小鼠扁桃体免疫细胞受照射后DNA双链断裂损伤修复的忠实性

第20卷 第2期

2002年5月辐射研究与辐射工艺学报J.Radiat.Res.Radiat.Process.Vo l.20,No.2M ay 2002

小鼠扁桃体免疫细胞受照射后

DNA 双链断裂损伤修复的忠实性

吴 玮 屈昌民 吴代民

(中国人民解放军第三0六医院 北京100101)

摘要 观察了受照射小鼠瓦尔代尔扁桃体环(WRE)在体细胞出现DN A 双链断裂修复的忠

实性,用60Co 射线照射后观察WRE 细胞凋亡的最高峰,在此时间点处死小鼠,取WRE 细胞分

别用脂质体和电穿孔方法介导的基因转染技术,将双标记基因质粒pPMH16导入细胞。研究

WRE 细胞DNA 双链修复的忠实性。结果表明,未照射WR E 细胞的抗G 418转化克隆有69.75%

的gpt 基因表达,说明大部分断裂的g pt 基因被忠实性地修复;2G y 、4Gy 射线照射的WRE 细胞的

转化克隆只有36.05%和21.50%的克隆能正确表达gpt 基因功能,说明WRE 细胞照射后DNA 双

链断裂的修复显著低于正常细胞,且剂量越大,修复的忠实性越低。脂质体和电穿孔方法介导的基

因转染技术可用于原代细胞基因转染的研究,照射后的WRE 细胞易发生DNA 双链断裂错误重

接。

关键词 DNA 修复忠实性,基因转染,WRE 细胞,辐射损伤

中图分类号 Q782,R818.74

总装备部医药卫生重点科研课题基金(299004)资助

第一作者:吴玮,女,1963年8月出生,1998年毕业于第二军医大学博士,临床免疫专业,副主任医师

收稿日期:初稿2001-08-15, 修回2001-11-28

免疫细胞是辐射的高敏感细胞,我们观察到小鼠瓦尔代尔扁桃体环[1](Waldeyer s Ring Equivalent WRE)细胞受照射后,细胞DNA 发生了断裂,这种断裂触发了一系列的凋亡事件。与此同时,DNA 又在进行自身修复,WRE 细胞凋亡率也在经历了凋亡高峰后逐渐减少,然而,这只是断裂的DNA 和WRE 细胞的一个量的恢复。照射后经历了凋亡高峰渐恢复的细胞DNA 质的恢复如何,即基因序列的正确性如何?这将直接影响细胞功能的正常发挥。修复的准确性或忠实性对机体免疫功能的恢复至关重要,本工作用双标记基因质粒DNA 转染技术,对受照射WRE 在体细胞DNA 双链断裂的修复的忠实性进行了探讨。

1 材料和方法

1.1 实验动物

昆明种小鼠,雄性,体重20g 2g,北京医科大学动物中心提供。

1.2 照射条件

采用60Co 射线照射,剂量率为1.5Gy !min -1。

1.3 主要试剂及质粒DNA 的准备

质粒pPMH 16,北京放射医学研究所赠送,带有两个选择标记基因(neo 和g pt)。A 液:DMEM+10%小牛血清,B 液:A 液+2( g/mL PHA+100 /mL IL-2,C 液:B 液+0.75mg /mL G418,D 液:C 液+10%XHATM ,XHAT M 选择培养液含10 g/m L 黄嘌呤、15 g /mL 次黄嘌呤、0.2 g /mL 氨基喋呤、5 g /mL 胸腺嘧啶、25 g /mL 霉酚酸。DNA 抽提试剂盒(Promega 公司产品)。pPMH 16质粒用EcoRV 酶切,然后在紫外分光光度计上测DNA 含量。

1.4 细胞凋亡率的检测及单个核细胞和滋养细胞的制备

采用碘化丙啶(PI)常规方法,根据凋亡测试结果小鼠2Gy 、4Gy 照射后8h 取WRE 组织,

研磨,过200目的尼龙网,常规制备单个核细胞,将单个核细胞种于B 液中,5%CO 237?孵育24h 。150#g 离心收取细胞,加PI,避光室温30m in,流式细胞仪(Coulter ,EPICS-XL ,美国)检测细胞荧光,软件处理,计算细胞凋亡(PCD)细胞数。取未照射组WRE 免疫细胞1#107共5mL,经60Gy 照射后即为滋养细胞。

1.5 脂质体基因转导

脂质体-质粒DNA 复合物的制备:取脂质转染胺Lipofectamine 5 L 加入1640无血清培养基95 L 中混匀30min;而后加入酶切的pPMH16质粒DNA2 g (100 L),两者轻轻混合,调整细胞浓度,照射组为2#106/mL,正常对照组为1#106个/mL ,加入60mm 培养皿中,与脂质体-DNA 复合物轻轻混合,加入700 L 1640无血清培养基中1mL,37?,放置5h 。更换B 液培养48h 。

