酶学分析方法及酶活性测定复习与练习

酶学分析方法及酶活性测定复习与练习

复习和练习1。酶的基本理论知识

1。酶浓度和酶反应速度之间有什么关系？

2、底物浓度和酶促反应速率之间的定量关系是什么？3.影响酶促反应速度的主要因素是什么？

4、Km和Vm的意义及其在临床酶活性测定中的应用和意义二、酶活测定的基本知识

1，酶活的概念以及如何表达酶活的单位

2，目前酶活的单位有-？3.解释酶活性的国际单位和卡达尔的概念，并比较它们之间的关系？4.酶活单位的计算:几种类型的计算公式需要理解和熟练的应用。1)通用公式

2)常用单位的计算公式(确定产品生成类别的计算公式；用于确定底物消耗的计算公式)3)**连续监测方法根据摩尔吸收率计算酶活性浓度；

**连续监测法(全自动生化仪通常用k表示)f因子值的计算及应用？

三、酶活的测定方法

1，酶活测定的基本原则是什么？

2，酶反应时间过程曲线有三个周期-，-，-

酶活性测定是在-周期内，这个周期的反应速度不受-连续监测法的影响-

4分为-直接法有哪些类型？

5，什么是酶偶联反应？写下酶偶联反应的基本模式？要测试的酶是

什么，辅助酶和指示酶？6.什么是工具酶？当酶在临床生化试验中用作工具时，哪两种指标系统通常可用于酶活性测定或代谢物浓度(底物)测定？什么是-Trinder反应？Trinder反应的主要缺点或影响因素是什么？

7，什么是同工酶？同工酶分析的共同原则是什么？同工酶检测的临床意义是什么？举个例子？

8，酶活性的测定条件和影响因素是什么？

9，从几种酶活性测定(如AMY、ALT、LD、ALP|)的实验操作，讨论了酶活性测定中应注意的问题。

10。影响血清酶的生理变化是什么？

11、酶活性测定、样品采集、处理、储存和样品试剂的比例有什么要求？四.体液酶的测定:

1。临床诊断中常用的血浆酶是什么？用于帮助诊断心肌损伤、肝病、胰腺疾病、骨骼肌、前列腺疾病等的常用血清酶是什么？常用的临床诊断酶谱是什么？2.分析和总结测定血清酶活性的方法学原理，并请总结有哪些主要反应基础3.写出AMS和ALP(化学比色法，连续监测法)和ALT、AST、GGT、LDH和CK酶测定法(连续监测法)的反应原理、主要试剂成分和功能？影响结果准确性的因素有哪些？评价低密度脂蛋白反应和

低密度脂蛋白反应试剂盒的优缺点？

4、血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、GGT、AMS、CK、LD等酶测定的临床意义？

5，选择题:

A 1，K m指

A底物浓度b酶浓度c活化剂浓度

D温度e抑制剂浓度

D 2。根据1976年国际生化学会生化委员会的规定，酶的国际单位是指酶量b的最佳条件，它在

A的最佳条件下催化每小时生产1摩尔/升的产物。在每分钟催化生成1摩尔/升产物的酶量C、每小时催化生成1摩尔/升产物的酶量

D、每分钟催化生成1摩尔底物的酶量

E 25℃等最佳条件下，每分钟催化1摩尔底物变化所需的酶量E 3，IFCC推荐方法测定AST的辅助酶为

aG6 pdbhkcpod dldhdeh

| 以NAD(P)或NAD(P)H为指示剂体系测定酶活性的主波长应设定为:a293 Nm B 340Nm C 405Nm D 380Nm E 500Nm

D5，基于NAD还原为NADH反应的生化分析。采用的波长和吸光度变化为:a，340 nm a降低b，405 nm a升高c，500 nm a降低d，340 nm a升高

e，405 nm a降低

A 6，淀粉酶测定值的显著升高主要见于

A、溃疡穿孔b、急性胰腺炎c、甲状腺功能亢进d、糖尿病e、肾病

综合征

C 7、正常成人血清中乳酸脱氢酶同工酶电泳带的结果应与

LD1 > LD2 > LD3 > LD4 > LD5B ld1ld 5d LD3 > LD1 > LD2 > LD4 > LD5E LD4 > LD1 > LD2 > LD3 > LD5

b8一致，IFCC推荐的测定缓冲液

的方法乙二胺四乙酸三甘氨酸二乙醇胺 C 9酶促反应最佳底物浓度的测定原则:

