三疣梭子蟹抗菌肽基因的克隆
第41卷 第2期 海 洋 与 湖 沼
Vol.41, No.2 2010年
3月
OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA
Mar., 2010
* 国家科技支撑计划项目, 2007BAD43B08号; 浙江省重大科技专项重大项目, 2007C02001号; 浙江省面上项目, 2009C32019号; 浙江省教育厅项目, 20061141号。申 望, 讲师, E-mail ：shenwangzs@https://www.wendangku.net/doc/c116536243.html,
① 通讯作者: 王日昕, 教授, E-mail ：wangrixin1123@https://www.wendangku.net/doc/c116536243.html, 收稿日期: 2009-06-19, 收修改稿日期: 2009-08-25
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus ) Pthyastatin
抗菌肽基因的克隆与表达分析*
申 望 叶 茂 石 戈 王日昕①
(海洋生物资源及分子工程实验室 浙江海洋学院海洋科学学院 舟山 316004)
提要 采用构建三疣梭子蟹血细胞全长cDNA 文库的方法克隆了一个新型抗菌肽基因Pthyastatin, 并用荧光定量RT-PCR 方法, 进行Pthyastatin 的表达研究。结果表明, Pthyastatin 前体由16个氨基酸残基的信号肽和成熟肽两部分组成, 其中Pthyastatin 成熟肽有两个结构域：N 端的富含Pro/Arg 结构域和C 端的包含6个保守Cys 残基与对虾抗菌肽penaeidins 同源的结构域, 表明Pthyastatin 属于对虾抗菌肽penaeidins 家族; 荧光定量RT-PCR 分析结果表明Pthyastatin 在血细胞中高水平组成型表达; 致病菌副溶血弧菌诱导后Pthyastatin 在血细胞中表达先下调、后上调, 在诱导后24h 表达量又基本恢复到诱导前水平, 支持Pthyastatin 在血细胞中高水平组成型表达的观点, 但致病菌诱导后表达变化机制不明。
关键词 三疣梭子蟹, 血细胞, 抗菌肽, Pthyastatin, mRNA 表达 中图分类号 Q956
无脊椎动物体液中没有免疫球蛋白, 因此缺乏抗体介导的特异性免疫系统, 依赖先天性非特异免疫系统识别和清除入侵的微生物, 维持机体健康(Begum et al , 2000)。甲壳动物是无脊椎动物中一个重要类群, 同时虾、蟹是大宗养殖品种, 有巨大经济价值, 研究甲壳动物非特异免疫机理可为甲壳动物养殖疾病防治提供理论依据和新的思路, 因此该领域一直是无脊椎动物免疫系统的研究热点。已报道的甲壳动物体液免疫相关因子主要有抗菌肽、溶菌酶、酚氧化还原酶、凝集素、脂多糖/β1, 3-葡聚糖结合蛋白、细胞粘着蛋白、蛋白酶抑制剂等(Iwanaga et al , 2005)。其中甲壳动物抗菌肽由于具有广谱抗细菌、抗真菌活性以及独特的作用机理, 在医学和农业上具有潜在的应用价值, 极有可能成为抗菌、抗病毒及抗肿瘤药物的新来源而备受关注(李义等, 2006)。
甲壳动物抗菌肽根据结构和来源可大致归为三个家族(Lee et al , 2003; Vazquez et al , 2009)：(1) 对虾
抗菌肽Penaeidins 家族：N 端富含脯氨酸, C 端含有6个Cys, 形成3个分子内二硫键, 两个结构域的功能互补, 富含脯氨酸的N 端结构域在锚定微生物的细胞膜中起重要作用, 而富含Cys 的C 端结构域则起抗菌作用; (2) Crustins 家族抗菌肽：Crustins 家族抗菌肽以其C 端的WAP(whey acidic protein)结构域为标志, 与甲壳类中发现的其它富含Cys 的抗菌肽区分开来(如同样富含Cys 但不含WAP 结构域的Penaeidins), WAP 结构域是由8个保守的Cys 位点形成四个二硫键构成的一个紧密结构, 因此又被称作4-DSC 核(four-disulphide core); (3) 血蓝蛋白水解产生的抗菌肽：该类型抗菌肽可能来源于蛋白水解酶对血蓝蛋白的加工, 与血蓝蛋白C 端部分区段高度同源或完全相同, 如细角滨对虾(Penaeus stylirostris )抗菌肽PsHct1、PsHct2, 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei )抗菌肽PvHct, 淡水螯虾(Pacifastacus leniusculus )抗菌肽astacidin 1等。
2期申望等: 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) Pthyastatin抗菌肽基因的克隆与表达分析 247
抗菌肽Hyastatin是Sperstad等(2009b)从蛛形互爱蟹(Hyas araneus)血细胞中纯化鉴定的一种对G+/G-菌、真菌均有抑制活性的新型抗菌肽, 其C端结构域与对虾抗菌肽Penaeidins同源, 也有6个保守的Cys残基, 形成3对分子内二硫键, 因此Hyastatin 属于Penaeidins家族抗菌肽。本研究通过对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)血细胞全长cDNA文库克隆进行测序, 克隆到与蛛形互爱蟹Hyastatin同源, 但结构存在显著差异的新型Hyastatin(命名为Pthyastatin)抗菌肽全长cDNA序列, 并对不同组织中Pthyastatin 表达量差异及感染致病菌副溶血弧菌(Vibrio para-haemolyticus)后血细胞中Pthyastatin表达量变化进行分析, 为研究Pthyastatin在三疣梭子蟹免疫防御反应过程的地位和作用机制奠定基础。
1材料与方法
1.1三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库的构建及
Pthyastatin基因克隆
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)采自浙江舟山海域。成年雄性蟹采集后饲养于恒温水族箱(25℃), 饲养24h后, 以内含抗凝剂(0.45mol/L NaCl, 0.1mol/L 葡萄糖, 26mmol/L柠檬酸, 30mmol/L柠檬酸钠, 10mmol/L EDTA, pH 4.6; S?derh?ll et al, 1983)的注射器从蟹肢体未硬化部位抽取血淋巴, 立即离心(4℃, 2000g, 5min)收集血细胞, 采用TRIZOL法提取血细胞总RNA, mRNA的分离按Invitrogen公司FastTrack 2.0Kit试剂盒操作手册进行, 通过poly(T)纤维素柱亲和层析, 从血细胞总RNA中得poly A+ mRNA。全长cDNA文库的构建按Clontech公司SMART cDNA全长文库构建试剂盒说明书进行, 连接载体使用pGEM-T easy T载体, 转化菌株为E. coli (DH10B)。文库随机测序使用引物M13F (5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3′), 当由于poly(A)的出现使测序效果差时改用引物M13R (5′- CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3′)反向测序。测得的ESTs序列通过BLASTX 检索Genbank nr蛋白数据库寻找同源基因。
1.2三疣梭子蟹抗菌肽Pthyastatin的分析
