基因工程的载体和工具酶

第二章基因工程的载体和工具酶

【教学时数】9小时

【教学目录与学时分配】

2.1 载体（6）

2.1.1 质粒载体

2.1.2 噬菌体载体

2.1.3 其他载体

2.1.4 穿梭载体与表达载体

2.2 工具酶（3）

2.2.1 限制性内切核酸酶

2.2.2 DNA聚合酶和Klenow大片段

2.2.3 DNA连接酶

2.2.4 碱性磷酸酶

2.2.5末端脱氧核苷酸转移酶

【教学目的】

让学生掌握什么是基因工程的载体，有哪些典型的基因工程载体，哪些常用的基因工程工具酶，什么情况下使用工具酶等基本常识。

【教学重点】

常用基因工程载体的结构、工具酶的用途。

【教学难点】

基因工程载体的结构和使用

【教学方式】

多媒体讲解结合启发讨论式教学

第一节载体

一、质粒载体（3）

【教学重点】

质粒载体的构建与标记基因；克隆质粒载体的克隆过程

【教学难点】

质粒的结构

【教学过程与内容】

载体是指运载外源DNA有效的进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。

作为载体必须满足的条件：①有多种限制性内切酶的切点，但每一种酶最好只有一个切点；②外源DNA插入以后载体在受体细胞中自我复制；③有便于选择的标记基因；④具有促进外源DNA表达的调控区。

2.1.1 质粒载体

质粒是在许多种细菌中发现的染色体外的遗传因子。它是闭合环状双链DNA分子，大小1kb到200kb不等。能自主复制，但要利用寄主细胞复制染色体的同一组酶系。有某些基因，如抗药性基因，对寄主的生长是有利的。

质粒的复制分松弛型和严谨型两种。松弛型质粒是指质粒的复制跟细菌染色体的复制不同步，一般在一个菌体内能复制10-200 拷贝；严谨型质粒是指质粒复制跟细菌染色体同步，一般含有1-10 拷贝。

一、质粒的基本特性

1．质粒的复制

通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制

的方式，如滚环复制和θ复制。在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。

2．质粒的拷贝数

质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。

3．质粒的不相容性

两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现象。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。

4．转移性

质粒具转移性。它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。它需要移动基因mob，转移基因tra ，顺式因子bom 及其内部的转移缺口位点nic。

二、标记基因

（一）选择标记

抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记。

1．氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, amp r）

氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因。青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化β-内酰胺环水解，从而解除了氨苄青霉素的毒性。

2．四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tet r）

四环素可与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环素抗性基因编码一个由 399 个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 pBR322 质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外，还带有四环素抗性基因。

3．氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cm r, cat）

氯霉素可与核糖体 50S 亚基结合并抑制蛋白质合成。cat 基因编码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基 23kDa）。在乙酰辅酶 A 存在的条件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。

4．卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kan r, neo r）卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶（APH（3'）-Ⅱ, 25kDa）的基因，氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。

（二）筛选标记

筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。

1．α-互补（α-complementation）

α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。大肠杆菌的乳糖lac 操纵子中的lacZ 基因编码β-半乳糖苷酶，如果lacZ 基因发生突变，则不能合成有活性的β-半乳糖苷酶。例如，lacZ△M15 基因是缺失了编码β-半乳糖苷酶中第 11-41 个氨基酸的lacZ 基因，无酶学活性。对于只编码 N-端 140 个氨基酸的lacZ 基因（称为lacZ'），其产物也没有酶学活性。但这两个无酶学活性的产物混合在

一起时，可恢复β-半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。

在lacZ' 编码区上游插入一小段 DNA 片段（如 51 个碱基对的多克隆位点），不影响β-半乳糖苷酶的功能内互补。但是，若在该 DNA 小片段中再插入一个片段，将几乎不可避免地导致产生无α-互补能力的β-半乳糖苷酶片段。利用这一互补性质，可用于筛选在载体上插入了外源片段的重组质粒。在相应的载体系统中，lacZ△M15 放在 F 质粒上, 随宿主传代；lacZ' 放在载体上, 作为筛选标记。

2．插入失活

通过插入失活进行筛选的质粒主要有 pBR322 ，该质粒具有四环素抗性基因（tet r）和氨苄青霉素抗性基因（amp r）两种抗性标记。当外源 DNA 片段插入tet r 基因后，导致tet r 基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。

