巴氏染色原理及操作步骤

巴氏染色原理及操作步骤巴氏染色法是脱落细胞染色中最好的染色方法。苏木素染液，细胞核内的染色质主要是去氧核糖核酸（DNA）,DNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木素精碱性染料以离子或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。分化：苏木素染色之后，用水洗去未结合在细胞上的染液，但是在细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附的染料必须用分化液1%盐酸酒精脱去，才能保证细胞核和细胞浆染色的分明，把这个过程称为染色的分化作用。因酸能破坏苏木素的醌型结构，使色素与组织解离，分化不可过度。蓝化：分化之后苏木素在酸性条件下处于红色离子状态，在碱性条件下处于蓝色离子状态，而呈蓝色，所以分化之后用水洗去酸而中止分化，再用弱碱性水使苏木精染上的细胞核变呈蓝色，称蓝化作用，一般多用自来水浸洗即可变蓝，也可用温水（50度温水最佳）变蓝。EA50染液的酸碱度对于巴氏染色的成功起着关键作用，EA50染液由伊红、亮绿、等染料配成。伊红、亮绿、橘黄等属于酸性染料，在溶解媒中其发色团是负离子部分，发色团可与蛋白质中带正电的氨基结合，从而是胞浆显蓝色、绿色、橘黄色或红色，但蛋白质所带正负电荷的多少是随溶液的PH值而改变的，在偏碱环境中，蛋白质的羧基游离增多（带负电），在偏酸环境中蛋白质氨基游离增多（带正电），磷钨酸在染色过程中，不但作为媒染剂可增加染料的着色力，同时磷钨酸与碳酸锂还是一对弱酸弱碱，实际上是一对缓冲剂，可中和分化及蓝化时可能留下的少量酸或碱，保证染色达到理想效果，其适用于上皮细胞及间皮组织的标本，是阴道脱落细胞检查中最常用的染色方法，该

染色法不但具有显示细胞核结构清晰、分色明显、透明度好、胞浆受色鲜艳等特点。

巴氏染色法将胞核染为深蓝色；鳞状上皮底层、中层及表层角化前细胞胞质染绿色，表层不全角化细胞胞质染粉红色，完全角化细胞胞质呈桔黄色；细菌：灰色；滴虫：淡蓝灰色；黏液：淡蓝色或粉红色；中性粒细胞和淋巴细胞、吞噬细胞胞质均为蓝色；红细胞染粉红色；高分化鳞癌细胞可染成粉红色或桔黄色；腺癌胞质呈灰蓝色。

巴氏染色的操作方法及注意事项

染色有4个步骤：1、固定；2、核染色；3、胞浆染色；4、透明。

主要达到以下要求：1、核的结构清晰；2、透明度高；3、分色恰当。

一、固定

固定的目的细胞制片的迅速固定是制片过程中关键的一步，否则会影响细胞学诊断的准确性。对于不同的标本需要不同的固定方法。最为常用的固定方法是95％酒精作为固定液的湿固定法。酒精作为一种脱水剂能够防止细胞内的酶捋蛋白质分解而自容，并凝固细胞内的物质如蛋白质、脂肪和糖类等，使其保持与组织生活相仿的成分，从而使细胞各部分，尤其核染色质易于着色。对于巴氏染色来说，酒精固定最为重要的。如果酒精浓度不足引起的固定不佳，可造成细胞的人为变化，并可导致假阳性或假阴性的诊断。

1、固定方法湿固定法：作为用95％酒精固定液固定的细胞学标本一定使用湿固定法。制片制备完后，趁标本新鲜而又湿润时，立即放入盛有95％酒精的固定缸内。制片在固定液内至少保持15-30min。固定时间通常不超过1周。这种制片染色后，颜色鲜艳，结构清晰。如果细胞制片需要送至另一实验室或邮寄他处染色时，可以固定15min后，把制片取出后立即密封的容器中或者使用甘油防止制片干燥。因为无论固定前或固定后的制片，如果发生干燥后都会影响染色的效果。

2、固定注意事项固定液的过滤：为了防止细胞污染，凡是使用过的固定液，必须过滤后才能再使用。使用过长的固定液，必须用酒精相对密度计测定，酒精浓度低于90％时应该及时更换新液。湿固定的重要性：标本再新鲜时及时固定时保证染色效果的重要因素。如苏木素对细胞核的染色，巴氏染色中胞浆的特殊着色作用，均可因标本干燥后固定而大受影响。制片标本的邮寄：标本再固定15min后取出，立即加甘油数滴于制片上，装入密封的小盒中。实验室在收到标本后，先浸入95％酒精中，使甘油溶去，再进行染色。

二、核染色

1、苏木素液浸染时间一般在3-5min，但是必须随气温和燃料情况而酌情改变。夏季或放置较久的苏木素染液容易着色，时间要缩短；冬季或新配制的苏木素染液和应用已久较稀释的苏木素液不易着色，时间要延长。在使用苏木素染色时，一般有2种方法：

1）过染法：首先有意识地进行深染，然后通过盐酸酸化过程使核染色趋于合适。这种方法能够在酸化过程中把胞浆内黏附多余的苏木素染料去掉，使胞浆染色更为鲜艳、清晰、多用于黏液多的标本。

2）淡染法：在核染色过程中，严格掌握染色时间，使核染色适宜而不用盐酸酸化，但是胞浆中少量的苏木素会影响EA染色的质量。主要用于黏液少的标本，避免在酸化和自来水冲洗的过程中使细胞成片地脱落。在使用苏木素染色时，一定要每日进行过滤，否则苏木素结晶会影响染色的质量。一般苏木素染液可以使用较长时间，所以每日增加少量新鲜染液即可。

2、碱化碱化亦称返蓝过程，可以使用饱和碳酸锂或3％氨水碱化，目的使苏木素及早显色，时间约数秒。更重要的是流水冲洗，可使蓝色显的更鲜艳。碱性溶液亦需要充分漂清才不会妨碍下一步的胞浆着色及标本制成后的颜色保存。分化和碱化溶液至少每天更换新液。

