载体构建流程
一、简介
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。
在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体（筛选）。
二、实验流程（大致的简单过程）
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的
病毒颗粒，需要利用表达载体(自己构建)和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T细胞(购入)中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
大致的实验流程：
1. 根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存）
2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；
3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T 细胞[1]，进行病毒包装和生产，收集病毒液；
4. 浓缩、纯化病毒液；
5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T细胞)；
6. 通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果；
7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。病毒液足够用于一般的动物活体实验。
三、重组质粒构建流程
1.基因的获得: shRNA寡核苷酸序列的设计和合成(将正确序列克隆入载体中，退火形成双链，PCR扩增)
2.回收
A．酶切产物的胶回收：一般做50-100ul 体系，然后跑电泳回收，回收量一般为30ul。B．PCR扩增产物的胶回收
原理：首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。试剂盒的胶回收柱采用特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA、RNA的原理，配备设计独特的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速离心机，在几分钟之内即可以高效回收核酸片段。
实验仪器：1、琼脂糖凝胶电泳系统2、紫外观察分析仪3、离心机4、单面刀片5、恒温水浴锅
试剂：1、DNA回收试剂盒[2]2、50×TAE[3]（电泳缓冲液Tris-乙酸）3、ddH2O
4、琼脂糖凝胶[4]
步骤：
1）使用TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳（分离DNA 作用）[5]。
2）在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖。放入1.5ml离心管中。
3）按每100mg琼脂糖加入300—600μl 溶胶液[6]的比例加入溶胶液（本实验加500ul），置55℃水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一次促溶。
4）将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm 室温离心1分钟，倒掉收集管中的液体。再将吸附柱放入同一个收集管中。
5）在吸附柱中加入500uI漂洗液，室温静置1分钟后，12000rpm 室温离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
6）再在吸附柱中加入500uI漂洗液，12000rpm 室温离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
7）12000rpm 室温空离心1分钟。
8）将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30ul洗脱缓冲液，室温静置2分钟后，12000rpm 室温离心1分钟（为提高回收效率可再洗脱一次），将1.5ml 离心管(DNA)贮存于-20℃。
9）琼脂糖凝胶电泳（鉴定作用）检测回收产物。
注意事项：
1）切胶时应快速操作，在紫外灯下时间长容易伤害到眼睛；
2）溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。
3）胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。
4）把洗脱液加热，使用时有利于提高洗脱液效率
3．连接
器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。
试剂：T 载体，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液，无菌dd Water 。
操作步骤：PCR产物（已纯化回收）与T载体直接连接：
（1）事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在14~16°C。
（2）取4个灭菌的200ul微量离心管，加入：（需要调整）4ml 目的基因；1ml T 载体；0.5ml T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul）；1ml 连接酶缓冲液10 x buffer ；
3.5 ml dd Water ，总量10ml 体系。
（3）上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14°C干式恒温仪（或14°C 水中）中保温过夜（12-16h）。
（4）连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。
4. 转化
原理：目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。在一定条件下，经过连接后的ＤＮＡ片段与感受态细胞混合保温，可以进入感受态细胞。进入感受态细胞的ＤＮＡ分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。
目的：连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒。
器材：恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。
试剂：1.LB固体和液体培养基[7] 2.含特定抗生素的LB固体培养基3.100mM CaCl2溶液。4.待转化质粒
大肠杆菌感受态细胞制备步骤：
1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mlLB液体培养基，37℃振荡培养过夜（12h 左右），直至对数生长期。
2）取0.4ml菌液转接到40mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h，至OD600值达到0.5-0.6之间。
3）菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min。
4）4℃离心10min（4000r/min）
5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽
6）用冰浴的0.1mol/L氯化钙10ml悬浮细胞，立即冰浴30min
7）4℃离心10min（4000r/min）
8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置）
9）分装细胞，200ul一份，4℃保存。暂且不用的贮存于-70℃可保存半年。取其中一份进行转化。
质粒DNA的转化
1）取200ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀，冰浴30min
