饲养层细胞的接种密度对分离培养胚胎干细胞的影响

饲养层细胞的接种密度对分离培养胚胎干细胞的影响

赵　晶1,2,董雅娟2,33,柏学进2,3,靳亚平1,张廷龙2,封纪武2,3　(1.西北农林科技大学农业部家畜内分泌与胚胎工程重点开放实验室,陕西杨凌712100;2.青岛农业大学动物胚胎工程中心,山东青岛266109;3.山东小黑牛集团公司,山东淄博255000)

摘要:建立有效的昆明白小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,M EF)饲养层培养体系,用于分离和培养小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)的研究。(1)取怀孕14.5d昆明白小鼠胎儿分离成纤维细胞,利用体外培养体系分离传代,选取生长旺盛并且已纯化的P3代的M EF,经丝裂霉素处理后,用细胞计数板计算活细胞数,分别按1×104、1×106、1×108/mL密度接种,制备饲养层,观察不同密度饲养层的生长状况。(2)取怀孕4d 的昆明白小鼠囊胚,接种在不同密度饲养层上。观察不同密度饲养层上囊胚、ICM及ES细胞的克隆生长情况。结果显示:囊胚在密度为1×106/mL的饲养层上,贴壁率和ICM孵出率分别为(97.0±3.606)%和

(96.3±2.887)%,显著高于其他2组;密度为1×106/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率高于密度为1×104/mL

(差异极显著,P<0.01)和1×108/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率(差异显著,P<0.05);而1×104/mL饲养层和1×108/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率差异不显著(P>0.05)。结果表明:以1×106/mL密度接种的M EF作为饲养层,最适合用于分离培养昆明白小鼠ES细胞,有利于囊胚的发育,ICM的增殖,促进ES细胞的增殖,并起到抑制其分化的作用。

关键词:昆明白小鼠;胎儿成纤维细胞;饲养层;胚胎干细胞

中图分类号:Q81;S852.16 文献标识码:A 文章编号:100524545(2009)0420494208

E ffect of densities of feeder layer for isolation and culturing of K unming white mouse embryonic stem cells

　ZHAO Jing1,2,DON G Ya2juan2,33,BA I Xue2jin2,3,J IN Ya2ping1,ZHAN G Ting2long2,FEN GJi2wu2,3

　(1.Key O pen L aboratory of A ni m al Rep rod ucti ve Endocri nolog y and Embry o En gi neeri ng

of t he M i nist ry of A g ricult ure,Yangli ng,S haanx i712100,Chi na;2.T he Center of A ni m al Em2 bryo En gi neeri ng Qi ng d ao A g ricult ural Uni versit y,Qi ng d ao,S han don g266109,Chi na;3.S han2 don g X i aohei ni u Grou p Cor poration,Zibo,S handong255000,Chi na)

Abstract:To establish feeder layer culture system of Kunming mouse embryonic fibroblast(M EF)cells for isola2 tion and culturing of embryonic stem(ES)cells in vit ro.(1)M EF were isolated f rom the14.5d fetus mouse.By in vit ro culture system of M EF,after isolated and subcultured,using Generation3M EF were selected.After treated with Mitomycin C,living cell were inoculated at concentrations of1×104,1×106and1×108/mL after their number counted as the feeder layers of ES cells.The growth behavior of different density of M EF was observed.(2)The blastulas of4d f rom Kunming mouse were collected,cultured on medium with different density of M EF.The growth of the blastulas,ICM and ES cells were observed.The blastulas cultured on M EF with a density of1×106/mL showed that attachment rate and ICM growing rate were(97.0±3.606)%and(96.3±2.887)%respectively, which expressed more than those cultured on the other two kinds of feeders.The clone forming efficiency of ES cells on1×106/mL M EF were higher than those of on1×104/mL M EF(P<0.01)and on1×108/mL M EF(P<0.05).

While the clone forming efficiency of ES cells on1×104/mL M EF and1×108/mL M EF were not significant(P>0.

05).As feeder celI of M EF with a density of1×106/mL is the best for isolation and culturing of embryonic stem

(ES)cells in vit ro,which can be beneficial for the development of blastulas,the proliferation of ICM,inducing the proliferation of ES cells,and inhibiting their diferentiation.

收稿日期:2007211220

基金项目:青岛市科技将才项目(2005620313)

作者简介:赵　晶(19802),女,硕士研究生。

3通讯作者

K ey w ords:mouse;embryonic fibroblasts;feeder layer;embryonic stem cells 3Corres ponding author

胚胎干细胞(Embryonie stem cells,ES细胞)是具有多向分化能力的全能性细胞,研究和利用ES 细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。1981年,Evans等[1]和Martin[2]分别利用胎儿成纤维细胞饲养层的培养系统,首次成功建立了小鼠ES细胞系。但是,ES细胞在体外极易分化,必须在培养基中加入分化抑制因子或将其培养在能分泌分化抑制因子的饲养单层细胞上,而单独应用分化抑制因子效果不甚理想。因此,选用状况良好的饲养层细胞培养体系至关重要。迄今为止已建立了数百个小鼠的ES细胞系[127],但已建立的小鼠ES细胞系大多来源于129,C57BL/6J和BALB/C等品系,有关昆明白小鼠ES细胞建系的研究较少,作为国内普遍使用的一种试验动物,探讨昆明白小鼠ES细胞建系方法更具有应用广泛性。

本试验拟通过对M EF的分离培养,用不同接种密度的饲养层细胞培养囊胚、ES细胞,旨在筛选出一个比较理想的昆明白小鼠饲养层培养体系,为进一步开展昆明白小鼠ES细胞研究奠定基础。

1　材料与方法

111　试验动物　6～8周龄的昆明白小鼠,购自山东大学实验动物中心,室温颗粒饲料喂养,常规饮水。

1.2　主要试剂　H2DM EM培养基(G ibco公司)、L2DM EM培养基(G ibco公司)、胎牛血清(FBS, Hyclone公司)、β2巯基乙醇(β2M E,Sigma公司)、非必需氨基酸(N EAA,Sigma公司)、白血病抑制因子(L IF,Oncogene公司)、孕马血清绒毛膜促性腺激素(PMSG,杭州动物药品厂)、人绒毛膜促性腺激素(hC G,丽珠集团)、Dulbecco改良Eagle培养基及不含钙镁的磷酸缓冲液(Dulbecco’s Phosp hate Buff2 ered Saline,PBS-,Sigma公司)、丝裂霉素C(mito2 mycine2C,MMC;kyowa Hakko K ogyo公司)、胰蛋白酶(Sigma公司)、乙二胺四乙酸二钠(ED TA,天津博迪化工有限公司)、双抗(青、链霉素,Sigma公司)、胰蛋白酶(Tryp sin,sigma公司)、瑞氏2姬姆萨(RS2G iemsa)染色液、碱性磷酸酶(A KP)染色试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3　溶液配制

1.3.1　胎儿成纤维细胞培养液　L2DM EF+10% FBS+100IU/mL双抗1.3.2　ES细胞培养液　H2DM EM+15%FBS+ 0.1mmol/L N EAA+0.1mmol/Lβ2M E+2mmol/ L谷氨酰胺+20mg/L胰岛素+10mg/L L IF+ 100IU/mL双抗