A1 Km B2 Km C10 ~ 20Km D100K E越大B 10越好，前列腺疾病最敏感的指标是:

a碱性磷酸酶B酸性磷酸酶D D D D Amy e ast

|在199C 11全自动生化分析仪测定酶活时，通常计算K值的主要原因是

A便于B准确，C无标准物质，测定

D 12和GPT时D酶校准品不准确。底物液体中α酮戊二酸的量比丙氨酸的量少近100倍的原因是，当

A阻止酶促反应时，丙酮酸产生的过量B确保酶具有足够的底物

C以防止底物中的酸碱度低于7.4 D。它减少了α酮戊二酸和2.4二硝基苯肼之间的显色反应。过量的E α酮戊二酸可激活酶

D 13的活性。在AST测定试剂(速率法)中，不含

A天冬氨酸B NADHα-酮戊二酸D丙氨酸E Tris缓冲液C 14，最后一个附加酶在酶联反应中被称为

A偶联酶B辅酶C指示剂酶D工具酶E同工酶

D 15，碱性磷酸酶测定(King法)其底物为

铁氰化钾B苯酚血清alt测定，干扰物用抛物线标准曲线表示是丙酮酸B 2.4-二硝基苯肼c谷氨酸d a-酮戊二酸e 2.4-二硝基苯腙B 17，alt测定(r-f)终止酶促反应是

a0.4 mol/l氢氧化钠2.4二硝基苯肼c a-酮戊二酸2.4二硝基苯腙d磷酸盐缓冲液e碳酸盐缓冲液

A 18，血清ALT测定(r-f法)，以下哪种情况会导致结果偏低:A用于使标准曲线恶化的丙酮酸钠

b样品严重溶血c对照管未发现混浊d水浴温度过高(高达50℃)，

e血清与基质混合后未及时放入37℃水浴中保温A 19，100单位酶量等于

a6iu d 278 iu b 27.8 iu e 1667 iu c 166.7 iu

e20，根据米氏方程，什么不符合[S]和Km的关系是

a当[S]> Km时，反应速度与底物浓度无关。当[s] E，丙氨酸+α酮戊二酸→丙氨酸+谷氨酸B天门冬氨酸+α酮戊二酸→草酸+谷氨酸

C肌酸+三磷酸腺苷→磷酸肌酸+二磷酸丙酮酸+NADH →乳酸+NAD E草酸+NADH →苹果酸+NAD B 21，AST催化反应D时，V = VM/2d 的测量单位是相同的

E CK催化反应

a磷酸二钠B铁氰化钾C4-AAPdp酚

e碱性试剂

B 24，碱性磷酸酶(金)测定氧化剂

C 25，显色剂

D 26，标准A 27\\底物

aalt B ALP cggt D am sec-MB a28，急性肝细胞损伤的最佳指标

299 C 29，肝占位性病变骨病

nad (p) h指示剂系统B POD指示剂系统C均有D均无C 42、葡萄糖测定C 43、甘油三酯测定B 44、胆固醇测定B 45、尿酸测定D 46、尿总磷测定

(ALT AST胆汁酸胆红素、肌酐等。A)平衡法B)速率法C)两者都没有A 47，葡萄糖的GOD-POD b48，肌酐的碱性苦味酸C 49，尿素的GLDH

A酶试剂B)离子选择电极C)两者都没有C 50，血清钠和钾的C 51，血清氯和钙的A 52，血清磷的测定

D 53，血清总蛋白和白蛋白的测定A 54，血清丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶的测定

ABCD 55，酶活性的测定采用酶偶联法分别是:

丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、CK丙氨酸氨基转移酶和乳酸脱氢酶ABCD 56，下列哪些因素影响酶活性的测定

A缓冲液的类型和离子强度B酸碱度C反应温度D活化剂浓度E

比色杯光程BC 57和酶反应指示剂的检测波长分别为

A NADH

B 4-硝基苯酚

C 5-氨基-2-硝基苯甲酸D磷钼酸E ABC

D 58，ALT测定，UA-BA的意义在于A消除了2.4-二硝基苯肼溶液的A值

B消除了α-酮戊二酸-2.4-二硝基苯腙C消除了血清色素的干扰

D消除了血中可能存在的酮酸的干扰BC 59，属于Trinder反应的色原是

A H2O2 B苯酚c 4-AAP d pod e cod acde 60。下面的陈述是正确的a。当[s] b。当[s]> >千米时，反应速度与酶浓度成正比。酶促反应是一级反应。在零级反应v = vman = k[e]