2）离心管放到42℃水浴锅中保温90s（90s一定要精确，不要摇动试管）
3）将试管迅速转移到冰浴，冷却1-2min
4）每管加800u l LB液体培养基，37℃培养1h
5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在含有适当抗生素的LB固体培养基上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀，室温正置30min
6）倒置平皿37℃，12~16h，出现菌落
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：
1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。
2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行。
5．抽提质粒（碱裂解法提取质粒DNA)
原理：本实验采用碱裂解法进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。
1）用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA。两种DNA在强碱环境都会变性。
2）当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值后，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA分子巨大，难以复性。
3）通过离心，大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质沉淀（SDS的作用下）除去，而质粒DNA留在上清中。
4）再用异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
试剂：
1. 溶液Ⅰ: 50mM(mmol/L)葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）1
2.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置（NaOH作用是使细胞裂解）。
3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH
4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O 至500ml。4℃保存备用。
4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
5.苯酚/氯仿 /异戊醇（25：24：1）
6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）
7. 5×TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
8．溴化乙锭（EB）：10mg/ml
9.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。
10. 6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。
11. 1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TBE），即可上样。
仪器：(1)塑料离心管架（30孔）；(2) 10、100、1000μL微量加样器；(3) 1.5mL塑料离心管（又称EPPendorf离心管）；(4)低温高速离心机（20 000 r／min）一台；(5)无菌工作台(6)高压锅，(7)常用玻璃仪器及滴管等。
质粒提取步骤：
1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于
2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。
2.取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心 8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。
3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0））中，剧烈振荡，使菌体分散混匀，（且不至于沉淀）。
4. 加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。
5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ（醋酸甲AcK），将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
6.加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g ×10min。没有用PDS沉淀干净的蛋白质置于下层
7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4℃离心12000g×15min。
8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。
9. 沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。
6．重组质粒克隆的鉴定
1）通过PCR方法鉴定：以重组质粒为模板，PCR产物的特异性引物或载体的通用引物进行PCR扩增后电泳鉴定。
2）酶切鉴定：双酶切鉴定时只要出现质粒条带和你的插入片段的目的条带就行了
7. 质粒DNA的含量及纯度鉴定
实验材料：质粒DNA
仪器：(1)稳压稳流电泳仪 (2) 可调微量移液器(3)水平电泳槽（4）紫外分光光度计
(5)紫外透射仪等
试剂：（1）电泳缓冲液：Tris-硼酸（1×TBE）pH8.0。（2）加样缓冲液（6×）：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖（3) 溴化乙锭（EB）溶液：10mg/ml
含量测定：紫外吸收法溴化乙锭荧光强度法
纯度鉴定：紫外吸收法和琼脂糖凝胶电泳
测定DNA浓度的方法有两种：
紫外光吸收法：核酸在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA 进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同。因此，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。
溴化乙锭荧光强度法：当DNA含量很低以及样品中杂质含量高时，会影响紫外光吸收值的测定，这时，可以采用测定嵌入DNA中溴化乙锭分子受紫外光激发而发射出的荧光强度，因为这种荧光的强度与DNA总质量数成正比。
测定质粒DNA纯度的方法
琼脂糖凝胶电泳
四、慢病毒包装流程
4.1实验材料
4.1.1、细胞株：293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM[8](含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
4.2.2、菌株：大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
4.2.3、病毒载体系统组成
a) pGC-LV重组载体（已制备好的）；b) pHelper 1.0；c) pHelper 2.0
DNA溶液的制备（见上面具体步骤）：质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA 的A260/A280在1.8～2.0之间。
4.2.4、试剂
台盼兰、胎牛血清FBS、DMSO、DMEM、胰酶、Lipofectamine 2000
4.2.5、仪器
荧光显微镜、CO2培养箱、生物安全柜、Plus-20离心超滤装置
4.2病毒包装细胞293T的培养