1.3.3　M EF细胞消化液　0.25%胰酶20.04% ED TA,0.05%胰酶20.04%ED TA

1.3.4　ES细胞消化液　0.02%胰酶20.008%ED2 TA

1.4　母鼠的超排处理　选健康性成熟昆明白母鼠于16:00～16:30腹腔注射PMSG(10IU/只),48h后再腹腔注射hCG(10IU/只),并与有生育能力的昆明白公鼠按1∶1合笼。次日8:00前观察母鼠阴道栓(乳白色或蛋黄色胶冻状物)即定为怀孕0.5d。

1.5　MEF的分离培养

1.5.1　M EF原代培养　取怀孕14.5d的昆明白小鼠,断颈处死,75%乙醇浸泡5min取出。无菌条件下用眼科剪剪开小鼠下腹部,止血钳钳铗皮肤纵向翻剥,充分暴露腹膜。剪开腹腔,分离子宫。将子宫取出用PBS-冲洗3遍。在超净工作台中,无菌取出胎儿,去头、内脏和四肢后,用含双抗的PBS-反复清洗剩余躯干组织,直至无血迹。用眼科剪将洗净的躯干组织剪碎(<1mm3)并将其转移到15mL 离心管中,将离心管上层的PBS-吸弃后,置于0.25%胰酶20.04%ED TA中,37℃消化30min,加入等量的M EF培养液终止消化,并反复吹打,离散组织,经双重200目不锈钢细胞滤网过滤,用离心管收集滤液,以80×g离心8min。弃上清,加入PBS-,用移液枪反复地缓慢吹打,使细胞重新悬浮, 80×g离心5min,重复3～4次,洗去血块及其他杂质,直至沉淀呈乳白色为止。弃上清,加入培养液重悬细胞,调整细胞密度,以1×107/mL密度接种到直径35mm的培养皿中。做好标记,置37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中孵育1.5～2h后半量换液, 24h后全量换液。

1.5.2　M EF传代培养　培养4～5d,倒置相差显微镜下观察,当原代成纤维细胞(Primary mouse embryonic fibroblast,PM EF)铺满皿底时,弃去培养液,用PBS-清洗2～3次;加入一定量的0.05%胰酶20.04%ED TA(以覆盖皿底为准),对光观察,当细胞间出现裂隙,细胞变圆时(1～2min),立即加入等量的M EF培养液终止消化,用移液枪反复吹

打,制成单细胞悬液;将细胞悬液转入15mL离心管中,80×g离心5min;弃上清液,加入细胞培养液,制成细胞悬液,按1∶2～1∶3传代。置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。每48h换液1次,3～4d 可传代1次。2～4代均可用于制备饲养层。

1.5.3　瑞氏2姬姆萨(RS2G iemsa)染色　取生长状态良好纯化率达95%并接近融合的第3代(记为P3代)M EF,弃去原培养液,用PBS-冲洗3次,加入3～5滴瑞氏2姬姆萨染色液Ⅰ,以铺满培养皿底壁为准,1min后直接加入5～10滴染色液Ⅱ,5～10min 后吸出染色液,用去离子水缓慢冲洗,直至洗净为止,晾干,倒置相差显微镜下观察细胞形态,并拍照。

1.5.4　不同接种密度饲养层制备　选取铺满皿底的P3代M EF,吸去培养液,加入含10mg/L丝裂霉素的M EF培养液,在37℃、5%CO2培养箱孵育1.5～2h;PBS-洗涤6～8次,尽量除去丝裂霉素;加入0.05%胰酶20.04%ED TA消化1～2min,对光观察,当细胞间出现裂隙,细胞变圆时(1～2min)立即加入等量的M EF培养液终止消化,用移液枪反复吹打,制成单细胞悬液;将细胞悬液转入15mL 离心管中,80×g离心5min;弃上清液,加入细胞培养液,制成单细胞悬液;用微量加样器取10μL单细胞悬液,加于已盖好盖玻片的血球计数板的计数室,在倒置显微镜下观察计数板四角和中间大方格中的细胞数,细胞压边线时,只计数压上线和左边线者,将计数结果代入下式,计算细胞密度:细胞密度(/ mL)=(5个大方格细胞数总和/5×104/mL);调整细胞密度至1×104、1×106、1×108/mL后,接种到四孔皿中,每个浓度接种3孔,待细胞铺满皿底后即可使用。接种ES细胞前1～2h换为ES细胞培养液。

1.6　ES细胞的分离、培养与传代

1.6.1　囊胚获取　取怀孕4d的母鼠断颈处死,无菌条件下取出子宫,用含双抗的PBS-从子宫角冲胚,在体视镜下,挑选发育良好的囊胚。将胚胎置于不同接种密度的饲养层上,加入适量的含有白血病抑制因子(L IF)的培养基,37℃、5%CO2培养箱中进行培养,观察不同接种密度饲养层上囊胚的生长情况。

1.6.2　内细胞团(Inner cell mass,ICM)的分离　体外培养的囊胚ICM细胞数量增殖4～5d后,选择生长集中,隆起明显,形态仍未表现分化迹象的ICM 集落进行初次传代。在体视镜下,用自制的口吸管连接玻璃微针小心挑起ICM,使之与饲养层以及滋养层细胞分离,并吸至提前准备好的2个50μL PBS-液滴内,洗涤2次;然后,采用连续消化法,将ICM转移到50μL的消化液滴内,洗涤2次,目的是除去滋养层细胞以及分化的细胞;最后将其转移至100μL消化液中作用1～2min,并用自制的内径为100μm的玻璃微针轻轻吹吸ICM,使之分散成若干个细胞在一起的小团块。将吹散的细胞团块依次转入50μL的培养液滴中洗2次,然后接种在新的饲养层上,在37℃、5%CO2培养箱中继续培养。

1.6.3　ES细胞集落的分离、传代　分散的ICM培养1d左右细胞开始贴壁;2d后可见有鸟巢状ES 细胞样集落出现,此时半量换液。继续培养3～4d 后,此时形成的干细胞集落为F1代。传代方法:吸去培养液,用PBS-洗涤培养皿2～3次,加入0.02%胰酶20.008%ED TA消化液,以能覆盖细胞为宜,消化30s后弃去消化液,让残余消化液继续作用。在倒置显微镜下观察,见细胞与细胞分开即加入培养液终止消化,消化时间一般为2～3min。添加适量的ES细胞培养液,轻轻吹打,使其成小细胞团块,转移至新的培养皿中,在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。依照此方法进行分离、传代,直至获得稳定传代的ES细胞集落。

1.7　ES细胞的鉴定

1.7.1　形态学鉴定　在倒置显微镜下观察囊胚、ICM和ES集落的形态,观察其生长特征。

1.7.2　碱性磷酸酶(A KP)染色　取一皿生长状态良好的ES细胞集落,弃去原培养液,用PBS-冲洗干净,加入5滴固定液(甲醇溶液)固定5～10min,然后加入预先配置好的新鲜底物液铺满平皿底部,放置37℃湿盒中,15min后水洗,自然晾干,镜检,拍照。

1.8　不同接种密度饲养层培养体系的检测　将囊胚接种在不同接种密度饲养层培养体系上,观察囊胚的贴壁率、ICM孵出率,以及ICM离散后ES细胞集落的克隆数和克隆形成率。

2　结果

2.1　MEF生长形态观察　M EF细胞为贴壁型生长细胞(图1),细胞呈长梭形或条带状,细胞质中央为卵圆形核,周边向外伸出纤维状伪足,细胞生长迅速,逐渐连成片层,3d左右需进行传代。原代M EF 细胞形态多样,有其他细胞混杂,传代过程中杂细胞逐渐被去除。5代以前的细胞纯度较好,生长旺盛。第6代以后细胞生长缓慢,形态变异,出现明显粗颗粒区,细胞之间空隙较大,呈衰老征象。