1.2.1三疣梭子蟹抗菌肽Pthyastatin序列分析DNSP 4.10分析Pthyastatin单倍型多态位点、核苷酸多样性、单倍型频率、单倍型多样性(Rozas et al, 2003); SignalP 3.0在线分析信号肽序列(Emanuelsson et al, 2007); 核苷酸及氨基酸序列比对使用Clustal W (Thompson et al, 1994); 等电点预测使用ExPASy服务器的 Compute pI/Mw tool (https://www.wendangku.net/doc/c116536243.html,/ tools/ pi_tool.html) (Bjellqvist et al, 1994)。
1.2.2系统发生分析三疣梭子蟹抗菌肽Pthyastatin氨基酸序列和以下抗菌肽进行序列比对(Sperstad et al, 2009b)：蛛形互爱蟹抗菌肽Hyastatin (ACQ76432), 凡纳滨对虾抗菌肽penaeidin-2 (CAA75142), penaeidin-3a1 (AAK73084), penaeidin- 3d(AAK77533), PEN4-1 (ABA55000)和penaeidin-1 (P81056), 白滨对虾(L. setiferus)抗菌肽penaeidin-2d (AAK83453), penaeidin- 3l (AAK83454)和penaeidin- 4d (AAK83455), 斑节对虾(Penaeus monodo)抗菌肽penaeidin (AAQ05769), 南方滨对虾(L. schmitti)抗菌肽PEN4-1(AAX58699)和PEN2-1 (AAX58697), 中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)抗菌肽penaeidin-5-1 (AAZ79334) 和penaeidin-3-1 (AAP33450), 细角滨对虾抗菌肽penaeidin-2 (AAQ62565)和penaeidin-3 (AAQ62566), 长毛明对虾(F. penicillatus)抗菌肽pen3-p (ABY56821), 保罗美对虾(Farfantepenaeus paulensis)抗菌肽PEN2-1 (AAX58695), 巴西美对虾(F. brasiliensis)抗菌肽penaeidin (ABO93324), 小褐美对虾(F. subtilis)抗菌肽penaeidin (ABO93321)。切除所有抗菌肽C端Cys富集区第一个Cys残基前的N端序列, MEGA 4.1软件包(Kumar et al, 2008)中邻接法(nerghbor-joining method, NJ)构建系统树, 参数设置为默认的泊松校正算法, 不考虑插入/缺失位点, 同时应用自举检验(bootstrap test)重抽样500次估计系统树中节点的自引导值(bootstrap value)。
1.3Pthyastatin基因表达的荧光定量RT-PCR分析1.3.1 Pthyastatin基因在三疣梭子蟹不同组织中的差异表达分析从5只雄性三疣梭子蟹分别采集等量的血细胞、肌肉、肝胰脏、眼组织, 按组织差别将5个体来源的组织合并后提取总RNA。血细胞总RNA 提取按 1.1方法进行; 其它组织采集后先液氮研磨, 再用TRIZOL法提取总RNA。分别以4个组织的总RNA为模板, oligo(dT)18为引物, 按全式金EasyScript Reverse Transcriptase说明书操作反转录合成cDNA 第一链。以三疣梭子蟹核糖体蛋白S18(RpS18)为内参基因采用荧光定量RT-PCR技术研究Pthyastatin基因在不同组织中的差异表达。RpS18基因 RT-PCR引物：Ptrs18-F：5′- AGG AGG AGG TTG AGA AGA TTG T-3′, Ptrs18-R：5′-GCA GCT TGG TTT CCA GGT AG-3′, 扩增片段长度141bp; Pthyastatin基因RT-PCR 引物：Pthya-F：5′-CGG GAG TAG TTG GAG TCA
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GTC-3′, Pthya-R：5′-CAC CTC GCA TTA CCG CTT-3′, 扩增片段长度151bp。RT-PCR反应体系：第1链cDNA 2μl, SYBR Premix Ex Taq TM(2×) 12.5μl, 上游引物0.5μl (10μmol/L), 下游引物0.5μl (10μmol/L), 加9.5μl 去离子水至总体积25μl, 复孔数均为3。扩增条件：95℃预变性2min; 94℃变性10s, 60℃ 40s, 40个循环。反应在ABI 7500Fast实时定量PCR仪上进行, 定量的数据结果采用2－△△Ct法(Livak et al, 2001)进行分析。
1.3.2三疣梭子蟹血细胞Pthyastatin基因在副溶血弧菌诱导下表达的时空差异分析副溶血弧菌在LB液体培养基扩大培养后离心收集细菌, 无菌去离子水洗涤3次, 最后用无菌去离子水稀释到109 CFU/ml备用。5只雄性三疣梭子蟹(重250—300g/只)在恒温水族箱(25℃)暂养24h后, 每只抽取0.3ml血淋巴, 合并后按1.1方法提取总RNA, 然后每只蟹注射50μl菌液, 并在注射菌液后的3、6、12、24h时如前所述抽取血淋巴并提取总RNA。实时荧光定量PCR分析操作按1.3.1进行。2结果
2.1三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库的构建与测序
采用Clontech公司SMART 技术成功构建了三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库。在测序的克隆中有37个克隆的核苷酸序列经BLAST X检索Genbank nr 蛋白数据库发现与蛛形互爱蟹Hyastatin基因同源。
2.2三疣梭子蟹Pthyastatin基因的序列分析
测序的37个Pthyastatin克隆都由5′-UTR、编码区、3′-UTR和poly(A)组成, 长度介于818—848bp [不包括poly(A)]之间, 长度差异主要出现在3′-UTR末端, 可能是由于转录体3′末端剪切加poly(A)过程中剪切差异引起的, 典型Pthyastatin基因及编码的氨基酸序列如图1所示, 信号肽序列为N端16个氨基酸残基(图1)。成熟肽理论等电点pI为9.91, 是一个碱性多肽。删除3′-UTR末端不匹配部分后, 保留822个核苷酸位点, 经DNSP4.10分析共检测到插入/缺失位点6个, 多态位点20个, 其中单碱基突变位点11个, 简约信息位点9个。在37个克隆中共定义了18
个单倍型, 单倍型多样性(h)为
0.887 (表1)。所有单倍型都提
交GenBank数据库, 在数据库
中的登录号为：GU111230—
GU111247。
18个单倍型编码区共编
码8个不同多肽, 其中3个多
肽(Hap_3、Hap_15、Hap_18)
由于有单碱基插入发生移码突
变(重测序验证表明非测序错
误), 均编码107个氨基酸残基,
而5个Pthyastatin多肽, 分别
编码127(Hap_10)和129(Hap_
1、Hap_7、Hap_11、Hap_13)
个氨基酸残基。氨基酸序列比
对显示3个移码突变多肽与5
个Pthyastatin多肽N端64个
氨基酸残基完全相同, 而C端
由于移码而无同源性。BLAST
检索NCBI nr蛋白库未发现与
3个移码突变多肽显著同源的
蛋白质或多肽。
5个三疣梭子蟹Pthyas-
tatin前体氨基酸残基序列比
图1 三疣梭子蟹Pthyastatin核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig.1 The cDNA nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Pthyastatin 注：下划线示信号肽; 方框示加尾信号; 星号示终止密码子
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表1 三疣梭子蟹Pthyastatin 的多态位点、核苷酸多样性、
单倍型多样性