4.2.1、活细胞计数（台盼蓝染色）
用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/ml (一般稀释倍数为100倍)，在0.1ml 的细胞悬液中加入0.1 ml的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。
4.2.2、细胞株的冻存
1．取培养2～3天生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×106～2×107/ml。
2．在1 ml细胞冻存管中加入0.5 ml细胞悬液，0.4 ml小牛血清和0.1 ml二甲基亚砜[9](或甘油)，混匀后密封。置4℃1小时，-20℃2小时，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后浸入液氮中。
4.2.3、细胞复苏
1．从液氮罐中取出细胞冻存管，应带有防护眼睛和手套。
2．迅速放入盛有37℃水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。
3．用70%酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加3 ml含10% FBS（胎牛血清）的DMEM培养基，置温箱培养。
4．次日更换一次培养液后再继续培养。
4.2.4、细胞传代
1．弃去旧培养液，加入5 ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS溶液。
2．加入2 ml胰酶消化液，消化1- 2 min直到细胞完全消化下来。
3．加入含10%胎牛血清和100 U/ml双抗的DMEM培养基5 ml，用刻度吸管吹打数次，将瓶壁上的细胞冲洗下来。
4．混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。
4.3 慢病毒包装
细胞转染
1) 转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为1.2 x 107细胞/20 ml，重新接种于15 cm细胞培养皿，37 ℃、5% CO2培养箱内培养。24 h待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。
2) 转染前2 h将细胞培养基更换为无血清培养基。
3) 向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC-LV载体20 μg ，pHelper 1.0载体15μg，pHelper 2.0载体10 μg)，与相应体积的Opti-MEM[10]混合均匀，调整总体积为2.5 ml，在室温下温育5分钟。
4) 将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100μl Lipofectamine 2000试剂在另一管中与2.4 ml Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟。
5) 把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。
6) 混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。
7) 将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37 ℃, 5% CO2细胞培养箱中培养。
8) 培养8 h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20 ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。
9) 每瓶细胞中加入含10% 血清的细胞培养基25 ml，于37 ℃、5% CO2 培养箱内继续培养48小时。
4.4病毒的收获及浓缩
1．收集转染后48小时（转染即可为0小时计起）的293T细胞上清液。
2．于4 ℃，4000 g 离心10 min，除去细胞碎片。
3．以0.45 μm滤器过滤上清液于40 ml超速离心管中。
4．把病毒粗提液样品加入到过滤杯中（最多19 ml），盖上盖子。将过滤杯插到滤过液收集管中。
5．组合好后，做好平衡，放在转头上。
6．在4000 ×g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15分钟。
7．离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。
8．将过滤杯倒扣在样品收集杯上。
9．离心力不超过1000g,时间为2分钟。过高转速会导致样品损失。把离心杯从样品收集杯上移开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。
10．将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80 度长期保存。取其中一支进行病毒生物学滴度测定。
4.5 慢病毒滴度测定
1) 孔稀释法测定滴度
1．测定前一天，为测定滴度所需的细胞（英茂盛业公司用的293T细胞：贴壁生长）铺板，96孔板，每个孔加4×104个细胞，体积为100 μl。
2．根据病毒的预期滴度，准备7~10个无菌的Ep管。在每个管中加入90 μl的无血清培养基。
3．取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10 μl加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。
4．选取所需的细胞孔，吸去90 μl培养基，丢弃。加入90 μl稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养。
5．24小时后，加入完全培养基100 μl。小心操作，不要吹起细胞。
6．4天后，观察荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。
说明：
第一个Ep管中加入10ul病毒原液，记为1E+1μl；
第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释,所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0μl；第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1μl；依次类推…
第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5μl；第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6μl；
2) Real time定量PCR法测定滴度
样品制备
1. 检测前一天，对293T细胞传代，每个24孔中加1×105个细胞，体积为500 l；
2. 次日，准备7~10个无菌的Ep管，在每个管中加入90 μl的培养基（DMEM+10% FBS）；
3. 取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10 μl加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管；
4. 选取所需的细胞孔，吸去90 μl培养基。加入稀释好的病毒溶液。放入37℃5%CO2培养箱中培养；
5. 48小时后，加入新鲜培养基500μl。小心操作，不要吹起细胞；
6. 4天后，抽提RNA准备做RT-qPCR。
总RNA抽提
说明：根据Invitrogen公司的TRIZOL操作说明书进行，均为RNase-free操作。
1. 去细胞上清，每孔加入１ｍl TRIZOL吹打，室温静置5 min，后转移至另一新的1.5 ml移液管中。
2. 每管加入200 μl氯仿，用力震荡15s，室温静置15 min。
3. 4℃，12000 rpm，离心15min。