图1　M EF 的生长行为　A.原代小鼠胎儿成纤维细胞(40×

);B.第3代小鼠胎儿成纤维细胞(100×);C.第3代小鼠胎儿成纤维细胞RS 2G iemsa 染色(100×

)2.2　不同接种密度的饲养层生长状况　试验结果显示,在接种密度为1×104/mL 的饲养层中(图2A ),成纤维细胞密度过小,则铺层所需时间延长,

细胞之间空隙较大,这样容易造成细胞衰老,表现在附着性降低,细胞核裂解空泡化或胞质颗粒变性等,由此制备的饲养层因过多的衰老细胞而降低质量;

密度为1×108/mL 的饲养层中(图2B ),培养液中细胞密度过大,细胞生长状态不良,且寿命缩短,导致皿底边缘饲养层细胞卷曲脱落,影响ES 细胞的生长;密度为1×106/mL 的饲养层(图2C ),细胞铺层所需时间短,细胞均匀铺满皿底,形成细胞单层,细胞生长状态良好

。

图2　不同密度饲养层生长情况　A.密度为1×104/mL 的饲养层;B.密度为1×106/mL 的饲养层;C.密度为1×108/mL 的饲养层

2.3　不同接种密度饲养层培养体系的检测结果2.

3.1　饲养层细胞的密度对囊胚ICM 的影响　饲

养层培养体系对囊胚及ICM 的培养至关重要。结果显示,囊胚在密度为1×104/mL 和1×108/mL 的饲养层上贴壁率低,ICM 孵出率低,并且ICM 增殖缓慢,不易传代(图3、4);在密度为1×106/mL 的饲养层上,囊胚贴壁时间短,贴壁率高,ICM 孵出快,并呈柱状生长,与饲养层细胞间界限清晰(图5)。使用SASS 软件分析数据,结果表明密度为1×106/mL 饲养层上的囊胚贴壁率和ICM 孵出率显著高于其他2组(P <0.05)(表1)。

表1　不同接种浓度的饲养层对小鼠囊胚ICM 发育的影响

观测指标1×104/mL

1×106/mL

1×108/mL

囊胚数/枚464548贴壁率%80.7±4.93297.0±3.60680.3±2.082ICM 孵出率%

49.0±6.083

96.3±2.887

49.3±5.033

注:表中数据均为5次试验的平均值所得,百分率数据为x —

±s

2.3.2　ES 细胞在密度为1×104/mL 饲养层上的

生长表现　在密度为1×104/mL 饲养层上,ES 细胞

培养至第2天,集落最小且隆起不明显,与饲养层细胞间无明显的分割线,大部分集落形态不规则(图6A ),A KP 染色显示ES 细胞集落中部分细胞呈阳性,少数的细胞集落为阴性(图6B )。生长至第4天时,集落与饲养层间的界限不清晰,并观察有分化细胞集落出现,集落周围分化形成内皮样细胞(图6C )

。

图3　饲养层密度为1×104/mL 上增殖的ICM (100×

)

图4　饲养层密度为1×108/mL 上增殖的ICM (100×

)2.3.3　ES 细胞在密度为1×106/mL 饲养层上的

生长表现　在密度为1×106/mL 的饲养层上,ES

细胞生长至第2天增殖旺盛,细胞间紧密,呈典型的“鸟巢状”生长,边缘清晰,表面光滑,结构致密,与饲养层细胞间界限清晰,集落形成率高(图7A 、D );生长至第4天,集落形态仍然很规则,细胞间紧密,A KP 染色呈阳性,集落呈红棕色或蓝色(图7B 、E )。目前传到第5代(图7C 、F )。2.3.4　ES 细胞在密度为1×108/mL 饲养层上的生

长表现　在密度为1×108/mL 的饲养层上,

可见小

图5　密度为1×06/mL 饲养层上的囊胚ICM A.囊胚正在孵化脱出(200×

);B.脱出的ICM (200×);C.贴壁生长的ICM (100×)

集落生成,但是显著小于密度为1×106/mL 饲养层

上的集落,形态较规则(图8A )。生长至第4天,A KP 染色显示集落大部分细胞呈阳性少数细胞集落为弱阳性,可见集落表面分散有较多的染色较深的大细胞,但集落与饲养层间的界限清晰(图8B )。

本试验分析了在密度为1×104、1×106、1×108/mL 饲养层上的ES 细胞克隆形成率,密度为1×106/mL 饲养层上的ES 细胞克隆形成率高于1×108

/mL 饲养层上的ES 细胞克隆形成率,差异显著(P <0.05);显著高于密度为1×104/mL 饲养

层上的细胞克隆形成率,差异极显著(P <0.01);

1×104/mL 饲养层和1×108/mL 饲养层上的ES 细胞克隆形成率差异不显著(P >0.05)(表2)。

表2　不同饲养层上ES 细胞克隆形成率

项　目

饲养层细胞密度

1×104/mL 1×106/mL 1×108/mL F1代平均克隆数/个25.8±2.32652.6±1.25123.2±2.563

F1代克隆形成率%

25.852.623.2最高传代数/代

2

5

3

注:表中数据均为5

次试验的平均值所得

图6　密度为1×104/mL 饲养层上培养的ES 细胞生长行为(100×)　A 、B.生长第2天的ES 细胞集落形态及A KP 染色;C.

生长第4天的ES 细胞集落,周围分化形成的内皮样细胞

图7　密度为1×106/mL 饲养层上培养的ES 细胞生长行为　A 、D.生长第2天的ES 细胞集落形态及A KP 染色(40×

);B 、E.生长第4天的ES 细胞集落及A KP 染色(100×);C 、F.第5代ES 细胞集落及A KP 染色(200×

)图8　密度为1×108/mL 饲养层上培养的ES 细胞生长行

为　A 、B.生长第4天ES 细胞集落(100×)及A KP 染色(200×

)3　讨论

ES 细胞多能性的维持需要一定的微环境,饲养

层细胞除了在ES 细胞分离培养过程中具有促进全

能性(或多能性)细胞的增殖和抑制其分化两方面的作用外,应该还具有一个营造细胞生长微环境的作用,饲养层在体外模拟了体内子宫内膜的角色,为胚胎的着床提供依托,并且饲养层分泌L IF ,明显促进胚泡的发育、ICM 的增殖、孵出及贴壁。因此,在分离和培养ES 细胞的过程中选用状态良好的饲养层细胞至关重要。目前,常用的饲养层细胞有M EF [8]和STO 细胞(SIM 小鼠成纤维细胞的耐硫代鸟嘌呤和耐鸟苯苷亚系)[9210]、子宫内膜细胞[11]等。M EF 饲养层可以分泌成纤维细胞生长因子(F GF )

等促有丝分裂因子促进其增殖,同时还可以分泌白

血病抑制因子(L IF )和分化抑制因子(DIA )等多种细胞因子抑制ES 细胞分化。尽管ES 细胞的扩增培养可在无饲养层而添加分化抑制因子的条件培养液中进行[12214],但ES 细胞的建系和冻存在饲养层上更易完成[3]。因此,进行ES 细胞的建系和后续研究需要有效而成熟的饲养层培养体系支持,经典