三、胞浆染色

胞浆染色在巴氏方法中亦称为OG—EA染色，它包括橘黄G（OG）和EA两部分染色。由于橘黄G是一种小分子染料，能够很快地作用于胞浆，一般染色时间

不宜过长，通常1-2min。对于宫颈、阴道上皮中非正常角化细胞和角化型鳞癌

细胞的胞浆中都可以出现鲜艳的橘黄色。

四、封固制片

封固制片对于避免空气干燥的影响，制片经长期存放不褪色是非常重要

的。一般使用24mm×50mm或24mm×60mm的盖玻片，用二甲苯调配的中性树胶进行封固。

五、透明

染色的最后一步是透明，使细胞的色度与细胞的重叠不致影响镜下检查。

这是在脱水与制片封固之间的一项重要步骤。最常用的透明溶剂使二甲苯，二

甲苯的折射率在，载玻片的折射率在，两者较为匹配。如果二甲苯溶液出现颜

色或变得浑浊，一定要更换新液。巴氏染色操作流程95％乙醇固定（15min）→清水冲洗多次→苏木素染液（3-5min）→清水冲洗三次→蓝化→95％乙醇漂洗→橙黄染液（1-10s）→95％乙醇漂洗→95％乙醇漂洗→100%乙醇漂洗→EA50（3-5m）→95％乙醇漂洗→95％乙醇漂洗→无水乙醇漂洗→无水乙醇（2min）→二甲苯（2min）→中性树胶封片

染色注意事项

1、细胞核着色不佳

（1）细胞核着色过浅：

1）盐酸分化时间过长或苏木素染液时间过长。需要缩短分化时间或延长碱化时间；每日加入少量新鲜苏木素染液或重新配制苏木素液。

2）在固定之前制片干燥。所以对巴氏染色的制片需要严格遵守湿固定的原则。

3）自来水的PH值偏酸性。使用碱性溶液。

（2）细胞核着色过深：

1）盐酸溶液浓度不够。适当加入几滴盐酸以增加浓度。

2）制片用高于95％以上浓度的酒精固定后可以出现染色过深。应用95％酒精固定。

2、细胞浆着色不佳

（1）如果全片内胞浆都淡染，则需要延长染色时间或更换新液。

（2）如果胞浆不分色，均为浅红色。制片在固定前干燥或制片被有大量球菌样细菌影响胞浆染色。此情况可以适当增加染色时间能够部分纠正不分色状况。

（3）胞浆染成灰色或紫色，是由于苏木素染色时间过长或盐酸分化不佳。经过褪色后重新苏木素可以纠正。

（4）由于标本的不同，同样配方的EA染液可造成偏蓝、偏绿和偏红，对不同的标本应该使用不同的EA染液。一般认为，EA36和EA50用于妇科标本，而EA65或改良EA用于非妇科标本。

（5）胞浆不分色的另一重要原因是由于EA染液的PH值不恰当所致。如染色为红色，可以加少许磷钨酸溶液纠正；如染色均为蓝色或绿色，可以加少许饱和碳酸锂溶液纠正。对于改良EA染液，每100ml染液加入2ml冰醋酸后染色效果更佳；染液使用更持久

巴氏染色法

巴氏染色液说明书 【产品名称】 巴氏染色液 【包装规格】 货号：DA0082 单瓶(盒)包装规格：100ml 、250ml 、500ml 、5000ml ； 套组(盒)包装规格：4×100ml/盒、4×250ml/盒、4×500ml/盒。 【预期用途】 主要用于对脱落细胞的组织细胞学染色。 【检验原理】 细胞学常规染色普遍使用巴氏(Papanicolaou)法，橘黄G 与EA36或EA50联合使用可将胞浆染成颜色鲜明的绿色、蓝色和粉色，细胞中的细胞核是由酸性物质组成，它与碱性染料的亲和力较强；而细胞浆则相反，它含有碱性物质和酸性染料的亲和力较大。巴氏染色液利用这一特性对细胞进行多色性染色，细胞经染色后能清晰地显示细胞的结构，胞质透亮鲜丽，各种颗粒分明，细胞核染色质非常清楚，从而较容易发现异常细胞。通过巴氏染色可反映出细胞在炎症刺激下和癌变后的形态学变化，对早期发现和诊断一些病变和肿瘤具有较重要意义。 【主要组成成分】 试剂组成 主要成分 l 、苏木素染色液 苏木素 2、1%盐酸乙醇分化液 盐酸、乙醇 3、橘黄G 染色液 橘黄G 4、EA50染色液或EA36染色液 EA50染色液：淡绿、伊红、磷钨酸、冰乙酸； EA36染色液：淡绿、伊红、磷钨酸 【储存条件及有效期】 5℃～35℃环境保存，原包装未开封染色液的有效期为18个月，在有效期内的已开封染色液建议在开封后6个月内使用完，每次用后应及时拧紧瓶盖，以免挥发或变质。 【样本要求】 新鲜标本涂片后，应尽快用95%乙醇固定，以避免细胞变形。 【检验方法】 1、固定：将细胞涂片置于95%乙醇中固定； 2、染色，按要求进行染色。 3、二甲苯透明，中性树脂封片，镜检。 【检验结果的解释】 【检验方法的局限 性】 仅供形态学初检观察染色使用。 【注意事项】 1、冬季气温较低时，苏木素染色液不易着色，可适当延长染色时间。 细胞核 蓝紫色或黑色 非角化细胞的胞质 淡蓝色或淡绿色 角化细胞的胞质 粉红或橘黄色 红细胞 鲜红色或橙红色 粘液 淡蓝或粉红色

13.巴氏染色液

巴氏染色液说明书 【产品名称】巴氏染色液 【产品名称】巴氏染色液PAP Staining Solutions 【产品编号】PAP-500ml,PAP-1000ml,PAP-2500ml 【包装规格】苏木素染色液500ml、1000ml 2500ml；橘黄G6染色液500ml、1000ml 2500ml；EA50染色液500ml、1000ml 2500ml。 【预期用途】主要用于对脱落细胞的组织细胞学染色。 【检验原理】 巴氏染色液由3部分组成：苏木素染色液、橘红G6染色液和EA50染色液。 苏木素染色液，是一种针对正常以及变态细胞学涂片染料，对核膜、核质、核仁染色效果非常清晰。涂片标本可是妇科或非妇科的，如痰液，尿液及细胞学穿刺样本。为获得优质的染色效果，苏木素染液技术完全按照帕氏染色法，以及OG-6染液；EA 31染液；同时供应选择性多色复染染料，如EA50试剂；EA65试剂，满足细胞学染色需求。 橘黄G6染色液，是橘黄G (Orange G) 染料添加磷酸（PMA）后的酒精溶液。Papanicolaou染色，首先用苏木素将细胞核染色，之后用OG-6 试剂和EA试剂继续染色。橘黄G染料对细胞质染色，并保持在成熟细胞和角质化细胞。之后的EA试剂对未染色的细胞组分染色，如鳞状细胞，核仁，纤毛，红细胞。测试样本可为妇科细胞样本和非妇科细胞样本，如痰液，尿液，细胞穿刺等。为获得优质的染色效果，OG-6试剂特性与其他用于Papanicolaou染色法中染色试剂-苏木素试剂，EA 31试剂，及对比染色试剂EA50试剂，EA65试剂相符。 EA50染色液,为伊红Y和亮绿SF酸（加入了磷钨酸，PTA）染液的酒精溶液。Papanicolaou染色，首先用苏木素将细胞核染色，之后用OG-6 试剂和EA试剂继续染色。橘黄G染料对细胞质染色，并保持在成熟细胞和角质化细胞。之后的EA试剂对未染色的细胞组分染色，如鳞状细胞，核仁，纤毛，红细胞。测试样本可为妇科细胞样本和非妇科细胞样本，如痰液，尿液，细胞穿刺等。为获得优质的染色效果，EA 50 Pap 3B试剂特性与其他用于细胞学涂片染色试剂（苏木素试剂，OG-6试剂）相符。 【主要组成成分】 苏木素：乙二醇、苏木素、碘酸钠、硫酸铝；橘黄G染液：橘黄G6、磷酸、稳定剂；EA50：伊红Y、亮绿 SF、磷钨酸、稳定剂 【储存条件及有效期】保证产品包装完整的情况下，储存温度在+15°C 和+25°C