1.6 电穿孔法基因转导

参照Davis [2]电穿孔法转染细胞,200V,1080 F,1ms ,3?5次,培养48h 。

1.7 DNA 双链断裂修复忠实性检测

pPMH16质粒中的neo 基因表达氨基糖苷磷酸转移酶,使细胞抗新霉素(G418);gpt 基因表达黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶,使细胞能在XHATM 选择培养基中生长,gpt 基因上有EcoRV 酶单一切点,产生一个平齐末端DNA 双链断裂,通过上述脂质体、电穿孔介导的基因转染法,将酶切损伤的pPMH 16质粒DNA 导入细胞中,细胞在B 液中培养48h,转96孔板,每个筛选孔接种数为:正常对照组1#104个/mL 、照射组2#104个/mL,同时接种1#104个/mL 滋养细胞,更换C 液进行选择性培养15?20d,计算G418克隆总数后加入筛选gpt 基因的D 液,继续培养15d,其间3?4d 换液一次,计算抗XHAT M 的克隆数(死亡克隆经台盼蓝染色鉴定),具有G418和XHATM 两种抗性的细胞克隆数所占全部G418转化克隆的百分率,即为受损gpt 基因具有的忠实性修复效率。

1.8 User 、DNA 斑点印迹杂交

按常规方法点样,DNA 样品用前先用95?变性5min,用32P 标记DNA 探针,预杂交2h,再加入带探针的杂交液,杂交12h,洗液后晾干、压片、显影,定影后洗片[3]。

2 结果

2.1 各剂量组照射后不同时间小鼠W RE 细胞凋亡(PCD)的变化

小鼠照射后2h 各剂量组WRE 细胞中PCD 细胞数均较正常组明显增多,但各组达凋亡高峰值的时相不同,依次为:2Gy 组照射后12h;4Gy 组照射后8h 。4Gy 达凋亡高峰值的百分数较高;两个剂量组在36h 时凋亡百分数均接近正常,而后出现再次升高,在照射后10d,4Gy 凋亡率再次达高峰,而2Gy 组这时的凋亡率为4Gy 组的1/2,认为在此时相点上4Gy 组WRE 细胞再次出现了细胞凋亡。在细胞凋亡高峰时研究DNA 双链断裂的修复忠实性可以客观地反映数据的真实性和可参照性。上述实验结果见表1。

2.2 细胞DNA 双链断裂的修复忠实性

酶切后pPMH16质粒DNA 转染到未照射和照射小鼠的WRE 细胞中进行表达可看出明显差别(见表2),未照射WRE 细胞的抗G418转化克隆69.75%有gpt 基因表达,说明大部分断裂的g pt 基因被忠实性修复,2Gy 、4Gy 射线照射的WRE 细胞的转化克隆只有36.05%和147 第2期吴玮等:小鼠扁桃体免疫细胞受照射后DN A 双链断裂损伤修复的忠实性

Tab.1Analysis of apoptotic WRE cells with FAC S at the different time after irradiation

t/h

Apoptotic r ate/%

2G y4Gy

216.320.3322.370.58

425.260.2342.330.61

830.60 1.1348.220.76

1240.700.2933.61 1.04

2427.350.3616.14 1.27

3614.130.15 3.400.36

7210.230.0932.320.45

16815.450.8740.650.17

240 3.870.0949.300.57

n=6,Apo ptotic rate for mean normal WR E cells is3.500.67

21.50%的克隆能正确表达gpt基因功能,说明WRE细胞照射后DNA双链断裂的修复显著低于正常细胞,且剂量越大,重接修复的忠实性越低(正常对照组与两个照射组之间,2Gy、4Gy组之间统计学处理差异非常显著,p<0.001)。表3显示的是电穿孔方法基因转导质粒DNA的正常WRE细胞的DNA重接率以及用脂质体方法的对比,两种方法的结果基本相同,统计学处理无差异。

2.3 pPMH16质粒转染后表达的检测

利用DNA斑点杂交发现,转染pPMH16质粒细胞的DNA为阳性,而未转染细胞和空载体的对照细胞的DNA未显影,这不仅说明了pPMH16质粒在WRE细胞中转染的成功,同时也证实了收集的细胞克隆内被酶切的gpt基因得到了修复。

Tab.2The rejoining ef ficiency of gpt gene in the linearised plasmid pPMH16which

was transf ected into mouse cells with lipof ceamine

Exp. N o

0G y2Gy4Gy

XHAT M(1)/G418%(2)XHAT M(1)/G418%(2)XHA T M(1)/G418%(2)

18.1/11.471.1 6.3/16.538.1 2.4/10.423.1

28.7/13.863.17.3/17.242.4 1.3/7.218.1

39.1/12.075.8 4.2/14.728.6 1.2/6.817.6

47.8/11.369.0 5.9/16.835.1 2.2/8.127.2

x s69.75 2.5636.05 5.65(3)21.50 4.49(1)

(1)T he number of co lonies found to XHAT M(gpt+)among the total G418(neo+)colonies scored,

(2)Persentage meant the proportion of the correctly rejoined gpt gene,(3)p<0.001

Tab.3C omparisin of the rejoining efficiency of the gpt gene obtained using

electroporation with that using lipof ectamine

Ex pt. N o

L ipofectin

XHA T M R(1)/G418R%(2)

Electro poration

XHAT M R(1)/G418R%(2)

