液相色谱进阶讲座之梯度洗脱
主题：液相色谱进阶讲座之梯度洗脱
简介：通过实例详细介绍“梯度洗脱”的意义、应用领域、操作方法以及优化，相信能够使广大网友的液相色谱
技术有一些崭新的提高
欢迎参与交流和讨论
梯度洗脱gradient elution
1 简介
通常情况下，液相色谱操作中的流动相组成和比例是恒定的，这种洗脱化合物的方式被称为等度洗脱；但是为了改善分析结果，某些操作需要连续改变流动相中各溶剂组分的比例以连续改变流动相的极性，使每个分析组分都有合适的容量因子k，并使样品种的所有组分可在最短时间内实现最佳分离，这种洗脱方式称为梯度洗脱。
2 梯度洗脱的应用
梯度洗脱可在下列情形中发挥重要作用：
A 在等度下具有较宽k值的多种样品分析。
B 大分子样品分析。
C 样品含有强保留的干扰物，在目标化合物出峰后设置梯度洗脱，将干扰物洗脱出来，以免其影响下一次分析。
D 单组份化合物方法建立时，不知道其洗脱情况，使用梯度洗脱，找出其较优的洗脱条件。
(1)多组分分析时，这些组分往往具有很宽的k值范围。假如使用等度洗脱，这些化合物的k值无法同时落在1~10之间，结果就是，无法同时得到较好的分离度、较短的分离时间、较高的响应值。
图T1、T2、T3是笔者不同条件下分析邻苯二甲酸酯类化合物得到的色谱图。
图T1 (等度，流动相：80%乙腈水溶液)
图T2 (等度，流动相：100%乙腈)
图T3 (梯度，0-5 min，乙腈由70%上升到90%，5-10 min乙腈由90%上升到100%，10-18min，乙腈100%)
其他色谱条件：
色谱柱：Diamonsil C18(2)，250*4.6 mm，5 μm
流速：1.0 ml/min
检测器：UV254 nm
1 邻苯二甲酸二甲酯(DMP)
2 邻苯二甲酸二乙酯(DEP)
3 邻苯二甲酸二正丙酯(DPrP)
4 邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)
5 邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)
6 邻苯二甲酸二戊酯(DPP)
7 邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)
8 邻苯二甲酸二己酯(DHP)
9 邻苯二甲酸(2-乙基己基)酯(DEHP)
三种洗脱方式对比
条件最小分离度分析时间灵敏度
等度1(T1)＞4＞100 min 1-9，灵敏度逐渐降低，8和9难以检出
等度2(T2)＝0.811 min 1-9，灵敏度逐渐降低，
均较高
梯度(T3)＞325 min 1-9，灵敏度相差不大，
均较高
由该分析案例可知，在多组分分析时，只要能够选出合适的梯度条件，就能够实现“较好的分离度、较短的分离时间、较高的响应值”。
(2) 样品溶液中同时含有目标化合物和强保留化合物，目标化合物流出后使用梯度洗脱将强保留化合物洗下来，以避免强保留化合物污染色谱柱或在后续的分析中流出干扰分析。
T4 某分析项目末端梯度洗脱以洗掉过剩的衍生试剂(末端梯度：39-40 min，有机相含量由38%升高到80%，保持10 min)
由T4可以看出，40 min左右，最晚出峰的组分已经被洗下来，然而却把有机相在1 min内由38%升高到80%，目的就是为了洗脱衍生反应剩余的衍生试剂(50 min处的色谱峰)。前面的杂质峰为样品基质中的强保留干扰物，末端的梯度洗脱同样也将其洗了下来，这就避免了这些化合物在随后的分析中缓慢流出造成的基线起伏。
(3)当遇到新的化合物需要分析，我们没有文献可以参考，只能初步圈定分析模式(反相、正相等等)，此时确定不了等度洗脱的流动相组成和比例，只好借助梯度洗脱。
3 梯度洗脱的原理(以反相色谱为例)
梯度洗脱的实质就是，样品随梯度起点的流动相进入色谱柱入口，由于起点流动相中强洗脱溶剂B含量较低，化合物C1(保留性适中)和化合物C2(保留较强)因k值较高而滞留于色谱柱入口附近(几乎未移动)。一段时间后，B增加到一定数值，C1的k值达到足够小(比如小于10)，其在柱中的移动速率明显增大，并且随着B的增加，其移动速率愈加快速，直到t C1时流出色谱柱，被检测器检测到并被记录成色谱峰C1，t C1虽然比等度时的保留时间长很多，但C1的的平均k值却很小，因而色谱峰并未展宽，灵敏度仍处于较高水平。
B持续增加，在随后的某个时间点，C2的k值也降到10以下，C2的移动速率也开始变快，以与C1类似的方式于t C2被洗脱出色谱柱，其平均k值同样很小，色谱峰亦未展宽，灵敏度处于较高水平。
T5 梯度洗脱过程中的峰迁移
黑色虚线代表B比例的变化(对应左侧上方纵轴)
红色曲线代表化合物k值随流动相改变而发生的变化(对应右侧纵轴)
绿色曲线代表化合物化合物在柱中的位置变化(对应左侧下方纵轴)
紫色曲线为色谱图
4 梯度分离的建立
梯度洗脱可以按下列步骤建立;
A 选择初始条件：色谱柱(类型和规格)、流动相组成、流速、柱温等等
B 根据A的分析结果升高起始流动相中的B%并降低结束流动相中的B%，以去除色谱图中第一个峰出现前的和最后一个峰出现后的无意义时间
C 当峰分离较差或运行时间过长的时候，应通过调整强洗脱溶剂B、B升高速率或使用分段梯度等方式予以解决
D 考察不同仪器对梯度分离的影响。
(1)选择梯度条件
流动相：选择一种强洗脱溶剂和一种弱洗脱溶剂，反相中常用强洗脱溶剂为乙腈和甲醇，弱洗脱溶剂为水,(由于反相中分离的化合物许多具有解离性，所以水相往往有酸、缓冲盐等，这些不在本讲座讨论范围以内，本讲座提到的水相可能包括纯水、缓冲盐水溶液等，具体事例会明确写出)。正相中常用的强洗脱溶剂为甲基叔丁基醚、异丙醇等，弱洗脱溶剂为正己烷。
流速：对于4.6 mm内径的色谱柱一般把流速设定为1.0~1.5 ml/min，其他内径的色谱柱可以以此标准进行换算；
柱温：如有柱温箱，设定柱温35~45 oC为宜；
初始变化速率：可以按下面的公式计算确定
F为流速，单位为ml/min；V m为色谱柱死体积，单位为ml；k*为期望的平均保留因子；△%B为强洗脱溶剂的变动值；t G为梯度时间，单位为min。该公式适用于相对分子量处于50~500之间的化合物。对于150*4.6 mm 的色谱柱，V m约为1.2 ml；流速通常设定为1.0 ml/min；k*为5是比较好的选择；因此△%B/t G应为3.3，也就是B的改变速率设定为3.3%是适宜的，当梯度范围为5%-100%，梯度时间可以设为29 min。
梯度范围：为避免峰遗漏，初始梯度范围最好设置为强洗脱溶剂变动范围为5%-100%，在反相中可以把乙腈的变动范围设置在5%-100%，如果是能够耐受纯水的色谱柱，也可以设定在0%-100%。
梯度形状：在初始梯度实验中，梯度可设置成线性(不分段)，在后续的调整中则可以设置分段梯度，每一段梯度的B变动斜率存在差别。