HE染色基本流程

HE（Hematoxylin & Eosin）染色基本流程 苏木精—伊红染色法简称HE染色法，它是最常用的普通染色方法。苏木精是阳离子染料，将细胞核内的嗜碱性物质染成蓝紫色。伊红是阴离子染料，将细胞质和胶原纤维等染成粉红色。 1、二甲苯脱蜡三道，每道30min 2、无水乙醇两道，每道5min 3、95%乙醇两道，每道5min 4、80%乙醇5min 5、70%乙醇5min 6、50%乙醇5min 7、蒸馏水3-5min 8、苏木素染色液5-10min，根据染色结果和气温调整时间 9、浸自来水冲洗多余的染色液 10、0.5%盐酸酒精分色（70%酒精配制）3-10seconds 11、水洗蓝化15-30min 12、50%乙醇5min 13、70%乙醇5min 14、80%乙醇5min 15、伊红染色液（95%乙醇配制）60seconds 16、95%乙醇两道，每道5min 17、无水乙醇两道，每道5min 18、乙醇+二甲苯（1:1）5min 19、二甲苯三道，每道5min 20、中性树胶封片

HE染色注意事项： 1. 染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，自来水中冲洗时间要长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。 2. 切片染苏木精后，分色这一步是关键，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清楚（晰）而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色。 3. 切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。 4. 在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。 5. 切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。 6. 最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。 试剂配制： 0.5%盐酸酒精分色液 浓盐酸0.5～1 ml 70%酒精99 ml

巴氏染色的几点体会

巴氏染色的几点体会 李瑞祥熊灏靳敏 巴氏（Papanicolaou）染色法是脱落细胞染色中最好的染色方法。其适用于上皮细胞及间皮组织的标本。是阴道脱落细胞检查中最常用的染色方法。该染色法不但具有显示细胞核结构清晰，分色明显，透明度好，胞浆受色鲜艳等特点，而且所染标本不易脱色，可长久保存。对如何染好巴氏染色，笔者有以下几点体会，报告如下。 1 EA 36 染液pH值的测试 EA 36 染液的酸碱度对巴氏染色的成功起着关键性作用，EA 36 染液由伊红、亮绿、桔黄及俾麦棕等染料配成。伊红、亮绿、桔黄及俾麦棕等属于酸性染料。在溶媒中其发色团是负离子部分。发色团可与蛋白质中带正电的氨基结合，从而使胞浆显蓝色、绿色、桔黄色或红色。但蛋白质所带正负电荷的多少是随溶液的pH值而改变的。在偏碱环境中，蛋白质的羧基游离增多（带负电）。在偏酸环境中蛋白质氨基游离增多（带正电）。所以必须把染液pH 值调至5.2为宜［1］。EA 36 染液pH的调节，可用石蕊试纸法，也可用酸度计测试。当然用酸度计法最为准确。但以上方法均比较麻烦，同时还要受到仪器设备的限制，不方便。本文采用一种简单方便的方法。即用10%磷钨酸及饱和碳酸锂溶液直接测试。具体做法是，拿一张滤纸先滴少量染液于纸上，若滴染液处呈紫色，说明染液偏碱，则滴加少量10%磷钨酸。若显绿色，说明染液偏酸，则滴加少量饱和碳酸锂。并充分混匀。直至染液滴在纸上既显绿色又有红色，颜色鲜艳为宜。用此法测试染液pH同用石蕊试纸法测试一样，同样可获得满意的染色效果。磷钨酸在染色过程中，不但作为媒染剂可增加染料的着色力。同时磷钨酸与碳酸锂还是一对弱酸弱碱，实际上是一对缓冲剂。可中和分色及蓝化时可能留下的少量酸或碱。保证染色达到理想效果。 2 分色 分色或酸化，对染色效果也很重要。分色目的是去掉胞浆中染上的多余的苏木素，使胞核着色显示特异性。因此，经分色后的胞浆在镜下观察应无色为佳。若胞浆中还残留有苏木素染料，会影响EA 36 染液的着色。结果会出现该红的胞浆不红，该绿的胞浆不绿，或不红不绿的现象。看不到红蓝相间现象。因此，掌握好分色是关键。分色时间不能过短或过长。太短胞浆中苏木素除不尽，太长会把核上的苏木素也退掉。每次应在数秒内完成。盐酸浓度应偏低（0.5%为好）。这样便于掌握分色的时间。 3 蓝化或碱化 蓝化的目的是使胞核着色更具有特异性。经蓝化后的胞核紫中带蓝。这与红色的胞浆对比更鲜明。蓝化所用的碳酸锂是一种弱碱。因此，蓝化过程中碳酸锂还可中和分色时可能残留下的少量盐酸。为EA 36 的着色创造良好条件。所以蓝化时间可适当长些，以肉眼观察涂片变蓝为好［2］。 若涂片经EA 36 染色后，镜下观察效果不理想时。根据涂片着色情况，可于EA 36 染液中滴加少量10%磷钨酸或饱和碳酸锂后重染EA 36 3～5min而补救。比如:角化细胞浆不红，就滴加10%磷钨酸。若角化前细胞浆也变红，就滴加饱和碳酸锂如此边复染边镜下观察，直至获得最佳染色效果为止。