18.1/11.471.19.7/14.865.5

28.7/13.863.111.3/15.473.4

39.1/12.075.810.4/14.472.2

47.8/11.369.09.2/13.269.7

x s69.75 2.5670.2 2.25

(1),(2)See the legend in T ab.2

148辐射研究与辐射工艺学报第20卷

3 讨论

免疫细胞的基因转染是许多疾病基因治疗研究以及基因标志研究的前提,由于淋巴细胞的原代细胞培养较难持久,再加上淋巴细胞的体积较小,使淋巴细胞的基因转导较难进行[4-6]。脂质体介导的基因转染方法简便、安全且适合于体内研究。本实验应用脂质体转导方法,通过调整各种影响细胞生长的因素,成功地将pPMH16质粒DNA 导入小鼠WRE 细胞,并获得高的基因转染率,为原代淋巴细胞的基因转染探索了一条途径。实验中发现,调整适量的细胞浓度和血清浓度,加用IL-2、PH A 维持细胞生长增殖,并加用滋养细胞等措施都是维持较长时间淋巴细胞原代培养的必要条件;脂质体、质粒DNA 的用量和转染时间的控制是获得较高基因转染率的关键。由于WRE 细胞体积较小,为避免转染中的误差,我们采用脂质体和电穿孔两种转染法同时进行,结果表明,两种方法的转染率基本相同。

pPMH16质粒是在单基因质粒pSV2gpt 的EcoRI 酶切位点,加入一个带有neo 基因的DNA 片断构建而成的[7,8],它的应用使研究DNA 双链断裂修复的正确性成为可能。以往研究DNA 双链断裂重接修复,所检测的只是群体细胞中双链断裂DNA 的重接率,是一种%量&的衡量,至于断裂DNA 重接是否准确,能否恢复原来正常的结构和功能,仍不清楚,这些不能正确重接所导致的DNA 错误修复,同样可以引起基因突变、染色体畸变和细胞死亡,影响细胞功能的发挥。因此,Debenham 等[9]利用单标记基因质粒来研究细胞的DNA 重接修复忠实性,使DNA 修复的研究由%量&跨入%质&的过程,因为单标记基因质粒导入哺乳动物细胞中,只有一个供筛选转化克隆的选择标记,使DNA 修复忠实性的研究受到限制,即细胞在选择性培养液中发生死亡是由于受损的标记基因未被忠实性修复,还是由于细胞根本没有接受外源基因,很难确定。双标记基因质粒载体的建立和应用,完全解决了上述问题,即用限制性内切酶损伤其中一个标记基因,转染细胞后先以未受损伤的标记基因筛选转化克隆,然后从中检测到受损的基因是否被忠实性修复。

凝胶电泳和流式细胞仪均显示WRE 细胞在4Gy 照射后4?12h 达凋亡高峰,我们选择已经经历了凋亡高峰的WRE 细胞观察其修复的忠实性。结果表明,照射后的WRE 细胞对内切酶EcoRV 作用产生的平齐末端DNA 双链断裂的重接修复忠实性显著低于正常细胞,WRE 细胞照后易发生DNA 错误重组,且照射剂量越大,对DNA 损伤越重,DNA 的双链重接修复率越低,错误修复的机率也就越大。这很可能是免疫细胞为高辐射敏感细胞的主要原因。此外,辐射伤者易患癌症可能与免疫系统低水平DNA 修复的忠实性而致免疫机能下降有直接关系。

参 考 文 献

1 Koor nstr a P J,Dejo ng F ICRS,Vlek L FM et al .Acta Otolaryngol (Stockh),1991,111:591-599

2 Davis L G,Kuehl W M ,Battey J F.N orwalk:Paramount Publishing ,1994,636-641

3 J 萨姆布鲁克,E F 弗里奇,T 曼尼阿蒂斯.分子可隆实验指南.北京:科学出版社,1989,486-489

J,Fritsch E F,M aniatis T.Mo lecular cloning a labor ator y manual,NG ,A Labo rator y M anual.Cold Spr ing har bor L aboratory P ress Sambrook,1989,486-489

4 Br ant M ,N achmansso n N ,N orrman K et al .DNA Cell Biol,1991,10:75-82

5 No vak T J,Y oshimura F K ,Rot henber g E V.Cell Biol,1992,12:1515-1520

6 Rupprecht A P,Coleman D L.J Immunol M ethods,1991,144:157-163

7 周平坤,项晓琼,刘学英等.生物化学杂志,1995,11:412-415

149 第2期吴玮等:小鼠扁桃体免疫细胞受照射后DN A 双链断裂损伤修复的忠实性

150辐射研究与辐射工艺学报第20卷

ZHOU P K,XIA NG X Q,L IU X Y et al.J Biochem,1995,11:412-415

8 T hacker J.M utation Research,1989,220:187-193

9 Debenham P G,Jones N J,Webb M B T et al.M utation Research,1988,199:1-10

THE EFFICIENCY AND FIDELITY OF REJOINING OF THE DNA DOUBLE STRAND BREAK IN THE IMMUNOCYTES OF

TONSILS OF IRRADIATED MIC E

WU Wei QU Chang min WU Daimin

(Chinese PL A306H osp ital,Beij ing100101)