NADPH

..一级反应是用工具酶e测定各种代谢物浓度的方法基础。零级反应是测定酶ABCD 61活性或浓度的方法基础..在溶血过程中影响测定结果的血清酶有

A、CK

B、低密度脂蛋白胆固醇、丙氨酸氨基转移酶D、天冬氨酸氨基转移酶E、GGT ABE 62，碱性磷酸酶活性的升高可见于

A、多发性骨肿瘤

B、骨折C贫血D、甲状腺功能减退E、梗阻性黄疸AE 63、G6PD，可用于测定

A、葡萄糖

B、淀粉酶

C、乳酸脱氢酶

D、碱性磷酸酶

E、肌酸激酶ACDE 64，以下代谢物与酶试剂结合使用正确的是a，尿酸-尿酸酶-过氧化氢酶

B，葡萄糖-葡萄糖氧化酶-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶c，尿素-脲酶-谷氨酸脱氢酶

D，三酰甘油-脂蛋白脂酶-甘油激酶e，胆固醇-胆固醇氧化酶-过氧化物酶ABDE 65，下列酶活性测定描述是正确的:

A，可测量的产物产生量b，可测量的底物消耗量c，与底物浓度d 无关，最佳温度e，和最佳ph补充多选题:

A零级反应一级反应二级反应混合级反应

D 2不能确定。为保证酶动力学分析，最佳底物浓度为

a . 0 . 5km

b . 2km

c . 2 ~ 5km

d . 10 ~ 20km

e . 100km 3。用于测定谷丙转氨酶的连续监测方法的底物通常是对硝基酚磷酸钠C 4。测定下列哪种血清酶有助于确定ALP

a、急性胰腺炎

b、丙型肝炎、肠梗阻d、急性腮腺炎e、溃疡穿孔

其他运动的来源:

1、基于NAD+还原为NADH反应的生化分析，使用波长_ _ _ _ _ _ _ _ _ nm。吸光度变化为_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _。当S:R=1:20(酶速率法)确定时，结果计算为单位/升=△A/分×因子。因子为

_ _ _ _ _ _ _ _ _ _(在340纳米时NADH吸收系数为6.22)。2.在SGPT 测定中，DL丙氨酸的浓度要求为200毫摩尔/升，α-酮戊二酸的浓度要求为2毫摩尔/升。准备500±500毫升的基质时，每个人应该服用多少毫克？

(dl丙氨酸分子量= 89，α-酮戊二酸分子量= 146)

3，CK原理测定实验中的酶联催化序列_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

_4.SGPT测定的底物为_ _ _ _ _，显色剂为_ _ _ _ _，酶作用时间为_ _ _ _ _。

5年，AST催化_ _ _ _ _ _ _ _+_ _ _ _生成_ _ _ _ _ _ _ _、_ _ _ _ _在指示酶_ _ _ _ _ _的催化下，使_ _ _ _ _ _+_ _ _生成_ _ _ _ _ _+_ _ _，并在波长_ _ _ _ _ _ nm处连续监测吸光度_ _ _ _ _的变化，从而测定AST的活性。

6和0.1毫升血清在37℃水浴中水解生成0.2±0.2毫克苯酚。这个样本的AKP活动是什么？(列出计算公式并计算结果)

SOD酶活性测定方法

SOD酶活性测定 所需药品： （1）0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液： A液：0.1mol/l磷酸氢二钠液 B液：0.1mol/l磷酸二氢钠液 1毫升B+10.76毫升A （2）0.026mol/l蛋氨酸液（Met）：现用现配 称取0.3879克蛋氨酸，用1号液定容至100毫升。 （3）75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）液：现用现配 称取0.1533克NBT，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至250毫升。 （4）1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液 （5）0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液 （6）石英砂 实验步骤： 1.酶液制备：称取0.5克鲜叶，放入研钵中，加入3毫升5号液和少量石英砂，于冰浴中研成匀浆。然后用5号液定容至8毫升，于0～4℃、13000g时离心15分钟，上清液即为酶提取液。酶液可在低于0℃下的环境中保存。 2.按下表加入试剂： 试剂摇匀后，迅速遮光处理1号杯，其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟，然后立即遮光。接着在560nm下，以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%，然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。 M/N=100/X M——2、3号杯中溶液的光密度的平均值 N——其余杯中溶液的光密度值 X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率 然后以酶液量为横坐标，以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率（X）为纵坐标制作曲线，根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位。 结果计算：SOD活力按下式计算： A=V*1000*60/（B*W*T）

