云南省建水县番茄上Tospovirus属病毒的初步鉴定
园艺学报2009,36(3):437-440
A c ta H orticu lt urae Si n ica
云南省建水县番茄上Tos povirus属病毒的初步鉴定
刘雅婷1,3,郑元仙1,李永忠2,李正跃3*
(1云南农业大学农学与生物技术学院,昆明650201;2云南农业大学烟草学院;昆明650201;3云南农业大学植保学院,昆明650201)
摘要:2005)2006年对云南省主要蔬菜种植区昆明、红河和楚雄等3个地区进行调查,获得9份疑似番茄斑萎病毒属(T o spoviru s)病毒的样本。通过该属病毒引物(T osp ov irus G roup P ri m er)进行RT-PCR 扩增,其中1份来自红河州建水县番茄上的样品获得约500bp核酸片段,通过NCBI BLA S T网络数据库比
对,确定为T ospovirus属的病毒;应用DNAM AN软件与已经公布的T osp ovirus属病毒L RNA序列比对分析,
从得到的相似性树状图可以看出,该样品与血清组?的T o s p ovirus属病毒聚为一簇。
关键词:番茄;番茄斑萎病毒属;血清组
中图分类号:S64112文献标识码:A文章编号:0513-353X(2009)03-0437-04
Preli m i nary Identification of Tospovirus on To mato i n Jianshui County of Yunnan Provi nce
LI U Ya-ti n g1,3,Z H ENG Yuan-x i a n1,LI Y ong-zhong2,and LI Zheng-yue3*
(1College of A gricult ural and B iotechnology,Yunnan Agr icultural Universit y,K unm ing650201,China;2College of T obacco Science,Yunnan A gricult ural University,K unm ing650201,China;3Colle ge of P lant P rotection,Yunnan A gricult ural Un i vers it y,K unm i ng650201,Ch i na)
Abst ract:N i n e sa m ples possi b ly fro m genus Tos povirus w ere co llected fro m m ajor vegetab le-gro w i n g fie l d i n Yunnan prov i n ce,i n clud i n g H onghe,Chux iong and Kun m i n g,dur i n g2005)2006peri o d.A round500bp fragm ents w ere obta i n ed after RT-PCR w ere executed on9sa m ples using Tos p ovirus G roup Pri m er.The sequence results o f around500bp fragm ents w ere co m pared i n t h e NCB I BLAST w ebsite,one sa m p le fro m to m ato in H onghe County of Yuannan Province w as iden tified as Tos p ovirus genus.A phy logenetic tree w as constructed using DNAMAN soft w are acco r d i n g to t h e sequence o f t h e sa m p le and the ir co rrespond i n g pub lic L RNA frag m ent sequences of Tos p ovirus.The results indicated t h at th is sa mp le obta i n ed i n t h is st u dy fell into t h e Serogroup?.
K ey w ords:to m ato;Tos povirus;serog r oup
番茄斑萎病毒属(Tospovirus)是布尼亚病毒科(Bunyav iridae)惟一的植物病毒属,能够侵染烟草、番茄、辣椒和花生等多种重要作物,致使这些作物发生严重病害,导致世界范围内重大农业经济损失(W hitfield et a.l,2005)。该属病毒球状,具有包膜,由S RNA、M RNA和L RNA,3个单链RNA分子构成(Ger m an et a.l,1992)。Tospovirus属目前已经有14个确定种(W h itfield et a.l, 2005)。在亚洲报道的种有:花生芽坏死病毒(P eanut bud necrosis virus,PB NV)、西瓜芽坏死病毒(Water m elon bud necrosis virus,W B NV)、鸢尾黄斑病毒(Iris yello w s p ot virus,I Y SV)、花生黄斑病毒收稿日期:2008-10-09;修回日期:2009-02-04