(2)调整强洗脱溶剂B、梯度变化速率或使用分段梯度等方式以优化梯度条件
流动相对选择性起着至关重要的作用，流动相组成或比例的改变均会显著改变分离度，在梯度中亦然。反相模式梯度的初试中，强洗脱溶剂往往选择乙腈，但乙腈只是在某些项目中具有较好的选择性，而另一些项目甲醇或许更合适。乙腈、甲醇洗脱能力相近，但二者的选择性则具有互补性。
T6、T7、T8是PITC柱前衍生-反相液相色谱分析18种氨基酸的色谱图。T6以乙腈作为强洗脱溶剂，丙氨酸和脯氨酸(7和8)分离度不足1.5；T7以甲醇作为强洗脱溶剂，9后面的组分分离很差。上述表明，甲醇对前面一组峰的分离较好，儿乙腈则更适合后面一组峰，因此笔者把甲醇乙腈混合液作为强洗脱溶剂，T8证明这种混合
溶剂的确能够将18种天然氨基酸、内标物正亮氨酸以及NH3的的分离度达到2.0以上。T6 B为80%乙腈水溶液
T7 B为80%甲醇水溶液
T8 B为甲醇：乙腈：水=20:60:20
其他色谱条件
色谱柱：Diamonsil AAA氨基酸分析柱，250*4.6 mm，5 μm；
流动相B：见谱图上方的描述
流动相A：0.05 mol/L乙酸钠水溶液(pH=6.5)
流速：1.0 ml/min
检测器：UV 254 nm
柱温：35 摄氏度
具体化合物：
1 Asp(天冬氨酸)；
2 Glu(谷氨酸)；
3 Ser(丝氨酸)；
4 Gly(甘氨酸)；
5 His(组氨酸)；
6 Arg(精氨酸)；
7 Thr(苏氨酸)；
8 Ala(丙氨酸)；
9 Pro(脯氨酸)；10 NH3；11 Tyr(酪氨酸)；12 Val(缬氨酸)；13 Met(蛋氨酸)；14 Cys(胱氨酸)；15 Ile(异亮氨酸)；16 Leu(亮氨酸)；17 Nle(正亮氨酸)；18 Phe(苯丙氨酸)；19 Trp(色氨酸)；20 Lys(赖氨酸)
化合物列表与T8上的峰号严格对应。
梯度变化速率
梯度变化速率与平均保留因子k*是成反比关系的，梯度变化速率降低，k*值增加，并会产生如下结果：其一，
各组分间的分离度R提高；其二，色谱峰的区域宽度增加，灵敏度下降；其三，分析时间延长。第一点是积极的，第二、第三点是消极的。所以应在分离度能满足要求的前提下，控制梯度变化速率不要过低。
下面是梯度变化速率的影响：
测试项目为15种农药，唯一变量为梯度变化速率。
T9 甲醇变化速率20%/min，k*=1
T10 甲醇变化速率5%/min，k*=4
T11 甲醇变化速率1%/min，k*=15
其他色谱条件
色谱柱：C18,250*4.6 mm，5 μm
流动相：甲醇，水
流速：1.7 ml/min
柱温：室温
由T9、T10、T11可知，随着强洗脱溶剂变化速率降低，各组分的分离度逐渐增大，分析时间也逐渐延长。
如果改变溶剂、调整梯度变化速率仍不能较好分离则需要改成非线性梯度。下面是偶氮释放的24种芳香胺分析：
T12 偶氮释放的24种芳香胺分析的梯度设置
B为甲醇，A为0.005 mol/L 磷酸二氢铵+0.005mol/L磷酸氢二钠水溶液
T14 色谱图
结合梯度和色谱图可知，1-6是由第一段梯度(蓝色虚线)洗脱下来，B升高速率为0.5%；7-16由第二段梯度(粉色虚线)洗脱下来，B升高速率为0.27%，色谱峰宽度较大；17-24由第三段梯度(绿色虚线)洗脱下来，B升高速率为1.85%，因而峰形最为尖锐。
(3) 不同仪器对梯度分析结果的影响以及消除影响的办法
与等度分析不同，梯度分析时，色谱柱入口的流动相状态并不能与梯度曲线上的流动相状态在时间上准确对应。比如，0 min流动相比例已经开始变化了，这种变化首先由泵或比例阀做出动作，而此刻柱入口处的流动相组成仍是初始流动相，变化的流动相穿过泵或比例阀到柱头之间的空间后才能传达到柱入口，所以色谱柱入口的流动相状态始终滞后于时间程序上的流动相状态。滞后时间tD=VD/F，VD是泵或比例阀到柱头之间的体积，F 为体积流速。
不论是高压梯度还是低压梯度，滞后体积通常处于2~8 mL之间，滞后体积的不同会导致下列现象：
其一，在不同款式仪器上使用相同梯度，保留时间会发生变化；
其二，在一种款式的仪器上开发的梯度洗脱方法换到另一款仪器上，可能会出现分离度下降、峰位置变化等现象
可用用下面的办法消除上述不利影响：
在A仪器上(VD=V1)开发梯度方法，在开发的梯度程序前预先加入5 min等度洗脱(比例与初始流动相比例相同)，并确定这5 min的等度为影响分离，这就可以作为最终的梯度条件；等换到B仪器上(VD=V2)，若V2=V1，
梯度程序不需改变；若V2大于V1，那么应把前面的等度时间调小，减小值应为(V 2-V1)/F；若V2小于V1，那么应把前面的等度时间调大，增加值应为(V1-V2)/F。
说到这里了，您可能会问我该怎样获得仪器准确的滞后时间呢？
您可以这样测定：将色谱柱卸下，用无体积两通将色谱柱入口管线与出口管线连接。以甲醇做A相，0.1%丙酮做B相，流速为1 ml/min，先以B=0%的流动相平衡一段时间，响应值调为0，然后运行梯度，B20min内由0%增到100%，并且在B为100%的条件下平衡20 min，数据采集到40 min左右。从色谱图上找出，响应值达到(最大值-最小值)/2时的保留时间tx，tD=tx-10，VD=TD*F。具体如下图。
讲座部分到此处结束，欢迎大家踊跃参加讨论。
三唑锡的液相色谱分析方法
三唑锡的液相色谱分析方法 薛维家梁孝生孔斌 (山东华阳农药化工集团有限公司271411) Anal y tical Method of Azoc y clotin b y HP LC Xue W ei j ia Lian g Xiaoshen g K on g Bin(Shandon g Hua y an g Pesticide Chem ical Industr y G rou p Lim2 ited C om p an y,T aian271411) Abstract:T he q uantitative anal y sis of azoc y clotin w as undertaken b y IEC,usin g acetonitrile and m ethano1and acetic acid-sodium acetate buffer solution as m obile p hase,the results show ed that the standard deviation,variation coefficient and avera g e recover y w ere0.3519,0.39%and99.75%re2 s p ectivel y.T he m ethod g ave a g ood linear res p onse,correlation coefficient w ere0.9997. K e y w ords:azoc y clotin IEC anal y sis 摘要:本文叙述了采用离子交换液相色谱法,以乙腈+甲醇+醋酸-醋酸钠缓冲溶液作流动相测定三唑锡的含量。