BIAcore技术及其应用

BIAcore技术及其应用

BIA(biomolecular interaction analysis)技术是基于一种称为表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)的物理光学现象发展起来的新型生物传感分析技术，自1990年正式出现后，有关该技术利用的研究便迅猛发展起来了。由于该技术的实时监测性、样品无需标记及快速自动化等突出优点，到目前为止全世界已有几百个实验室的工作涉及到它，应用领域也已从最初的单纯研究免疫中抗原抗体相互作用的动力学机制扩展到了细胞粘附、蛋白伴侣等许多新型领域。

1.BIA技术的基本原理

BIA技术的关键是利用了基于SPR现象发展的生物传感器作为检测系统。一般情况下，当入射光以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将产生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同。但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光可引起金属中自由电子的共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称作共振角(SPR Angle)。共振角会随金属薄膜表面通过的液相的折射率的改变而改变，且折射率的变化又与结合在金属表面的生物大分子质量成正比。因此，BIA技术可以通过对反应全过程中各种分子反射光的吸收获得初始数据，并经相关处理获得各动力学参数从而完成对分子间相互作用的研究。利用SPR进行检测分析的具体情形如图1所示。

图1SPR检测分析原理

2.BIA技术分析装置——BIAcore系统

现在利用BIA技术进行检测的主要装置是Pharmacia公司的产品——BIAcore系统。该系统的基本组成部分及工作原理如图2、3所示。

图2BIA装置

图3传感图

(1) 传感片(Sensor chip)

该部分是BIA系统的关键组成。它是实时BIA信号传导的载体。通常情况下，传感片为一片表面镀有金属薄膜的玻璃载片。而在金膜表面布满共价固定的亲水性集团以提供一个可与生物分子发生偶联的专一性结合表面。现在最常用的传感片为CM5(表面吸附有羧甲基葡聚糖)［1］。

(2) 微射流卡盘(Microfluidics)

BIA系统利用其作为液体传送系统，将极少量的样品及试剂输入流通池。由于系统有计算机自动控制，它可以保证实验的精确性及重复性。

(3) BIA操作的辅助软件

通常有用于分析传感图数据，计算反应动力学参数的BIA评鉴软件(BIA Evulation)及利用已知动力学参数模拟真实实验的BIA模拟软件(BIA Simulation)两种。

3BIA技术的应用

BIA技术尽管被广泛应用于生物学与医学的许多领域，但就其应用原理不外乎以下三种：动力学研究、生物分子结合位点研究、生物分子浓度测定。

3.1动力学研究

BIA技术最早的应用即是对免疫中单克隆抗原抗体相互作用的动力学研究［2］。Magulies等［3］利用BIA技术研究MHC、TCR与多肽抗原三者的相互作用。他们在测定了三者相互作用的亲和常数及动力学参数后提出一个相当有说服力的生物学模型：即T细胞的激活依赖于抗原递呈细胞表面大量的抗原多肽-MHC复合物对单个T细胞表面大量TCR的刺激。除用于免疫学的基础研究外，BIA技术由于能提供抗原-抗体间的反应动力学参数以大大提高筛选质量而被用于加快、优化免疫测定的开发。这也是目前BIA技术在免疫学方面的最大应用。

3.2生物分子结合位点的研究

利用BIA技术进行结合位点的分析为生物大分子相互作用关系的研究提供了一个强有力的工具。由于它可获取靶分子的拓扑结构信息及结构变换与功能的关系，从而被广泛用于蛋白质之间、DNA之间及蛋白质-DNA间的结合分析。(尤其是蛋白质-DNA间作用的研究已成为研究基因表达调控的关键所在)。

在研究蛋白质间的相互作用中，对蛋白伴侣(Chaperones)的研究一直是热点之一。在几乎同一时期，Plunkhum［4］领导的研究小组与以Hartl［5］为首的实验组分别利用BIA技术开展对细菌中两种已知蛋白伴侣GroEL和GroES的研究。前者主要研究内酰胺酶的各种构型与GroEL结合的作用；后者则利用BIA 技术验证了其先前提出的蛋白伴侣工作机理模型。他们的做法都是将GrolEL偶联于BIA装置的传感片上，不同的是在传感片表面流过的样品不一样。Hartl等是使GroES与ATP一起流过传感片表面，从传感图上可以观测到GroES与GroEL 的结合过程及ATP的存在促使GroES从GroEL上解离，且可算出ATP存在下的解离常数，从而显示该Kd值(动态常数)与ATP被GroEL水解时的Kd值完全一致。该结论的正确性已得到其它相关实验结果进一步证明。