球孢白僵菌Bb174固态发酵产几丁质酶产酶及酶学特征研究

万方数据

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球孢白僵菌Bb174固态发酵产几丁质酶产酶及酶学特征研究 作者：张洁， 蔡敬民， 吴克， 金胜先， 潘仁瑞， 樊美珍 作者单位：张洁,蔡敬民,吴克,金胜先,潘仁瑞(合肥学院生物科学与技术系,合肥,23002)， 樊美珍(安徽农业大学虫生真菌研究所,合肥,230036) 刊名： 应用生态学报 英文刊名：CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY 年，卷(期)：2004,15(5) 被引用次数：6次 参考文献(19条) 1.Bradford MM Rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[外文期刊] 1976 2.Cai JM;Wu K;Zhang J Production,Properties and Application of Xylanase from Aspergillus Niger A3,Volume 864 1998 3.蔡荟梅;刘斌;蔡敬民Study on production conditions and properties of chitinase by Metarhizium anisopliae Ma83[期刊论文]-食品与发酵工业 2003(02) 4.陈三凤;李季伦The study about prospectand history on chittinase 1993(03) 5.Felse PA;Panda T Regulation and clonining of microbial chitinase gene[外文期刊] 1999(2) 6.Fumio N;Mariko I;Kycouke K Purification,thansglu cosylation reaction of β -N-acetylglucosaminidase from Nocardia orientalis 1990(04) 7.Izume M;Ohtakara A Preparation of D-glucoesmine oligosaccharides by the enzymatic hydrolysis of chitosan 1987 8.Jeunianx C Chitinase[外文期刊] 1966 9.Lowry DH Protein messurement with the folin phenol reagent 1951 https://www.wendangku.net/doc/b52285727.html,ler GL Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[外文期刊] 1959(03) 11.Ohtakara A;Mitsutomi M;Uchida YJ Purification and some properties of chitinase from ribrio species 1979(03) 12.Quakfaoui SEL;Potvin C;Brzesinski R A Streptomyces chitosanase is active in transgenic tobacco[外文期刊] 1995 13.彭仁旺;管考;黄秀梨Induction and purification of two extra cellular chitinases from Beauveria bassiana 1996(02) 14.邱立友;汪世山;余功德Screening of chitinase formingstrains and conditions for enzyme production [期刊论文]-微生物学通报 2000(04) 15.邱立友Microbe chitinase and its application topest control 1995(02) 16.夏国庆;马应伦;贾新成Production conditions of chitinase from Aspergillus sp.F-817 1996(04) 17.夏国庆;董志扬;苗雪霞Some properties of the chitinase from Aspergillus sp.F817 1997 18.徐同;柳良好Chitinases from Trichoderma spp.and their antagonism against phytopathogenic fungi 2002 19.郑爱萍;李平Advances of researches on bacterial chitinase[期刊论文]-中国生物工程杂志 2002(04)

实验 酶学性质研究

实验四酶学性质研究 一、实验目的 1、了解pH、温度、金属离子对酶的活性的影响机理； 2、掌握如何选择酶催化反应的最适pH、温度和获得最适pH条件的确定、以及Km常数的测定。 二、实验原理 酶促反应速度受介质pH的影响，一种酶在几种pH介质中测其活力，可看到在某一pH时酶促效率最高，这个pH称为该酶的最适pH。pH影响酶分子的活性部位的解离，另外，也影响底物的解离状态，从而影响酶活性中心的结合与底物或催化。其次，有关基团解离状态的改变影响酶的空间构象，甚至会使酶变性。酶的最适pH不是酶的特征性常数，如缓冲液的种类与浓度，底物浓度等均可改变酶作用的最适pH。 在一定温度范围内，酶促反应速率随温度的升高而加快；但当温度高到一定限度时，酶促反应速率不仅不再加快反而随着温度的升高而下降，最终，酶因高温变性失去活性，失去了催化能力。在一定条件下，每一种酶在某一温度时活力最大，这个温度称为这种酶的最适温度 在进行酶学研究时一般都要制作一条pH与酶活性的关系曲线，即保持其他条件恒定，在不同pH条件下测定酶促反应速度，以pH值为横坐标，反应速度为纵坐标作图。由此曲线，不仅可以了解反应速度随pH值变化的情况，而且可以求得酶的最适pH。最适温度的实验方法和pH类似。 酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数K m值等于酶促反应速度为最大速度一般时所对应的底物浓度，其值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特征常数。不同酶的K m值不同，同一种酶与不同的底物反应