4. 从每管中吸取上清至另一新的1.5 ml 移液管。加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀后-20℃沉淀10 min。
5. 4℃，12000 rpm离心10 min后，去上清。
6. 加入至少1 ml 4℃预冷的75%乙醇，洗涤沉淀及离心管壁。
7. 4℃，10000 rpm离心5 min，弃上清。
8. 4℃，10000 rpm再次离心5 min，吸去残液，室温干燥（不需完全干燥）。
9. 加入20 μl RNase-free水[11]，至完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA的浓度。
五、慢病毒感染目的细胞
慢病毒感染目的细胞预实验注意事项
A．测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。
B．在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞。加入puromycin[12]可以筛选稳定表达shRNA 的细胞系。
puromycin最优浓度筛选:
每种细胞对puromycin的敏感性不同，因此，准备建立稳定细胞系之前，需要确定能够在3-5天杀死细胞的最优puromycin浓度。方法如下：
1. 在6孔板内种植细胞，约2x105/孔，共十孔，CO2孵箱过夜培养。
2. 第二天，观察细胞密度为80%-90%融合。稀释puromycin至培养基，按照从1 μg/ ml 到10 μg/ ml，每隔1μg/ ml递增的浓度，加至培养孔内。
3. 第三天观察细胞，每隔一天换一次培养基，最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。
慢病毒感染细胞和稳定细胞系筛选
第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为第二天细胞融合能达到70%-80%，CO2孵箱过夜培养。
第二天：准备3ml培养基，加入Polybrene[13]，终浓度为8 μg/ ml。将步骤五制备的病毒颗粒0.5 ml加至上述培养基，轻吹混匀。去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基（Polybrene能够增加病毒感染的效率，然而，有时候Polybrene对细胞有毒性。这时，可以用Protamine Sulfate代替Polybrene）
第三天：病毒感染后24小时，可以换用含最优浓度puromycin的培养基。
如果病毒对细胞有毒性，可以减少感染时间至4-6小时，然后换用新鲜培养基，24-48小时后换加含puromycin的培养基。最好设立一个对照皿，不加病毒液，加入Ploybrene，观察Polybrene是否对细胞有毒性；如果Polybrene没有毒性，还可以加入puromycin，作为puromycin是否有效的对照。
第四天以后：每隔一天换用新鲜含puromycin的培养基，以替换含大量死细胞的培养基。待抗性细胞长满以后，细胞转入10cm培养皿，同时，留一部分细胞在原来的60mm 平皿内，待细胞长满后，收获细胞，在蛋白或mRNA水平鉴定基因敲低效率。10cm培养皿内的细胞待长满后传代，首先每种稳定细胞系冻存4-5支细胞，待基因敲低鉴定清楚后，解冻冻存细胞，进行表型观察分析。通常情况下，由于慢病毒为复制缺陷型病毒，受感染的细胞不能产生新的病毒，因此从加入病毒颗粒开始，经过5-6次换液后，培养基内已不存在病毒颗粒，可以移至普通细胞培养室内培养研究。
转染后24-48h用RT-PCR检测细胞mRNA水平，用Western Bolt法检测蛋白质水平。RNAi首先变现在mRNA水平下降，其次是蛋白质水平下降。
六、感染后的细胞检测方法
6.1荧光初步检测
若有荧光，则表示病毒感染成功，但并不能确定目的基因是否整合到细胞中，待进一步检测，荧光有强弱之分，与病毒加入的量有关。
6.2 RNA的提取及RT-PCR检测
6.2.1原理
因为真核细胞DNA含有很多非编码区，真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪
切和拼接，去掉这些非编码区，才能形成真正的mRNA，，是否表达真核生物的基因并表达相应的蛋白，只能通过提取其mRNA并RT-PCR这条途径来测定
6.2.2RNA提取步骤
加1mlTrizol，吹打后移至1.5ml无菌的离心管中；加100ul氯仿剧烈振荡30s混匀，12000转15min，可看到明显分层；取上层透明液体至新的1.5ml离心管中，加等体积的异丙醇，混匀静置10min，12000转离心10min，弃上清，加1ml70%乙醇，12000转，离心10min，弃上清，风干剩余液体，最后加DEPC-水溶解RNA，电泳，粗步判定RNA纯度。
6.2.3RT-PCR步骤：
RT是一个逆转录的过程，用前一天提取好的总RNA，在加入引物，模版和酶，并在PCR 仪的温度设置下，RNA可逆转录为cDNA。
PCR是cDNA在模版，引物，酶的作用下进行复制成双链DNA。（具体步骤省略）
6.3蛋白提取及Western检测
western-Bloting：蛋白免疫印迹（Western blotting 或Immunoblotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。第一步是做SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC 膜)和PVDF 膜，蛋白转移的方法多用电泳转移（转移电泳），它又有半干法和湿法之分，现在大多用湿法。第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或X 光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中。
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤 令狐采学 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。 【2】.载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。 （3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。 （5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与
载体构建流程
载体构建SOP流程: GenBank查询目的基因序列→根据ORF序列利用引物设计软件设计引物→表达目的基因的组织或细胞总RNA提取→RT-PCR获取目的基因→酶切目的基因和载体→分别纯化酶切的目的基因和载体并建立连接反应→转化→初步筛选阳性克隆→阳性克隆测序→测序正确的质粒保种并重提质粒 I.获取目的基因/序列片段 一.获取序列信息 通过GENBANK数据和生物信息的方法设计目的基因或目的片段引物（shRNA、miRNA）。 PCR引物的设计原则： ①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ②产物不能形成二级结构。 ③引物长度一般在15~30碱基之间。 ④G+C含量在40%~60%之间。 ⑤碱基要随机分布。 ⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧引物5′端可以修饰。 ⑨引物3′端不可修饰。
⑩避免在引物的3’端使用碱基A。 在实际设计引物中由于ORF两末端序列本身的限制，不能完全按照上述理想的设计原则，但也切记引物不能过长或过短。过长的引物不容易打开其二级结构，与模板结合缓慢，也容易形成引物二聚体，通常不超过35bp(不包括酶切位点和保护碱基)。过短的引物特异性差，扩出其它不相关片段，最终很难得到目的片段，通常不短于18bp(不包括酶切位点和保护碱基)。要将目的基因定向克隆至相应载体，需要在上下游引物两端设计不同的酶切位点，由于酶切位点位于线性末端时酶对其识别切割能力大大降低，需依据NEB目录添加相应保护碱基，酶切时可相应增加时间。 二.制备模板 1.分离高质量RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。现在实验室通常使用Trizol试剂法提取总RNA，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可