三、质粒DNA的制备与注意事项：

细菌的培养：从琼脂平板上挑取单菌落接入5ml含适合抗生素的LB培养基中，于37℃摇床中振荡培养过夜。

保种：取80%灭菌甘油300ul加入1ml菌种中冷冻保存。

质粒提取：

（1）1.5ml过夜培养物倒入EP管，5000rpm/10min，弃上清。

（2）加入150ul冰预冷的solutionⅠ，vortex，使菌分散重悬。

（3）加入300ul solutionⅡ，来回颠倒4-6次，冰上≤5min。

（4）加入225ul solutionⅢ，来回颠倒4-6次，冰上≥5min。

（5）6000rpm/15min（或12000rpm/5min）。

（6）吸上清移入新EP管，等体积酚/氯仿抽提一次，vortex，12000rpm/15min。

（7）吸上清移入新EP管，等体积氯仿抽提，vortex，12000rpm/5min。

（8）重复步骤7）1-2次。

（9）吸上清移入新EP管，0.7倍体积异丙醇沉淀，vortex，12000rpm/15min。

（10）弃上清，1ml70%酒精洗涤1-2次，12000rpm/5min。

（11）弃上清，空气中干燥。

（12）加入10-20ul灭菌ddH2O溶解。

（13) 加入适量RNaseA，37℃温育。如果要用限制酶酶切DNA，缓冲液和限制酶可与RNaseA 同时加入，同时进行反应。

提质粒DNA时,溶液I,II,III的作用:

?溶液I: 溶菌液,含溶菌酶,使细菌壁溶解,裂解细菌;

?溶液II: NaOH-SDS液,强碱使质粒DNA和染色体DNA变性, 而SDS使蛋白质解聚沉

淀.

?溶液III, 酸性高盐溶液,使质粒DNA复性,但高盐使染色体DNA变性沉淀,从而使染

色体DNA和质粒DNA分离.

质粒DNA的纯化

?RNA酶去RNA

?SDS-蛋白复合物

?蛋白酶K去蛋白质

?酚-氯仿抽提

?纯化试剂盒

?紫外分光光度计测A260与A280值：1·8 或2·0

SDS的作用

?十二烷基硫酸钠，离子型表面活性剂

?溶解细胞膜上的脂质与蛋白

?解聚核蛋白

?与蛋白质结合成复合物

?有毒，是一种刺激物，避免吸入粉末

酚与氯仿的使用

?酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质

分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性，离心后沉淀在下层，而DNA 水溶液在上层。

?虽然酚比氯仿变性效果好些，但酚与水相有一定程度的混溶，而氯仿与水不混溶，

所以混合使用酚与氯仿比较好。

?酚要用Tris-HCl缓冲液饱和，并调PH到8，使DNA更稳定，获得RNA含量较少的

DNA样品。

质粒DNA沉淀

?二倍体积的无水乙醇与DNA相混合。使乙醇的终含量占67%左右。室温静置30分钟。

?乙醇沉淀时，加NaAc or NaCl至终浓度为0·1-0·25M，是为了中和DNA分子在碱

性条件下所带的负电荷，减少DNA分子同性电荷的相斥力。

?0·6倍体积的异丙醇沉淀，-20°C半小时。

DNA分离

?琼脂糖凝胶电泳

?聚丙烯酰胺凝胶电泳

?氯化铯密度梯度离心

DNA浓度检测

?琼脂糖凝胶电泳 0.05-0.1μg

?EB-标准DNA浓度比较: 1 ng

?紫外分光光度计测A260: 0.1-1 ideal, 0.05-1.5 accepted

?纯度:分光光度计不但能确定核酸的浓度，还可以通过A260/A280估计核酸纯度。纯

DNA其比值为1.8，纯RNA为2.0。如比值高于1.8，说明DNA样品中含RNA，而样品中的酚和蛋白质将会导致比值降低。

在紫外透射仪下看DNA时，DNA亮度与哪些因素有关？

?DNA浓度

?DNA大小

?波长

?纯度

?EB量等有关

四、质粒载体的种类

（一）克隆载体

克隆载体主要用于扩增或保存 DNA 片段，是最简单的载体。

1．pBR322

pBR322 质粒的大小为 4361bp ， GenBank 注册号为 V0lll9 和 J01749 ，含有 30 多个单一位点，具有四环素抗性基因（tet r）和氨苄青霉素抗性基因（amp r），其质粒复制区来自 pMB1。目前使用广泛的多质粒载体几乎都是由此发展而来的。利用四环素抗性基因内部的Bam HⅠ位点来插入外源 DNA 片段，可通过插入失活进行筛选。