HE染色原理

苏木精-伊红染色方法 苏木精（hematoxylin）和伊红（eosin）染色方法，简称HE染色方法，是细胞与组织学最广泛的染色方法。 一、HE染色的基本原理 （一）细胞核染色的原理 细胞核内的染色质主要是去氧核糖核酸（DNA），DNA的双螺旋结构中，两边链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。 （二）细胞浆染色的原理 细胞浆内主要成分是蛋白质，为两性化合物、细胞浆的染色与pH 值有密切关系，当pH调到蛋白质等电点4.7-5.0时，胞浆对外不显电性，此时酸或碱性染料不易染色。当pH调到6.7-6.8时，大于蛋白质的等电点pH值，表现酸性电离，而带负电荷的阴离子，可被带正电荷的染料染我以，现时胞核也被染色，核和胞浆难以区分。因此必须把pH调至胞浆等电点以下，在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷（阳离子），就可被带负电荷（阴离子）的染料染色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织，嗜伊红颗料等被感染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。（三）、二甲苯的作用

烤片后切片进入二甲苯是脱蜡的作用。组织处理和染色后进入二甲苯是透明作用。组织处理的透明是为了石蜡能进入到细胞中去，染色后透明是为了使细胞的折光率与玻璃相同，以便显微镜观察。（四）、酒精的作用 酒精用于苏木精染色前由高浓度至低浓度是为了洗脱用于脱蜡的二甲苯。 伊红染色以后的酒精由低浓度至高浓度酒精逐渐过度是为了彻底脱去组织中的水份。 （五）、水洗的作用 在脱蜡经酒精处理之后，水洗切片，是为了苏木精染液能更好的进入细胞核中去，使细胞核染色均匀。 染色之后的水洗作用是为洗去未与切片结合的染液。 分化以后的水洗则是为了除去分化液和脱下的染料，中止分化作用。 在伊红染色之后也可以水洗，是为了减少伊红染液进入脱水的酒精中。 （六）分化和蓝化作用 1、分化作用 苏木精染色之后，先用水洗去未结合在切片中的染液。然后用分化液1%盐酸酒精脱去细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附 的染料，这个过程称为染色的分化作用。 2、蓝化作用

巴氏染色技术要点

巴氏染色 巴氏（Papanicolaou）染色法是脱落细胞染色中最好的染色方法。其适用于上皮细胞及间皮组织的标本。是阴道脱落细胞检查中最常用的染色方法。该染色法不但具有显示细胞核结构清晰，分色明显，透明度好，胞浆受色鲜艳等特点，而且所染标本不易脱色，可长久保存。对如何染好巴氏染色，笔者有以下几点体会，报告如下。 1 EA 36染液pH值的测试 EA 36染液的酸碱度对巴氏染色的成功起着关键性作用，EA 36染液由伊红、亮绿、桔黄及俾麦棕等染料配成。伊红、亮绿、桔黄及俾麦棕等属于酸性染料。在溶媒中其发色团是负离子部分。发色团可与蛋白质中带正电的氨基结合，从而使胞浆显蓝色、绿色、桔黄色或红色。但蛋白质所带正负电荷的多少是随溶液的pH值而改变的。在偏碱环境中，蛋白质的羧基游离增多（带负电）。在偏酸环境中蛋白质氨基游离增多（带正电）。所以必须把染液pH值调至5.2为宜［1］。EA 36染液pH的调节，可用石蕊试纸法，也可用酸度计测试。当然用酸度计法最为准确。但以上方法均比较麻烦，同时还要受到仪器设备的限制，不方便。本文采用一种简单方便的方法。即用10%磷钨酸及饱和碳酸锂溶液直接测试。具体做法是，拿一张滤纸先滴少量染液于纸上，若滴染液处呈紫色，说明染液偏碱，则滴加少量10%磷钨酸。若显绿色，说明染液偏酸，则滴加少量饱和碳酸锂。并充分混匀。直至染液滴在纸上既显绿色又有红色，颜色鲜艳为宜。用此法测试染液pH同用石蕊试纸法测试一样，同样可获得满意的染色效果。磷钨酸在染色过程中，不但作为媒染剂可增加染料的着色力。同时磷钨酸与碳酸锂还是一对弱酸弱碱，实际上是一对缓冲剂。可中和分色及蓝化时可能留下的少量酸或碱。保证染色达到理想效果。 2 分色 分色或酸化，对染色效果也很重要。分色目的是去掉胞浆中染上的多余的苏木素，使胞核着色显示特异性。因此，经分色后的胞浆在镜下观察应无色为佳。若胞浆中还残留有苏木素染料，会影响EA 36染液的着色。结果会出现该红的胞浆不红，该绿的胞浆不绿，或不红不绿的现象。看不到红蓝相间现象。因此，掌握好分色是关键。分色时间不能过短或过长。太短胞浆中苏木素除不尽，太长会把核上的苏木素也退掉。每次应在数秒内完成。盐酸浓度应偏低（0.5%为好）。这样便于掌握分色的时间。 3 蓝化或碱化 蓝化的目的是使胞核着色更具有特异性。经蓝化后的胞核紫中带蓝。这与红色的胞浆对比更鲜明。蓝化所用的碳酸锂是一种弱碱。因此，蓝化过程中碳酸锂还可中和分色时可能残留下的少量盐酸。为EA 36的着色创造良好条件。所以蓝化时间可适当长些，以肉眼观察涂片变蓝为好［2］。