Tab.1 The polymorphic sites, nucleotide polymorphism and
haplotype diversity of the Pthyastatin
单倍型编号 1222222222222223334444555556667
42222223377778803813360778808983456789394789032210027348681021单倍型频率Hap_1 TTGGAGTT-AAGG-C-AGCGCC-CGTTTTAG 7 Hap_2 ........-....-.-..T...-........ 1 Hap_3 ........TG...-.-...AA.-.......C 1 Hap_4 ........-G...-.-...AA.-.-...... 1 Hap_5 ........-G...-.-...AA.-........8 Hap_6 ........-G...-.-...AA.-....C... 2 Hap_7 ........-G...-.-...AA.-......G. 4 Hap_8 ........-G...-.-...AA.-..C..... 1 Hap_9 ........-G...-.-...AA.-...C.... 1 Hap_10 .------.-G...-.-...AA.C........ 1 Hap_11 ........-G...-.-.A.AA.-........ 1 Hap_12 .......C-G...-.-...AA.-........ 1 Hap_13 ........-GTCC-T-...AA.-........ 1 Hap_14 ........-....-.-G....A-T....... 2 Hap_15 C.......-....-.A.....A-T....... 1 Hap_16 ........-....-.-.....A-T....C.. 1 Hap_17 ........-....-.-.....A-T....... 2 Hap_18 ........-..TCT.-.....A-T.......
1
多态位点数 20
核苷酸多样性(π)
0.00404
单倍型数 18
单倍型多样性(h )
0.887 对结果显示Pthyastatin 前体中有1个缺失位点和3个突变位点(图2); 与蛛形互爱蟹Hyastatin 抗菌肽前体氨基酸残基序列比对结果表明, 蛛形互爱蟹Hyasta- tin 前体的N 端信号肽区、Pro/Arg 区、C 端Cys 富集区与Pthyastatin 前体同源性高, 氨基酸残基一致性分别为56.25%、41.8%—47.06%和45.45%—48.48%, 特别是C 端Cys 富集区, Cys 位点完全保守, 提示该区域二者结构可能相同; 而在Pthyastatin 中没有蛛形互爱蟹Hyastatin 相应的Gly 富集区, 代之以延长的Pro/Arg 区(图2), 氨基酸残基一致性仅为16.90%—18.31%。值得注意的是, 蛛形互爱蟹Hyastatin C 末端酰胺化位点Gly 在Pthyastatin 中也同样保守(图2), 提示成熟的Pthyastatin 可能也需酰胺化加工。 2.3 抗菌肽Hyastatin 的系统发生
为阐明Pthyastatin 与甲壳类其它已报道的具有相似C 末端结构抗菌肽之间的系统发生关系, 将其与对虾penaeidins 、蛛形互爱蟹Hyastatin 先进行氨基酸序列比对, 再将C 末端自第一个Cys 后的序列构建NJ 系统树, 结果显示不同的对虾抗菌肽penaeidins 亚
家族聚为单系群, 而Pthyastatin 与蛛形互爱蟹Hyastatin 聚在一枝, 且蟹类Hyastatin 与对虾抗菌肽
penaeidins 4
聚在一枝(图3)。提示在C 端具有6个
图2 Pthyastatin 与蛛形互爱蟹Hyastatin 氨基酸序列比对
Fig.2 Multiple alignment of the a sequences of Hyastatins from H. araneus and P. trituberculatus
注：Hap_1/7/10/11/13 分别为5个Pthyastatin 异构体, ACQ76432为蛛形互爱蟹Hyastatin; *示相同氨基酸位点; ▲示C 末端甲酰
化Gly 位点; 灰框示信号肽区, 斜线框示Gly 富集区, 竖线框示Pro/Arg 区; 黑框示Cys 富集区
250 海洋与湖沼41卷
图3 Pthyastatin在对虾抗菌肽penaeidins家族的系统发生Fig.3 Phylogenetic analysis on Hyastatins and selected
penaeidin sequences
注：基于C端第一个Cys残基后的序列构建的penaeidins家族抗菌肽NJ无根系统树, 重抽样500次计算的自引导值标注在节点上; 对虾抗菌肽penaeidin不同类群聚在一起, 两种蟹
Hyastatin聚在一枝
Cys结构域的甲壳类抗菌肽家族中, 蟹类Hyastatin亲缘关系较近, 与物种系统发生一致, Pthyastatin与蛛形互爱蟹Hyastatin的分化晚于虾蟹类的分化; 同时蟹类Hyastatin与对虾抗菌肽penaeidins 4聚在一枝, 提示对虾抗菌肽penaeidins 4可能代表了penaeidins 家族的祖先基因型。
2.4三疣梭子蟹Pthyastatin的表达分析
荧光定量RT-PCR分析未诱导的三疣梭子蟹血细胞、肝胰脏、肌肉和眼等组织中Pthyastatin表达差异显示：Pthyastatin在血细胞、眼和肌肉中均有表达, 而在肝胰脏中未检测到Pthyastatin的表达。血细胞中Pthyastatin表达量最高, 比眼和肌肉中Pthyastatin表达量分别高909倍和7692倍(表2)。
以未诱导三疣梭子蟹血细胞Pthyastatin表达量为对照, 荧光定量RT-PCR分析副溶血弧菌诱导后不同时间血细胞Pthyastatin表达量变化结果显示：诱导3h、6h、12h和24h后Pthyastatin表达量分别相当于与诱导前的0.37、1.31、1.27和1.01倍(表2), 表明副溶血弧菌诱导后, 血细胞中Pthyastatin表达量先降低, 后上升, 大约24h后又恢复到诱导前水平。
3讨论
三疣梭子蟹是我国重要的经济蟹类, 南北沿岸浅海均产, 是20世纪90年代虾病暴发和流行后发展起来的大宗养殖品种。但近年来养殖病害呈现逐年上升趋势, 成为制约该产业健康发展的重要因素。而迄今为止关于三疣梭子蟹免疫相关因子及免疫防御机制的研究极少, 如已报道基因的三疣梭子蟹免疫相关因子仅见酚氧化酶(Chen et al, 2010)、热休克蛋白Hsp70 (Cui et al, 2010)、C-type lectin like-domain (CTLD)-containing protein (PtLP; Kong et al, 2008)等。本研究从三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库中测序鉴定了一个新的免疫相关因子基因, 即与蛛形互爱蟹抗菌肽Hyastatin同源的三疣梭子蟹Pthyastatin基因。推导的三疣梭子蟹Pthyastatin抗菌肽前体与蛛形互爱蟹Hyastatin抗菌肽前体氨基酸序列比对显示二者结构相似, 三疣梭子蟹Pthyastatin前体有对虾抗菌肽Penaeidins家族的典型结构特征(Cuthbertson et al, 2005), 即信号肽区、Pro/Arg区和C端的Cys富集区, 因此三疣梭子蟹Pthyastatin也属Penaeidins家族。系
表2实时定量RT-PCR 分析Pthyastatin的差异表达
Tab.2 Differential expression analysis on Pthyastatin by RT-PCR
Pthyastatin在不同组织类型血细胞肝胰脏肌肉眼组织
组织中的表达差异相对表达量 1 0
0.00013
0.0011