的ES 细胞分离培养所用饲养层仍为M EF 。M EF

因其取材方便、易于铺层、分泌力强而成为ES 细胞首选的饲养层细胞。鉴于目前国内外多用原代或2～5代成纤维细胞或成纤维细胞株作为饲养层,本试验特选用怀孕14.5d 孕鼠的胎儿作成纤维细胞培养,用已纯化的第3代M EF 作为饲养层,并加入适量的含有白血病抑制因子(L IF )的培养基,比较在不同接种密度的饲养层上培养囊胚、ICM 及ES 细胞的生长状况。试验结果表明,在密度为1×106/mL 的饲养层上,囊胚贴壁时间短,贴壁率高,ICM 孵出快,孵出率高,ES 细胞集落形成率高,集

落形态很规则,细胞间紧密,集落表面少见大细胞,A KP 染色强阳性,目前传到第5代;囊胚在密度为1×104/mL 和1×108/mL 的饲养层上贴壁率低,ICM 孵出率低,形成的ES 细胞集落生长缓慢,并且

不易传代,A KP 染色显示,大部分细胞集落呈阳性,少数的细胞集落为弱阳性。并且在接种密度为1×108/mL 的饲养层,由于接种密度大,导致饲养层细

胞卷曲脱落,影响ES细胞的生长。

优质的饲养层培养体系是胚胎干细胞分离培养的关键。近些年来,有些学者对饲养层的必要性提出了质疑,认为L IF可以完全取代饲养层细胞,辅以条件培养基即可维持ES细胞的多能性[15],消除饲养层细胞的干扰。但Thomson等[16]在建立猕猴ES细胞系中发现,不使用饲养层,加入一定浓度的L IF,ES细胞传2代后便消失,认为尽管对饲养层细胞的一些处理,或多或少会对ES细胞的生长有一定的毒性影响,但是饲养层对ES细胞的建系仍是必需的,L IF不能完全取代饲养层。饲养层中成纤维细胞密度太低,细胞铺层所需时间长,这样容易造成细胞衰老,表现在附着性降低,细胞核裂解空泡化和胞质颗粒变性等,细胞间隙太大,不能够提供足够的营养成分,从而导致囊胚贴壁困难,ICM孵出率低,ES细胞分化、变异。安立龙等[17]将小鼠ESC 置于衰老饲养层表面进行培养时发现,ES细胞集落松散,表面及周围形成许多颗粒细胞,巨形细胞和上皮样细胞,认为衰老饲养层细胞能诱导ES细胞的体外分化;饲养层中成纤维细胞密度太大,导致细胞寿命缩短,原因为:培养液中营养成分有限,细胞浓度大,则造成营养不足,二为细胞在生存过程中产生一定代谢产物,释放到周围环境中,当其浓度达到一定程度时,就会引起培养液p H及其他成份的变化,并且细胞卷曲脱落,影响ES细胞的生长。本试验研究结果显示,饲养层最佳接种密度为1×106/ mL,细胞铺满皿底所需时间短,细胞之间无间隙、无死亡细胞,生长良好,形成细胞单层,满足ES细胞的增殖需要,尤其是早期ES细胞克隆的增殖。

小鼠ES细胞在体外培养过程中,饲养层细胞通过分泌营养或生长因子维持其多能性和未分化状态,有利于信号网络的相互作用。目前认为ES细胞主要通过一些外源性信号分子的作用某些重要的内源性转录因子的表达共同起作用来达到其维持多能性的目的。在外源性因子中,L IF、STA T3、BMPs 和Wnt s对小鼠ES细胞自我更新起作用,而T GFβ/activin/nodal,Wnt sbF GF和ECM分子等是人ES细胞维持所必需的分子。ES细胞的多能性及自我复制能力的维持涉及一系列具有重要功能的转录因子的作用,即内源性因子,包括Oct24, Nanog,FoxD3,Sox2等[18219],这些转录因子的表达仅存在于早期胚胎发育过程中的多能细胞中(如ICM,Epiblast等)。随着胚胎的进一步发育,这些多能细胞逐渐分化成成熟的组织细胞类型而丧失多能性,而此时这些多能性相关的转录因子的表达也就随之消失。在体外培养的细胞系中,这些转录因子也只局限在具有多能性的细胞中,如ES细胞,EC 细胞等。同样,如果这些细胞由于分化而丧失多能性,这些转录因子的表达也就随之消失。这些转录因子在胚胎的正常发育过程中起非常重要的作用,它们在早期胚胎发育过程中,共同起作用来维持ES 细胞的多能性及自我复制能力,它们分别或者共同抑制那些促进ES细胞分化的基因表达,激活那些有助于维持ES细胞多能性维持的基因表达。在这些转录因子中,尤以Oct24和Nanog的作用最为重要,Oct24、Nanog是小鼠和人ES细胞的多能性维持都必需的内源性因子对ES细胞多能性的维持起关键作用。目前,转录因子Oct24和Nanog的表达与否已经成为衡量一种细胞是否具有多能性的标志。然而,它们对于干细胞的多能性是如何进行调控的还不清楚。

此外,分离和克隆ES细胞集落的前提是得到高质量的小鼠早期胚胎。早期胚胎的发育是一个复杂的过程,需要多种细胞因子的参与,在体外培养时,提供与体内环境类似的培养条件,是促进胚胎发育的关键。可通过超数排卵和自然交配的方法得到胚胎,冲胚时间一般在见栓后第3天[20]即3.5d。本试验采用超数排卵方法获取胚胎,为确保所得胚胎都已发育到囊胚期,并保证所有胚胎都尚未着床。通过预试验,我们发现在昆明白小鼠中,同一孕鼠体内的胚胎发育存在一定的差异性,超数排卵小鼠更为明显。所以,很难确定一个准确的时间。本试验将冲胚时间推迟至见栓后第3天下午2:00～4:00时冲胚,即用怀孕4d的昆明白小鼠冲胚,得到的胚胎95%是囊胚及扩张囊胚,胚胎质量好,此结论与董晓等一致[21]。由于不同品系小鼠的解剖、生理条件不同,饲养环境不同,其胚胎发育的时间也不相同。因此,建立不同品系小鼠的ES细胞系,需要摸索冲胚的具体时间。

昆明白小鼠是我国应用最多的实验小鼠[22226],昆明白小鼠的ES细胞分离培养中遇到的困难是不能稳定地传代和成功获得ES细胞集落的比例较低,这可能由其种属特异性所决定。由于品系之间的差异,适用于某品系小鼠ES细胞系建立的方法和培养条件,可能并不适宜昆明白小鼠。因此建立一套稳定、高效的ES细胞分离培养体系,对于提高ES细胞建系的成功率有着重要意义。