该方法标准偏差为0.3519,变异系数0.39%,平均回收率99.75%,方法线性关系良好,其相关系数为0.9997。 关键词:三唑锡离子交换色谱分析 收率,测得的敌百虫和仲丁威的回收率分别在98.56%～100.41%和99.18%～100.52%之间,说明此法的准确度良好。取同一样品采用此法进行5次平行测定,其敌百虫的标准偏差为0.18、变异系数0.74%;仲丁威的标准偏为0.08、变异系数0.57%,说明此法的精密度良好。 实验结果表明,本文建立的气相色谱程序升温法测定40%敌?仲乳油,具有简便、快速、准确,方法的线性关系良好,精密度、准确度符合定量分析要求,可作为敌?仲乳油复配制剂产品质量的有效分析方法。 (收稿日期2001-01-10) 三唑锡是一种高效、广谱、触杀性杀螨剂,其化学名称是三(环己基)-1H-1,2,4-三唑-1-基锡。可防治柑桔、山楂、苹果、葡萄、茄子等作物的全爪螨、叶螨、锈螨等多种害螨,并且对若螨、成螨和夏卵均有很好的防治效果。三唑锡由德国拜耳公司开发、生产,目前国内也有部分厂家生产。对于三唑锡的分析方法,有气相色谱法文献报道,但未见有液相色谱分析方法的报道。我们经过大量实验,采用离子交换高效液相色谱,采用外标法测定三唑锡的含量,具有分离效果好、操作简单、快速、灵敏度高、结果重现性好等特点。 1实验部分 1.1仪器和试剂日本岛津公司生产带可变波 长紫外检测器的高效液相色谱仪;250×4.6mm (i.d.)SCX强阳离子交换不锈钢色谱柱,内装10μm填料;CR-6A色谱数据处理机;25μL进样器;乙腈、甲醇均为色谱纯;冰醋酸、氢氧化钠均为分析纯;二次蒸馏水;于500m L容量瓶中准确称取15.0g冰醋酸和0.20g氢氧化钠,用2次蒸馏水稀释至刻度,配制成醋酸-醋酸钠缓冲溶液(p H= 2.8);三唑锡标准品(已知标准含量≥98%)。1.2色谱条件以乙腈+甲醇+醋酸-醋酸钠缓冲溶液=50+25+25(V/V)为流动相;流量为1.5m L/m in;柱温为室温;检测波长240nm;进样量10μL;在此色谱条件下三唑锡保留时间5.73m in。(下转第23页)
高效液相色谱(HPLC)
高效液相色谱（HPLC）操作规程 一操作 1.准备工作 ⑴流动相的准备 应根据实验选择合适的流动相，所有流动相原则上应选择HPLC级别，水应选择超纯水，并应保持新鲜。 所有流动相在进行实验前应经过相应的脱气处理，脱气时间应根据流动相的量相应增加，但一般超声脱气不应少于20min。 在实验过程中应保证足够的流动相，流动相的量与流速、洗脱时间等有关，应根据具体情况进行准备。 ⑵样品的准备 对于待测的样品，在进样之前应经过滤膜过滤，根据样品的不同选择不同种类、不同直径的滤膜。 2. 排气 打开purge阀，键入stop→prime，直到无气泡停止stop。 B泵同样操作。 关闭purge阀。 3. 开机 打开电脑主机和显示器，点击Galaxie，进入工作站。选择系统，点击Agilent HPLC. 点击overview，可观察仪器各部分状态。 打开泵及检测器的电源。 二 分析方法建立 1.进入工作站系统界面。 点击数据，文件→新建→方法，出现视窗，点击前进即可。 键入方法名和相应描述→点击ok后出现方法文档。 2.210的设定 点击控制→210图标→Elution。 选择流动相A和B的种类。 Compressibility、Pressure Constant以及Refill Time属于内置参数无需设定。 设置A、B流动相的比例，通过改变B的比例设定。 如需梯度洗脱，则根据方法对Equilibrium Time 和Hold Time进行设定。 点击Misscellaneous。 Start Mode选择Inject Trigger on Pump A。 End of Sequence 选择Leave Pump on。 210设定结束。 3.325的设定 点击325图标，选择Signal。 其中Detector Bunch Rate建议设置成2（10Hz），Noise Monitor Length建议设定成64，Response Time建议设定0.5。 根据方法设定相应波长。 其余三项包括Peak Sensor、Relay、Misscellaneous不需设定。 325设定结束。 此时方法已经建立，选择文件，保存方法即可。
高效液相色谱原理
高效液相色谱法（HPLC） 一、方法原理 1、液相色谱法概述 高效液相色谱分析法
其工作流程为：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导人，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据处理系统记录、处理和保存。
HPLC仪器的基本结构 2、高效液相色谱法的特点（HPLC） 与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分
配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。 由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了检出限，缩短了分析时间。 特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。 高沸点有机物的分析、离子型化合物、高分子化合物、热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱法的不足。 高效液相色谱法与气相色谱法相比，各有所长，互相补充。 如果能用气相色谱法分析的样品，一般不用液相色谱法，因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。 3、高效液相色谱法的固定相和流动相 （1）固定相 表面多孔型和全多孔型两大类。 （2）流动相（淋洗液） 流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。 从实用，选用的流动相具有廉价、易购的特点外，还应满足下列要求： ①与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。 ②高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱 性能的改变。 ③与所用的检测器相匹配。 ④应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏 度。 ⑤具有低的黏度（可减少溶质的传质阻力，提高柱 效）和适当低的沸点。