血细胞Pthyastatin 诱导时间(h) 0 3 6 12 24 诱导前后表达变化相对表达量 1 0.37 1.31 1.27 1.01
2期申望等: 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) Pthyastatin抗菌肽基因的克隆与表达分析 251
统分析表明两种蟹类Hyastatin的系统关系较近, 独立于虾类Penaeidins聚在一枝。同时本研究从cDNA 文库中共测序鉴定了37个三疣梭子蟹Pthyastatin克隆, 共定义了18个单倍型, 表明Pthyastatin在基因组中有多个基因座位。其中3个单倍型由于在编码区发生移码突变而编码与典型Pthyastatin不同的多肽, 这也可能是由于多基因座位的存在, 相对选择压力较轻造成的。
两种蟹类的Hyastatin抗菌肽与对虾来源的Penaeidins家族相比, 在信号肽后的N端都多出一段结构域, 在蛛形互爱蟹Hyastatin中为Gly富集区, 而在本研究发现的三疣梭子蟹Pthyastatin中该结构域Pro/Arg含量相对较高, 类似于一个延长的Pro/Arg结构域。同时值得注意的是：两种蟹类的Hyastatin抗菌肽与对虾Penaeidins家族相对应的结构域(信号肽区、Pro/Arg区和C端的Cys富集区)相对保守, 氨基酸残基一致性为41.8%—56.25%; 而信号肽区与Pro/Arg区之间这段多出的结构域则氨基酸残基一致性很低, 仅为16.90%—18.31%。对虾抗菌肽Penaeidins的Pro/Arg结构域主要赋予Penaeidins的靶微生物的种类特异性, 但也发现大西洋白对虾(L. setiferus)的Penaeidin-4的Pro/Arg结构域单独就是一个有活性抗菌肽, 它与全序列的Penaeidin-4具有相同的靶微生物范围(Cuthbertson et al, 2004), 而Sperstad等(2009b)研究表明蛛形互爱蟹Hyastatin Gly 富集区有甲壳素结合活性。因此, 三疣梭子蟹Pthyastatin信号肽后的Pro/Arg结构域是否具有抗菌活性, 或是执行其它功能是一个值得关注的问题。
荧光定量RT-PCR分析显示三疣梭子蟹Pthyastatin主要在血细胞中组成型表达, 与蛛形互爱蟹Hyastatin以及其它甲壳类抗菌肽如arasin 1、crustin、penaeidins等在不同组织表达差异研究得出的结论一致(Kang et al, 2004; Stensvag et al, 2008; Sperstad et al, 2009a)。提示Pthyastatin的表达模式可能也与抗菌肽penaeidins、curstin等类似, 即在血细胞中组成型转录、合成与存储, 在入侵微生物的诱导下释放, 肌肉、眼等组织中检测到的Pthyastatin微量表达可能是组织血管中血细胞造成的(Destoumieux et al, 2000; Smith et al, 2008)。
甲壳类免疫相关因子在致病微生物诱导前后表达量的变化是一个比较令人困惑的问题, 不同类型免疫相关因子、甚至同一类型免疫相关因子在不同物种或不同微生物诱导前后的表达量都可能不同, 出现上调、下调或是不变(Lorgeril et al, 2005; Smith et al, 2008)。例如, 淡水螯虾在感染大肠杆菌(E. coli)后crustin家族抗菌肽Plcrustin1和Plcrustin3表达在血细胞、造血组织中都上调, 而Plcrustin 3表达量没有变化(Jiravanichpaisal et al, 2007); 欧洲龙虾(Homarus gammarus)II型crustin在感染绿色气球菌(Aerococcus viridans)后表达上调, 而感染利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)后表达下调(Hauton et al, 2006)。因此, 研究甲壳动物免疫相关因子在感染微生物前后表达量的变化, 探讨免疫相关因子在甲壳动物免疫防御过程中的作用方式和地位一直是研究者关注的重点问题。在本研究中, 通过荧光定量RT-PCR分析观察到三疣梭子蟹血细胞Pthyastatin表达量受致病菌副溶血弧菌的影响, 但波动幅度较小。副溶血弧菌诱导后Pthyastatin表达先下调, 诱导3h时表达量约为诱导前的0.37倍; 然后上调, 诱导6h、12h后的表达量分别约为诱导前的1.31倍和1.27倍, 大约24h后又基本恢复到诱导前水平。这一现象支持三疣梭子蟹血细胞中Pthyastatin属组成型表达的观点, 但Pthyastatin在副溶血弧菌诱导后表达量为何表现为先下调、后上调、最后回复到诱导前水平这一特别的变化趋势, 以及其在三疣梭子蟹免疫防御系统的地位和作用机制还有待在后续研究中给予解答。
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2期申望等: 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) Pthyastatin抗菌肽基因的克隆与表达分析 253 cDNA CLONING, CHARACTERIZATION AND mRNA EXPRESSION OF A
HYASTATIN-LIKE GENE FROM SWIMMING CRAB PORTUNUS TRITUBERCULATUS
SHEN Wang, YE Mao, SHI Ge, WANG Ri-Xin
(Laboratory of Marine Biology Resources and Molecular Engineering, Ocean Science College, Zhejiang Ocean University,
Zhoushan, 316004)
Abstract Pathogenic challenges in decapod crustaceans are combated by innate immune responses, including the production and secretion of soluble antibacterial peptides into hemolymph. Hyastatin antimicrobial homologues, containing
a domain of six Cys residues at the C-terminus, had been identified from the haemocyte library of the swimming crab,
Portunus trituberculatus and designated Pthyastatin. Sequence analysis of these cDNAs indicated the presence of five iso-
forms of Pthyastatin. The full-length cDNA of Pthyastatins contain an open reading frame of 381 or 387bp encoding a
precursor of 127 or 129 amino acids that comprise 16 amino acid signal peptides and 111 or 113 amino acid mature pep-
tides. The putative mature peptides consist of two distinctly different domains: a Pro/Arg-rich region at the amino-terminus
and a C-terminal region containing six Cys residues with a Cys pattern resembling the one found in penaeidins. Seqences