在ES细胞分离培养过程中,建立良好的饲养层培养体系是必要的。从本试验结论可以得出,选用第3代生长旺盛且杂细胞较少的成纤维细胞,经

丝裂霉素处理后,以接种密度为1×106/mL作饲养层培养体系,可以有效地促进ES细胞增殖。

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胚胎干细胞培养有新法

胚胎干细胞培养有新法 2010-12-22 来源：科技日报责编：杨婷 据美国每日科学网12月19日报道，美国研究人员发现，利用软凝胶基质代替硬培养皿来培养小鼠胚胎干细胞，无需添加昂贵的生长因子，便可让干细胞培养物长时间维持同质的多能状态。研究人员表示，这一技术在未来的再生医学中有着巨大的应用前景。相关论文发表在《公共科学图书馆·综合》杂志上。 干细胞研究面临的主要障碍就是如何让小鼠胚胎干细胞培养物保持一种均一的多能状态。多能干细胞可自发地分化成皮肤或者肌肉等不同的组织类型，长期以来，科学家都是利用一种被称作生长因子的化学物质来维持干细胞的多能态不变，但即便如此，培养出来的干细胞还是会很快进入各自的分化阶段，呈现出不同的基因表达和形态，这种多样性分化使得干细胞培养物很难被诱导生成所需的特定组织。 该研究负责人之一、伊利诺伊大学基因组生物学研究所动物科学教授田中哲也表示，可以从培养一群同质的未分化细胞入手，诱使其分化成特定的细胞类型以实现临床应用。 研究小组发现，多能小鼠胚胎干细胞喜欢“抱团”黏附在一起，而处于群体边缘、与坚硬的培养皿接触的细胞分化速度相对较快，于是他们决定对小鼠胚胎干细胞进行机械学研究而非化学研究。由于干细胞比成熟细胞要柔软10倍，研究人员猜测是否是培养皿和细胞之间的机械力刺激了细胞分化，并通过前期研究证实，即使很小的机械力也可诱导细胞分化。 接下来，研究小组将小鼠胚胎干细胞分成3组进行平行试验：第一组用加入了生长因子的常规培养基培养；第二组采用与这些细胞同样硬度的软凝胶基质进行培养，并加入生长因子；第三组同样用软凝胶基质培养，但没有加入生长因子。结果显示，即使缺乏生长因子，利用软凝胶基质培养的干细胞在3个多月传代20次后仍能表现出更明显的同质性和多能性。 研究合作者、伊利诺伊大学机械科学和工程系教授王宁(音译)说，这体现了事物的两面性：机械力能够诱导分化，但如果降低培养基和干细胞之间的机械力，就可以将干细胞保持在多能状态。这项研究证实了在干细胞分化过程中力学环境的重要性不亚于化学生长因子。在活的有机体中，细胞只在短期内分泌生长因子，而机械力则始终在影响每个细胞。 研究小组下一步打算利用这种新技术来培养诱导多能干细胞(iPS)，虽然iPS 细胞医学应用前景广阔，但也是出了名的难以培养。田中哲也说：“我们可以试

胚胎干细胞的体外诱导分化模型

胚胎干细胞的体外诱导分化模型马宗源　李祺福(厦门大学生命科学学院福建厦门361005) 胚胎干细胞是具有全能性及无限制的自我更新与分化能力的一类特殊的细胞群体,它能通过祖细胞为中介,分化为各种类型的体细胞,可重演体内干细胞的分化过程。自80年代从小鼠囊胚的内细胞团分离到胚胎干细胞并建系到现在已建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞、造血细胞等体外分化体系。将胚胎干细胞体外分化成为可利用的分化模型,无论从组织结构、细胞及分子水平都体现了体内分化过程的体外重演,再加上胚胎干细胞系具有体系简单,影响因子少,可控制,便于研究等特点,因此可用于研究早期胚胎发育和细胞分化调控;可成为器官移植和修复器官的细胞来源;还可用于新型药物筛选。 1　胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞具有与早期胚胎相似的结构特征,具有较高的核质比和整倍体核型。体外培养的细胞紧密堆积,呈克隆状生长,具有发育分化的多潜能性和无限制的自我更新能力,碱性磷酸酶染色呈阳性,具有高的端粒酶活性,早期胚胎细胞均表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、T RA-1-81、T R A-1-60等;表达种系转录因子OCT-4,并且可将O CT-4基因作为细胞多能性的一个标志;白介素6型细胞因子家族参与维持调节胚胎干细胞未分化状态。 胚胎干细胞建系的过程中要解决的问题在于体外不断增殖的过程中保持未分化的状态,但是细胞如何维持其未分化状态的机理并不清楚。研究发现主要是通过膜上的特异受体蛋白gp130来发挥作用,细胞因子受体蛋白g p130可激活JA N U S、酪氨酸激酶,JA K-ST A T、M EK/M A P K等信号途径,而JAK/ST A T3和M EK/ ERK信号途径则处于相对平衡的状态。另外,一些未知的膜结合分子也参与胚胎干细胞的增殖与分化。分离纯化及鉴定调节细胞的自我更新及分化的未知分子已成为研究的热点。 2　胚胎干细胞为基础的分化模型 胚胎干细胞要维持其未分化的状态,需要在胚胎饲养层中加入分化抑制因子。一旦改变了维持胚胎干细胞未分化状态的条件,胚胎干细胞首先形成胚胎小体,胚胎小体有外中内三胚层,继续分化可形成多种类型的细胞。在体外分化培养时,可自发形成有节律性跳动的心肌细胞,同时还形成骨骼肌、神经细胞、上皮细胞等。由于体外胚胎细胞可重演体内胚胎细胞的发育过程,并且基因的表达时相与体内的胚胎发育过程是相似的,在这一过程中加入外源的诱导分化因子并与相关的调控基因结合,可使胚胎干细胞分化为各种类型的细胞。现在已初步建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞和造血细胞等体外分化模型。 2.1　神经细胞　体外培养胚胎干细胞可模拟从未定型细胞向功能性神经元转化的过程,并且其基因的表达时相与体内的胚胎发育过程相似。在分化的早期表达N FL、N F M基因,后期则表达N eur ocan基因。维甲酸及神经生长因子可诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞,是常用的诱导分化物,它能上调神经元特异基因的表达,同时下调中胚层基因的表达。将神经元特异的SOX2基因转进胚胎干细胞,再经维甲酸诱导,可表达90%以上的具有神经元标志的神经细胞。可能是外源基因和维甲酸同时拮抗分化抑制因子的作用,阻碍细胞向其他的方向分化,迫使其向神经元的方向分化。维甲酸能诱导胚胎干细胞分化为C-氨基丁酸能和多巴胺能神经元,而维甲酸分别结合无血清培养基和含胎牛血清的培养基培养胚胎干细胞后发现,采用无血清培养时,几乎检测不到分化的多巴胺能神经元的存在;但在有血清培养时,却能检测到大量的多巴胺神经元。这暗示血清中的某些未知的因子和维甲酸共同起到定向诱导分化 化为特定组织细胞,将这些细胞回输体内,从而达到长期治疗的目的。干细胞的医学应用还包括体外克隆人体器官,然而这比体内移植干细胞要复杂的多。相信随着研究的不断深入,来自人体干细胞的器官应用于临床治疗已为期不远。干细胞研究与应用不仅在疾病治疗方面有着极其诱人的前景,而且将对克隆动物,转基因动物生产,发育生物学,新药物的开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响。 参考文献 　1　Th omson J A,Itsk ovitz-Eldor J os eph,Shapiro S S,et al. Em bryonic s tem cell lin es d erived from human b las tocysts.S cience,1998,282:1145—1147. 　2　Sh amb lott M J,Axelman J,W ang S,et al.Derivation of Plurip otent stem cells from cultured human primordial germ cell.Proc Natl Acad S ci U SA,1998,95:13726—13731. 　3　Jack son K A,M i T,Goodell M A.Hematopoietic potential of s tem cells isolated from murie s keletal mus cle.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:14482— 14486. 　4　裴雪涛.干细胞研究现状与展望.高技术通讯,2001, (6):93—95. (BH)

小鼠胚胎干细胞培养

以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。 一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM（高糖） 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5．离心3分钟； 6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次； 7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； 8．孵育。 冻存细胞 冻存液