载体构建的基本步骤
载体构建 一．原理 依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。 二．操作步骤 1．摇菌 取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。2．提质粒 依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。 3．酶切 按下表加入试剂。 反应所需试剂体积（单位：ul） 质粒10 所需内切酶反应缓冲液 2 所需限制性内切核酸酶 1 H2O 7 将加好的EP管置于37℃保温1-2h。（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度） 4．电泳检测 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。 5．连接 如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接，连接体系如下： 双蒸水5μL 10×T4 DNA连接缓冲液1μL 载体2μL 酶切后的目的基因1μL T4DNA连接酶1μL 总体积10μL 置于温箱，12-16℃，保温8-16h 6．转化 依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。 7．单克隆检测 （1）挑单克隆
先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取1.5 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。 （2）单克隆检测 以每管摇好的菌液为模板，以原有的引物进行PCR，然后将PCR产物跑电泳，观察电泳图像中那几管的条带正确，将正确条带相对应管的菌液再抽取100μL，加到3ml（有LB液体培养液，AMP+）试管中，过夜摇；第二天重摇，将摇好的菌取1ml于1.5mlEP管中送测序，并保种。 注：①挑单克隆时，一定要挑单一圆润的菌落，有卫星斑的不挑。 ②别忘记往培养基中加AMP。 ③用接种环挑菌后，要在酒精灯上反复灼烧，然后再进行下一次挑菌。 三．注意事项 1．连接产物可短时间在-20℃保存，使用时可以取出进行后续实验； 2．在细胞转化时，冰浴和热激要严格控制好时间； 3．连接反应是DNA重组过程中的关键步骤，其成败的重要参数之一就是温度，因此要控制好连接温度。 4．进行黏末端连接时，会产生一定数量的载体自身环化分子，导致转化菌中过高的假阳性克隆背景。针对这一问题，常采用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）去掉载体的5’-磷酸以抑制DNA 片段的自身环化。 参考： 1.刘进元，常智杰，赵广荣,等.分子生物学实验指导[M].北京:清华大学出版社，2002 2.周俊宜.分子生物学基本技能和策略[M].北京：科学出版社，2003：117-120 3.李海英，杨峰山，邵淑丽,等.现代分子生物学与基因工程[M].北京:化学工业出版社，2008:138-142 4.朱旭芬.基因工程实验指导[M].北京：高等教育出版社，2006:134-139
慢病毒载体包装构建过程
慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活
质粒构建流程
质粒构建流程 一、引物设计 1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI 2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。 3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如pcDNA3.1(+)， 4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。 5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。 6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。 7）引物设计完成，送公司合成。 二、目的片段获取 1. RNA提取 试剂盒：Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存） 准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套 操作步骤： 1）将1000μl裂解液RL加入细胞中，混合5min。 2）加200μl氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。 3）4℃，12000rpm离心10min。 4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550μl） 5）加入1倍体积（550μl）70%乙醇，混匀 6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃，10000rpm离心45s 7）弃废液，重套收集管，加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45s 8）弃废液，重套收集管，加700μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s 9）弃废液，重套收集管，加500μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s 10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min 11）吸附柱放入新EP管，加50μl RNase free water于膜上，室温放置2min 12）4℃，12000rpm离心60s 13）点样：5μl RNA+ 1μl 10×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，3min，可见3条亮带。14）-20℃保存 2.RNA反转录 试剂盒：TaKaRa primescript RT reagent kit with gDNA eraser（-20℃保存） 准备：冰盒，②④⑤⑥取出解冻，①③为酶不可取出，预冷离心管 操作步骤： 1）基因组DNA去除（10μl体系） ② 5×gDNA eraser buffer 2μl ① gDNA eraser 1μl
载体构建的基本步骤
载体构建的基本步骤 Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT
载体构建 一、原理 依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。 二、操作步骤 1、摇菌（制作感受态细胞备用） 取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。 2、提质粒（也就是载体） 依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。 3、酶切（双酶切产生粘性末端） 反应所需试剂体积（单位：ul） 质粒 10 所需内切酶反应缓冲液 2 所需限制性内切核酸酶 1 H2O 7 将加好的EP管置于37℃保温1-2h。（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度） 4、电泳检测 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。 回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能； 检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。