alignment with Hyas araneus Hyastatin and Pthyastatins indicated the signal petide domain and six-Cys domain conserved,
but Pthyastatin lacked of a Gly-rich domain which is in the N-terminal region of the mature H. araneus Hyastatin, in-
steaded of an extended Pro/Arg-rich domain. It suggests that Pthyastatin is a new member of the antimicrobial peptide
group containing a six-Cys-residue domain at the C-terminus. Quantitative reverse transcriptase Real-Time PCR (qRT-PCR)
assay were developed to assess the mRNA expression of Pthyastatin in different tissues and the temporal expression of Pthyastatin in the hemocytes challenged by pathogen, Vibrio Parahaemolyticus. The results indicate that Pthyastatin tran-
script is constitutively expressed and mainly found in hemocytes. But the expression of Pthyastatin in the hemocytes was enigmatic, down-regulated in the initial hours and up-regulated subsequently and returned to unstimulated level about 24 h,
after stimulated by V. parahaemolyticus.
Key words Portunus trituberculatus, Hemocyte, Antimicrobial peptide, Pthyastatin, mRNA expression
转基因动物与克隆动物的区别
转基因动物与克隆动物的区别：转基因，用人工方法将外源基因导入或整合到其基因组内，并能将此外源基因稳定的遗传给下一代的一类动物[1]。由于转基因动物体系打破了自然繁殖中的种间隔离，使基因能在种系关系很远的机体间流动（有性繁殖）。克隆，通常是一种生物技术，以人工诱导的无性生殖方式或者自然的无性生殖方式（例如：植物），产生与原个体有完全相同基因组之后代的过程。一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一种生物完全一样。 基因工程的内容，原理，步骤：是利用DNA重组技术，将目的基因与载体DNA在体外进行重组，然后把这种重组DNA分子引入受体细胞，并使之增殖和表达的技术[1]；取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；构建基因的表达载体；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。基因工程是人类根据一定的目的和设计,对DNA 分子进行体外加工操作,再引入受体生物,以改变后者的某些遗传性状,从而培育生物新类型或治疗遗传疾病的一种现代的、崭新的、分子水平的生物工程技术 现代生物工程：现代生物技术包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等五大工程技；可分为农业生物技术、医学生物技术、植物生物技术、动物生物技术、食品生物技术、环境生物技术等。[1] 生态系统(Ecosystem)是指在一个特定环境内，相互作用的所有生物和此一环境的统称。此特定环境里的非生物因子（例如空气、水及土壤等）与其间的生物之间具交互作用[2]，不断地进行物质的交换和能量的传递，并借由物质流和能量流的连接，而形成一个整体，即称此为生态系统或生态系。 中国的环保策略：科学协调行业间关系，制定持续发展规划；实现森林资源的供需平衡，持续利用；建立自我调节的生态系统；提高人们的“绿色环保”意识；完善相关法律并严格执行；林业的可持续发展，城市的可持续发展 公害public nuisance，凡由于人类活动污染和破坏环境，对公众的健康、安全、生命、公私财产及生活舒适性等造成的危害均为公害，由于大气污染、水体污染、噪声污染、振动、恶臭等所影响和侵害的是不特定的公众，所以由此产生的危害一般均称为公害。
基因克隆及转基因方法
基因克隆及转基因 一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物 软件是https://www.wendangku.net/doc/c116536243.html,sergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何； （如果克隆的话不能满足条件也没办法。） 不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。 步骤： 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR： 20ul体系：灭菌水13.8ul，若模板为质粒灭菌水14.3ul； 2.5mMdNTP2.0ul；
基因克隆、假病毒操作步骤
实验名称：基因克隆 实验器材:荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工PCR产物纯化试剂盒、恒温加热器、 NEB连接体系、灭菌纯水、JM109感受态、冰、LB培养基、酒精灯、涂棒、氨苄、氨苄抗性平板、甘油等； 操作步骤： 1、可通过PCR进行拼接获得目的基因的，过柱纯化（生工试剂盒根据说明书进行纯化， 在最后一步的洗脱可以用预热的灭菌纯水洗脱，在加灭菌纯水洗脱的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）； 2、选择合适的载体（EZ-T）用连接酶进行连接，NEB体系，16℃过夜连接 T4lages 1.0 10×T4buffer 2.0 EZ-T 1.0 目的基因8.0 DdH2O 8.0 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 20ul 3、取100μl摇匀后的JM109感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下 面的操作），加入10μl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min； 4、加入500μl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并 使转化体产生抗药性； 5、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200μl重悬菌体， 并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（氨苄抗性），37℃倒置培养12~16小时； 6、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（氨苄）的LB液体培养基中，37℃振 荡培养3h； 7、培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定； 8、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充 分混匀，-80℃保存；
4植物基因克隆的策略与方法