在分子生物学领域，BIA技术在DNA-蛋白质相互作用研究中的突出优点使其取代了以往用放射同位素标记法进行的基因表达调控方面研究。Stockley等［6］利用BIAcore系统对MetJ (SAM甲硫氨酸抑制子)与DNA操纵子的亲和作用进行研究。他们采用了一系列的SAM类似物(改变SAM中S原子与DNA中的距离)以替代SAM，得出了诱导亲和常数的阶梯性(hierarchy)，从而证明了晶体学研究提出的SAM中S原子与DNA中间的势能为基因开关这一理论。此外，在基因表达方面，BIA技术还被广泛用于对转录激活的研究［8、9］。

3.3生物分子的浓度测定

该方向的研究是BIA技术有异于前两者的新型应用。用SPR检测器所得的信息可直接来自表面的样品，也可间接来自能与样品特异结合的相关试剂。且该相关试剂一方面可以放大样品信号，另一方面还可以从粗制样品的嘈杂信号中获得微量待测样品的特异性信号。Ronnberg等曾做过一个实验：以β2μ特异性单克隆抗体作为相关试剂，再利用BIA技术对一组浓度范围为9～1040ng/ml的24个人血清样品浓度进行测定，结果与放射免疫分析(RIA)所得的结果几乎完全吻合(达到0.99以上)。但BIA无需任何同位素标记。

在过去的几年里，BIA技术的应用领域进一步拓广到许多新型领域，如信号传递，细胞粘附、基因治疗、神经科学等等。其中尤其值得一提的是利用BIA

技术进行信号传递的研究报告更是层出不穷。如Ladbary等［10］利用BIA技术对SH2(src同源域2)的研究，Rickle［11］及其同事对SH3的研究，还有大量有关神经信号传递的研究［12、13］。总之，BIA技术对复合物信息获取的特异性