实例解析——高效液相色谱(hplc)
实例解析——高效液相色谱(HPLC) 一、原理 利用不同物质在两相中（液液、液固、离子交换、尺寸排阻）具有不同的分配系数，当二者相对运动时候，物质在两相中反复多次分配，从而使得物质得到完全分离 二、适用范围 高沸点、热不稳定的天然产物、生物大分子、高分子化合物、离子型样品、生化样品三、特点 高压、高效、高灵敏度 四、仪器组成 流动液贮存提供脱气，输液系统、进样系统、分离系统、检测系统，控制记录系统贮液瓶、高压泵、进样器、分离柱、检测器、记录仪 五、仪器选择 由实验条件确定是选用二元高压还是四元低压、一般来说，二元高压的准确度较高。四元低压是先将样品按比例混合再泵入，而二元高压是先泵入不同比例的溶剂再混合。确定采用的脱气系统，一般采用在线脱气。确定进样方式，人工手动六通阀进样，还是进样针自动进样，一个适用于少量样品，一个适用于大量样品。 选择检测器，如果是有较强的紫外吸收的可用紫外可见检测器(二极管阵列检测器)，如果是芳香族化合物，可选用荧光检测器，对于离子可采用电导检测器。 六、实验条件优化 配置待测物质的标准溶液 1、色谱柱的确定 分析样本确定是采用何种类型的色谱柱 (1)分配色谱，两项间分配系数 流动相选用极性的物质（甲醇、乙腈、水）则固定相选择非极性物质。一般用 C18 ODS柱。 (2)吸附色谱， (3)离子交换色谱 各种离子与树脂上交换集团的交换能力不同。固定相：离子交换树脂，流动相 为无机酸、无机碱。常用于分离离子或者可解离的化合物 (4)排阻色谱法 配置含待测物质的标准品溶液，采用不同C18柱分离，检测，对照不同色谱图像，可得到分离效能最高的色谱柱 2、最佳流动相梯度洗脱程序的确定 梯度洗脱：按照一定的程度，不断改变流动相中个溶剂组成的比例以改变流动相的 极性。将色谱柱上不同的组分洗脱出来。 配置不同的梯度洗脱方案，用标准溶液进行试验，并选取能达到最高分离效能的梯 度洗过方案作为最佳流动相梯度洗脱程序 3、流动相的确定 在分离效能相似条件下选择更经济、毒性小的流动相 4、流速确定 流速太大，待分离组分来不及与固定相充分作用，故其中的组分较易被洗脱下来，出峰时间变短，而且柱压比较高，会引起泵负荷的增加，进而导致色谱柱的使用命
液相色谱进阶讲座之梯度洗脱
主题：液相色谱进阶讲座之梯度洗脱 简介：通过实例详细介绍“梯度洗脱”的意义、应用领域、操作方法以及优化，相信能够使广大网友的液相色谱 技术有一些崭新的提高 欢迎参与交流和讨论 梯度洗脱gradient elution 1 简介 通常情况下，液相色谱操作中的流动相组成和比例是恒定的，这种洗脱化合物的方式被称为等度洗脱；但是为了改善分析结果，某些操作需要连续改变流动相中各溶剂组分的比例以连续改变流动相的极性，使每个分析组分都有合适的容量因子k，并使样品种的所有组分可在最短时间内实现最佳分离，这种洗脱方式称为梯度洗脱。 2 梯度洗脱的应用 梯度洗脱可在下列情形中发挥重要作用： A 在等度下具有较宽k值的多种样品分析。 B 大分子样品分析。 C 样品含有强保留的干扰物，在目标化合物出峰后设置梯度洗脱，将干扰物洗脱出来，以免其影响下一次分析。 D 单组份化合物方法建立时，不知道其洗脱情况，使用梯度洗脱，找出其较优的洗脱条件。 (1)多组分分析时，这些组分往往具有很宽的k值范围。假如使用等度洗脱，这些化合物的k值无法同时落在1~10之间，结果就是，无法同时得到较好的分离度、较短的分离时间、较高的响应值。 图T1、T2、T3是笔者不同条件下分析邻苯二甲酸酯类化合物得到的色谱图。 图T1 (等度，流动相：80%乙腈水溶液) 图T2 (等度，流动相：100%乙腈)
图T3 (梯度，0-5 min，乙腈由70%上升到90%，5-10 min乙腈由90%上升到100%，10-18min，乙腈100%) 其他色谱条件： 色谱柱：Diamonsil C18(2)，250*4.6 mm，5 μm 流速：1.0 ml/min 检测器：UV254 nm
高效液相色谱法讲座文稿
高效液相色谱法的应用讲座 z HPLC仪器的介绍，基础知识。 z HPLC在各项分析技术中应用，及一些主要的技术要求、技术细节，着重讲解方法认证的各要素应如何理解和进行试验。并将举更多的实例，使大家对原理和应用有一个更深的认识和体会。 z同时，还将讲述在新药申报和审评中，应注意的问题和事项，并就各剂型的注意事项逐一讲解。 z有关物质的测定方法如何建立，和如何做到更科学、合理地制订一个产品的质量标准，和今后应如何去完善，修改。 z我将还介绍以下Excel软件在我们分析工作中的应用。 z演示一下HP-1100高效液相色谱仪软件的使用技巧 ?大家在工作中应经常总结，理论联系实际，重视文献的查询，不要匆匆忙忙地就进行试验，搞清楚原理，做好试验计划、设计好试验后，再有条不紊地进行。期间不要怕遇到问题，越是遇到问题，解决问题，提高得越快，如果长时间下来，都没有问题，都“一帆风顺”，那将会一直没有提高。这就是同样学历的大学生毕业几年后，水平差异很大的主要原因所在。建立一新药的质量标准时，可查阅其相关品种（结构式很像的），或其前几代品种的质量标准（USP、BP、JP等），一定会有所启发和帮助的。 ?工作的出发点也应一切以工作为主、以人为本！这一点是非常重要的，所有的工作都应该是有意义的，应把力气花在“刀刃”上。不要片面地追求数量，尽量把每一个工作把它做透、做明白，力争做到举一反三、融会贯通，这样遇到问题才能够解决。否则，将会事倍功半。大家应尽量多动脑筋，多思考，如何去提高工作效率，避免人力和物力的不必要浪费！ z HPLC仪的一般操作 1.几大仪器生产厂商的介绍和使用下来的体会。 2.流动相的配制全部混合好后，泵抽滤、超声。不要用两个泵分别将流动相输入，即便是带了脱气机也不要这样操作，除非摸索试验条件。另应特别注意，抽滤所采用的膜。现市场上分别三种：用于水相、有机相，以及混用膜。最好采用混用膜，有一些厂家已发生将膜使用错，将泵堵塞的情况发生。抽滤后最好能再超声片刻。基线如波动过大，或出现毛刺基线时，基本上为气泡所至，再进行一遍抽滤和超声脱气。尤其是梯度洗脱时，更
高效液相色谱法梯度洗脱测定三七中三七皂苷R_1含量