巴氏染色原理及操作步骤

巴氏染色原理及操作步骤 巴氏染色法是脱落细胞染色中最好的染色方法。苏木素染液，细胞核内的染色质主要是去氧核糖核酸（DNA）,DNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木素精碱性染料以离子或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。分化：苏木素染色之后，用水洗去未结合在细胞上的染液，但是在细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附的染料必须用分化液1%盐酸酒精脱去，才能保证细胞核和细胞浆染色的分明，把这个过程称为染色的分化作用。因酸能破坏苏木素的醌型结构，使色素与组织解离，分化不可过度。蓝化：分化之后苏木素在酸性条件下处于红色离子状态，在碱性条件下处于蓝色离子状态，而呈蓝色，所以分化之后用水洗去酸而中止分化，再用弱碱性水使苏木精染上的细胞核变呈蓝色，称蓝化作用，一般多用自来水浸洗即可变蓝，也可用温水（50度温水最佳）变蓝。EA50染液的酸碱度对于巴氏染色的成功起着关键作用，EA50染液由伊红、亮绿、等染料配成。伊红、亮绿、橘黄等属于酸性染料，在溶解媒中其发色团是负离子部分，发色团可与蛋白质中带正电的氨基结合，从而是胞浆显蓝色、绿色、橘黄色或红色，但蛋白质所带正负电荷的多少是随溶液的PH值而改变的，在偏碱环境中，蛋白质的羧基游离增多（带负电），在偏酸环境中蛋白质氨基游离增多（带正电），磷钨酸在染色过程中，不但作为媒染剂可增加染料的着色力，同时磷钨酸与碳酸锂还是一对弱酸弱碱，实际上是一对缓冲剂，可中和分化及蓝化时可能留下的少量酸或碱，保证染色达到理想效果，其适用于上皮细胞及间皮组织的标本，是阴道脱落细胞检查中最常用的染色方法，该染色法不但具有显示细胞核结构清晰、分色明显、透明度好、胞浆受色鲜艳等特点。 巴氏染色法将胞核染为深蓝色；鳞状上皮底层、中层及表层角化前细胞胞质染绿色，表层不全角化细胞胞质染粉红色，完全角化细胞胞质呈桔黄色；细菌：灰色；滴虫：淡蓝灰色；黏液：淡蓝色或粉红色；中性粒细胞和淋巴细胞、吞噬细胞胞质均为蓝色；红细胞染粉红色；高分化鳞癌细胞可染成粉红色或桔黄色；腺癌胞质呈灰蓝色。

免疫组化、HE染色步骤

骨组织石蜡切片制作 步骤： 1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓 冲液内固定12—24h。 2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h. 3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2 次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。 4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。 5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I 1小时，石蜡II 1小时。 6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片。 7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。 免疫组化检测 步骤： 1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min 二甲苯 1（10min）二甲苯2（10min）。 2.水化：100%酒精1（2min） 100%酒精（2min）95%酒精（2min）80%酒精（2min）70%酒精(2min) 。

3.PBS冲洗3次，每次5min.。 4.抗原修复：将组织片置0.01M的柠檬酸缓冲液（PH6.0）中煮沸 15min ,自然冷却至室温。 5.PBS冲洗3次，每次5min。 6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活 性。 7.PBS冲洗3次，每次5min。 8.滴加1抗（GFP 1：100稀释, 4℃过夜） 9.PBS冲洗3次，每次5min。 10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min, PBS 冲洗3次，每次5min。 11. 滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min, PBS 冲洗3次，每次5min。 12.DAB显色5min。 13.自来水冲洗10min。 14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。 15.自来水冲洗10min。 16.常规脱水，透明，封片，镜检。 组织切片HE染色 步骤

巴氏染色的操作方法及注意事项

巴氏染色的操作方法及注意事项 染色染色有4个步骤：1、固定；2、核染色；3、胞浆染色；4、透明。主要达到以下要求：1、核的结构清晰；2、透明度高；3、分色恰当。 一、固定固定的目的细胞制片的迅速固定是制片过程中关键的一步，否则会影响细胞学诊断的准确性。对于不同的标本需要不同的固定方法。最为常用的固定方法是95％酒精作为固定液的湿固定法。酒精作为一种脱水剂能够防止细胞内的酶捋蛋白质分解而自容，并凝固细胞内的物质如蛋白质、脂肪和糖类等，使其保持与组织生活相仿的成分，从而使细胞各部分，尤其核染色质易于着色。对于巴氏染色来说，酒精固定最为重要的。如果酒精浓度不足引起的固定不佳，可造成细胞的人为变化，并可导致假阳性或假阴性的诊断。1、固定方法湿固定法：作为用95％酒精固定液固定的细胞学标本一定使用湿固定法。制片制备完后，趁标本新鲜而又湿润时，立即放入盛有95％酒精的固定缸内。制片在固定液内至少保持15-30min。固定时间通常不超过1周。这种制片染色后，颜色鲜艳，结构清晰。如果细胞制片需要送至另一实验室或邮寄他处染色时，可以固定15min后，把制片取出后立即密封的容器中或者使用甘油防止制片干燥。因为无论固定前或固定后的制片，如果发生干燥后都会影响染色的效果。 2、固定注意事项固定液的过滤：为了防止细胞污染，凡是

使用过的固定液，必须过滤后才能再使用。使用过长的固定液，必须用酒精相对密度计测定，酒精浓度低于90％时应该及时更换新液。湿固定的重要性：标本再新鲜时及时固定时保证染色效果的重要因素。如苏木素对细胞核的染色，巴氏染色中胞浆的特殊着色作用，均可因标本干燥后固定而大受影响。制片标本的邮寄：标本再固定15min后取出，立即加甘油数滴于制片上，装入密封的小盒中。实验室在收到标本后，先浸入95％酒精中，使甘油溶去，再进行染色。 二、核染色1、苏木素液浸染时间一般在3-5min，但是必须随气温和燃料情况而酌情改变。夏季或放置较久的苏木素染液容易着色，时间要缩短；冬季或新配制的苏木素染液和应用已久较稀释的苏木素液不易着色，时间要延长。在使用苏木素染色时，一般有2种方法：1）过染法：首先有意识地进行深染，然后通过盐酸酸化过程使核染色趋于合适。这种方法能够在酸化过程中把胞浆内黏附多余的苏木素染料去掉，使胞浆染色更为鲜艳、清晰、多用于黏液多的标本。2）淡染法：在核染色过程中，严格掌握染色时间，使核染色适宜而不用盐酸酸化，但是胞浆中少量的苏木素会影响EA 染色的质量。主要用于黏液少的标本，避免在酸化和自来水冲洗的过程中使细胞成片地脱落。在使用苏木素染色时，一定要每日进行过滤，否则苏木素结晶会影响染色的质量。一般苏木素染液可以使用较长时间，所以每日增加少量新鲜

免疫组化HE染色步骤

免疫组化H E染色步骤 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020

骨组织石蜡切片制作 步骤： 1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓冲 液内固定12—24h。 2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h. 3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。 4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。 5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I1小时，石蜡II1小时。 6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片。 7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。 免疫组化检测 步骤： 1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min二甲苯1 （10min）二甲苯2（10min）。 2.水化：100%酒精1（2min）100%酒精（2min）95%酒精（2min） 80%酒精（2min）70%酒精(2min)。 冲洗3次，每次5min.。