导致其在多种领域的广泛应用，并随着人工智能、精密仪器及相关试剂的日新月异发展，必将成为生物学、医学等诸多领域的强有力分析手段

L、利用BIAcore通过表面胞质基因共振光谱学分析相互作用的蛋白质

RAMc通过伯氨基与CM-5传感芯片表面的结合

1．将CM-5传感芯片模块嵌入BIAcore仪器。

2．全部采用过滤并除气的HEPES缓冲盐溶液。

3．将分别含有NHS、EDC、乙醇胺和RAM Fc以及20 mmol/L HCl各100μl 的小管置于BIAcore自动进样器架的适当位置。

4．将一个空管置于BIAcore自动进样器架上。

5．开动仪器，以5μl/min的流速流过一个流动池。

6．将75μl的NHS加入到一个空管中。

7．在同一个管中再加入75μl的EDC。

8．将含有NHS和EDC的小管中的成分混匀。

9．注射35μl NHS/EDC混合物使表面活化。

10．注射35μlRAM Fc到活化表面与抗体结合。

11．注射35μl乙醇胺使过量的反应基团失活。

12．快速注射10μl的20 mmol/L HCL，然后用Extraclean除去非共价结合型材料。

13．通过在开始注射RAMc前放置一个基线报道点，并在注射20 mmol/L HCl 结束后2 min放置第二个报道点，来测定结合RAMc水平。

14．关闭流动液，关闭命令窗口，保存报道文件。

检测抗-TSH与RAMc表面的结合

15．开动仪器，使含有结合RAMc的流动池流速为10μl/min。

16．注射10μl的2μg/ml抗-TSH。

17．快速注射10μl的20mmol/L HCl，然后用Extraclean再生RAMc表面。

18．为了测定结合到RAMc表面的重现性，用可以与抗TSH结合引起250 Rus 所需的体积重复注射抗TSH。

19．快速注射10μl的20 mmol/L HCl，然后用Extraclean再生RAMc表面。

20．关闭流动液体，关闭命令窗口，保存报道文件。

检测TSH与捕获抗-TSH表面的结合

21．开动仪器，使含有结合RAMc的流动池的流速为10μl/min。

22．注射10μl的2μg/ml抗-TSH。

23．注射25μl的200 nmol/L TSH，限定120 s的解离时间。

24．快速注射10μl的20 mmol/L HCl，然后用Extraclean再生RAMc表面。

25．关闭流动流，关闭命令窗口，保存报道文件。

表面等离子体共振 (SPR) 是一种物理光学现象。表面等离子体共振检测是一种利用表面等离子体波（ SPW ， Surface Plasma Wave ）进行检测的技术，他具有无须标记、高速化、专一性、灵敏度高以及大量平行筛选等优点。表面等离子体 (SP) 是沿着金属和电介质间界面传播的电磁波形成的。当平行表面的偏振光以称之为表面等离子体共振角入射在界面上 , 发生衰减全反射时 , 入射光

被耦合入表面等离子体内 , 光能大量被吸收 , 在这个角度上由于表面等离子

体共振引起界面反射光显著减少。由于 SPR 对金属表面电介质的折射率非常敏感 , 不同电介质其表面等离子体共振角不同。同种电介质 , 其附在金属表面的量不同 , 则 SPR 的响应强度不同。基于这种原理的生物传感器通常将一种具特异识别属性的分子即配体固定于金属膜表面 , 监控溶液中的被分析物与该配体的结合过程。在复合物形成或解离过程中 , 金属膜表面溶液的折射率发生变化 , 随即被 SPR 生物传感器检测出来等等。

BIACORE适用范围：

1. 检测蛋白质相互作用的特异性

2. 动力学：作用的速度

3. 亲和力：作用的强度

4. 浓度的测定

5. 复杂样品中的多重反应

BIACORE检测类型：

1. 蛋白质相互作用

2. 小分子化合物的作用如药物

3. 膜蛋白的作用

4. 核酸

5. 细胞和病毒

6. 碳水化合物

操作流程

值

可以下

载相应的溶液以及程序

2. Immobilization：将配体与芯片藕联

可以下

载相应的藕联程序

3. Regeneration：选择合适的表面再生溶液

可以下

载相应的溶液以及程序

4. Interaction：分析物与配体的相互作用

5. Analysis：数据分析处理，得出合理的结论

BIACORE3000生物分子相互作用分析仪

BIA是基于表面等离子体共振（SPR）技术来实时跟踪生物分子间的相互作用，而不用任何标记物的技术。表面等离子体子共振( surface plasmon resonance , SPR) 是一种物理光学现象。在发生全反射的界面涂上一薄层金膜（或其它金属膜）约50nm厚，由于金膜中有自由电子，它们并不是静止不动而是不停在平衡位置附近振动，并具有一定的频率。当光由另一侧以大于临界角入射有金膜的界面，由于入射光会在界面方向有一分量，当这一分量与金膜中电子振荡频率相同时，两种能量会发生整合，使在某个角度上发射光能量降低，这个能量降低的角度成为SPR角。当紧靠在金属薄膜表面的介质折射率不同时, SPR角的位置将不同，根据SPR角的变化可以推断所发生的变化。

BIA是英语“Biomolecular Interaction Analysis” 的缩写，BIA提供了实时观察生物分子间相互作用的技术。通过它能观察两种分子结合的特异性，能知道两种分子的结合有多强，还能了解生物分子的结合过程共有多少个协同者和参与者。BIA可以让得到用其他技术方法难以得到的结果，因为它可以实时反映分子结合过程中每一秒变化的情况。无需借助标记物进行分析使BIA广泛应用于各类生物体系的测定，从各类小分子化合物、多肽、蛋白质、寡核苷酸和寡聚糖直至类脂、噬菌体、病毒和细胞。BIA就是利用金属薄膜表面的折射率的改变，引起共振角的变化，来推断金属薄膜表面的变化。实验时先将一种生物分子固定在传感器芯片表面，将与之相互作用的分子溶于溶液流过芯片表面。检测器能跟踪检测溶液中的分子与芯片表面分子的结合、解离整个过程的变化。