4植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1功能克隆(functional Cloning) 功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针 从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因 缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该
植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤
植物基因的克隆 08医用二班姚桂鹏0807508245 简介 克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。 关键词 植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法 Plant gene cloning Introduction Cloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes means
based on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. Keywords Plant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy 一、植物基因的结构和功能 基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。一般来说，植物基因都可分为转录区和非转录的调控区两部分。 （一）植物基因的启动子 启动子（promoter）是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域，植物积阴德启动子包括三个较重要的区域，一时转录起始位点，而是转录起始位点上游25~40bp的区域，三是转录起始位点上游-75bp处或更远些的区域。 （二）植物基因的增强子序列
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
动物克隆与转基因
动物克隆与转基因 一、人工辅助生殖通常都指那些技术？这些技术主要针对何种需求（可以从阐述技术优缺点的视角来分析）？ 人工辅助生殖技术（assisted reproductive technology, ART）主要包括人工授精(artificial insemination, AI)、卵母细胞的体外成熟(in vitro maturation, IVM)、体外受精(in vitrofertilization, IVF)、胚胎体外发育(in vitro production, IVP)、胚胎移植(embryo transfer, ET)和配子冷冻等。这些技术主要可用于改善动物的生殖性能、保护生物多样性和推动基础研究等。在动物方面，可用于商业（如高产）或名贵动物的繁殖及濒危动物的保护研究。此外，还有助于转基因动物克隆和转基因的相关基础研究。 在人类方面，有人工授精、试管婴儿、卵浆内单精子注射技术（ICSI）、种植前遗传学诊断（PGD）及辅助孵化（AH）等，试管婴儿技术（包括体外受精和胚胎移植等）主要解决不孕不育症，自我调控人类的生殖。但是，人工辅助生殖技术还有很多不完善的地方，对于不同的动物研究进展情况不同，主要在超排卵、核移植克隆等方面有待进一步发展。用于人类的辅助生殖技术，也存在一定的弊端，如无法保证妊娠率、多胎率较高、伴随着并发症以及费用风险较高等。此外，用于人类的辅助生殖技术还会引发一些伦理问题。 尽管人工辅助生殖技术尚存在一系列问题，但随着其快速的发展和完善，将有着更加广泛的应用。 三、胚胎分割、胚胎克隆和体细胞克隆在技术方法上有何不同？简单
分析体细胞克隆未来的应用方向和途径。 胚胎分割（Embryo bisection）的理论根据是动物细胞具有全能性，指借助显微操作技术或徒手操作方法切割早期胚胎成二、四等多等份再移植给受体母畜，从而获得同卵双胎或多胎的生物学新技术。来自同一胚胎的后代有相同的遗传物质，因此胚胎分割可看成动物无性繁殖或克隆的方法之一。 胚胎克隆以未分化或处于不同发育阶段的胚胎分裂球或细胞作为核供体，与体外成熟后去核的卵母细胞融合构建成克隆胚胎，或再从克隆胚胎内分离出细胞移入成熟去核卵母细胞融合后即可发育成再克隆胚胎，将这些胚胎移入同期发情的母体得到克隆体和再克隆体。 体细胞克隆则是取出一个双倍体细胞核移入一个去核的卵细胞，并在一定条件下进行核卵重组，再植入代孕母体中发育成新个体的过程。供体细胞均来自高度分化的体细胞，其种类繁多、数量无限。 体细胞克隆技术在动物育种及珍稀动物保护领域具有极其广阔的应用前景，异种克隆则为器官移植提供了一种全新的、可行的方法。体细胞克隆技术在未来将会与基因工程、干细胞技术相互结合，往简单、实用、高效等方向发展。 参考文献： [1]韩堃，石艳春等人类辅助生殖技术研究进展（J）Chinese Journal of Woman and Child Health Research Vo1．19 No．6 2008 [2]刑华犬科动物的生殖生物学与辅助生殖 [3]马利兵，王凤梅等哺乳动物体细胞克隆技术的研究进展（J）生物技术通报，2009，5：51-54
整个基因克隆实验流程(完整)
一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入 液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管， 加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min 晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。
拟南芥基因克隆的策略与途径
拟南芥基因克隆的策略与途径 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序 已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物 的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字 花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各 国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功 能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的 几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms. 图位克隆（map-based clonig）又称定位克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化机制。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
转基因克隆动物技术涉及的生物学问题 生物学转基因
转基因克隆动物技术涉及的生物学问题生物学转基因 1 转基因克隆动物技术简介转基因克隆动物技术是转基因动物技术与克隆动物技术的有机结合，它是以动物体细胞(包括动物成体体细胞、胎儿成纤维细胞等)为受体，将目的基因导入其中，再以这些体细胞为核供体，进行动物克隆。这种结合不仅仅是简单的技术叠加，而是技术的重组、综合和优化，它实现了高效率、低成本的转基因动物制作，已成为当前动物生物技术领域研究的新热点。 1.1转基因克隆动物技术的发展历程 Wilmut研究小组在取得克隆绵羊“多利”后，Schnieke等用阳离子脂质体介导外源基因转染到培养的绵羊胎儿成纤维细胞中，然后将细胞融入去核卵母细胞中，经激活后在体外培养至囊胚期，移入同步受体母羊中，最后获得6只转基因绵羊。 Cibelli等用同一方法获得了3只转基因牛。 xx年6月21日，日本静冈县中小家畜实验场宣布，该实验场和北里大学合作，成功克隆出了体内含有水母基因的转基因猪。该实验第一次成功地把转基因技术和体细胞克隆技术有机地结合在一起。