基金项目:云南省自然科学基金面上项目(2005C0036M,2007C0036M);云南省教育厅自然科学基金项目(5Y0171B);国家-973.项目(2006CB100204))
*通讯作者Au t hor f or corres ponden ce(E-ma i:l liz hengyue@vi p1km1691net;Te:l0871-*******)
致谢:感谢美国北卡罗来那州立大学植物病理系主任Ja m esW.M oyer教授为本研究提供完善的试验条件。
园艺学报36卷
(P eanu t y ello w s p ot virus,PYSV)、辣椒褪绿病毒(Cap sicum chloro sis virus,C a CV)、西瓜银斑病毒(Water m elon silver m ottle virus,W S M oV)、瓜类黄斑病毒(M elon y ello w s pot virus,MYSV)、花生褪绿扇斑病毒(P eanut chlorotic fan virus,PCFV)和彩色马蹄莲褪绿斑病毒(Call a lily h lorotic s p ot virus, CCSV)。张仲凯等(1997)报道了云南烤烟上发现Tos p ovirus,并在2005年报道了云南省具有其广泛的野生自然寄主(张仲凯等,2005)。
作者在云南省蔬菜种植基地调查了Tos povir us属病毒侵染情况,并应用RT-PCR技术确定Tos povir us属病毒在云南省番茄上的发生。
1材料与方法
111病毒样本收集
2005)2006年,在云南省昆明、楚雄和红河地区对主要蔬菜基地的番茄、辣椒、莴苣和花生等蔬菜作物进行田间调查,获得9份具有感染Tos p ovirus属病毒较为典型症状的植株样品(表1)。按照Ndunguru等(2005)的方法将具有疑似症状的叶片转移到FTA卡(W hat m an,Inc)上备用。
表1本研究采集的病毒样本及其分离物
Table1V irus sa m ples and i so l ates coll ected i n t he s t udy
样品编号Sa m p l e No.自然寄主
Nat u ral host
症状
Symp t om
采样地点
Locati on
采样时间/(Y-M-D)
Date
To-2番茄To m at o黄斑和同心环纹Y ell o w spot,concen tric ri ng昆明呈贡C henggong,Kunm i ng2005-07-19
Pep-3辣椒Pepper同心环纹Con cen tri c ring楚雄元谋Yu an m ou,Chuxi ong2006-02-14
L e-1莴苣Lett u ce坏死斑N ecrotic spot楚雄元谋Yu an m ou,Chuxi ong2006-02-14
Tomato番茄To m at o黄斑和同心环纹Y ell o w spot,concen tric ri ng红河建水Jians hu,i H ongh e2006-05-30
Pean-1花生Peanu t坏死斑N ecrosis spot楚雄元谋Yu an m ou,Chuxi ong2006-08-03
To-3番茄To m at o同心环纹和坏死斑Con centric ri ng,n ecrosis spot楚雄元谋Yu an m ou,Chuxi ong2006-08-03
Pep-4辣椒Pepper同心环纹和坏死斑Con centric ri ng,n ecrosis spot昆明呈贡C henggong,Kunm i ng2006-07-27
To-4番茄To m at o同心环纹和坏死斑Con centric ri ng,n ecrosis spot昆明呈贡Chenggong,Kunm i ng2006-07-27
On i on-1洋葱On i on褪绿斑Ch l orotic l esion红河蒙自M engz,i H onghe2006-09-06
112RNA的提取
应用Pure L i n k Total RNA纯化试剂盒(I nv itrogen,Carlsbad,C A)从FTA卡上提取RNA,根据I nv itrogen公司使用说明书操作,并略有改动,在RNA溶解溶液中加入了2%PVP和1%B-巯基乙醇,取5mm2FTA卡溶解于500L L RNA裂解溶液中。
113L RNA片段的RT-PCR
用随机引物N6(I nv itrogen,Carlsbad,CA)逆转录合成c DNA。使用AGD I A公司设计的Tos p ovirus 通用引物Tos p ovirus G roup Pri m er和试剂盒(AGDI A,E lkhar,t I N)进行L RNA片段PC R扩增,PCR 反应在M J研究(W aterto w n,MA)的PTC-100热周期循环中完成,反应程序如下:预变性94e10 m in;94e1m i n,45e2m i n,72e3m in,5个循环;然后94e1m in,52e2m i n,72e3m i n, 30个循环;72e延伸10m in。然后在1%琼脂糖凝胶电泳,紫外成像系统拍照。