pBR322 质粒克隆外源基因的过程，见幻灯片课件中的图。

2．pUC18 和 pUC19

pUC18 和 pUC19 大小只有 2686bp ，是最常用的质粒载体，其结构组成紧凑，几乎不含多余的 DNA 片段，GenBank注册号为 L08752（pUC18）和 X02514（pUC19）。由 pBR322 改造而来，其中lacZ （MSC）来自 M13mp18/19。

这两个质粒的结构几乎是完全一样的，只是多克隆位点的排列方向相反。这些质粒缺乏控制拷贝数的rop 基因，因此其拷贝数达 500-700 。 pUC 系列载体含有一段lacZ 蛋白氨基末端的部分编码序列，在特定的受体细胞中可表现α-互补作用。因此在多克隆位点

中插入了外源片段后，可通过α-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。

（二）穿梭载体

穿梭载体是指具有多个复制子能在两个以上的不同宿主细胞复制和繁殖的载体。

(三)表达载体

表达载体是指能将目的基因在人工控制下置于生物宿主中大量生产的载体.

表达载体的三个系统:

1.DNA复制及质粒DNA的筛选: 有DNA复制起点ori, 及Amp, Tet抗性基因

2.目的基因的转录:这一系统包括启动子,抑制物基因和转录终止子.启动子位于目的

基因的上游,常用的如Placz等.

3.蛋白质的翻译:包括核糖体识别位点SD,翻译起始密码子和终止密码子.

表达载体又分为完整蛋白表达载体和融合蛋白表达载体两类。

该类载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的，主要增添了强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。

【思考题】

1.质粒的克隆过程如何？

2.质粒克隆片段大小是多少？

3.质粒的克隆表现形式是什么？

第一节载体

二、噬菌体载体与其他类型载体（3）

【教学重点】

噬菌体载体的改建；柯斯载体与人工染色体的结构组成特点

【教学难点】

噬菌体与其他载体的克隆过程

【教学过程与内容】

（一）λ噬菌体

λ噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。λ噬菌体基因组为长度约为 50kb 的双链 DNA 分子，实际大小为 48502bp （GenBank 注册号为：J02459 或 M17233）。在噬菌体颗粒内，基因组 DNA 呈线性，其两端的 5' 末端带有 12 个碱基的互补单链粘性末端，叫COS位点。 12 个碱基的序列为5'-GGGCGGCGACCT-3'。当λ噬菌体 DNA 进入宿主细胞后，COS位点两端互补单链通过碱基配对形成环状 DNA 分子，而后在宿主细胞的 DNA 连接酶和旋促酶（gyrase）作用下，形成封闭的环状 DNA 分子，充当转录的模板。同时COS位点也是噬菌体包装蛋白的识别位点，包装范围在35kb－51kb。

λ噬菌体的基因组可分为3个区域：右侧的DNA复制与调控及裂解相关区域，左侧是头部蛋白和尾部蛋白基因区域，中间为非必需区，可被外源基因取代。野生型λ噬菌体基因组 DNA 为 48kb ，若用外源 DNA 片段完全替换可取代区，外源 DNA 片段的大小将在9-23kb 范围内。

λ噬菌体的选择标记：lacZ 基因

lacZ 基因也可用于λ噬菌体载体，通过插入或替换载体中的β-半乳糖苷酶基因片段，在 IPTG/X-gal 平板上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬菌体。

λ噬菌体载体的类型：

噬菌体λ载体有两种类型：插入型和置换型。插入型λ噬菌体是由于改建后的噬菌体λ较野生型短，所以可插入外源DNA。而且缺失的片段越长，插入的片段越大。置换型λ噬菌体基因组分三个区域：左侧区域包括外壳蛋白基因，约20kb；中间区域18kb，为不重要的