xx年12月24日，我国东北农业大学刘忠华教授的转基因克隆猪获得成功，3头含绿色荧光蛋白的转基因克隆猪自然分娩。 1.2转基因克隆动物培育过程 转基因克隆动物的培育过程如图1所示。 2 转基因克隆动物涉及的生物学问题 2.1生物技术 2.1.1基因工程 图1中过程A表示目的基因的获取，目前常用的方法有以下几种：①从基因文库中获取目的基因；②利用PCR技术扩增目的基因；
③通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。得到目的基因后，还要构建基因表达载体，才能导入受体细胞。 图1中过程C表示将目的基因导入受体细胞，常用的方法为显微注射法。目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，还需要对目的基因进行分子水平上的检测。检测方法包括：DNA分子杂交法、DNA-RNA杂交法和抗原一抗体杂交法。 2.1.2细胞工程 图1中过程B表示从供体动物的某一部位取体细胞，在体外进行动物细胞培养，得到能进行传代的体细胞。过程D和E表示采用显微操作技术，用微型吸管吸出供体细胞的细胞核，注入去核的卵母细胞中(也有人将供体细胞注入受体细胞中)。过程F表示从受体动物中获得卵巢，再采集卵母细胞，在体外培养成熟，即培养到减数第二次分裂中期。过程G表示通过电刺激使两个细胞融合，得到重组细胞。 2.1.3胚胎工程
基因克隆的几种常见方法
基因克隆得几种常见方法 基因（gｅｎe)就是遗传物质得最基本单位,也就是所有生命活动得基础。不论要揭示某个基因得功能,还就是要改变某个基因得功能,都必须首先将所要研究得基因克隆出来。特定基因得克隆就是整个基因工程或分子生物学得起点。本文就基因克隆得几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列得基因克隆就是基因克隆方法中最为简便得一种。获取基因序列多从文献中查取，即将别人报道得基因序列直接作为自己克隆得依据。现在国际上公开发行得杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及得基因序列在基因库中注册，拟发表得文章中仅提供该基因在基因库中得注册号(acｃｅssion numｂer）,以便别人参考与查询。目前，世界上主要得基因库有１）EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室得基因库，其网上地址为; （2)Genbank，为设在美国国家卫生研究院(ＮIＨ）得基因库，其网上地址为;（3)Swｉssport与TＲEMBＬ,Swissport就是一蛋白质序列库,其所含序列得准确度比较高,而TREMBＬ只含有从EＭBＬ库中翻译过来得序列。目前,以Geｎbａnk得应用最频繁。这些基因库就是相互联系得,在Genbank注册得基因序列,也可能在Swisspoｒt注册。要克隆某个基因可首先通过Inｔeｒnet查询一下该基因或相关基因就是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都就是免费得,因而极易将所感兴趣得基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异得引物，通过PＣＲ从基因组中克隆该基因,也可以通过RＴ-PCＲ克隆cＤNA。值得注意得就是,由于物种与分离株之间得差异,为了保证PＣR扩增得准确性,有必要采用两步扩增法,即neｓted PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质得基因扩增出来。在基因文库中注册得蛋白质序列都可以找到相应得ＤNA或cDNＡ序列。如蛋白质序列就是自己测定得，那么需要设计至少１对简并引物(dｅgｅneｒated ｐrimeｒ),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆得基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物得特异性。 另外,在基因克隆之后，如还要进一步做表达研究，所使用得PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶，而采用其她有自我检测（reading proｏf)功能得酶,如pfｕ。这样可以避免由于扩增过程中出现得点突变或终止密码子而导致整个研究结论得错误。 ２根据已知探针克隆基因 这也就是基因克隆得一种较直接得方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理得基因组DNＡ杂交,最后将所识别得片段从胶中切下来，克隆到特定得载体（质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中得拷贝数。
动物转基因技术及其应用
动物转基因技术及其应用 摘自（作者：幸宇云任军江西农业大学来源：《百名专家谈转基因》） 转基因是指利用现代分子生物学技术，将某些生物的基因导入到其他物种中，由于导入基 因的表达，引起这些物种性状发生可遗传的变化。转基因动物就是利用转基因技术获得的、具 有正常表达和可稳定遗传外源基因的动物。自1982年第一只转基因动物——一只因导入大鼠 生长激素基因而使生长速度倍增的转基因鼠诞生以来，各种转基因动物，如鱼、兔、猪、牛、 羊等先后问世，1997年，举世轰动的“多莉”克隆羊的诞生使转基因克隆动物成为现实，转 基因动物研究得到了进一步发展。 生产转基因动物的方法有很多，如：显微注射法、精子载体法、逆转录病毒载体法、胚胎 干细胞介导法、体细胞克隆介导法、人工染色体介导的基因转移法等，这些方法各有其优缺点，在转基因动物生产中有着不同程度的应用。 显微注射法是动物转基因技术中最早使用的方法。1982年，美国人Gordon就是利用这种 方法获得了名噪一时的转基因鼠。其基本原理是在显微镜下直接将目的基因注射到受精卵细胞 的原核内，在目的基因与胚胎基因组融合后进行体外培养，最后移植给受体母畜“借腹怀胎”。这种方法的优点是：可靠性高，重复性好，目的基因的整合效率相对较高，导入基因片段的大 小和类型不受限制，转基因在世代之间可以稳定遗传。该方法也有其缺点，主要体现在导入基 因整合的随机性和不可见性，这样会导致基因表达不稳定及可能出现不希望的插入突变。该方 法成功的范例很多，如：美国科学家Hammer等在1985年获得一批转基因兔、绵羊和猪；荷兰 科学家KrimPenfort等于1991年获得了转基因牛；1985年，我国朱作言院士等成功获得了世 界上首例转基因鱼；由中国农业大学李宁院士领导的课题组于2008年获得了一头导入人CD20 抗体基因的转基因奶牛——贝贝。 有的学者另辟蹊径，创立了精子载体转基因法。该方法是将精子与目的DNA进行预培养后，使精子具有携带目的基因进入卵子的能力，精子与卵子结合后，该基因被整合到受精卵的DNA 中。同显微注射法相比，该方法有几个明显的优点：无需显微注射操作，不会对胚胎造成损伤，整合率高，成本很低，不需要对动物进行胚胎移植手术处理等。但该方法成功率不高、效果不 稳定，有待科研人员进一步探索和改进。与显微注射法相比，该方法成功的例子不多。1989 年意大利Lavitrano等首次报道利用精子载体法获得转基因鼠；1996年意大利Sperandio科 研小组报道了采用该方法生产转基因牛和猪。 谈到病毒，人们往往面容失色，殊不知病毒在科学上有很多妙用。逆转录病毒是一种RNA 病毒，在转基因技术中有着独特的应用。人们将目的基因结合到逆转录病毒上，通过病毒感染 可将目的基因插入到宿主基因组中去。该方法具有可同时感染大量胚胎、不需要昂贵的显微注 射设备等优点，但也存在插入外源DNA大小有限、外源基因易发生重排和丢失、逆转录病毒的 序列可能干扰转基因表达等缺点。应用该方法，美国人Salter等（1987）生产出转基因鸡； 德国学者Hofmann等获得绿色荧光蛋白转基因猪（2003），随后又生产出转基因牛（2005）； 来自冷泉港实验室的Michael获得能够发荧光的山羊（2006）。 胚胎干细胞是生命体中保留的未成熟细胞，具有再分化形成其他细胞和组织器官的潜力， 被称为“万能细胞”。利用胚胎干细胞生产转基因动物的原理是将外源基因导入分离好的胚胎 干细胞，然后将转基因的胚胎干细胞注射于受体动物胚胎后，参与宿主的胚胎融合形成嵌合体，从而得到转基因动物。这一方法的优点是可以对胚胎干细胞进行特定选择。缺点是目前只有小 鼠干细胞系比较成熟，而家畜干细胞系还未完全建立，有不少问题尚待解决。 体细胞克隆介导的转基因是动物转基因技术中的“高级版本”。说到体细胞克隆，很多人都会想到一位“动物明星”——多莉羊，它是于1997年由英国Wilmut等获得的杰作。转基因 克隆技术是转基因技术和动物克隆技术的有机结合，其基本原理是将目的基因导入动物体细胞