表4 凌霄花喷雾剂对热板法疼痛阈值的影响 组别数量/只用药量痛阈值 x s P值 对照组101ml/20g 2.72 1.6 实验组101ml/20g76.9 7.3 <0.01 2.3.1 灌胃法 取雄性昆明种小鼠30只,体重20 ~22g,随机分为对照组与给药组。对照组给常水0.8m l20g-1,给药组给凌霄花喷雾剂0.8ml20 g-1,45min后放入小鼠活动仪内,记录10m in内各组小鼠活动次数,结果见表5。 表5 凌霄花喷雾剂对小鼠自主活动的影响 实验方法组别n自发活动数抑制率/%P值 灌胃法对照组15133.1 5.9 实验组1568.5 3.2外涂法对照组15130.0 8.8 实验组15110.1 4.848.52<0.01 15.33>0.05 2.3.2 外涂法 取昆明种雄性小鼠30只,体重20 ~22g,随机分为对照组和给药组。各组动物于给药前24h,将背部脊柱两侧去毛,每侧2cm!2cm。对照组给予常水0.6ml/只,给药组给予凌霄花喷雾剂0.6ml/只,均匀涂于脱毛区,45m in后放入小鼠活动仪内,记录各组小鼠10min内活动次数,结果见表5。 3 讨论 本研究结果证明,凌霄花喷雾剂对组织胺所致小鼠皮肤毛细血管通透性增加有显著抑制作用,能使慢性疼痛模型(热板法)痛阈值有显著的提高。外涂给药能明显降低二甲苯致小鼠耳壳炎性肿胀和琼脂所致小鼠足跋庶肿胀程度,口服表现轻度抑制小鼠自主活动的作用。提示凌霄花喷雾剂可能对炎症反应多个环节均有抑制作用,从而缓解炎症反应症状,达到镇痛的目的。结果表明,凌霄花喷雾剂对于临床蚊虫叮咬所致局部痛、痒、肿、胀可以发挥治疗作用。 参考文献: [1] 李仪奎主编.中药药理实验方法学[M].上海:上海科学技术出 版社,1991.3 [2] 陈奇主编,中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社, 1993.9 收稿日期:1999 10 25 高效液相色谱法梯度洗脱测定三七中三七皂苷R1含量 李性天,周密妹,耿立坚,曲春华 (武汉铁路中心医院,湖北武汉430064) [摘要] 目的:以HPLC梯度洗脱测定三七中三七皂苷R1含量。方法:采用Spherico rb NH2柱,流动相为CH3CN CH3OH H2O,梯度洗脱浓度55?30?15#70?20?10,波长210nm,外标一点法测定。结果:以峰面积计算,三七皂苷R1在5~40 g ml-1呈线性相关, =0.994,最低检测限为0.6 g ml-1(S/N=3)。平均回收率102.6%,RSD为1.43%.日内误差RSD= 1.7%(n=5),日间误差RSD=3.0%(n=4)。结论:本法专属性强,结果准确,操作简捷。 [关键词] 三七;三七皂苷R1;高效液相色谱法;含量测定 中图分类号:R927.2 文献标识码:A 文章编号:1001 5213(2000)12 0728 03 Quantitative analysis of notoginsenoside R1in Radix Notoginsen g by HPLC gradient elution mode LI Xing T ian,ZHOU M i Mei,GENG Li Jian,et al(Clinical Pharmacy Institute,Wuhan Central R ailway Hospital,Hubei Wuhan430064) [ABSTRAC T] OBJECTIVE:T o quant itate analyze no to ginsenoside R1in Radix N otoginseng by H PLC gradient elutio n mode. METHODS:T he chromatographic conditions included column Sphericorb NH2,mobile phase of acetonitrile methanol w ater(g radient concentr at ion55?30?15#70?20?10),and detector U V210nm.RESULTS:T he linear range and the limit o f detection for notogin senoside R1w ere w ithin5~40 g ml-1(r=0.9994)and above0.6 g ml-1of by measuring the peak ar ea,r espectiv ely.T he method was accurate(mean recov er y=102.6%,RSD=1.43%).CONCLUSIONS:T he method was proved to be simple and r apid. [KEY WORDS] Radix N otoginseng;notoginsenoside R1;H PLC;determination content 三七中已知单体皂苷成分为达玛烷型的20 (S) 原人参二醇型(如人参皂苷R b1)和20(S)原人参三醇型(如三七皂苷R1)四环三萜皂苷,其中以人参皂苷R b1,R g1和三七皂苷R1为主,含量也最高。三七皂苷R1为其独有成分,以HPLC测定其含量方法可靠、结果准确,但其样品预处理需多次液 液
高效液相色谱法(HPLC)的概述
此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC 主要容包括： 1?高效液相色谱法（HPLC）的概述 2.髙效液相色谱基础知识介绍（1——13楼） 3.髙压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类 4.液相色谱的适用性 5.应用 高效液相色谱法（HPLC）的概述 以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。 由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。 高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。 目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液一液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。C18 （0DS）为最常使用的化学键合相。 根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极