114基因克隆和测序
用Q I Aquick PCR纯化试剂盒(Q iagen I nc.,Chats w orth,CA)纯化PCR扩增产物,将扩增产物克隆到pGE M-T载体(Pro m ega,M ad ison,W I,USA)上,并转化大肠杆菌菌株J M-109,在美国北卡州立大学基因组研究所完成重组体克隆的测序。
115序列分析
用V ector NTI Versi o n910(I nv itr ogen,Carlsbad,CA)创建序列数据库;B i o edit(http:// 438
3期刘雅婷等:云南省建水县番茄上T o s p ovirus 属病毒的初步鉴定 www 1mbio 1ncsu 1edu /B i o Edit/bioedit 1ht m l)用于序列整理;通过BLAST (http ://www 1ncbi 1n l m 1ni h 1gov /BLAST /)进行比对分析;使用DNA MAN (versi o n 215,Lynnon B iosof,t Quebec ,Canada)将获得的序列与已知的TS WV 、I Y S V 以及其他公布的Tos povir us 属病毒序列进行多序列比对产生相似性矩阵及系统进化树。2 结果与分析
211 云南省Tospovirus 属病毒分布
通过引物To s povirus Group Pri m er 进行L RNA
序列RT-PCR 扩增,其中采自云南省红河州建水
县番茄的样本获得4条500bp 左右的序列(图1,
to m ato -5,to m ato -8,to m ato -9,to m ato -10),通过
BLAST 比对发现该序列与To s povirus 属其他已经在GenBank 中公布的序列有较高的一致性,因此确定该样本为Tos p ovirus
属病毒。图1 样品番茄应用引物Tos po virus
G roup Pri m er 的PCR 扩增
F i g .1 PCR a m plifi cati on from to m ato sa m ples
by Tos p ovi rus G roup Pri m er 212 L RNA 核酸序列片段比对和系统进化关系分析
通过引物Tos p ovirus G r oup Pri m er 进行L RNA 序列RT-PCR 扩增,该样品均获得约500bp L RNA 片段。应用DNAMAN 软件将这些核酸序列和GenBank 公布的其他序列比对,从图2可以看出,云南的该样本与Tos povir us 属血清组I V 的病毒PB NV 和W S M o V 聚为一簇,相似性超过79%
。
图2 应用To s povir us G roup P ri m er 获得Tospovi rus 属L RNA 序列的系统进化树
F i g .2 A phylogeneti c tree ba s ed on the L RNA frag m ent of Tospovir us
I YSV (M oyer et a.l,unpub lis hed data)
213 该病毒在自然寄主上的典型症状
该病毒在番茄果实上表现出黄斑和同心环纹的症状(图3)。
图3 T os povir us 属病毒自然侵染番茄的症状表现
F i g .3 The s ymp t om of tom ato infected by To s povir us 439
园艺学报36卷440
3讨论
血清组是一种广泛用于Tos p ovirus属病毒新种确定和分类的重要标准,血清学比较是检测和鉴定Tos povir us属病毒最有效的方法(Chu et a.l,2001)。目前Tos povirus属病毒划分为6个血清组,即?,ò,ó,?,?和?(de H aan et a.l,1990;M aiss et a.l,1991;de Av ila et a.l,1993),TS WV是血清组I的代表种。番茄褪绿斑病毒(To m ato chlorotic s pot virus,TCSV)和花生环斑病毒属于血清组ò.凤仙花坏死病毒(I mpatiens necrotic s po t vir us,I N SV)和花生芽坏死病毒(P eanu t bud necrosis vi-rus,PBNV)分别是血清组ó和?的代表种。两种新的Tos p ovirus即花生黄斑病毒(P eanut yello w s po t virus,P YSV)和鸢尾黄斑病毒(Iris yello w s p ot virus,I Y SV)分别是血清组?(Satyanarayana et a.l, 1998)和?(Cortez et a.l,1998)的代表种。本研究中的云南样品与?聚为一群,因此可能属于血清组?。
自1947年以来,陆续有关于Tos povirus的发现,但是中国对于Tospovirus很少有系统的调查和研究,关于种的鉴定鲜见报道。
作者在过去的几年中对云南省蔬菜进行调查,确定采自云南红河建水县番茄上的病毒样本为Tos povir us属病毒,但是属于Tos povirus属的哪一个种,还有待进一步的研究确定。
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