时，其Km值也不同，Km值反映了酶和底物亲和力的强弱程度，Km值越大，表明酶和底物的亲和力越弱；Km值越小，表明酶与底物的亲和力越强。 酶的活力就是酶所催活的反应速度，通常用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。酶反应过程中产物的生成和时间的关系可以用进程曲线来说明，曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。从进程曲线来看，在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延长，反应速度逐渐降低，这是由多种因素造成的。所以，为了准确表示酶的反应速度必须采用初速度，即保持恒定时的速度。同样，不同酶浓度下的反应进程曲线也可以说明这个问题。V=Vmax[S]/Km+[S]，Vmax 指该酶促反应的最大速度，[S]为底物浓度，Km是米氏常数，V是在某一底物浓度时相应的反应速度。双倒数作图（将米氏方程两边取倒数，可转化为下列形式：1／V=Km／Vmax.1／[S]+1／Vmax，可知，1/V对1/[S]的作图得一直线，其斜率是Km/V，在纵轴上的截距为1/Vmax，横轴上的截距为-1/Km。此作图除用来求Km和Vmax值外，在研究酶的抑制作用方面还有重要价值 三、实验器材与试剂 1、试剂：磷酸二氢钠、柠檬酸、ABTS、酸性靛蓝。 2、器材：可见分光光度计、恒温水浴锅、试管、酸度计 四、操作步骤 1、配置缓冲溶液 按下表配置缓冲溶液，其溶液pH值以酸度计测定值为准。

实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质

实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020

实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、实验目的 1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。 2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。 二、实验原理 马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。 多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。 多酚氧化酶 邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2O 2——————→邻醌＋H 2 O

三、试验材料、试剂及试验用品 1．材料：马铃薯块茎。 2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶 3．试剂：L 磷酸缓冲液（pH=）；L邻苯二酚；L磷酸氢二钠；L磷酸二氢钠；10mmol/L 柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠 四、实验方法： 1.多酚氧化酶的提取 取马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。 2.多酚氧化酶活性测定 采用比色法测定。将ｍl邻苯二酚加入2ｍl磷酸缓冲液（ｐＨ）中，加入ｍl酶提取液，立即于波长410nm下测定吸光值，2min后再计吸光值，以不加酶提取液的反应液做对照(注意空白为： ml缓冲液和 mL邻苯二酚溶液)。以每分钟吸光度变化为1个多酚氧化酶活性单位。 表1 多酚氧化酶活性测定

土壤酶活性测定方法综合

土壤酶活性测定方法 1、土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（）：184g柠檬酸和氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（L）：苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和丙酮，用乙醇稀释至100ml （A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（ml）。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10% 尿素溶液和20ml PH 柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）。 标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml 氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作 与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验 试剂纯度和基质自身分解。

纤维素酶活力测定方法_张瑞萍

测试与标准 纤维素酶活力测定方法 张瑞萍 南通工学院(226007) 摘　要　用DN S 为显色剂,分别以滤纸和CM C 为底物,以滤纸糖酶活性(FP A )和羧甲基纤维素酶活性(CM C a se )表征纤维素酶活力。确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。结果表明,CM C a se 比FP A 高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CM C 酶活力关系密切。 叙　词:　测试　纤维素酶　活度中图分类号:　TS197 纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。我们选择滤纸、CM C 为底物,原理系利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力)和CM C ase (羧甲基纤维素酶酶活力)。本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。 1　实验方法 1.1　化学药品、材料 纤维素酶(工业品),DNS 试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CM C (试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。 1.2　FPA 滤纸酶活力和CMC 酶活力的测定 取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CM C 溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h ;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值。 酶活可定义为:每毫升酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位( )。 1.3　针织物酶减量率的测定 将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。减量率= 处理前织物干重-处理后织物干重 处理前织物干重 ×100% 2　结果与讨论 2.1　显色剂的选择 选用DNS ,在碱性条件下与还原糖反应,生成有色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。 碱性条件下DNS 与还原糖共热反应如下: O 2N OH O 2N CO OH +还原糖 　H 2N OH CO OH O 2N DN S(黄色) 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色) 生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。2.2　最大吸收波长的确定 选取490～580nm 波长对显色液进行比色。由图1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490～500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收。为了排除DNS 的干扰,选择在波长 530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。 图1　D NS 与葡萄糖的吸收曲线 2.3　底物及酶本身含糖量的影响 在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色。而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物。2.4　葡萄糖标准曲线 用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值(见图2)。标准曲线的线性相关系数R 2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。 38 印　染(2002No .8) www .cdfn .com .cn