ABSTRAC T T o ex amine the efficiency and fidelity of rejoining of the double strand break (dsb)DNA of the irradiated mouse Waldeyeer s Ring Equivalent(WRE)cells.With lipofec tam ine or electroporation,the linearized plasmid pPMH16w ith two marker genes(neo and gpt) w ere transferred into the WRE cells from irradiated mice.T hrough ordinal G418screen and XHAYM screen,the rejoining efficiency of the broken gpt gene w es evaluated.The rejoining ef ficiency of gpt gene w as69.75%for control WRE cells,and36.05%for the WRE cells gotten form the irradiated mice4h after exposure to2Gy irradiated and21.50%4h after exposure to 4Gy irradiated.The results show ed that the fidelity of the rejoining of dsb of DNA for the irra tiated mouse WRE cells w as low er than that for control,and as the radiation dose increased,the fidelity decreased.Both the lipofectamine or electroporation could be successfully used in g ene transfection for primary culture of mouse WRE cells.And the w rong repair of dsb of DNA in irra diated mouse WRE cells might be caused frequently.

KEYWORDS Fidelity of DNA repair,Gene transferred,Waldeyer s-Ring Equivalent cells,Radiation injury

C LC Q782,R818.74

染色质改构蛋白BRG1在DNA双链断裂修复中的作用及机制研究

染色质改构蛋白BRG1在DNA双链断裂修复中的作用及机制研究基因组是生物遗传信息的载体。基因组的稳定性对于生物个体以及种族的生存与延续都具有至关重要的作用。 然而生物体内的基因组DNA并不是处于一个绝对安全的环境下,细胞内的自身代谢产物以及细胞外的各种毒性因子的刺激都会造成DNA损伤。损伤的DNA 如果不能被及时修复或错误修复就会导致基因突变或缺失,进而危害生物体。 为了维持遗传信息的稳定性,真核生物的DNA通过与组蛋白结合进化出复杂紧密的染色质结构。这种致密的结构虽然可以保护整个基因组尽可能免受内外界刺激因子的影响,但同时,这种结构对于DNA的转录,复制和修复等代谢活动却是一个巨大的障碍。 因此,染色质结构的动态变化在DNA代谢中扮演着重要的角色。DNA双链断 裂(DSBs)是一种严重的致死的DNA损伤类型。 生物体为了应对体内的DNA损伤进化出复杂有序的修复机制,以此来维持机体正常的生命代谢活动。在DNA损伤修复过程中涉及许多蛋白的共同参与,其中包括细胞周期调控蛋白、骨架调节蛋白、DNA损伤修复蛋白、染色质结构调控蛋白等。 BRG1是染色质改构复合物SWI/SNF的核心催化亚基,具有ATP水解酶的活性。已有研究发现,BRG1与肿瘤发生和基因组不稳定性具有紧密联系。 然而,BRG1在DNA双链断裂修复中的作用机制仍不是很明了。本文利用化疗药物依托泊苷(etoposide),博来霉素和紫外激光照射等手段,在体外构建了DNA 双链断裂损伤修复模型。 通过SW13和U2OS细胞存活率实验,我们发现BRG1缺失会明显增加细胞对

DNA损伤药物的敏感性,同时降低受损细胞的生存能力。另外,细胞彗星电泳与免疫荧光实验共同证明了,BRG1对于DNA双链断裂的修复进程具有至关重要的作用。 接下来,我们通过染色质分离提取与染色质免疫共沉淀技术发现,BRG1能够 被募集到DNA损伤位点。真核生物中DNA双链断裂主要有两种修复途径:同源重组修复和非同源重组末端连接修复。 利用DR-GFP与EJ5-GFP报告系统,我们进一步探讨了BRG1参与DNA双链断裂修复的机制。通过流式细胞仪检测DR-GFP与EJ5-GFP报告系统的GFP阳性细胞的比例,我们发现BRG1主要参与同源重组修复途径而不是非同源重组末端连 接修复。 最后,利用免疫荧光,免疫共沉淀以及活细胞示踪观察实验,我们发现BRG1 能够与介导RAD51和RPA替换的RAD52蛋白相互作用,并且调控RAD52在损伤位点的募集,从而调节RPA与RAD51在单链DNA(ssDNA)上的置换过程,进而影响同 源链侵入过程的起始。本文研究揭示了染色质改构因子BRG1参与DNA双链断裂修复的作用机制,为阐明染色质结构与DNA代谢的关系提供了一定的证据。

聚焦DNA双链断裂(DSBs)