大鼠骨骼肌细胞培养实验指导

大鼠骨骼肌细胞培养 骨骼肌是一种横纹肌，通常是通过肌腱固定到骨骼上，其伸缩可以带动骨骼的移动，促进机体运动。 肌细胞呈纤维状，不分支，有明显横纹，核很多，且都位于细胞膜下方。肌细胞内有许多沿细胞长轴平行排列的细丝状肌原纤维，每一肌原纤维都有相间排列的粗肌丝及细肌丝。肌纤维收缩并不是肌纤维中肌丝本身的缩短或卷曲，而是细肌丝在粗肌丝之间滑行的结果，肌丝滑行使肌节长度缩短，肌原纤维缩短表现为肌纤维收缩。 体外培养大鼠骨骼肌细胞，为临床肌肉损伤的治疗提供理论依据. 一、实验前准备 实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。 按照含0.2%的XI胶原酶、0.2%的中性蛋白酶、0.1%的胶原酶进行配制消化液，用0.22微米的PES微孔滤膜进行过滤除菌，置于50毫升离心管中，可直接用于组织消化。瓶口消毒后室温待用。 取出无菌培养皿，分别作好标记，吸取适量PBS置于相应标记的培养皿中。 无菌条件下，准备好各种大小的眼科剪刀、止血钳、眼科镊子和手术刀。将断颈处死后浸泡于体积分数为 75%乙醇的SD大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。 二、骨骼肌提取 眼科剪刀剪开大鼠后肢皮肤，暴露腿部肌肉，用手术刀小心割取后肢大腿肌肉，同样方法分离另一后肢大腿肌肉。小心剪取表面无附着膜和脂肪组织的肌肉，置于装有PBS的无菌培养皿中。 吸取适量消化液于相应标记的培养皿中。 将剪取的骨骼肌在无菌PBS浸泡清洗，去除脂肪组织后放置于含消化液的培养皿中，采用眼科剪刀剪碎骨骼肌组织，成1平方毫米不规则碎片。 轻轻摇匀，室温静置消化30分钟 收集组织悬液于50毫升离心管中，用消化液反复冲洗培养皿，直至将全部组织块收集到离心管内。 轻轻吹打混匀组织块悬浮液。

胚胎干细胞体外诱导分化综述

胚胎干细胞体外诱导分化综述 摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。 关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用 干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以 分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离 自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的 分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团 内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培 养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤

细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。

b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养

细胞培养实验指导

细胞培养实验指导陈轶霞刘俊林

实验报告书写要求： 1、学生实验后应按时完成并提交实验报告。报告要求结构完整、内容充实、图表齐全、书面整洁、分析讨论认真合理等。 2、严禁互相抄袭实验报告，发现雷同实验报告一律视为不及格。 3、切忌全班同学统一打印相同的实验结果图（以前曾发生过全班同学共用一张错误的图的情况） 实验一细胞培养实验室介绍及使用卫生要求 【目的与要求】 1.了解细胞培养实验室的基本设施和布局 2. 掌握细胞培养实验室的使用卫生要求 【基本原理】 细胞培养必须无菌操作，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素影响，应建立专门的实验室并划分不同功能区。理想的细胞培养实验室可分为准备室、更衣室、缓冲室、培养室等。 【内容与方法】 1．通过教师讲解并参观了解开展本课程教学的细胞培养实验室的布局、设施与仪器设备的摆放情况 2.使用卫生要求。 （1）实验室的消毒 实验室日常采用紫外灯消毒；按实验室的卫生管理要求对实验室洁净区按周期进行熏蒸消毒；在培养期间发生严重污染时要进行熏蒸消毒。 （2）培养工作开始操作前将所有培养用的物品经专用物流通道通过传递窗放进培养室，开紫外灯消毒30min，关紫外灯后方进入操作。配有空气净化系统的洁净室在风机开启至少30min后才能达到相应的洁净度级别。 （3）操作者进入培养室时要遵守的程序 a: 用肥皂洗手，在干手器上吹掉手臂上的水滴。 b: 换穿无菌室专用鞋，进入更衣室，外衣挂到指定的衣柜里，用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂进行消毒，戴帽子（不露头发）、口罩（应包住胡须），穿已消毒的洁净服，进入缓冲室。再用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂消毒，在其滞留3min后进入培养室。 （4）开超净工作台10min，期间用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭操作台面后可开始具体的操作，同时点燃酒精灯用于临时性的火焰消毒。 （5）实验完毕，关闭超净工作台，及时清理实验用品，废物从通往物流通道的传递窗中传出。工作台面用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭消毒后方可出培养室。 （6）出培养室时，将工作服放在更衣室指定的位置以便清洗和消毒，鞋放到隔离鞋柜里，跨过隔离鞋柜，将用过的一次性帽子、口罩、鞋套等放到指定的废物桶，出实验室前用肥皂洗手，关闭空气净化系统，开紫外灯30min。 注：(不写实验报告)

细胞原代培养细胞生物学实验报告

细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理

细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤

胚胎干细胞体外培养.

胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs

【2018新课标 高考必考知识点 教学计划 教学安排 教案设计】高二生物：胚胎分割和胚胎干细胞

二、重难点提示 重点：1. 胚胎分割的过程 2. 胚胎干细胞的特点和应用 难点：胚胎干细胞的特点和应用

【随堂练习】 1. 胚胎分割是一种现代生物技术，关于这一技术的叙述正确的是（） A. 胚胎分割可以将早期胚胎任意分割成多份 B. 胚胎分割技术可以获得同卵双胎或多胎 C. 胚胎分割技术属于有性生殖，不属于克隆 D. 胚胎分割技术可以分割任意时期的胚胎 思路分析：在胚胎分割时要将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育，所以不能将早期胚胎任意分割成多份；胚胎分割移植可以看作无性生殖；胚胎分割一般要在桑椹胚或囊胚时期进行。 答案：B 2. 北京市某医院接生了一名婴儿，医院为他保留了脐带血，如果后来他患了胰岛素依赖型糖尿病，就可以通过脐带血中的干细胞为其治疗。关于这个实例说法正确的是（） A. 用干细胞培育出人体需要的器官来治疗疾病，需要激发细胞的所有全能性 B. 用脐带血干细胞能治疗这个孩子的所有疾病 C. 如果要移植用他的干细胞培育出的器官，需要用到细胞培养技术 D. 如果要移植用他的干细胞培养出的器官，应该长期给他使用免疫抑制药物 思路分析：用脐带血干细胞培养出人体需要的器官用来治疗疾病，不需要激发细胞的所有全能性。脐带血干细胞不能治疗所有疾病，如意外伤害、毒药伤害等。脐带血干细胞最大的优点就是自体移植不会有免疫排斥反应，因而不需要给他使用免疫抑制药物。 答案：C 例题1 利用胚胎干细胞治疗肝衰竭，实现此过程的最重要原因是（） A. 细胞生长 B. 细胞特化 C. 细胞分化 D. 细胞增殖 思路分析：胚胎干细胞具有发育的全能性，可以被诱导分化形成新的组织细胞，移植胚胎干细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能，因此利用胚胎干细胞治疗肝衰竭主要是利用其分化特性而实现的。 答案：C 例题2 如图为经过体外受精和胚胎分割移植培育优质奶牛的过程，请回答下列问题： （1）A细胞是____________，在进行体外受精前要对精子进行____________处理。 （2）进行胚胎分割时，应选择发育到____________时期的胚胎进行操作。 （3）②指的是____________。 （4）通过胚胎分割产生的两个或多个个体具有相同遗传性状的根本原因是