性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。 在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。 系统组成： （一）高压输液系统 由贮液维、脱气装置、高压辙液泵、过滤券、梯度洗脱装置等组成。 1.贮液罐 由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。贮液謹的放置位置要高于泵体，以保持输液靜压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。 2.流动相 流动相常用甲醇-水或乙肠一水为底剂的溶剂系统。 流动相在使用前必须脱气，否则很易在系统的低压部分逸出气泡，气泡的出现不仅影响柱分离效率，还会影响检测器的灵敏度甚至不能正常工作。脱气的方法有加热回流法、抽真空脱气法、超声脱气法和在线真空脱气法等。 3.高压输液泵 是髙效液相色谱仪的关键部件之一，用以完成流动相的输送任务。对泵的要：耐腐蚀、耐高压、无脉冲、输出流量围宽、流速恒定，且泵体易于清洗和维修。高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵（其压力随系统阻力改变而流量不变）。 （二）进样系统 常用六通阀进样器进样，进样量由定量环确定。操作时先将进样器手柄置于釆样位置（L OAD）,此时进样口只与定量环接通，处于常压状态，用微量注射器（体积应大于定量环体积）注入样品溶液，样品停留在定量环中。然后转动手柄至进样位置（INJECT）,使定量环接入输液管路，样品由高压流动相带入色谱柱中。 （三）色谱柱 由柱管和填充剂组成。柱管多用不锈钢制成。柱填充剂有硅胶和化学键合固定相。在化学键合固定相中有十八烷基硅烷键合硅胶（又称ODS柱或C18柱）、辛烷基硅烷键合硅胶（C 8柱)、氨基或飢基键合硅胶等，在中药制剂的定量分析中，主要使用ODS柱。由于ODS属于非极性固
反相高效液相色谱梯度洗脱法测定七叶神安胶囊中人参皂苷Rb3的含量
反相高效液相色谱梯度洗脱法测定七叶神安胶囊中人参皂苷Rb3的含量 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 【摘要】目的建立反相高效液相色谱梯度洗脱法测定七叶神安胶囊中人参皂苷Rb3的含量。方法色谱柱为Hypersil C18(5 μm，4.6 mm×200 mm)，流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液梯度洗脱：0～14 min，19→33；14～16 min，33→49，流速为 1.0 ml/min，检测波长为203 nm，柱温为30℃。结果人参皂苷Rb3进样量在1.769 6 ～10.617 6 μg（r=0.999 9）的范围内线性关系良好，平均回收率为98.22% ，RSD=1.26%。结论该方法简便、准确、重现性好，可用于七叶神安胶囊的质量控制。 【关键词】反相高效液相色谱梯度洗脱法七叶神安胶囊人参皂苷Rb3 Abstract：ObjectiveTo establish the method for determination of the contents of Ginsenoside Rb3 in Qiye Shen’an capsule .Methods The chromatographic conditions included Hypersil C18 column（4.6 mm ×200 mm , 5μm ）and the mobile phase consisted of acetonitril-0.2% phosphoric acid:
0～14 min,19→33；14～16 min,33→49. Detection wavelength was at 203 nm. The flow rate was 1.0 ml/min. Column temperature was at 30℃. ResultsThere was a good linear within the range of 1.7696 ～10.6176μg for Ginsenoside Rb3 with r=0.999 9. The average recovery was 98.22%（RSD=1.26%,n=6）. ConclusionThe method is simple,accurate,reproducible and can be used for the quality control of Qiye Shen’an capsule. Key words：Rp-HPLC Gradient Elution Method； Qiye Shen’an capsule； Ginsenoside Rb3 七叶神安胶囊是由三七叶提取的总皂苷制备而成的，功能益气安神，活血止痛。临床用于心气不足、心血瘀阻所致的心悸、失眠、胸痛、胸闷。本品疗效显著，且毒副作用甚微，因此，临床应用较为广泛。我们采用高效液相色谱法测定本品中所含有效成分人参皂苷Rb3的含量，以控制成品的质量［1～5］。 1 仪器与试药 岛津高效液相色谱仪（包括SCL-10A VP控制器、LC-10AT VP泵、SPD-10A VP检测器、SIL-10AD VP自动进样器、DGU-14A脱气机、CTO-10AS VP柱温箱、CLASS-VP工作站）；KQ-250型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；Mettler M3电子天平（梅特勒公司）；TG328A 分析天平（上海天平仪器厂）。
高效液相色谱法习题集
第12章高效液相色谱法习题 （一）选择题 单选题 1. 在高效液相色谱中影响柱效的主要因素是( ) A 涡流扩散 B 分子扩散 C 传质阻力 D 输液压力 2. 在高效液相色谱中，提高柱效能的有效途径是( ) A 提高流动相流速 B 采用小颗粒固定相 C 提高柱温 D 采用更灵敏的检测器 3. 高效液相色谱法的分离效果比经典液相色谱法高，主要原因是( ) A 流动相种类多 B 操作仪器化 C 采用高效固定相 D 采用高灵敏检测器 4. 在高效液相色谱中，通用型检测器是( ) A 紫外检测器 B 荧光检测器 C 示差折光检测器 D 电导检测器 5. HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为( ) A 柱前压力高 B 流速比GC的快 C 流动相黏度较小 D 柱温低 6．液相色谱定量分析时，要求混合物中每一个组分都出峰的是( ) A 外标标准曲线法 B 内标法 C 面积归一化法 D 外标法 7．下述四种方法中最适宜分离异构体的是是( ) A 吸附色谱 B 反离子对色谱 C 亲和色谱 D 空间排阻色谱 8．在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离( ) A 异构体 B 沸点相近，官能团相同的化合物 C 沸点相差大的试样 D 极性变化范围宽的试样 9．在HPLC中，范氏方程中对柱效影响可以忽略不计的因素是( )