碱性蛋白酶的分离纯化及其酶学特性的研究

碱性蛋白酶的分离纯化及其酶学特性的研究碱性蛋白酶(alkaline protease)是一类最适pH为碱性的蛋白酶,是一种非常重要的水解酶类,在医药、饲料、食品等领域中都有广泛应用。本论文以Cellulomonas bogoriensis sp.nov为出发菌株,对其产酶条件、碱性蛋白酶的分离纯化及酶学性质等方面进行了研究,并得到以下结论:利用单因素法和响应面Box-Behnken组合设计方法对菌株产碱性蛋白酶的发酵条件进行了优化,得出菌株最佳产酶条件为:培养温度30℃,培养基初始pH 10.5,装液量75/250 mL,1.5%(w/v)蔗糖为碳源、1.5%(w/v)的牛肉膏酵母浸粉(1:1)为混合氮源、NaCl 含量为2.67%(w/v),培养时间120 h。 经硫酸铵分级沉淀和CM Sepharose Fast Flow柱层析纯化得到一个相对分子质量约为18.3 kDa的碱性蛋白酶,纯化倍数为10.83,回收率为25.79%。酶的最适反应温度70℃,最适pH为11.0。 在4-60℃、pH3.0-12.0范围内酶活力稳定;1 mM的Mg2+、Fe2+会增加蛋白酶活力;而1 mM的Ba2+、Mn2+、Ca2+对蛋白酶活力几乎没有影响,但在10mM时会明显抑制蛋白酶的活力。EDTA浓度为10m M时,碱性蛋白酶的酶活力仍能达到77%。 抑制剂PMSF,TPCK对酶有强烈的抑制作用,表明该酶属于丝氨酸蛋白酶家族中的胰凝乳蛋白酶。酶对甲醇、乙醇、甘油等有机溶剂具有较强的耐受能 力,Triton X-100强烈抑制酶活力。 该蛋白酶最佳作用底物为酪蛋白,可以水解血红蛋白和牛血清白蛋白,不能水解明胶和胶原蛋白,米氏常数Km为19.2μg/mL,Vmax为2000μg/min。该蛋白酶与市售的洗涤剂均有良好的相容性,具有良好的脱毛效果、处理血污的能力和

酶活性测定方法

酶活性测定 1、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase) 试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠） 0.2mol/L 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液(pH: 9.6)——buffer 0.2mol/L NaOH 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min； (3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应； (4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。 计算： 每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。 [(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.704 (Eu) 2、酸性磷酸酶(Acid phosphatase) 试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠） 0.2mol/L HAc/Ac缓冲溶液(pH: 4.8)——buffer 0.2mol/L NaOH 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min； (3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应； (4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。 计算： 每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。 [(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.719 (Eu) 3、a-葡萄糖甘酶(a-glucosidase) 试剂：0.1% p-nitrophenyl a-D glucopyranoside（p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷） 0.2mol/L Tris-HCl (pH: 7.6) 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷及Tris-HCl 37°C 孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL 0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷+2mL Tris-HCl 37°C孵化

酶活性测定方法

一、过氧化物酶（POD）活性的测定 POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。 测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。 △470 ×V T POD活性= 0.01×t×Vs×W 式中：△470----反应时间内吸光度值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g） 二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定 多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。 酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。 PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。 PPO活性= O D×V T 0.01×t×0.5g×V s = O D×V T 0.005 OD——反应时间内吸光值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） T———反应时间(min)；

实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质

实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质 一、实验目的 1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。 2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。 二、实验原理 马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。 多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。 多酚氧化酶 邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2O 2——————→邻醌＋H 2 O

三、试验材料、试剂及试验用品 1．材料：马铃薯块茎。 2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶 3．试剂：L 磷酸缓冲液（pH=）；L邻苯二酚；L磷酸氢二钠；L磷酸二氢钠；10mmol/L柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠 四、实验方法： 1.多酚氧化酶的提取 取马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。 2.多酚氧化酶活性测定 采用比色法测定。将ｍl邻苯二酚加入2ｍl磷酸缓冲液（ｐＨ）中，加入ｍl酶提取液，立即于波长410nm下测定吸光值，2min后再计吸光值，以不加酶提取液的反应液做对照(注意空白为： ml缓冲液和 mL邻苯二酚溶液)。以每分钟吸光度变化为1个多酚氧化酶活性单位。 表1 多酚氧化酶活性测定

三种主要酶活测定方法

土壤纤维素酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法）一、原理 纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1）甲苯 2）1%羧甲基纤维素溶液：1g 羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。 3）pH5.5醋酸盐缓冲液： 0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L. 0.2mol/L 醋酸钠溶液 16.4g C2H3O2Na或27.22g C2H3O2Na.3H2O溶至1L. 取11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和88ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液混匀即成PH 5.5醋酸盐缓冲液. 4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml 2mol/LNaOH和125ml水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天）， 5）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 三、操作步骤 葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。 称10g土壤置于50ml三角瓶中，加入1.5ml甲苯，摇匀后放置15min，再加5ml 1%羧甲基纤维素溶液和5ml pH5.5醋酸盐缓冲液，将三角瓶放在37℃恒温箱中培养72h。培养结束后，过滤并取1ml滤液，然后按绘制标准曲线显色法比色测定。（为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。） 四、结果计算 纤维素酶活性以72h，1g干土生成葡萄糖毫克数表示。 纤维素酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×n／m a样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数；n为分取倍数；m 表示烘干土重