最近，有关DNA双链断裂（DSBs）研究成果相继发表在顶级期刊Nature杂志子刊上。首先科学家提出一种利用全基因组技术进行DNA双链断裂（DSBs）作图新方法，相关研究成果荣登Nature Method杂志。于此同时，Nature杂志另一子刊Nature Neuroscience也刊登了一项成果，讲述了引发DNA双链断裂的因素。 Nature.Med：全基因组DSB作图新方法 近日，科学家提出一种利用全基因组技术进行DNA双链断裂(DSBs)作图新方法，这种作图法以单核苷酸为基本单位，称之为BLESS(direct in situ breaks labeling, enrichment on streptavidin and next-generation sequencing)，相关研究论文于2013年3月20日在线发表在Nature Method杂志上。 此项研究由德国法兰克福歌德大学医学院生物化学研究所 II、美国得克萨斯医学科大学转化科学研究院等处研究人员共同完成。 研究人员利用人类和小鼠细胞以及不同的DNA双链断裂(DSBs)诱导因子和测序平台对BLESS法进行验证。BLESS能够识别端粒末端、SCE核酸内切酶诱导的DNA双链断裂以及复杂的DSB全基因组。作为一种原理证明，我们让人类细胞复制压以敏感性基因组为特点，确定了> 2,000非均匀分布的阿非迪霉素敏感区(ASRS)，它们中基因过多，富含微卫星重复序列。人类癌症重排区也富含ASRS，许多癌症相关的基因对复制压具有极高的敏感性。 研究人员称，这种新方法适合各种细胞核实验条件下DSBs全基因组作图，其特异性和分辨率是现在的技术无法实现的。 罗格斯大学的神经遗传学家 Karl Herrup表示，这项工作令人惊叹。DNA 损伤对神经元的伤害极其危险。它无可更换，细胞必须从这些断裂中获取某些有价值的物质。Herrup并未参与此项研究。 加州大学神经科医生 Lennart Mucke，在他研究改变阿尔茨海默氏病(AD)基因组稳定性，偶然发现这种逮捕概念：切断和修复DNA是正常大脑活动的一部分。AD特征?是淀粉样蛋白和受损的神经元DNA纠结成块。带着期望了解更多有关DNA损伤及其相关高水平的淀粉样蛋白，Mucke的团队将研究焦点放在双链DNA断裂上，这是神经科学家认为最严重的损伤形式。 此研究小组揭示了一种自然行为，如探索一种新环境，能引起野生型年轻成年小鼠DNA双链断裂(DSBs)。DNA双链断裂(DSBs)发生在多个脑区域，但在海马齿状回神经最丰富。海马齿状回神经参与学习和记忆，能在24小时内修复。感受器或光刺激下增加的神经元活动，增加了相关神经元DNA双链断裂(DSBs)，而非不相关的神经网络。 人淀粉样前体蛋白(hAPP)转基因小鼠增加了基线神经元DNA双链断裂(DSBs)，且在探索新环境后出现严重和长期的DSBs。其中hAPP可刺激AD关键方面。

DNA损伤修复

黑龙江大学 课程论文 题目：DNA损伤修复---重组修复 系院：生命科学学院 专业：生物工程 起止时间：2013年5月—— 2013年6月 DNA损伤修复---重组修复

摘要：DNA损伤修复(repair of DNA damage)在多种酶的作用下,生物细胞内的DNA分子受到损伤以后恢复结构的现象。 DNA损伤修复的研究有助于了解基因突变机制,衰老和癌变的原因 还可应用于环境致癌因子的检测。DNA损伤的修复模式有很多种 在这里主要谈有关重组修复方面的 关键词：重组修复、同源重组修复、DNA损伤 DNA damage and repair --- recombination repair LiuDongdong (The 1th class of Biotechnology , College of Life Science, Heilongjiang University, Harbin, 150080) Abstract：DNA damage repair (repair of DNA damage) in the role of a variety of enzymes, the DNA molecules within living cells by the phenomenon of structural damage after recovery. DNA damage and repair studies help to understand the reasons for the gene mutation mechanisms, aging and cancer, can also be applied to the detection of the environmental carcinogen. DNA damage repair model there are many, here mainly with regard to recombination repair. Key words：recombination repair、homologous recombination repair、DNA damage 重组修复(recombination repairing)：复制含有嘧啶二聚体或其它结构损伤的DNA，但当复制到损伤的部位时，子代DNA链中与损伤部位相对应的部位出现缺口，新合成的子链比未损伤的DNA链要短一些。完整的母链与有缺口的子链重组，缺口由母链来的核苷酸片段弥补。合成重组后，母链中的缺口通过DNA 多聚酶的作用，合成核苷酸片段，然后由连接酶使新片段与旧链联结，重组修复完成。 重组修复的主要步骤有：复制：含有TT或其他结构损伤的DNA仍然可以正常的进行复制，但当复制到损伤部位时，子代DNA链中与损伤部位相对应的位置出现切口，新合成的子链比未损伤的DNA链要短。重组：完整的母链与有缺口的子链重组，缺口由母链来的核苷酸片段弥补。再合成：重组后母链中的缺口通过DNA多聚酶的作用合成核酸片段，然后由连接酶使新片段与旧链连接，至此重组修复完成。重组修复并没有从亲代DNA中去除二聚体。重组蛋白质则可能通过其蛋白质间相互作用而组成大的蛋白质复合物或重组体,并装配于DNA 受损部位以启动同源重组修复。在对DNA 损伤剂反应时,Rad51、Rad51 同系物及其他许多已知的重组蛋白质共定位于核内,这类核灶区的形成表明DNA 双链断裂修复正在进行[1]。另外,该复制叉也可回行并以一条原始链为模板而进行断裂链修复, 这将导致新合成的两条链退火和在复制叉处形成四道联接,从而完成Rad51依赖性的DNA 同源重组修复[2]。在同源重组配对及链交换过程中Rad51必须首先装配于单链DNA而形成核蛋白细丝, 在该核蛋白细丝中,DNA以高度伸展状态与蛋白