植物生理学实验指导

植物生理学实验指导 Prepared on 24 November 2020

植物生理学实验指导

目录

植物材料的采集、处理与保存 植物生理实验使用的材料非常广泛，根据来源可划分为天然的植物材料（如植物幼苗、根、茎、叶、花等器官或组织等）和人工培养、选育的植物材料（如杂交种、诱导突变种、植物组织培养突变型细胞、愈伤组织、酵母等）两大类；按其水分状况、生理状态可划分为新鲜植物材料（如苹果、梨、桃果肉，蔬菜叶片，绿豆、豌豆芽下胚轴，麦芽、谷芽，鳞茎、花椰菜等）和干材料（小麦面粉，玉米粉，大豆粉，根、茎、叶干粉，干酵母等）两大类，因实验目的和条件不同，而加以选择。 植物材料的采集和处理，是植物生理研究测定中的重要环节。在实际工作中，往往容易把注意力集中在具体的仪器测定上，而对于如何正确地采集和处理样品却不够注意，结果导致了较大的实验误差，甚至造成整个测定结果的失败。因此，必须对样品的采集、处理与保存给予足够的重视。 一、原始样品及平均样品的采取、处理 植物生理研究测定结果的可靠性（或准确性），首先取决于试材对总体的代表性，如果采样缺乏代表性，那么测定所得数据再精确也没有意义。所以，样品的采集除必须遵循田间试验抽样技术的一般原则外，还要根据不同测定项目的具体要求，正确采集所需试材。目前，随着研究技术的不断发展，应该不断提高采样技术的水平。 在作物苗期的许多生理测定项目中都需要采集整株的试材样品，在作物中后期的一些生理测定项目中，如作物群体物质生产的研究，也需要采集整株的试材样品，有时虽然是测定植株的部分器官，但为了维持器官的正常生理状态，也需要进行整株采样。 除研究作物群体物质生产外，对于作物生理过程的研究来说，许多生理指标测定中的整株采样，也只是对地上部分的采样，没有必要连根采样，当然对根系的研究测定例外。采样时间因研究目的而不同，如按生育时期或某一特殊需要的时间进行。除逆境生理研究等特殊需要外，所取植株应是能代表试验小区正常生育无损伤的健康植株。

细胞复苏实验指导

细胞复苏 细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细胞的过程。细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。 一、实验前准备 实验开始前，将无菌培养瓶，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。然后，采用通风机通风3min。以75%酒精擦拭操作台和双手。准备好冰盒。 将离心机调节至800rpm，5min。水浴箱调节至37度恒温。取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。 消毒双手和超净台。取约10ml细胞完全培养基放于15ml离心管中。 实验前备冰盒，快速由液氮中取出冻存的细胞，置于冰盒内。然后迅速将冻存管投入到已经预热到37度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。 二、制备细胞悬液 以无菌枪头吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO的浓度，减轻细胞损伤。以封口膜封好管口。 配平离心：采用天平配平两端，800rpm，室温离心5min。 三、细胞计数 采用罗氏CASY-DT快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数。加入10ml CASY-ton至以标记viable的管子中，加入100ul细胞悬液，颠倒混匀三次，可进行细胞计数。可见每毫升悬液中有活细胞2乘10的5次方. 四、细胞培养 离心后，吸弃上清液，不要吸到底部的细胞沉淀。根据计数结果，向离心管内的细胞沉淀加入10ml细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液，吹打过程中尽量不要产生气泡。

人胚胎干细胞培养手册

人胚胎干细胞培养手册 操作指南 运输和保存：人胚胎干细胞（hESCs）和PMEFi被装在含90％FCS和10％二甲基亚砜的冻存管中，hESCs 4×105/管，可接种一个3.5cm培养皿（或六孔板的一个孔），PMEFi 4×106/管，可接种一块六孔板。冻存管用干冰运输，收到后，hESCs投入液氮，PMEFi放入－80℃保存。 培养条件：温度：37±0.5℃ CO2浓度：5.1±0.6％ 相对湿度：85-100% 主要技术： 1．细胞培养： 当进行hESC培养时，总的培养原则必需遵守，所有的操作都应该在相应的细胞培养间和超净台内按无菌技术进行。此外，通过安装空气处理和过滤设备减少空气颗粒制造一个相对洁净的空间。当接触和细胞有关的一切试剂和材料时，应该带手套（包括开冰箱门）。工作间在使用前后要用70％的异丙醇彻底消毒。 2．培养液和材料 所有的培养液和试剂在使用前都要用0.2μm的滤膜过滤；培养瓶和TC材料在拿进培养间之前都应该用70％异丙醇消毒。 3．细胞处理 为了便于操作，最好不要同时处理两个以上的标本。操作时，在室温和低CO2的时间不要太长。所有的细胞离心：室温，500－600g，5分钟。

培养液准备： MEF和hESCs培养液在无菌条件下进行，完成后用0.2μm的滤膜过滤。当准备hESCs培养液时，保持一致性很重要。如有可能，尽量使用相同的试剂。使用满足于附录提供的血清替代品尤为重要。 生长因子应该最后添加，需要强调的是bFGF进行重悬时需要蛋白载体，在少量培养液中不要试图重悬它。 MEF培养液： hESCs培养液： 冷冻培养液：90％FCS+10%二甲基亚砜, 0.2μm的滤膜过滤,4℃保存。 明胶准备： 用超纯水配制0.1％明胶溶液，加热确保明胶完全溶解，使用前高压或0.2μm 的滤膜过滤。 明胶包被： 接种细胞前，用0.1％明胶溶液包被培养皿，37℃至少30分钟，分别用1.5或4ml包被35mm或10cm培养皿。在接种MEF前吸除明胶溶液。

细胞划痕实验指导

细胞划痕 细胞划痕实验是指将细胞培养在培养皿或平板上，待细胞融合后用枪头或其他硬物在中央区域画一条线，这条线内的细胞被机械力去除掉了，然后将细胞继续培养，观察细胞向无细胞的划痕区域迁移的情况，来判断细胞的迁移能力。其意义在于：价格低廉，操作简单，还有很重要的一点在于细胞外围环境简单、单纯，容易控制，是肿瘤细胞最基本的研究方法。 一、实验前准备 实验开始前，将离心管、吸管筒、移液枪、枪头，直尺等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。然后，采用通风机通风3min。 取出无菌6孔板，用黑色记号笔在6孔板底部，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔，每孔至少穿过3条线。每条黑线的上下缘与划痕交叉点作为观察点，这样一方面便于观察另一方面可以一次取多个观察点，最终可以获得多个数据。 画好横线后，在板上分别做好标记。 取下试剂瓶和离心管上的封口膜，且将每个试剂瓶和离心管拧松，方便后续试验的操作。 二、细胞准备 取出处于对数生长期的健康细胞，吸掉原来的培养液，用无菌PBS清洗细胞。加入1ml 胰酶消化液消化细胞，显微镜下观察所有细胞完全皱缩变圆后加入完全培养基终止消化。收集细胞悬液于15ml离心管中，800rpm/min室温离心5min。用罗氏CASY快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数，弃去上清，加入培养基重悬细胞。，以每孔1~4×105细胞的密度接种到6孔培养板上，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养一天。具体数量因细胞种类不同而不同，掌握为过夜能铺满。 三、直线划痕 取出铺满六孔板的细胞，用200ul枪头垂直于细胞表面，由孔一端划向另一端。尽量垂直于背面的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。此时可在培养皿的表面清晰看到细胞表面呈#字形划痕。

[胚胎干细胞培养标准化操作规程]培养胚胎干细胞

[胚胎干细胞培养标准化操作规程]培养胚胎干 细胞 胚胎干细胞培养标准化操作规程6/28/01 目录 一、细胞 二、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态 培养基 细胞复苏 冻存细胞明胶包被 细胞传代 三、体外分化 培养基 包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板 体外分化方法 四、移植细胞的准备 细胞 多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡 1、表达绿色荧光蛋白的B5-ES细胞。由Dr、 Nagy的实验室制备。 2、D3-ATCC; CRL-19

34、我们得到时大约传了17代。 3、J1-由Dr、 Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。 4、J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr、 Jaenish的实验室友情提供。 5、表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr、 Nagy的实验室提供。 一般培养--维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有ESGRO的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液。分装在50ml FALCON管中，，贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO 加入450mlDMEM中制备培养基，μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。 贮存液

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化 ...