切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。 5、载体与目的基因连接 如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。置于温箱，12-16℃，保温8-16h 6、转化（连接产物转化到感受态细胞中） 依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃， 12-16h。 7、单克隆检测 （1）挑单克隆 先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的 AMP，用枪头混匀；取 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。 （2）单克隆检测 以每管摇好的菌液为模板，以原有的引物进行PCR，然后将PCR产物跑电泳，观察电泳图像中那几管的条带正确，将正确条带相对应管的菌液再抽取100μ
载体构建
载体构建
载体构建分为以下步骤： 1.载体的选择和引物设计以扩增目标基因 2.目标片段的PCR扩增 3.载体和目标片段的限制性酶切 4.连接转化 5.挑取克隆提质粒 6.单克隆的验证及送样测序。 载体的选择 实验室常用的载体有pUC19（扩繁目标片段），pet28a（原核表达载体Kna+），pGEX-4T-1(原核表达载体Amp+)，pCI-NEO(真核表达载体Amp+)，pCDNA3.1(真核表达载体Amp+)，pLKO.1(shRNA构建Amp+)。根据所要构建的质粒目的的差异以及载体和目标片段的酶切位点分析结果来选择载体。举例如下： 实验目的是将MYC基因插入到载体中，转染进细胞中表达。应选用真核表达载体pCI-NEO 或pCDNA3.1。 引物设计 引物设计的目的是将目标片段扩增出来以便与载体连接，所以在引物的两端应人为加上酶切位点，酶切位点前加上保护碱基。在选择酶切位点是应注意，选择的应该是目的基因片段中没有而载体上有的限制性内切酶，防止目标片段被切不完整，也便于和载体连接。 载体构建之后我们的目的是要表达，所以应该加入标签以便western blot检测蛋白是否表达。常用的标签有Flag标签、6XHis标签、HA标签和Myc标签。 Flag标签： D Y K D D D D K GAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG 6XHis标签： H H H H H H CAC CAC CAC CAC CAC CAC HA标签： Y P Y D V P D Y A TAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCT Myc标签： E Q K L I S E E D L 这些标签被表达成氨基酸后，特定的氨基酸序列会与相应抗体结合，在western blot时可被检测。因此，在设计引物时，这些核酸序列应位于起始密码子ATG之后。
CRISPRCas9基因敲入试验步骤(三)donor载体构建载体构建
CRISPRCas9基因敲入试验步骤（三）donor载体构建载体构 建 1、质粒骨架的选择 CRISPR/Cas9质粒按编辑细胞类型可分为八种，Mammalian 、Bacteria 、Drosophila 、Plant、C. elegans 、Yeast 、Zebrafish 、Xenopus，根据质粒所携带的编辑基因的不同，可分为野生型的cas9、突变型的cas9、cpf1、C2c2（可剪切RNA）。当然，还有一些筛选标记，如puro、GFP、RFP、mcherry、潮霉素等等，我们可以根据自己的需求选择自己合适的质粒。这里故意还掉了一种，最具有争议的Ngago，本楼主也重复过这个试验，也和大多数重复的人一样，GFP验证试验时，看到荧光显著减弱（本人还特意构建了一种Ngago载体，效果比韩老师的效果好很多），但是当时没有验证这个减弱是切割还是敲低，非常遗憾自己想法太简单，以先入为主认为是切割而没有去验证；最终结果是刘东老师使用Ngago发现了有表型（斑马鱼的眼睛上有缺陷），这个就是很强的提示，需要去做下一步，尽管基因组上没有被切割，有表型，那势必会去看该基因表达的数据，最后才有这篇文章。刘东老师运气也很好，knock down 有表型，如果没表型，估计也会放弃。这里就说到这，有不懂的可以留言询问。。具体分类在addgene上有，网址/。
2、酶切位点的选择 插入sgRNA的酶切位点，质粒基本为这两种，BsmbI和Bbsi，具体可以参见该质粒的protocol，后续的连接、转化、验证protocol里面有，我就不啰嗦了。哦还忘了一件事，使用snapgene这个软件可以很好地看质粒图谱，非常方便，强烈推荐！！以慢病毒载体V2为例具体说明3、同源臂的设计 同源臂我们一般都是在切割位点的两端各选一段，长度大约1kb-2kb，效率还可以。当然了，有人也用40-100bp做了也做成功了，但基本原则是越长效率越高。1kb-2kb效率已经很高，所以这个最合适。有相关文献支持，自己Pubmed查看。 4、启动子、目的基因及其终止子的扩增 这里也没什么可说的，启动子在我们选择质粒的时候就决定了，当然我们还可以改造以提高sgRNA的表达效率，这个时候我们可以通过方法筛选出该物种的启动子，替换上去就ok了。 目的基因的话，如果我们要做敲除，基本就是根据基因组，在外显子区域设计sgRNA序列，切割后以非同源性末端接合（Non-homologous end joining, NHEJ），造成变异而使该基因失去功能。当然还有一种修复方式，同源性重组（Homologous recombination，HR）同源性重组修复是利用细胞内的染色体两两对应的特性，若其中一条染色体上的
质粒载体的构建分析
质粒载体的构建 摘要：质粒载体的构建。首先要获得目的DNA。根据其目的基因序列和启动子序列设计引物，为提高目的基因产率，采用两次PCR的方法，即第一次设计引物扩增全序列基因，第二次设计带酶切位点的引物以第一次扩增产物为模板进行扩增，进而加尾连接到T-DNA上，再利用电转化的方法将连接产物转化到带有PCAMBIA1381的DH5α感受态细胞中复制表达。 关键词：质粒DNA PCR 电泳感受态转化 1.引言 质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下： ①是染色质外的双链共价闭合环形DNA（cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质 粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。 ②能自主复制，是能独立复制的复制子。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而 传给后代。 ③质粒对宿主生存并不是必需的。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的 特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。 所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。现在分子生物学使用的质粒载体
都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体。 质粒载体pBR322是研究得最多，是使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。 质粒载体pBR322的大小为4361bp,相对分子质量较小的是它第一个优点。优点之二是它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因，可供转化子的选择标记是它的第三个优点。 质粒载体pBR322的第四个优点是具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。 构建质粒载体所用的方法基本上是分子克隆技术，是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。 2. 材料方法 2.1目的DNA的获得 2.1.1 引物设计 第一次引物设计： 正向引物：sinn3F 冰盒标注：P2a 引物序列：5’—AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA—3’ 引物长度：25bp 反向引物：sinn3R 冰盒标注：P2b