DNA双链断裂与同源重组修复机理研究进展

DNA双链断裂与同源重组修复机理研究进展 卞广兴　郭葆玉 第二军医大学药学院生化药学教研室(上海,200433) 摘要　双链断裂(doub le strand b reak s,D SB s)是细胞染色体复制过程中经常出现的DNA损伤,它的修复过程在真核生物中以同源重组(homo logy recom b inati on,HR)修复为主。正常机体中有着一系列的基因和蛋白及时修复这些损伤,这些蛋白归属于RAD52上位性集团(RAD52ep istasis group)。它们对细胞发挥功能和维持生存意义重大,近来国外研究十分活跃。 关键词　同源重组;双链断裂 1　与HR有关的基因和蛋白 在多种多样的生物体中,基因组保持完整具有极为重要的意义。它是细胞发挥功能和维持生存的必要条件。生物体基因组暴露于离子射线或者受内切酶作用,特别是在染色体自我复制过程中都会出现双链断裂。如果这些断裂未能及时修复就会引起细胞的染色体丢失或导致细胞的死亡。修复不正确也会引起基因的突变和染色体的重组。真核生物对这些断裂的修复有两种机理:非同源末端连接(non2 hom o logy end j o in ing,N H EJ)和同源重组(hom o l2 ogy recom b inati on,HR)。 同源重组是发生在DNA的同源序列之间的重组方式。真核生物非姊妹染色子体的交换,姊妹染色子体的交换,细菌及某些低等真核生物的转化,细菌的转导,接合,噬菌体的重组等都属于这一类型。有人认为,在原核生物中D SB s的修复以HR方式为主;而对于真核生物,其它的修复方式才是主要的。但近几年对酵母和哺乳动物细胞的研究发现,真核生物中的HR不仅在机理上与原核相似,而且具有同等的重要性[1]。 在HR中起重要作用的蛋白归属于R ec A家族,其中R ec A是其中的第一个成员,它是一个由R ec A基因编码的蛋白,在E.coli的HR和DNA复制中起重要作用。近几年来,研究发现了R ec A的很多同源蛋白,如T4噬菌体中的U vsX和哺乳动物细胞中的R ad51等。它们被统称为RAD52上位性集团。包括:RAD50、RAD51、RAD52、RAD54、RAD55、RAD57、RAD59、M R E11和XR S2、XRCC2等。它们的突变缺失细胞都表现出对离子射线的敏感和有丝分裂 无丝分裂缺陷,表明它们是D SB s修复的某条途径的组成部分[2]。其中的不少成员就是在研究射线照射对生物体的作用(radiati on sen si2 tive m u tati on)中发现的,其命名也沿袭了原来的名称(RAD)。从酵母到脊椎动物基因序列的高度保守性表明它们在HR中有着类似的功能。研究中,符合这两者的因子大都可归于RAD52上位性集团。这其中最重要的是RAD51、RAD52和RAD54。 RAD51在所有的细胞中都表达,可能执行链交换的功能。它的作用同R ec A相似,但又不完全相同。Sonoda等[3]把人的RAD51转入鸡B细胞系的D T40细胞发现,RAD51缺失的细胞静息在细胞周期的G2 M期,累积对细胞有毒害作用的染色体断裂并最终死亡。同时发现大多数可探测到的染色体缺失是异染色质型的缺口或断裂,同一染色体的姊妹染色单体在同样的基因座断裂。这表明很多不可修复的裂隙是复制过程中产生的双链断裂的可能原因。尽管RAD51的分布远比其它因子广泛,研究表明它并不是D SB s诱导的所有重组修复形式中应用最广的因子[4]。RAD51在D SB s诱导的同源染色体交换中是必须的,但它对于其他形式的重组,如自发重组(spon taneou s recom b inati on),却并不是必须的。不过,RAD52在已知的这些重组形式中却都是必须的。 RAD52是重组中最重要的蛋白,它在真核细胞中进化保守,原核中基因序列差别较大。R ad52在体内形成多聚体的环,既可以连接DNA链末端又可促进互补链的退火。人的R ad52具有类似的特性。细胞在缺失RAD52的情况下几乎所有形式的HR 都被阻断了[4]。但是研究发现,剔除了RAD52的脊椎动物细胞可以存活而不会象剔除了RAD51等那样严重(死亡),有人认为这可能是细胞中还有其它起类似作用的因子未被发现[5]。 RAD55和RAD57同RAD51具有某些同源

SCGE法检测DNA损伤(包括DNA单链断裂和DNA交联)