4.抗原修复：将组织片置的柠檬酸缓冲液（）中煮沸15min,自然冷 却至室温。 冲洗3次，每次5min。 6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活 性。 冲洗3次，每次5min。 8.滴加1抗（GFP1：100稀释,4℃过夜） 冲洗3次，每次5min。 10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min,PBS冲洗 3次，每次5min。 11.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min,PBS冲洗 3次，每次5min。 显色5min。 13.自来水冲洗10min。 14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。 15.自来水冲洗10min。 16.常规脱水，透明，封片，镜检。 组织切片HE染色 步骤 1、将烘烤后的组织切片依次侵入二甲苯1，二甲苯II进行脱蜡各 10min。 2、脱蜡后的组织切片依次浸入无水乙醇I、无水乙醇II、95%酒精、80%酒精、70%酒精中各2min，PBS冲洗2次，每次5min。

巴氏染色

巴氏染色法是脱落细胞染色中最好的染色方法。苏木素染液，质去氧核糖核酸（DNA）,DNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木素精碱性染料以离子或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。分化：苏木素染色之后，用水洗去未结合在细胞上的染液，但是在细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附的染料必须用分化液1%盐酸酒精脱去，才能保证细胞核和细胞浆染色的分明，把这个过程称为染色的分化作用。因酸能破坏苏木素的醌型结构，使色素与组织解离，分化不可过度。蓝化：分化之后苏木素在酸性条件下处于红色离子状态，在碱性条件下处于蓝色离子状态，而呈蓝色，所以分化之后用水洗去酸而中止分化，再用弱碱性水使苏木精染上的细胞核变呈蓝色，称蓝化作用，一般多用自来水浸洗即可变蓝，也可用温水变蓝。EA50染液的酸碱度对于巴氏染色的成功起着关键作用，EA50染液由伊红、亮绿、等染料配成。伊红、亮绿、橘黄等属于酸性染料，在溶解媒中其发色团是负离子部分，发色团可与蛋白质中带正电的氨基结合，从而是胞浆显蓝色、绿色、橘黄色或红色，但蛋白质所带正负电荷的多少是随溶液的PH值而改变的，在偏碱环境中，蛋白质的羧基游离增多（带负电），在偏酸环境中蛋白质氨基游离增多（带正电），磷钨酸在染色过程中，不但作为媒染剂可增加染料的着色力，同时磷钨酸与碳酸锂还是一对弱酸弱碱，实际上是一对缓冲剂，可中和分化及蓝化时可能留下的少量酸或碱，保证染色达到理想效果，其适用于上皮细胞及间皮组织的标本，是阴

道脱落细胞检查中最常用的染色方法，该染色法不但具有显示细胞核结构清晰、分色明显、透明度好、胞浆受色鲜艳等特点。巴氏染色法将胞核染为深蓝色；鳞状上皮底层、中层及表层角化前细胞胞质染绿色，表层不全角化细胞胞质染粉红色，完全角化细胞胞质呈桔黄色；细菌：灰色；滴虫：淡蓝灰色；黏液：淡蓝色或粉红色；中性粒细胞和淋巴细胞、吞噬细胞胞质均为蓝色；红细胞染粉红色；高分化鳞癌细胞可染成粉红色或桔黄色；腺癌胞质呈灰蓝色

巴氏染色液(Papanicolaou EA50)使用说明

巴氏染色液(Papanicolaou EA50)使用说明 产品简介： 细胞学常规染色普遍使用巴氏(Papanicolaou)法。Papanicolaou Stain最初仅用检测于阴道上皮雌激素水平以及生殖道念珠菌、滴虫等病原体。橘黄G6与EA36或EA50联用，可将胞浆染成颜色鲜明的绿色、蓝色和粉色。目前大多数实验室采用成品染液，所以每种染液应注意其改良后的最佳条件。最终胞浆染色应透明可见，核染色质应很容易辨别出来。目前改良的巴氏染色液含有多种离子，具有多色性染色效能。染色后胞质鲜艳、透明性好以及核膜、核仁、染色质结构清晰。细胞核染色液主要为Harris苏木素染液，细胞质染色液主要为EA36染液、EA50染液。巴氏染色液用于细胞脱落标本，细胞核呈蓝色或黑色，角化鳞状细胞胞浆呈粉红或橘红色。 巴氏染色液(Papanicolaou EA50)细胞质染色采用EA50染液，细胞核染色采用无毒改良型苏木素染色液，不仅适用于妇科细胞学涂片染色如筛查宫颈癌和癌前病变，也适用于胸水、腹水、痰液等非妇科细胞样本的染色。 产品组成： 规格名称 G1540 4×100ml G1540 4×500ml Storage 试剂(A):苏木素染色液100ml500ml RT避光试剂(B):蓝化液100ml500ml RT 试剂(C):橘黄G6染色液100ml500ml RT避光试剂(D):EA50染色液100ml500ml RT避光使用说明书1份

自备材料： 固定液如95%乙醇-冰乙酸固定液；系列乙醇；显微镜，盐酸乙醇分化液。操作步骤（仅供参考）： 1、细胞涂片用95%乙醇-冰乙酸固定液固定10～15min。 2、95%的乙醇浸泡1min。 3、80%的乙醇浸泡1min。 4、70%的乙醇浸泡1min。 5、蒸馏水或自来水浸泡或冲洗1min。 6、苏木素染液染色5～10min。 7、自来水冲洗2min。 8、1%的盐酸乙醇分化液分化约4～5s或0.5%盐酸水溶液分化10s。 9、自来水冲洗2min。 10、蓝化液中蓝化2min。 11、自来水冲洗2min。 12、70%的乙醇脱水2min。 13、80%的乙醇脱水2min。 14、95%的乙醇(Ⅰ)(Ⅱ)各脱水2min。 15、橘黄G6染液染色2min。 16、95%的乙醇(Ⅰ)(Ⅱ)各脱水2min。 17、EA50染液染色3～5min。 18、95%的乙醇(Ⅰ)(Ⅱ)各脱水1min。 19、无水乙醇(Ⅰ)(Ⅱ)各脱水1min。

HE染色方法与步骤吐血整理

HE染色 试剂配置 A：0.5~1%的伊红酒精溶液： 称取伊红Y0.5~1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。 B：苏木素染液配方：(配制3000ml，可按比列减少) 苏木精6g 无水乙醇100ml 硫酸铝钾150g 蒸馏水2000ml 碘酸钠1.2g 冰醋酸120ml 甘油900ml 配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。 C：1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可。 染色流程 (1)二甲苯（Ⅰ）15min (2)二甲苯（Ⅱ）15min （3）二甲苯：无水乙醇=1:12min (4)100%乙醇（Ⅰ）5min (5)100%乙醇（Ⅱ）5min (6)80%乙醇5min (7)蒸馏水5min (8)苏木精液染色5min (9)流水稍洗去苏木精液1-3s (10)1%盐酸乙醇1-3s (11)稍水洗10-30s (12)蒸馏水过洗1-2s (13)0.5%伊红液染色1-3min (14)蒸馏水稍洗1-2s (15)80%乙醇稍洗1-2s (16)95%乙醇（Ⅰ）2-3s (17)95%乙醇（Ⅱ）3-5s (18)无水乙醇5-10min (19)石炭酸二甲苯5-10min (20)二甲苯（Ⅰ）2min (21)二甲苯（Ⅱ）2min