溶菌酶的应用及其酶学性质的研究

《高级微生物学》——文献综述2015级生物学专业黄君15107100002029 溶菌酶的应用及其酶学性质的研究 黄君 （大连工业大学生物工程学院辽宁大连116034） 摘要：本文旨在对溶菌酶的发展及应用并对纯化的溶菌酶的酶学性质研究,研究表明,该酶相对分子质量约为16 000,对溶壁微球菌的最适作用温度为35℃,最适作用pH 6.5,在45℃以下和pH 4.0-8.0都有较好的稳定性,并与常见金属离子和化学试剂有良好的配伍性?与通常从蛋清中提取的溶菌酶相比较,从海参中分离纯化的溶菌酶具有广谱杀菌功能,即对常见的革兰氏阴性菌和阳性菌细胞壁均有溶解作用? 关键词：发展及应用；溶菌酶; 酶学性质 The application of lysozyme and enzymology properties research (Biological Engineering, Dalian University of Technology, Dalian 116034) Abstract: This paper aimed to the development and application of lysozyme and the purification of lysozyme enzymology properties，The results showed that its molecular weight was estimated as approximately 16 000.The optimal pH and temperature against Micrococcus lysodleikticus were pH6.5and35℃,respectively.And the enzyme was stable at temperature below 45℃and pH 4.0-8.0.The purified lysozyme showed broad-spectrum against many bacteria,not only inhibiting the growth of Gram-positive bacteria,but also Gram-negative bacteria as well as a number of pathogens. Key words:Development and application;cloud point extraction;purification

植物五种酶活性检测方法

植物五种酶活性检测方 法 The document was finally revised on 2021

选择茶树不同品种，每个茶枝接种5头叶蝉，按不同的时间点 (0h/6h/12h/18h/24h/36h/48h/72h/96h)取样，每个样品重复三次，测定 PPO/POD/PAL/CAT/LOX 五种酶活。 1、多酚化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定 适量茶鲜叶（3g）,料液比1:2，加入内含5%PVP（w/v）经遇冷的pH为的柠檬酸-磷酸盐缓冲液（L）,冰浴研磨，隔夜浸提12h，于4℃、9000r/min离心35min，取上清液，过滤得到初酶液。 取200ml初酶液，加入L柠檬酸-磷酸盐缓冲液200uL,混合反应液（L柠檬酸-磷酸盐缓冲液：脯氨酸：1%邻苯二酚=10:2:3），反应30min（37℃恒温水浴锅），6mol尿素终止反应，460nm波长测吸光度。对照为不加邻苯二酚的反应混合液。 酶活性单位：本实验条件下，以邻苯二酚反应液在460nm处吸光度值每分钟增加为一个活性单位。 2、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）活性的测定 称取新鲜样品于预冷研钵中，加入6ml L（）硼酸钠-硼酸缓冲液，加入适量的石英砂，冰浴研磨后转入离心管中。混匀后在4℃冰箱中浸提4h。4℃10000r/min离心 20min，取上清液即为酶提取液。 取酶提取液，加入由硼酸钠缓冲液配制的L L-苯丙氨酸，蒸馏水，摇匀，在40℃水浴上反应30min，冰浴中终止反应，测定OD290值，以相同体积缓冲液代替酶液进行同样的反应为对照。PAL的酶活性以每小时在290nm处吸光度变化为一个活力单位。 3、脂氧合酶(linoleate:oxygen oxidoreductase，LOX)活性的测定 取新鲜样品，加7ml经4℃预冷的1mol/L（）的tris-HCL缓冲液冰浴上研磨。4℃、12000r/min离心25min,上层清液即为LOX酶提取液。

蛋白酶活力测定方法

酸性蛋白酶产品概述: 蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。 蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。工作机理 蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。 酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。（酸性蛋白酶537容易失活） 简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，

它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。 1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g 液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml. 2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml） 特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5 使用方法 1、白酒工业： 本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。 2、食品工业： 食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量 3、啤酒生产： 能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。 4 饲料添加剂：提高饲料利用率。 5、毛皮软化： 提高上色率，手感丰满，增加毛皮光泽。 推荐实验的初始添加量从醪液的百万分之一开始。推荐使用：先