SCGE法检测DNA损伤 SCGE的原理（中性电泳液，高盐和变性剂检测双链断裂；碱性检测单链，双链断裂和碱不稳定性） SCGE技术是一种在单细胞水平上检测有核细胞DNA损伤和修复的方法。该技术的原理是基于有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，唯独核DNA仍保持缠绕的环区(Loop)附着在剩余的核骨架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳中核DNA因其分子量大停留在核基质中，经荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。 若细胞受损，在中性电泳液(pH8)中，核DNA仍保持双螺旋结构，偶有单链断裂(SSBs)并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有当DNA双链断裂(DSBs)时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。如果在碱性电泳液(pH>13)中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小即可进入凝胶中，在电泳时断链或碎片离开核DNA向阳极迁移，形成拖尾。细胞核DNA受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强。因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定单个细胞DNA损伤程度。 1. 仪器及试剂 冰箱，载玻片，水平电泳槽，荧光显微镜。 不含Ca2+、Mg2+的PBS (PH=7.4)；正常溶点琼脂糖（NMA）及低溶点琼脂糖（LMA）（0.6％溶于PBS）；细胞裂解液（2.5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1%肌氨酸钠, PH=10, 用前加1％TritonX-100, 10% 二甲亚砜（DMSO））；电泳缓冲液（0.3 M NaOH, 1 mM Na2EDTA, PH=13）；0.4 M Tris-HCl（PH=7.5）；无水乙醇；20-30μg/mL 溴化乙锭（EB）。 2. 方法 1.在体外实验中,将对数期生长的细胞用0.25%胰蛋白酶消化,收集细胞备用。在体内实验中,取需测试的脏器或组织,用磷酸缓冲液( PBS,PH 7.4) 洗净后,剪至糜状滴加PBS(PH 7.4) 研磨,过300 目筛子,收集细胞,悬浮于PBS(PH 7.4) 中, 细胞密度为（1-5） x 104-6个/ mL （血细胞计数板最中央每小格0.5个细胞）,台盼蓝染色、镜检、细胞存活率90 %以上,即可进行以下操作。 2.样品处理： 1）通过尾动脉取血，肝素或枸椽酸钠抗凝，800r/min离心5min，加等体积无钙镁磷酸缓冲液，获得细胞悬液。 a.枸椽酸钠抗凝:有2Na 3C 6 H 5 O 7 。和2Na 3 C 6 H 5 ·11H2O等多种晶体。通常用前者配成 109mmol/l(32g/l)水溶液（也有用106mmol/l浓度），与血液按1：9或1：4比例使用。枸椽钠对凝血V因子有较好的保护作用。 b.肝素（heparin）每毫升血液抗凝需要持素15±2.5Iu.

DNA的损伤与修复习题

第五章 DNA的损伤与修复习题 一、单选题 1、紫外线照射使DNA 分子损伤后碱基之间形成二聚体, 其中最常见的形式是(D) A. C-C B. C-T C. T-U D. T-T E. U-C 2、DNA损伤后切除修复的说法中错误的是（A） A．切除修复包括有重组修复及SOS修复 B．修复机制中以切除修复最为重要 C．切除修复包括糖基化酶起始作用的修复 D．切除修复中有以UVrABC 进行的修复 E．是对DNA 损伤部位进行切除, 随后进行正确 3、胸腺嘧啶二聚体阻碍DNA合成的机制是（C） A．使DNA模板链断裂 B．修复机制中以切除修复最为重要 C．切除修复包括糖基化酶起始作用的修复 D．使两股DNA链间形成负超螺旋 E．使dNTP无法进入DNA合成链 4.紫外线照射对DNA分子的损伤主要是( 4 ) A．碱基替换 B.磷酸酯键断裂 C.碱基丢失 D.形成共价连接的嘧啶二聚体 5.关于大肠杆菌DNA聚合酶I下列说法错误的是(E) A．对复制及修复过程中的空隙进行填补 B．有5’→3’核酸外切酶活性 C．有3’→5’核酸外切酶活性 D．以dNTP为底物 E．有5’→3’核酸内切酶活性 6．下列能引起移码突变的是(D) A．点突变 B．转换同型碱基 C．颠换异型碱基 D．缺失 E．插入3个或3的倍数个核苷酸 7．紫外线照射造成的DNA损伤并形成二聚体主要发生在下列哪一对碱基之间(B) A．A－T B．T－T C．T－C D．C－C E．U－C 8．与DNA修复过程缺陷有关的疾病是(B) A．卟啉症 B．着色性干皮病 C．黄疸 D．痛风症 E．苯酮酸尿症 9．根据F．Crick中心法则，遗传信息的传递方式是(C) A．蛋白质→RNA→DNA B．RNA→DNA→蛋白质 C．DNA→RNA→蛋白质 D．RNA→RNA→DNA E．DNA→DNA→蛋白质10．亚硝酸盐引起分子的突变是(D) A．形成嘧啶二聚体 B．Glu→Gln C．A→G D．C→U E．碱基甲基化11．胸腺嘧啶二聚体阻碍DNA合成的机制是(A) A．DNA的合成将停止在二聚体处并使其合成受阻 B．使DNA聚合酶失活 C．使DNA模板链断裂 D．使两股DNA链间形成负超螺旋 E．使dNTP无法进入DNA合成链 12．镰刀状红细胞贫血与β链有关的突变是(E) A．插入 B．断裂 C．缺失 D．交联 E．点突变 13．比较真核生物与原核生物的DNA复制，二者的相同之处是(B)