(22)二甲苯（Ⅲ）2min (23)中性树胶封固 注：①第（11）、（12）步可省去，（13）步冲水时间需延长至20-30min。 ②第（21）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。 *冷冻切片HE染色步骤： （1）冰冻切片固定10～30s （2）稍水洗1～2s （3）苏木精液染色（60℃）30～60s （4）流水洗去苏木精液5～10s （5）1%盐酸乙醇1～3s （6）稍水洗1～2s （7）促蓝液返蓝5～10s （8）流水冲洗15～30s （9）0.5%曙红液染色30～60s （10）蒸馏水稍洗1～2s （11）80%乙醇1～2s （12）95%乙醇1～2s （13）无水乙醇1～2s （14）石炭酸二甲苯2～3s （15）二甲苯（Ⅰ）2～3s （16）二甲苯（Ⅱ）2～3s （17）中性树胶封固。 注：第（14）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。 染色结果：细胞核蓝色，胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色。 4．12切片脱水透明切片经HE染色后，要彻底脱水透明，才能用中性树胶封盖。如果脱水不彻底，封片后呈白色雾状，镜下观察模糊不清，且容易褪色。切片1-2级无水乙醇脱水，也可使用石碳酸二甲苯进行脱水。石碳酸有较强脱水能力，但长时间可使切片脱色，因此要经过多次二甲苯以使石碳酸完全除去。 5.H-E染色评定标准： （1）切片完整，厚度4-6微米，厚薄均匀，无皱褶无刀痕； （2）染色核浆分明，红蓝适度，透明洁净，封裱美观。 4 染色结果编辑 细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。 着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生活周期及病理变化而改变。例如，很多细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。胶原纤维在老化和出现透明变性时，伊红着色由浅变深。

HE染色步骤

常规HE染色步骤 （1）二甲苯（Ⅰ） 5-10 min (2) 二甲苯（Ⅱ） 5-10 min (3) 95%乙醇（Ⅰ） 1-3 min （4）95%乙醇（Ⅱ） 1-3 min （5）80%乙醇 1 min （6）蒸馏水 1 min （7）苏木精液染色 5-15 min (8 ) 流水稍洗去苏木精液 1-3 s (9) 1%盐酸乙醇 1-3 s (10) 稍水洗 10-30 s (11)促蓝液返蓝 10-30 s (12) 流水冲洗 10-15 min （13）蒸馏水过洗 1-2 s (14) 0.5%曙红液染色 1-3 min (15) 蒸馏水稍洗 1-2 s (16) 80%乙醇稍洗 1-2 s (17) 95%乙醇（Ⅰ） 3-5min (18) 95%乙醇（Ⅱ） 3-5 min (19) 无水乙醇 5-10 min (20) 无水乙醇 5-10 min (21) 二甲苯（Ⅰ） 3-5 min (22) 二甲苯（Ⅱ） 2-5 min (23) 二甲苯（Ⅲ） 3-5 min (24) 中性树胶封固 结果：细胞浆红色，细胞核蓝紫色。 转：常规HE染色步骤 （1）二甲苯（Ⅰ） 5-10 min (2) 二甲苯（Ⅱ） 5-10 min (3) 95%乙醇（Ⅰ） 1-3 min （4）95%乙醇（Ⅱ） 1-3 min （5）80%乙醇 1 min （6）蒸馏水 1 min （7）苏木精液染色 5-15 min

(8 ) 流水稍洗去苏木精液 1-3 s (9) 1%盐酸乙醇 1-3 s (12) 流水冲洗20-30min （13）蒸馏水过洗 1-2 s (14) 0.5%曙红液染色 1-3 min (15) 蒸馏水稍洗 1-2 s (16) 80%乙醇稍洗 1-2 s (17) 95%乙醇（Ⅰ） 2-3 s (18) 95%乙醇（Ⅱ） 3-5 s (19) 无水乙醇 5-10 min (20) 石炭酸二甲苯无水乙醇 5-10 min (21) 二甲苯（Ⅰ） 2 min (22) 二甲苯（Ⅱ） 2 min (23) 二甲苯（Ⅲ） 2 min (24) 中性树胶封固 注：①第（10）、（11）步可省去，（12）步冲水时间需延长至20-30min。 ②第（20）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。 1．取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片。 2．切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（I）5min→二甲苯（Ⅱ）5min （各→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。 两次，然后把水吸干） 3．苏木素染色5min，自来水冲洗。（吸干水） 4．盐酸乙醇分化30s（提插数下）。 5．自来水浸泡15min或温水（约50℃）5min。（吸干水） 6．置伊红液2min。 7．常规脱水，透明，封片：95％乙醇（I）min→95％乙醇（Ⅱ）1min→100％乙醇（I）1min→100％乙醇（Ⅱ）1min→二甲苯石碳酸（3：1）1min（省略）→二甲苯（I）1min→二甲苯（Ⅱ）1min→中性树脂封固。

病理片HE染色步骤

病理片 HE染色步骤： 烤片80度半小时 (1)二甲苯（Ⅰ）5min (2)二甲苯（Ⅱ）5 min (3)二甲苯（III）5min (4)100%乙醇（Ⅰ）2min (5)90%乙醇（Ⅱ） 2 min (6)80%乙醇（III）2min (7)70%乙醇（IV）2 min (8) 流水冲洗5min (9) 苏木精液染色5 min (10) 流水稍洗去苏木精液1-3 s (11) 1%盐酸乙醇1-3 s (12)流水过洗至返蓝 (13) 0.5%伊红液染色1-3 min (14) 蒸馏水稍洗1-2 s (15) 80%乙醇稍洗1-2 s (16) 95%乙醇（Ⅰ）2-3 s (17) 100%乙醇（Ⅱ）3-5 s (18) 二甲苯（Ⅰ）2 min (19) 二甲苯（Ⅱ）2 min (20) 二甲苯（Ⅲ）2 min (21) 中性树胶封固