A 涡流扩散 B 纵向扩散 C 固定相传质阻力 D 流动相传质阻力 10．当用硅胶为基质的填料作固定相时，流动相的pH范围应为( ) A 在中性区域 B 5一8 C 1一14 D 2一8 11．高效液相色谱法中，常用的流动相有水、乙腈、甲醇、正己烷，其极性大小顺序为( ) A 乙腈>水>甲醇>正己烷 B 乙腈>甲醇>水>正己烷 C 水> 乙腈>甲醇>正己烷 D 水>甲醇> 乙腈>正己烷 12．高效液相色谱法中,使用高压泵主要是由于( ) A 可加快流速，缩短分析时间 B 高压可使分离效率显著提高 C 采用了细粒度固定相所致 D 采用了填充毛细管柱 13．液相色谱的H-u曲线（）。 A 与气相色谱的一样，存在着H min B H随流动相的流速增加而下降 C H随流动相的流速增加而上升 D H受u影响很小 14. 与气相色谱相比，在液相色谱中（）。 A 分子扩散项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成 B 涡流扩散项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成 C 传质阻力项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成 D 速率方程式同样由三项构成，两者相同 15．液相色谱中不影响色谱峰扩展的因素是（）。 A 涡流扩散项 B 分子扩散项 C 传质扩散项 D 柱压效应 16．在液相色谱中，常用作固定相又可用作键合相基体的物质是（）。 A 分子筛 B 硅胶 C 氧化铝 D 活性炭 17．样品中各组分的出柱顺序与流动相的性质无关的色谱是（）。 A 离子交换色谱 B 环糊精色谱 C 亲和色谱 D 凝胶色谱 18．高效液相色谱法中，对于极性成分，当增大流动相的极性，可使其保留值（）。 A 不变 B 增大 C 减小 D 不一定
高效液相色谱基本常识
被分离组分在柱中的洗脱原理 Ⅱ基本概念和理论 一、基本概念和术语 1.色谱图和峰参数 ⊕色谱图（chromatogram）--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号－时间曲线，又称色谱流出曲线（elution profile）. ⊕基线（base line）--流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 ⊕噪音（noise）――基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 ⊕漂移（drift）基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。 ⊕色谱峰（peak）--组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称性正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰（leading peak）和脱尾峰（tailing peak ）.前者少见。 ⊕拖尾因子（tailing factor,T）--T=B/A,用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子（symmetry factor）或不对称因子（asymmetry factor）《中国药典》规定T应为0.95～1.05。T<0.95为前延峰，T>1.05为拖尾峰。 ⊕峰底――基线上峰的起点至终点的距离。 ⊕峰高（Peak height,h）――峰的最高点至峰底的距离。 ⊕峰宽（peak width,W）--峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=4σ。⊕半峰宽（peak width at half-height,Wh/2）--峰高一半处的峰宽。W h/2＝2.355σ。 ⊕标准偏差（standard deviation, σ）--正态分布曲线x=±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰宽的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。 ⊕峰面积（peak area,A）――峰与峰底所包围的面积。A=×σ×h＝2.507σh=1.064Wh/2h 2.定性参数（保留值） ⊕死时间（dead time,t0）--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。 ⊕死体积（dead volume,V0）――由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其他3部粉只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速） ⊕保留时间（retention time,tR）--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。⊕保留体积（retention volume,VR）--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR＝F*tR . ⊕调整保留时间（adjusted retention time,tR’）--扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间（reduced retention time）。在实验条件（温度、固定相等）一定时，tR’只决定于组分的性质，因此，tR’(或tR)可用于定性。TR’=tR-t0 ⊕调整保留体积（adjusted retention volume,VR’）--扣除死体积后的保留体积。VR=VR-V0 或VR=F*tR’ 3.柱效参数 ⊕理论塔板数（theoretical plate number,N）用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。 N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为： N=（tR/σ）2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2 W：峰宽；σ：曲线拐点处峰宽的一半，即峰高0.607处峰宽的一半。 N为常量时，W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组份含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。 用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更容易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。
高效液相色谱
高效液相色谱仪简介 系别：应用化学系 专业班级：应用化工技术0921 姓名：曹晋波 指导教师：贺永强 运城学院 2012年 5 月