RNA干扰载体的构建的实验流程
RNA干扰载体的构建的实验流程 RNA干扰载体主要用来研究基因表达调控，RNA干扰技术已已被广泛用于基因结构功能研究和传染性疾病及基因治疗领域，进行RNA干扰实验首先是构建RNA干扰载体，本文以pRI 系列载体为例论述了干扰载体的构建的实验流程。 产品技术背景 pRI系列载体是基于III类rna聚合酶启动子：人类H1启动子的专用于哺乳动物细胞RNA干扰的载体。H1启动子在哺乳动物细胞内合成类似siRNA分子的小分子RNA。由于H1启动子有精确的转录起始位点和终止信号，H1启动子转录产物精确生成人工设计的shRNA，shRNA 经过RISC剪切后形成有2个U突出末端的成熟siRNA。由于H1启动子对转录产物长度的严格限制，基本上杜绝了非特异性干扰片段的产生，将载体转染细胞后对其它基因的影响降到最低。 pRI系列载体已经成功用于多种哺乳动物细胞进行基因的RNA干扰。本系列中含有新霉素抗性基因的载体用于稳定表达siRNA，可以在更长时间内对基因表达抑制后的细胞功能和生理现象进行观察和分析。 插入寡核苷酸设计 pRI系列载体的使用需要将人工设计的寡核苷酸片段插入pRI系列载体中特定的酶切位点之间，寡核苷酸片段中包含了针对目标基因的mRNA设计的长度为19nt的干扰片段。 合成时需要化学合成正向和反向两条寡核苷酸。正、反向寡核苷酸退火后与载体连接，插入载体XhoI，BglII位点之间，位于载体上H1启动子下游正确的位置上。连接后的载体转入哺乳动物细胞在H1启动子作用下转录产生shRNA。 1. 选择干扰序列 在RNA干扰实验中，RNA干扰序列的选择会显著影响RNA干扰效果。我们建议您按照以下几点指导原则选择RNA干扰序列： 推荐长度为19 nt，采用21 nt序列也可以取得良好效果。 RNA干扰序列中不包含大于3 nt的连续相同碱基。 RNA干扰序列的GC含量为低到中等水平(推荐GC含量在35%到50%之间)。 不要将RNA干扰序列设计在已知的RNA-蛋白质结合位置附近。 确保RNA干扰序列与其它基因没有较高的同源性。 方向：在编码mRNA的正义链上选择RNA干扰序列。 设计RNA干扰序列是RNAi实验的关键。这里提供的设计原则可以为您设计RNA干扰序列提供帮助。但是，值得注意的是，遵循这些原则不能确保设计的RNA干扰序列对目标基因有好的抑制效果。针对一个目标基因，我们建议您至少设计3条干扰序列并且从中筛选出干扰效果好的序列。 2. 寡核苷酸设计。 （1）设计正义寡核苷酸链(5’-3’方向)。 a) 5’TCGACCC b) 19nt干扰序列正向序列(与目标mRNA一致)。 c) TTCAAGAGA(环状结构)。
载体构建的基本步骤
1、摇菌（制作感受态细胞备用） 上述菌液PCR 有结果的菌液送测，送测结果与 预期相符则该载体构建成功。阳性单克隆筛选 上述转化得到的菌液接种到筛 选培养基中过夜培养挑菌并菌液PCR 转化 感受态细胞制备转化步骤 载体与目的基因连接 质粒与目的基因双酶切 选择内切酶摸索酶切条件（时 间和温度）电泳检测及回收纯化步骤 质粒（载体）提取 质粒选择提取步骤 目的基因克隆 引物设计PCR
取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。 2、提质粒（也就是载体） 依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。3、酶切（双酶切产生粘性末端） 反应所需试剂体积（单位：ul） 质粒10 所需内切酶反应缓冲液 2 所需限制性内切核酸酶 1 H2O 7 将加好的EP管置于37℃保温1-2h。（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度） 4、电泳检测 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。 回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。 切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。 5、载体与目的基因连接 如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。置于温箱，12-16℃，保温8-16h 6、转化（连接产物转化到感受态细胞中） 依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。 7、单克隆检测 （1）挑单克隆
载体构建
载体构建分为以下步骤： 1.载体的选择和引物设计以扩增目标基因 2.目标片段的PCR扩增 3.载体和目标片段的限制性酶切 4.连接转化 5.挑取克隆提质粒 6.单克隆的验证及送样测序。 载体的选择 实验室常用的载体有pUC19（扩繁目标片段），pet28a（原核表达载体Kna+），pGEX-4T-1(原核表达载体Amp+)，pCI-NEO(真核表达载体Amp+)，pCDNA3.1(真核表达载体Amp+)，pLKO.1(shRNA构建Amp+)。根据所要构建的质粒目的的差异以及载体和目标片段的酶切位点分析结果来选择载体。举例如下： 实验目的是将MYC基因插入到载体中，转染进细胞中表达。应选用真核表达载体pCI-NEO 或pCDNA3.1。 引物设计 引物设计的目的是将目标片段扩增出来以便与载体连接，所以在引物的两端应人为加上酶切位点，酶切位点前加上保护碱基。在选择酶切位点是应注意，选择的应该是目的基因片段中没有而载体上有的限制性内切酶，防止目标片段被切不完整，也便于和载体连接。 载体构建之后我们的目的是要表达，所以应该加入标签以便western blot检测蛋白是否表达。常用的标签有Flag标签、6XHis标签、HA标签和Myc标签。 Flag标签： D Y K D D D D K GAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG 6XHis标签： H H H H H H CAC CAC CAC CAC CAC CAC HA标签： Y P Y D V P D Y A TAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCT Myc标签： E Q K L I S E E D L 这些标签被表达成氨基酸后，特定的氨基酸序列会与相应抗体结合，在western blot时可被检测。因此，在设计引物时，这些核酸序列应位于起始密码子ATG之后。
慢病毒载体构建步骤研究
一、简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。 在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体（筛选）。 二、实验流程（大致的简单过程） 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的
micRNA载体构建流程