DNA损伤修复通路

DNA损伤修复通路 一． DNA损伤检验点与损伤修复及基因组稳定性_英文_刘巍峰 DNA 损伤检查点通路是高度的保守的细胞过程。它的很多元素在低等真核生物与多细胞高等生物之间有功能同源性。整个通路可以大致分分为三部分，即损伤感受器、信号传感器和信号效应器。磷脂酰肌醇 -3-OH 激酶样激酶、 ATM、ATR 的激活是通路激活的第一步。激活的 ATM 和 ATR，通过一类传感器媒介，激活效应激酶 CHK1 和 CHK2。停止或减缓细胞周期进程。 在无应力条件下， ATM以不活泼的同聚二聚体存在。基因组中的 DNA 双链断裂导致高级染色质结构的一些微妙变化，使 ATM 蛋白的构象变化，这个促进ATM单体的 1981 丝氨酸的分子间的快速磷酸化，引起二聚体解离。激活的单体作用于它的许多下游底物，如 p53 ，NBS1、BRCA1和 SMC1. 因此， DSB 那样的 DNA 损伤导致 ATM 激活通过两个不同的步骤：（ 1）染色质结构损伤部位的真实变化诱导快速的分子间自磷酸化和二聚体解体；（2）活化的 ATM 单体定位损坏部位以进一步作用于下游子，在 ATM 的定位过程中， MRN（MRE11- RAD50-NBS1 ）复合物发挥重要作用。它可以以独立于 ATM 的方式快速定位于双链断裂损伤点。最近的研究结果表明 MRN 的 NBS1 亚基可以直接与 ATM 相互作用。此外， MRN复合物累积在 DSB，可通过解散 DSB末端进一步刺激 ATM 激酶活性。 相比于 ATM 活动的快速增长在细胞暴露于电离辐射后，活性ATR激酶的变化不明 显。然而，已经证明了 ATR 通路是防止复制的起源过度激活的关键，即使没有任何外界的 DNA 损伤。此外， ATR敲除小鼠是致死的，暗示了 ATR在正常细胞功能中的重要作用。 DNA 复制、 DNA 重组和 DNA 修复等过程产生的单链 DNA 很快被复制蛋白 A （RPA）占据，它可与 ATRIP 亚基结合，以募集 ATR-ATRIP 复合物到 DNA 单链区域。招募的 ATR 现在可以在其底物上发挥作用如 RAD17 和CHK1。与在 ATM 通过增加自身活性来激活检查点通路不同， ATR 的功能的合适发挥很大程度上取决于它的位置。除了 RPA之外，有效的磷酸化 ATR下游底物的需要 RAD17-RCF2-5 复合体， PCNA类似物 Rad9-Hus1-Rad1 复合物和

DNA突变与损伤修复

DNA突变与损伤修复 一、DNA突变概念 DNA突变是指个别dNMP（脱氧单磷酸核苷）残基以至片段DNA在结构、复制或表型功能的异常变化，也称为DNA损伤。 DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，因此维护DNA分子的完整性对细胞至关紧要。外界环境和生物体内部的因素都经常会导致DNA分子的损伤或改变，而且与RNA及蛋白质可以在细胞内大量合成不同，一般在一个原核细胞中只有一份DNA，在真核二倍体细胞中相同的DNA也只有一对，如果DNA的损伤或遗传信息的改变不能更正，对体细胞就可能影响其功能或生存，对生殖细胞则可能影响到后代。所以在进化过程中生物细胞所获得的修复DNA损伤的能力就显得十分重要，也是生物能保持遗传稳定性之所在。在细胞中能进行修复的生物大分子也就只有DNA，反映了DNA对生命的重要性。另一方面，在生物进化中突变又是与遗传相对立统一而普遍存在的现象，DNA分子的变化并不是全部都能被修复成原样的，正因为如此生物才会有变异、有进化。 二、DNA突变主要形式 1、自发性损伤 2、物理因素引起的损伤 3、化学因素引起的损伤DNA的损伤修复 三、DNA损伤修复机制 DNA损伤修复(repair of DNA damage)在多种酶的作用下，生物细胞内的DNA分子受到损伤以后恢复结构的现象。 DNA损伤修复的研究有助于了解基因突变的机制，衰老和癌变的原因，还可应用于环境致癌因子的检测。 1、光复活修复机制 紫外线可造成彼此相邻的嘧啶碱基形成二聚体（嘧啶二聚体会减弱了双链之间氢键作用，引起了DNA变形。如果生物体内修复系统失灵，则细胞走向死亡），该二聚体可被一种光裂解酶打开，恢复到正常碱基状态。 2、切除修复 （1）切除修复：切除修复是在DNA内切酶，DNA外切酶，DNA连接酶等共同作用下，将DNA分子受损伤部分切除，并以完整的一条链为模板，合成切除的部分使DNA恢复到正常结构的过程。 （2）DNA糖苷酶修复及AP核酸酶修复途径：自然状态下，DNA双链上的碱基特别是鸟嘌呤可发生自然脱落（37℃，20h一个哺乳动物细胞可自发脱鸟嘌呤10000个）若经诱变损伤更多。经糖苷酶作用产生大量AP位点（即无嘌呤或无嘧啶位点），AP核酸内切酶可识别细胞内AP位点，切开AP位点附近DNA链，然