替换区，可被外源基因替换；右侧区域含有复制及裂解基因，约12kb。

λDNA与外源DNA之和必须在39-53kb之间，所以可插入7-21kb的外源DNA片段。

（二）单链M13噬菌体：

M13丝状噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，其基因组为单链环状DNA分子，全长6.5 kb。M13 感染宿主菌以后，单链DNA转变成双链复制形式的DNA，当复制200-300拷贝以后，又只合成单链DNA，最后包装成单链噬菌体粒子。

M13 噬菌体的基因组为单链 DNA ，由 6407 的碱基组成（GenBank 注册号为V00604）。基因组 90% 以上的序列可编码蛋白质，共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因Ⅷ和基因Ⅲ以及基因Ⅱ和基因Ⅳ之间，其间有调节基因表达和 DNA 合成的元件。

M13单链噬菌体主要用于需要单链DNA做模板时，如DNA测序。M13噬菌体基因组中主要含有与复制有关的遗传信息，只有一段由507个核苷酸组成的序列可被替换，因此M13噬菌体载体只能插入约300-400bp的外源片段。

(三)柯斯质粒载体：

1978年由Collins和 Hohn改建的一种新型的大肠杆菌克隆载体，用正常的质粒与噬菌体λ的cos位点构成。一般长为4-6kb。含有Amp r和Tet r 抗性基因。其上的cos位点可识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度上相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA 片段的长度可大于40 kb，从而大大增加了载体的携带能力。

粘粒的结构特征和用途

粘粒（cosmid）实际是质粒的衍生物，是带有 cos 序列的质粒。粘粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（amp r），cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。它的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段 DNA ，克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。

粘粒载体的工作原理

粘粒克隆的主要原理类似λ噬菌体载体。在外源片段与载体连接时，粘粒载体相当于λ噬菌体载体的左右臂， cos 位点通过粘端退火后，再与外源片段相间连接成多联体。当多联体与λ噬菌体包装蛋白混合时，λ噬菌体 A 基因蛋白的末端酶功能将切割两个cos 位点，并将两个同方向cos 位点之间的片段包装到λ噬菌体颗粒中去。这些噬菌体颗粒感染大肠杆菌时，线状的重组 DNA 就象λ噬菌体 DNA 一样被注入细胞并通过cos 位点环化，这样形成的环化分子含有完整的粘粒载体，可象质粒一样复制并使其宿主获得抗药性。因而，带有重组粘粒的细菌可用含适当抗生素的培养基挑选。通过这种方式，就将外源 DNA 片段通过粘粒载体克隆到大肠杆菌中了。

与λ噬菌体载体不同的是，外源片段克隆在粘粒载体中是以大肠杆菌菌落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。这样所得到的菌落的总和就构成了基因文库。

（四）其他载体----人工微小染色体：

随着基因工程应用的深入，越来越需要克隆大片段的外源DNA，而且也需要逐步把外源基因转入真核生物体内，而前面提及的载体显然不能满足需要，于是构建人工微小染色体的设想提了出来。构建人工染色体必须包括染色体的4个基本要素，即基因，复制起点，着丝粒和端粒结构。

首先构建的是酵母人工微小染色体（YAC）。它含有酵母的标记基因leu2，酵母染色体的着丝粒序列CEN3和自主复制序列ARS1，以及四膜虫的两个端粒序列Tr末端。YAC由质粒pBR322改建而来，本身为环状；但去转化酵母细胞后，在细胞内断开成为线状的重组DNA 分子，可以象天然染色体一样地复制和分离。天然的酵母染色体长度为150-1000kb，而YAC 长为7-15kb，可以携带长度为1-2Mb的外源DNA片段。

但是YAC的装载能力过大也有不利的一面，例如，必须进行亚克隆以及形成“嵌合体”等。因此现在在人类基因组计划中所使用的新型载体有 BAC（细菌人工染色体）, PAC（PI 人工染色体）, MAC（哺乳细胞人工染色体）, Fosmid （一种类似于BAC，来源于大肠杆菌

的F因子的载体）等,装载能力居中（80-200kb），又方便可靠。

1.酵母人工染色体（Yeast artificial chromosomes YACs）

在 YAC 载体中最常用的是 pYAC4 。由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。但是，为了方便制备YAC载体， YAC 载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。