micRNA载体构建流程： 1．micRNA 片段PCR (1) PCR体系： 5x PrimeSTAR buffer 10.0 μL 2.5 mM dNTPs mixture 4.0 μL Primer1 (10 uM) 1.0 μL Primer2 (10 uM) 1.0 μL PrimeSTAR HS 0.3μL 模板DNA 2μL ddH2O 31.7μL 程序： 98℃ 1min； 98℃ 10s，55℃ 10min，72℃ 1.0min，30 cycles； 72℃ 10min 1.0%琼脂糖胶检测PCR结果：上样5ul 注意：PCR用50μL体系重复两管，回收时，并成一管纯化。回收完后检测纯化产物OD值，纯化产物含量最好高于50ng/ul，若产物浓度低，则再多做几份PCR再回收。 (2)纯化产物补A 上述纯化后，浓度达到要求的产物可进行补A，用于后续连接。 补A体系： 纯化产物：16.8ul 10x PCR buffer：2ul dATP(10mM)：1ul （终浓度2 mM） rTaq：0.2 ul 反应条件：72℃15-30min 补A产物放于-20℃备用。 2. CD3-1250载体酶切 做第一步PCR的同时，可先做载体酶切，做好准备。
酶切体系： ddH2O：34ul 10X NEB Buffer2: 5ul Xcm1: 1-1.5ul CD3-1250质粒：10-20 ul 酶切重复6管，胶回收时可将2-3管合并为一管回收。 反应条件：37℃ 3-5小时或过夜。 1.0%琼脂糖胶检测酶切是否完全，若酶切完全，可进行后续回收。上样5ul，检测时140-150V电压，跑胶15-20min即可，勿跑太长时间。 回收：制备一块1.0%琼脂糖新胶（大孔），将酶切产物全部上样，140V-150V跑胶20min 左右。切胶回收大片段载体。 载体片段较大，需用天根胶回收纯化试剂盒回收。 回收完后检测纯化产物OD值，载体纯化产物含量最好高于50ng/ul，若产物浓度低，则再多做几份酶切再切胶回收。 3. 连接反应： 体系：PCR补A产物（约50ng/ul）： 1.5ul CD3-1250载体回收产物(约50ng/ul)： 1.5ul Soltion I(TAKARA)：3ul 条件：16℃ 3-5小时，或过夜连接。 4. 转化DH5α感受态细胞 将上述连接产物全部用于转化，涂布Kan平板，Kan终浓度50ug/ml。倒置培养过夜。 5. 重组子鉴定 （1）菌落PCR鉴定或菌液PCR鉴定阳性克隆。PCR鉴定时别忘了加上阳性对照（col做模板）、阴性对照（不加模板）。鉴定一般用自制TAQ进行。 （2）挑选3-5个阳性克隆摇菌后提取质粒进行酶切鉴定。提质粒时用天根或生工提质粒试剂盒，集菌两次。质粒用BamH1进行酶切鉴定。 BamH1酶切鉴定体系： ddH2O：7ul 10X BamH1 Buffer: 2ul BamH1: 0.5ul 重组质粒：10.5 ul 条件：37℃ 2小时。 1.0%琼脂糖胶检测酶切结果，全部上样或上样10ul检测，检测时140-150V电压，跑胶
载体构建的基本步骤
创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 载体构建
一、原理 依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。 二、操作步骤 1、摇菌（制作感受态细胞备用） 取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。 2、提质粒（也就是载体） 依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。 3、酶切（双酶切产生粘性末端） 反应所需试剂体积（单位：ul） 质粒10 所需内切酶反应缓冲液 2 所需限制性内切核酸酶 1 H2O 7 将加好的EP管置于37℃保温1-2h。（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度） 4、电泳检测 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。 回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能； 检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。 切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。
5、载体与目的基因连接 如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。置于温箱，12-16℃，保温8-16h 6、转化（连接产物转化到感受态细胞中） 依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。 7、单克隆检测 （1）挑单克隆 先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL 的 AMP，用枪头混匀；取1.5 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。 （2）单克隆检测 以每管摇好的菌液为模板，以原有的引物进行PCR，然后将PCR产物跑电泳，观察电泳图像中那几管的条带正确，将正确条带相对应管的菌液再抽取100μL，加到3ml（有LB液体培养液，AMP+）试管中，过夜摇；第二天重摇，将摇好的菌取1ml于1.5mlEP 管中送测序，并保种。 注：①挑单克隆时，一定要挑单一圆润的菌落，有卫星斑的不挑。 ②别忘记往培养基中加AMP。 ③用接种环挑菌后，要在酒精灯上反复灼烧，然后再进行下一次挑菌。 三、注意事项 1．连接产物可短时间在-20℃保存，使用时可以取出进行后续实验； 2．在细胞转化时，冰浴和热激要严格控制好时间； 3．连接反应是DNA重组过程中的关键步骤，其成败的重要参数之一就是温度，因此要控 制好连接温度。
载体构建操作流程
载体构建操作流程 一、载体准备 1、质粒准备 电泳检测载体质量 好的质粒为三条带，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）；也有观点认为是质粒两条链没有断裂的超螺旋结构，开环DNA和线性DNA。超螺旋结构应至少占到90%。 测定质粒浓度 用核酸定量仪测定质粒的浓度，A230、A260和A280值。 2、质粒双酶切 根据需要的酶切位点，选择对应的酶，查找适合的Buffer，进行单酶切。 以TaKaRa的限制酶为例，双酶切的体系如下： 试剂体积 质粒<1 μg Enzyme I 1μL Enzyme II 1μL 10×X Buffer 2μL 灭菌水to 20μL 总体积20μL 将上述体系置于37℃（不同酶可能存在差异）水浴锅中酶切。 根据酶切效率不同确定酶切时间，可以去除2 μl进行电泳检测。 3、回收质粒 凝胶回收 参照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒说明书。 1)称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1μl进行计向胶 块中加入胶块融化液Buffer GM，我们一般用1%的琼脂糖凝胶电泳，所以一般加入3个凝胶体积量。 2)均匀混合后室温15-25℃融化胶块。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化 （约5～10分钟）。 3)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。将上述操作的溶液转 移至Spin Column 中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。 4)将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000 rpm离心30秒钟， 弃滤液。 5)重复操作步骤。 6)将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm离心1分钟。 7)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处 加入30μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。 8)将灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。 9)室温12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。