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态 培养基 细胞复苏 冻存细胞 明胶包被 细胞传代 体外分化 培养基 包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片） 体外分化方法 注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。 一般培养--维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM(高糖) 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF

动物细胞原代培养实验项目指导

附件-4 综合设计性实验项目指导 一、实验项目名称：动物细胞原代培养及活力检测 二、实验目的：掌握原代细胞培养的一般方法和步骤及培养过程中无菌操作技术，熟悉原代培养细胞的观察方法及细胞活力的测定方法，为细胞工程中的胚胎移植、细胞融合与单克隆抗体制备等技术奠定重要的技术基础。 三、实验原理 用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养。这种培养过程是把组织或器官从动物体取出，分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断的生长和繁殖。 原代培养是建立各种细胞系的第一步。利用原代培养技术可以在体外进行各种类型细胞的增殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究。原代培养科分为组织培养法和消化法两种。 台盼蓝染色法检测细胞活力的原理:台盼蓝是检测死、活细胞最常用的生物染色试剂之一。健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，由于膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。 四、实验材料： 1.新生兔 2.大剪子、弯头眼科剪、小镊子、平皿、细胞培养瓶、烧杯、酒精灯、移液枪、超净工作台、细胞计数板、0.22μm细菌过滤器、移液枪、枪尖、PE手套、一次性无菌橡胶手套、脱脂棉、无水乙醇、台盼蓝、15ml离心管 3. DMEM培养基、血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶 五、实验仪器：二氧化碳培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、离心机、显微镜 六、实验步骤（方案）：（如需要学生设计，也要提交一参考方案供论证评审）（一）DMEM培养基的配制 1. 将DMEM培养基干粉用800ml超纯水溶解，加入3.7gNaHCO3，搅拌溶解，加入双抗（100IU/ml），调整pH为7.0，定容至1L，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，分装，并用封口膜封口，4℃保存备用。

胚胎干细胞自我更新的信号转导途径和体外培养系统的研究

胚胎干细胞自我更新的信号转导途径和 体外培养系统的研究进展 朱江　汪燕　刁永书 【摘　要】 目的　综述近年来有关胚胎干细胞(em b ryon ic stem cell,ESC)自我更新相关的信号转导途径及体外培养系统的研究进展。　方法　广泛查阅近年有关ESC自我更新相关的信号转导途径及体外培养研究的文献,并进行综述。　结果　阐明有关ESC体外自我更新和多向分化潜能的分子机制,有助于改善ESC体外培养系统条件,是ESC成功应用于临床的基础。　结论　有关ESC实现自我更新及多向分化潜能的分子信号尚需更多研究,ESC培养体系有待于进一步完善和发展。 【关键词】 胚胎干细胞 自我更新 信号转导 培养系统 中图分类号:R318.04　R321.1 文献标识码:A SEL F-RENE W AL SIGNAL ING PATH W AY AND CUL TURE S Y STE M IN V ITR O OF E M BR YON I C STE M CELL S ZH U J iang,W A N G Y an,D IA O Y ong shu.Cancer Cen ter of W est Ch ina H osp ita l,Cen ter of R ep rod uctive M ed icine, W est Ch ina S econd U n iversity H osp ita l,S ichuan U n iversity,Cheng d u S ichuan,610041,P.R.Ch ina.E2m a il:z huj iang1 @m edm a il.co https://www.wendangku.net/doc/c215248774.html, Corresp ond ing au thor:ZH U J iang,E2m a il:z huj iang1@m edm a il.co https://www.wendangku.net/doc/c215248774.html, 【Abstract】 Objective　To review the latest developm en t of the research on the self2renw al signaling pathw ay and cu ltu re system in v itro of the em b ryon ic stem cells(ESC s).　M ethods　T he recen t articles abou t the self2renew al signaling pathw ay and cu ltu re system in v itro of the ESC s w ere ex ten sively review ed.　Results　U nderstanding of the mo lecu lar m echan is m of the self2renew al in v itro and p lu ri po tency of the ESC s w as con sidered i m po rtan t fo r develop ing i m p roved m ethods of deriving,cu ltu ring and differen tiating these cells in to the cells that cou ld be successfu lly u sed in the clin ical p ractice.　Conclusion　A fu rther research is needed to elucidate the self2renew al signaling pathw ay and the p lu ri po tency of the ESC s and the cu ltu re system in v itro fo r the hum an ESC s rem ain s to be fu rther i m p roved and developed. 【Key words】 Em b ryon ic stem cells Self2renew al Signaling pathw ay Cu ltu re system 胚胎干细胞(em b ryon ic stem cell,ESC)主要来自囊胚内细胞团或从胎儿生殖嵴分离得到的原生殖细胞以及体细胞核,转移至去核卵母细胞后培育出来,具有两个最显著的特征:自我更新和多向分化潜能。ESC 不但成为研究早期胚胎发生、细胞组织分化、基因表达调控等发育生物学事件的一个理想模型,更重要的是人ESC(hum an ESC,hESC)可为临床上细胞移植、组织替代和器官克隆提供新的细胞来源,为多种难治性疾病的治疗带来希望。目前,从胚胎或成人组织(器官)分离培养功能细胞在技术上已经十分成熟,制约临床应用的主要因素——体外大规模扩增技术在成体干细胞也部分得到解决[1],已有不少临床应用的报道,如自体骨髓间充质干细胞促进缺血肢体重建血循环在临床上有获得成功的报道[2,3]。由于ESC具有分 作者单位:四川大学华西医院肿瘤中心(成都,610041) 通讯作者:朱江,主治医师,研究方向:肿瘤干细胞,E2m ail: zhujiang1@m edm https://www.wendangku.net/doc/c215248774.html, 化全能性,较成体干细胞具有更广阔的临床应用前景,保持ESC体外无限增殖不分化状态是其临床应用的前提条件。研究表明,ESC的自我更新同时受到细胞生长环境和内源性调节因子的控制。近年来ESC自我更新机制和定向分化条件的研究是干细胞研究的热点,也是ESC得以临床广泛应用的前提。现就ESC自我更新相关的信号转导途径及体外培养系统作一综述。 1　ESC自我更新相关的信号转导途径 很多研究表明,多条信号转导通路和多种转录调节因子均参与ESC体内外自我更新及不分化状态的维持,阐述如下。 1.1　白血病抑制因子(leukem ia inh ib ito r facto r, L IF)2L IF受体(L IF recep to r,L IFR)2细胞因子亚单位(glycop ro tein130,gp130)2蛋白酪氨酸激酶(janu s k inase,JA K)2信号传导子及转录激活子3(signal tran sducer and activato r of tran scri p ti on3,STA T3)途径