淀粉酶活力的测定方法要点

淀粉酶活力的测定方法 淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。植物中最重要的淀粉酶是α -淀粉酶和β-淀粉酶。 α -淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α -1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α-极限糊精和少量葡萄糖。Ca 2+能使α-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH 3.6 以下可使其钝化。 β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α -1,6键时停止。单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要 Ca 2+ 及 Cl —等辅助因子，最适pH偏酸，与α -淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，60 ℃保温15min可使其钝化。 通常提取液中α -淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。可以先测定（α + β）淀粉酶总活力，然后在60 ℃加热 15 min ，钝化β-淀粉酶，测出α -淀粉酶活力，用总活力减去α - 淀粉酶活力，就可求出β- 淀粉酶活力。 淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的 3,5- 二硝基水杨酸生成棕红色的 3- 氨基 -5- 硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。 1 酶活测定方法 （1）标准曲线的制作(见下表) ①取7支20 ml具塞刻度试管,预先洁净灭菌干燥,编号,按表加入试剂。②摇匀,至沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20 ml,以1号管作为空白调零点,在520 nm的波长下比色测定吸光度值。并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。 表1 标准麦芽糖溶液成分表及OD测定值 试剂 麦芽糖标准液（mL） H2O（mL） 3,5-二硝基水杨酸（mL）麦芽糖含量（mg） OD520 1 0 2.0 2.0 0 2 0.2 1.8 2.0 0.2 3 0.6 1. 4 2.0 0.6 4 1.0 1.0 2.0 1.0 5 1.4 0. 6 2.0 1.4 6 1.8 0.2 2.0 1.8

植物五种酶活性检测方法

选择茶树不同品种，每个茶枝接种5头叶蝉，按不同的时间点(0h/6h/12h/18h/24h/36h/48h/72h/96h)取样，每个样品重复三次，测定PPO/POD/PAL/CAT/LOX 五种酶活。 1、多酚化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定 适量茶鲜叶（3g）,料液比1:2，加入内含5%PVP（w/v）经遇冷的pH为7.2的柠檬酸-磷酸盐缓冲液（0.1mol/L）,冰浴研磨，隔夜浸提12h，于4℃、9000r/min 离心35min，取上清液，过滤得到初酶液。 取200ml初酶液，加入0.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH5.6)200uL,混合反应液1.2ml（0.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液：0.1脯氨酸：1%邻苯二酚=10:2:3），反应30min（37℃恒温水浴锅），6mol尿素1.2ml终止反应，460nm波长测吸光度。对照为不加邻苯二酚的反应混合液。 酶活性单位：本实验条件下，以邻苯二酚反应液在460nm处吸光度值每分钟增加0.01为一个活性单位。 2、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）活性的测定 称取新鲜样品0.5g于预冷研钵中，加入6ml 0.1mol/L（pH8.8）硼酸钠-硼酸缓冲液，加入适量的石英砂，冰浴研磨后转入离心管中。混匀后在4℃冰箱中浸提4h。4℃10000r/min离心20min，取上清液即为酶提取液。 取酶提取液0.2ml，加入由硼酸钠缓冲液配制的0.1mol/L L-苯丙氨酸，2.8ml 蒸馏水，摇匀，在40℃水浴上反应30min，冰浴中终止反应，测定OD290值，以相同体积缓冲液代替酶液进行同样的反应为对照。PAL的酶活性以每小时在290nm处吸光度变化0.01OD为一个活力单位。 3、脂氧合酶(linoleate:oxygen oxidoreductase，LOX)活性的测定 取0.2g新鲜样品，加7ml经4℃预冷的1mol/L（pH7.6）的tris-HCL缓冲液冰浴上研磨。4℃、12000r/min离心25min,上层清液即为LOX酶提取液。 以2.4ml0.1g/L亚油酸作为底物，加入0.1ml酶液在234nm处测定吸光值，每隔30s读数一次，共测5分钟。Lox酶活性单位以每分钟在234nm处吸光度变化0.01OD作为一个活力单位。 4、过氧化物酶（PDA）的活性测定（愈创木酚法） 取0.5克剪碎叶片于预冷研钵中，加入5ml的提取介质0.05mol/L PH7.8的

各种酶活性测定方法

抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定 过氧化氢酶（CAT）活性测定 过氧化物酶（POD）测定方法 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 小组第一次讨论结果： 一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定 1.原理 APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。 2.所用方法 （1）采用碘液滴定法: 称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。每个处理设3 个重复。 （2）紫外吸收法： 称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 20mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。 APX总活性(uM·g-1·min-1) = △OD×Vr/ (A×d×Vt×W×△t) △OD：反应时间内吸光度的变化；△t：反应时间，min； Vr：提取液体积，mL；A：消光系数，2.8mM-1﹒cm-1； d：比色杯厚度，1cm；Vt：测定液体积，mL； W：样品鲜重，g。 二、过氧化氢酶（CAT）活性测定