高效液相色谱仪 摘要：高效液相色谱仪高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相) 内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。 关键词：流动相，色谱柱(固定相)，吸附，解吸 1 前言 高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）也叫高压液相色谱（high pressure liquid chromatography）、高速液相色谱（high speed liquid chromatography）、高分离度液相色谱（high resolution liquid chromatography）等。液相色谱分析是指流动相为液体的色谱技术,是色谱法中最古老的一种,但通过改进填料的粒度及柱压,在经典的液相柱色谱的基础上引入了气相色谱的塔板理论,在技术上采用了高压输液泵,高效固定相和高灵敏度的检测器,实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化,这种色谱技术被称为高效液相色谱法是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。又因分析速度快而称为高速液相色谱。 1．1 高效液相色谱发展 1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法(HPLC)正式建立。在此后的时间里，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手
液相色谱讲座
液相色谱讲座--六通阀 HPLC六通阀进样器的使用及保养 六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。 工作原理： 1、手柄装载(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出； 2、将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。虽然六通阀进样器具有结构简单、使用方便、寿命长、日常无需维修等特点，但正确的使用和维护将能增加使用寿命，保护周边设，同时增加分析准确度。如使用得当的话，六通阀进样器一般可连续进样3万次而无需维修。 以下浅谈有关六通阀进样器的使用及保养事宜(仅供参考)： 1、手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。 2、六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75％，20uL的定量环最多进样15uL的样品，并且要求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20uL的定量环最少进样60至100uL的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。推荐采用100uL的平头进样针配合20uL满环进样。 3、可根据进样体积的需要自已制作定量环，一般不要求精确计算定量环的体积，譬如，一根名义上10uL 的定量环，实际是9uL还是10uL并不重要，因为被测样品和校正样品的进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。 4、进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品溶液均要用0.45u的滤膜过滤。防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。并且不定期的断开色谱柱做全阀冲洗。另外一种清洗方法是：采用进样阀附件中的特殊清洗头（乳白色，聚四氟乙烯材料的），配合1mL以上的医用注射器，用纯水和甲醇清洗定量管，清除定量管、排放孔及排放管道中残留的样品中的缓冲盐和有机物。 5、如果进样样品无法去除微粒，则在进样时使用针式过滤器，此时可改用医用的1mL一次性注射器，配合进样阀附件中的特殊针头使用。此种办法最为经济合算，因为医用的一次性注射器价格低廉。需要注意的是，针式过滤器有水性的和油性的区分，不要用错。
高效液相色谱法
第十八章 高效液相色谱法 15.外标法测定黄芩颗粒剂中黄芩苷含量：色谱柱为Zirchrom C8柱（20c m ×，5um ）；流动相为乙腈-甲醇-水（含%三乙胺，磷酸调）（28：18：54）；以黄芩苷对照品配成浓度范围为～ml 的对照品溶液。进样，测得黄芩苷峰面积，以峰面积和对照品浓度求得回归方程为：A=××103，r=.精密称取黄芩颗粒，置于50ml 量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1ml 于10ml 量瓶中，30%甲醇定容到刻度，摇匀即得供试品溶液。平行测定供试品溶液和对照品溶液（ml ），得峰面积分别为4250701，5997670. 解：标样标样 A A c =c 599767042507018.6110 /=样c %4.17%1001255.01050%6=??=-样c w 16．校正因子法测定复方炔诺酮片中炔雌醇的含量：ODS 色谱柱；甲醇-水（60：40）流动相；检测器UV280nm ；对硝基甲苯为内标物。 （1）校正因子的测定：取对硝基甲苯（内标物）、炔诺酮和炔雌醇对照品适量，用甲醇制成10ml 溶液，进样10ul ，记录色谱图。重复三次。测得含ml 内标物、ml 炔诺酮和ml 炔雌醇的对照品溶液平均峰面积列于表18-6。 （2）试样测定：取本品20片，精密称定，求出平均片重（片）。研细后称取（约相当于炔诺酮），用甲醇配制成10ml 供试品溶液（含内标物ml ）。测得峰面积列于表18-6。 表18-6 复方炔诺酮片中各成分及内标物平均峰面积（u v ·s ） 解：02.3)10587.6/(100733.0)10043.1/(10035.0A /m A /m f 55s s =????==醇 醇醇 试样含炔雌醇的量： )mg (449.010841.610387.1100733.002.3A A m f m 55s s =?????=??=醇 醇醇 每片含炔雌醇的量：)/mg 0369.0(3.608 .732449.0片=? 17．测定生物碱试样中黄连碱和小檗碱的含量，称取内标物、黄连碱和小檗碱对照品各0.2000g 配成混合溶液。测得峰面积分别为, 和4.04cm 2。称取0.2400g 内标物和试样0.8560g 同法配制成溶液后，在相同色谱条件下测得峰面积为, 和4.54cm 2。计算试样中黄连碱和小檗碱的含量。