* 冷冻切片HE染色步骤： （1）冰冻切片固定10～30 s （2）水洗1～2 s （3）苏木精液染色（60℃）30～60 s （4）流水洗去苏木精液5～10 s （5）1%盐酸乙醇1～3 s （6）稍水洗1～2 s （7）促蓝液返蓝 （8）流水冲洗15～30 s （9）0.5%曙红液染色30～60 s （10）蒸馏水洗1～2 s （11）80%乙醇1～2 s （12）95%乙醇1～2 s （13）无水乙醇1～2 s （14）石炭酸二甲苯2～3 s （15）二甲苯（Ⅰ）2～3 s （16）二甲苯（Ⅱ）2～3 s （17）中性树胶封固。 H-E染色评定标准： （1）切片完整，厚度4-6微米，厚薄均匀，无皱褶无刀痕；（2）染色核浆分明，红蓝适度，透明洁净，封裱美观。

HE染色步骤

HE染色法是苏木精（hematoxylin）和伊红（eosin）的首个字母缩写。苏木精是碱性染料，使细胞核染色质和胞质内的核糖体呈紫蓝色。伊红是酸性染料，使细胞质和细胞外基质中带较强碱基的蛋白质成份着红色。 常规he染色步骤： (1)二甲苯（Ⅰ）15min (2) 二甲苯（Ⅱ）15 min （3）二甲苯：无水乙醇=1:1 2min (4)100%乙醇（Ⅰ）5min (5)100%乙醇（Ⅱ）5 min (6)80%乙醇5min (7)蒸馏水5 min (8)苏木精液染色5 min (9) 流水稍洗去苏木精液1-3 s (10) 1%盐酸乙醇1-3 s (11) 稍水洗10-30 s (12)蒸馏水过洗1-2 s (13) 0.5%伊红液染色1-3 min

(14) 蒸馏水稍洗1-2 s (15) 80%乙醇稍洗1-2 s (16) 95%乙醇（Ⅰ）2-3 s (17) 95%乙醇（Ⅱ）3-5 s (18) 无水乙醇5-10 min (19) 石炭酸二甲苯5-10 min (20) 二甲苯（Ⅰ）2 min (21) 二甲苯（Ⅱ）2 min (22) 二甲苯（Ⅲ）2 min (23) 中性树胶封固 注：①第（11）、（12）步可省去，（13）步冲水时间需延长至20-30min。 ②第（21）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。 冷冻切片HE染色步骤： （1）冰冻切片固定10～30 s （2）稍水洗1～2 s （3）苏木精液染色（60℃）30～60 s

（4）流水洗去苏木精液5～10 s （5）1%盐酸乙醇1～3 s （6）稍水洗1～2 s （7）促蓝液返蓝5～10 s （8）流水冲洗15～30 s （9）0.5%曙红液染色30～60 s （10）蒸馏水稍洗1～2 s （11）80%乙醇1～2 s （12）95%乙醇1～2 s （13）无水乙醇1～2 s （14）石炭酸二甲苯2～3 s （15）二甲苯（Ⅰ）2～3 s （16）二甲苯（Ⅱ）2～3 s （17）中性树胶封固。

石蜡切片和HE染色详细步骤

石蜡切片和HE染色详细步骤 石蜡切片和HE染色 方法与步骤 1(取材 颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织(或其他组织)。切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。取下所需要的肝组织，切成一小块2,3mm厚。 注意事项: (1)取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 (2)切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。 2(固定 将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中固定，固定30,50min。 注意事项: (1)一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。 (2)有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。 (3)固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。 (4)材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。

3. 脱水 50%酒精?70%酒精?80%酒精?95%酒精?100%酒精?100%酒精。每级0.5h。 注意事项: (1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。 (2)在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。 (3)在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。 (4)在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。 (5)如需过夜，应停留在70%酒精中。 (6)脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象 4. 透明 1/2二甲苯+1/2无水乙醇 (2h) ?纯二甲苯(1.5h) ?纯二甲苯(1.5h)。由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。 注意事项 (1)使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。 (2)更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。 3)在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱( 水，然后再透明。 5. 浸蜡

巴氏染色液(Papanicolaou EA65)操作步骤及注意事项

巴氏染色液(Papanicolaou EA65)操作步骤及注意事项 货号：G1614 规格：4×100ml/4×500ml 有效期：6个月有效。 产品内容： 产品组成4×100ml4×500ml Storage 试剂(A):苏木素染色液100ml500ml RT避光 试剂(B):蓝化液100ml500ml RT 试剂(C):橘黄G6染色液100ml500ml RT避光 试剂(D):EA65染色液100ml500ml RT避光 产品说明： 细胞学常规染色普遍使用巴氏(Papanicolaou)法。Papanicolaou Stain最初仅用于检测阴道上皮雌激素水平以及生殖道念珠菌、滴虫等病原体。橘黄G6与EA36或EA50联用使用，可将胞浆染成颜色鲜明的绿色、蓝色和粉色。目前大多数实验室采用成品染液，所以每种染液应注意其改良后的最佳条件。最终胞浆染色应透明可见，核染色质应很容易辨别出来。目前改良的巴氏染色液含有多种离子，具有多色性染色效能。染色后胞质鲜艳、透明性好以及核膜、核仁、染色质结构清晰。细胞核染色液主要为Harris苏木素染液，细胞质染色液主要为EA36染液、EA50染液。巴氏染色液用于细胞脱落标本，细胞核呈蓝色或黑色，角化鳞状细胞胞浆呈粉红或橘红色。 巴氏染色液(Papanicolaou EA50)细胞质染色采用EA50染色液，细胞核染色采用无毒改良型苏木素染色液，不仅适用于妇科细胞学涂片染色如筛查宫颈癌和癌前病变，也适用于胸水、腹水、痰液等非妇科细胞样本的染色。

自备材料： 1、固定液(如95%乙醇-冰乙酸固定液) 2、系列乙醇 3、显微镜 4、盐酸乙醇分化液 操作步骤(仅供参考)： 1、细胞涂片用95%乙醇-冰乙酸固定液固定10～15min。 2、95%的乙醇浸泡1min。 3、80%的乙醇浸泡1min。 4、70%的乙醇浸泡1min。 5、蒸馏水或自来水浸泡或冲洗1min。 6、苏木素染液染色5～10min。 7、自来水冲洗2min。 8、1%的盐酸乙醇分化液分化约4～5s或0.5%盐酸水溶液分化10s。 9、自来水冲洗2min。 10、蓝化液中蓝化2min。 11、自来水冲洗2min。 12、70%的乙醇脱水2min。 13、80%的乙醇脱水2min。 14、95%的乙醇(Ⅰ)、(Ⅱ)脱水各2min。 15、橘黄G6染液染色2min。 16、95%的乙醇(Ⅰ)、(Ⅱ)冲洗各2min。