基因克隆的几种常见方法
基因克隆的几种常见方法 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession number),以便别人参考和查询。目前,世界上主要的基因库有1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为 https://www.wendangku.net/doc/c116536243.html,/ebi-home.html;(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为 https://www.wendangku.net/doc/c116536243.html,/web/search/index.html;(3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物种和分离株之间的差异,为了保证PCR 扩增的准确性,有必要采用两步扩增法,即nested PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引物(degenerated primer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。 另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。 2 根据已知探针克隆基因 这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。但在探
DNA结构与复制中的相关计算的三种常用方法
DNA结构与复制中的相关计算的三种常用方法 一、特值法： 先按照碱基比例假设DNA片段中碱基总数为100或200等整百数，再根据碱基互补配对原则（A－T，C－G）图解分析求解。 例：一个DNA分子中，G和C之和占全部碱基数的46％，又知在该DNA分子的一条链中，A和C分别占碱基数的28％和22％，则该DNA分子的另一条链中A和C分别占碱基数的（）。 A．28％、22％B．22％、28％C．23％、27％D．26％、24％ 【解析】假设DNA每条链的碱基数为100，依题意得：（图略） ∵甲链: A=28, C=22,G+C=46, ∴甲中G=24, T=100-28-46=26。则乙中A=26，C=24。故选D。 练习：分析某生物的双链DNA，发现腺嘌呤与胸腺嘧啶之和占全部碱基的64％，其中一条链上的腺嘌呤占该链全部碱基的30％，则对应链中腺嘌呤占整个DNA分子碱基的比例是（） A．17％B．32％C．34％D．50％
二、首尾法： 根据DNA复制的过程与特点可以知道：一DNA分子复制n次后，将得到2n个DNA分子，其中保留原来母链的DNA 数目为2个。在处理与此相关的计算题过程中，我们只需要考虑开始和结尾的差异就可以顺利求解，笔者习惯于称之为首尾法。 例：假如一个DNA分子含有1000个碱基对（P元素只是32P）,将这个DNA分子放在只含31P的脱氧核苷酸的培养液中让其复制两次,则子代DNA分子的相对分子量平均比原来( )。 A.减少1500 B.增加1500 C. 增加1000 D.减少1000 【解析】每个碱基对应一个脱氧核苷酸，含1个磷酸基，即1个磷原子。复制两次后形成4个DNA分子，8条单链。其中两条含32P，6条含31P，因而相对分子量减少6000，4 个DNA平均减少1500。故选A。 练习：已知14N-DNA和15N-DNA的相对分子量分别为a和b。现让一杂合DNA分子在含14N的培养基上连续繁殖两代，则其子代DNA的平均相对分子量为（） A.(3a+b)/4 B.(a+3b)/4 C.(7a+b)/8 D.(a+7b)/8 三、公式法： 基于DNA的半保留复制，我们可以归纳出公式：X=m(2n-1)。
基因克隆基本实验方法
重组质粒的连接、转化及筛选 第一节概述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。 外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种： 1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。 2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。 3、带有平末端是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA 浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。 特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。 本实验所使用的载体质粒DNA为pBS,转化受体菌为E. coli DH5α菌株。由于pBS上带有Ampr 和lacZ 基因,故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α-互补现象筛选相结合的方法。 因pBS带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pBS DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。 pBS上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pBS和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为α-互补现象筛选。 第二节材料、设备及试剂 一、材料 外源DNA片段: 自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知; 载体DNA: pBS质粒(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互补能力的菌株。 二、设备 恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，电热恒温培养箱，电泳仪无菌，工作台，微量移液枪，eppendorf管。 三、试剂 1、连接反应缓冲液(10×)：0.5mol/L Tris·Cl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫苏糖醇(DTT)(过滤灭菌），500μg/ml 牛血清清蛋白(组分V.Sigma 产品）（可用可不用），10mol/L A TP（过滤灭菌）。 2、T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。 3、X-gal储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20℃。 4、IPTG储液(200mg/ml): 在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。