BIA技术应用的领域主要有四个方面：

1、动力学常数的测定

2、测定样品浓度

3、分析相互作用模式

4、复合物功能分析

一、动力学常数的测定通过实时监测结合在芯片表面分子质量的变化，可以得到两个分子之间的结合与解离常数。由于检测的是芯片表面质量的变化，所以大分子的分析物相互较容易得到较强的信号，但是对于小分子的分析物可以通过优化实验设计而进行检测。BIA可以用来分析不同抗体与抗原的结合与解离常数，相对与以前其它检测抗体效价的方法，BIA不仅快速，可以准确定量，和可以让你看到整个结合和解离的动态过程。二、浓度的测量如果简单地测量一个纯物质的浓度，有很多方法可以选择。但是如果想知道，某种复合物中其中一个组分的浓度，则很难实现。用BIA技术可以很轻松做到这一点。先将待测物的抗体耦联到芯片表面，再将一系列不同浓度的标样流过芯片，得到一条标准曲线，此时将混合物流过芯片，根据信号强度大小就可以得到原混合物中某组分的浓度。如果待测物很小，可以采取竞争的方法实现。三、分子相互作用模式的研究我们想知道两分子之间相互作用的比例，结合位点，抗原决定族的位点，都可以用BIA 来完成。研究突变后活力大小的变化，研究复合物形成次序等等。四、蛋白质功能分析复合物的组装可以看成研究蛋白功能的一个例子。也可以设计其它的一些实验，只要前后芯片表面的质量有变化就可以利用BIA技术来检测。

四、实验步骤

1、preconcentration （预结合试验）由于芯片表面带有负电，因此要偶联到芯片上的分子必须带上正电，才有利于分子吸附到芯片表面，以利于共价偶联反应的完成。预结合实验就是将样品溶解在不同PH值的缓冲液中，使其带上不同量的电荷。然后，将样品流过芯片表面，观察它与芯片的结合曲线，就可判断出合适的条件。如下图：两种不同条件下的吸附实验，第一个峰表明在该条件下，吸附很快达到饱和，这样吸附的量有限，第二种一直呈上升趋势，有利于在芯片上偶联较多的蛋白。实际工作中，还会碰到各种不同的吸附曲线，需要根据实际情况来判断最佳条件。将抗体用不同PH值的buffer稀释10－40倍，以5μl/m

的流速流过芯片表面，观察抗体与芯片的吸附结果。

2、偶联

a)取100μlNHS和100微升EDC混合，12000rpm离心5分钟；

b)取一定体积的偶联蛋白，按预结合的比例稀释，稀释后需要150μl，取100μl ethanolamine HCL。以上试剂平衡到室温25摄氏度左右，高速离心五分钟；

c)将上述三种试剂放在样品架上，设定加样流速为10μl/min ，inject方式进样，NHS/EDC,样品，ethanolamine-HCl分别上样100，100，和60μl。

d)结束即可得到类似下图的曲线。

3、结合

将抗原用合适的缓冲液稀释成适当浓度，离心后上样，观察抗原抗体结合过程。如果需要测量不同条件下的结合状况，可以在一次进样结束之后，对芯片进行再生。然后再上下一个样品。

4、芯片再生

抗原抗体结合的再生条件比较简单，简单地用PH2.5的10mMglycine冲洗就可以了。但实际工作中，如果偶联的是蛋白，往往情况要复杂得多。首先,再生条件要能将结合物从芯片上去掉，其次不能让结合在芯片上的蛋白变性失活。因为，万一所选条件使芯片上偶联的蛋白失活，这个通道就意味着报废。所以，芯片的再生是所有用户面临的一个比较头疼的问题。芯片再生要求再生之后，不仅要求基线要能回复到初始值，还要求再上相同的样品，结合能力不会出现明显下降。

5、如果需要得到结合与解离的动力学常数，至少需要进行五组不同浓度的结合实验。

6、分析实验结果，打印实验报告。

7、仪器维护，实验完毕，running buffer换成过滤并脱气的超纯水或HES－EP

缓冲液。芯片更换为维护芯片，进行至少两遍prime后，运行standby。收拾整理实验场所。