解，但却不是糖尿病缓解的最根本原因。
胃肠道是重要的内分泌器官，可以分泌多种胃肠道激素，部分学者认为胃肠道分泌激素改变对糖代谢的调节作用是减肥手术治疗糖尿病的重要机制之一，甚至有可能就是其最根本原因。由此出现了后肠道假说(hindgut hypothesis)、前肠道假说(foregut hypothesis)，统称为肠-胰岛轴学说。此外，还有炎性介质假说、异常信号机制假说和神经内分泌假说。
后肠道假说：食物快速接触末端回肠和结肠，营养物质刺激肠道内分泌激素的合成和(或)分泌增加，通过肠道-胰岛轴调控胰岛β细胞功能，增加胰岛素的合成和(或)释放，并可改善外周组织对胰岛素敏感性。目前已知的激素包括胰升糖素样肽-1(GLP-1)、抑胃肽或称葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)、多肽YY (PYY)、Ghrelin。其中研究较多的是GLP-1，它是一种重要的肠促胰岛素，主要由末端空肠、回肠及结肠的L细胞分泌，可诱导胰岛素的合成和释放、抑制β细胞的凋亡，还能抑制胰升糖素分泌、延迟胃排空、抑制食欲、改善胰岛素敏感性等多种生物学功能。GIP由十二指肠和空肠的K细胞分泌，其不仅可以促进胰岛素分泌、改善胰岛素敏感性，还可促进GLP-1的分泌。减肥手术后GLP-1和GIP水平变化与糖尿病缓解是否有相关性，虽有报道但结论不一。PYY、Ghrelin等其他胃肠道激素在减肥手术后糖尿病缓解中的作用更是鲜有报道，其机制尚待进一步阐明。
前肠道假说：手术使食物绕过十二指肠和近侧空肠，阻止未知的“抗肠促胰岛素因子”或“胰岛素抵抗因子”从前肠道释放。Rubino等经过实验得出结论近端小肠在血糖调节中可能起着重要作用，近端小肠可能存在某种尚未阐明机理的“抗肠促胰岛素因子”。但这一结论依然不能完全解释手术治疗的机理，仍然存在矛盾和争论。
2型糖尿病患者行减肥手术后血糖得到长期稳定的控制目前已经得到多数学者的认可，并且有临床病例的回顾性研究的支持。其机制现阶段多数学者支持肠-胰岛轴学说，但其具体作用机理还有待阐明。本课题将以此为出发点，深入探索和尝试。
三．主要攻关内容及技术路线
主要攻关内容：
①制作糖尿病大鼠模型
②糖尿病大鼠行GBP手术，术后监测血糖及体重变化同时测定GLP-1、GIP、
PYY、Ghrelin变化，与对照组大鼠进行比较，找到GBP术后糖尿病缓解
的影响因素，明确其作用机制。
③取糖尿病大鼠的血液及新鲜组织，研究GBP手术前后GLP-1、GIP、PYY、
Ghrelin基因的表达，旨在发现GBP手术后引发的基因变化位点，探讨
基因治疗的可行性。
④糖尿病大鼠分别注射GLP-1、GIP、PYY、Ghrelin，观察其血糖变化与GBP
手术前后血糖变化是否一致，是有具有治疗作用，能否用于临床内科治
疗糖尿病。
技术路线：
1．造模雄性Wistar大鼠适应性饲养1周，随机分为造模组及非造模组，。制作2型糖尿病大鼠的模型，非造模组饲喂普通饲料，正常饮食8周；造模组给予高糖高脂饮食，持续4周后按30mg/kg腹腔注射1％的STZ溶液(pH4.2 0.1 mmol／L的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液冰浴中新鲜配置)，1周后测血糖，挑选连续2次空腹血糖值≥7.8mmol/L大鼠作为造模组，继续高糖高脂喂养4周，然后测大鼠尾静脉血糖值>13.6mmol/L、稳定5 天为成功模型。
2．实验动物分组非造模组随机分为空白组(1组)和手术组(2组)，造模组随机分为造模组(3组)和造模+手术组(4组)。术前1组和2组、3组和4组之间体重、空腹血糖、平均进食量无显著性差异。
3．干预措施 2组和4组行GBP术。大鼠术前禁饮食12h，不限饮水，0.5％戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔内注射麻醉后固定于手术台上，无菌条件下上腹部正中切口长3cm切开进腹，闭合胃远端，距Treitz韧带10cm切断空肠，远端空肠与近端胃后壁吻合，距胃肠吻合口远端10cm行空肠端侧吻合，完成后均用庆大霉素2ml冲洗腹腔后关腹。
4．检测术前，术后48 h、1周、8周、12周测空腹血糖及胰岛素值，大鼠禁食过夜，尾静脉取血。Western blot 检测胰岛素、GLP-1、GIP、PYY、Ghrelim蛋白表达量，PCR检测对应基因表达水平。
5．疗效鉴定实验动物分组同与2相同，将手术组更改为用药组，分别注射GLP-1、GIP、PYY、Ghrelim，并测定用药前、用药后48 h、1周、8周的空腹血糖及胰岛素值。
四．现有工作基础和条件
课题组成员已经大量查阅相关文献资料，有深厚的理论基础。主要成员从事
相关细胞生物学、分子生物学和临床医学研究多年，先后主持和参加多项省市级科研项目，掌握了免疫组化、流式细胞技术，PCR等技术手段和相关各项指标的检测方法，为课题研究得处可靠的实验结果提供保证。
本课题将充分利用辽宁医学院与辽宁医学院附属第一医院的实验研究条件。附属一院外科实验室有组织细胞培养室、计算机数据处理及图像分析室、动物手术室、动物实验室、CO2恒温孵育箱、Olympas倒置显微镜、1/10000电子分析天平、真空冷冻干燥机、紫外分光光度计、-40℃低温冰箱等。生化检测部分及分子生物学相关实验在辽宁医学院中心实验室完成，中心实验室有PCR分析仪、电泳仪、投射及扫描电镜等。组织学检查在医院病理科完成，病理科有超薄切片机、-30℃恒冷低温切片机等。
五．申请人基础条件（包括主要研究成果）
六．进度安排和实施方案（包括运行机制）
2011年1月-2012年4月
①测定GLP-1、GIP、PYY、Ghrelin的变化，阐明GBP手术后激素变化缓
解糖尿病的作用机制。
②观察糖尿病大鼠GBP术后GLP-1、GIP、PYY、Ghrelin基因变化，找到
基因改变的位点。
2012年5月-2013年2月
对糖尿病大鼠进行GLP-1、GIP、PYY、Ghrelin注射，观察其疗效2013年3月-2013年12月
①收集整理实验资料
②结题，论文撰写
③总结报告
七．预期成果和考核目标
①阐明GBP手术缓解糖尿病的作用机制。
②为糖尿病基因治疗找到可行的靶点。
③为糖尿病内科治疗找到一条新的治疗途径。
本课题的完成可培养硕士研究生3-5名，发表论文4-7篇。八．经费预算及来源（万元）
经费来源：由省科技厅资助。