YAC 载体主要是用来构建大片段 DNA 文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。当用 Bam HⅠ切割成线状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体复制的必要顺式元件，如自主复制序列、着丝粒和位于两端的端粒。这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配，从而决定这个微型染色体可以携带酵母染色体大小的DNA 片段。对于Bam HⅠ切割后形成的微型酵母染色体，当用Eco RⅠ或SmaⅠ切割抑制基因sup4 内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段 DNA 在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段DNA 的目的。YAC 文库装载的 DNA 片段的大小一般可达200-500kb，有的可达 1Mb 以上，甚至达到 2Mb 。

2. 细菌人工染色体载体（Bacterial artificial chromosomes，BACs）

是基于大肠杆菌的 F 质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。每个环状 DNA 分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌 F 因子（致育因子）的严谨型控制的复制子oriS，一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋酶（（RepE）以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA , parB , 和parC ）。 BAC 载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。

第一代 BAC 载体，不含那些能够用于区分携带重组子的抗生素抗性细菌菌落与携带空载体的细菌菌落的标记物。新型的 BAC 载体可以通过α互补的原理筛选含有插入片段的重组子，并设计了用于回收克隆 DNA 的Not Ⅰ酶切位点和用于克隆 DNA 测序的 Sp6 启动子、 T7 启动子（Kim et al. 1996; Asakawa et al. 1997）。Not Ⅰ识别序列，位点十分稀少。重组子通过Not Ⅰ消化后，可以得到完整的插入片段。 Sp6 、 T7 是来源于噬菌体的启动子，用于插入片段末端测序。

BAC 与 YAC 和 PAC（P1 artificial chromosomes ， P1 人工染色体）相似，没有包装限制，因此可接受的基因组 DNA 大小也没有固定的限制。大多数 BAC 文库中克隆的平均大小约 120kb ，然而个别的 BAC 重组子中含有的基因组 DNA 最大可达 300kb 。

【思考题】

1.噬菌体的克隆体现形式是什么？

2.粘粒载体的优势是什么？

3.人工染色体构建原则是什么？

第二节工具酶（3）

【教学时数】3小时

【教学目录】

1 限制性内切核酸酶

2 DNA聚合酶和Klenow大片段

3 DNA连接酶

4 碱性磷酸酶

5末端脱氧核苷酸转移酶

【教学目的】

让学生掌握基因工程常用的工具酶有哪些，这些工具酶有什么用途，在什么情况下使用，以及使用有哪些注意事项等基本常识。

【教学重点】

限制性核酸内切酶、DNA聚合酶的性质与使用。

【教学难点】

限制性核酸内切酶的类型与使用注意事项。

【教学方式】

多媒体讲解结合启发讨论式教学

【教学过程与内容】

第二节工具酶

在基因工程的操作中，通常要对目的基因或外源DNA片段以及载体DNA进行剪切，修饰加工与连接等操作，这些处理是通过工具酶来完成的。

1. 限制性内切核酸酶

(1) 限制性核酸内切酶的概念：

限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异性核苷酸序列并由此特异切割DNA 双链结构的水解酶。是在DNA分子内部切割，水解磷酸二酯键的核酸内切酶。能够识别特异的DNA碱基序列， DNA碱基序列往往呈回文对称结构；并具有特异切割位点。

在 20 世纪 60 年代，人们就注意到 DNA 在感染宿主后会被降解的现象，从而提出限制性切酶和限制酶的概念。 1968 年，首次从E.coli K 中分离到限制酶，它有特定的识别位点但没有特定的切割位点，其中切割位点离识别位点达 1000bp 以上。

1970 年，美国约翰·霍布金斯大学的 H. Smith 于偶然中发现，流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌体 DNA ，其细胞提取液可降解E.coli DNA ，但不能降解自身 DNA ，从而找到Hin dⅡ限制性内切酶。Hin dⅡ限制性内切酶位点和切割位点如下：

5 '… GTPy ↓ PuAC … 3 '

3 '… CAPu ↑ PyTG … 5 '

从此以后，发现的限制酶越来越多，并且许多已经在实践中得到应用。EcoRⅠ是应用最广泛的限制性内切酶，酶切位点和切割位点如下：

5' G↓AATTC 3'

3' CTTAA↑G 5'

（2）核酸内切酶的命名：

限制性内切酶的命名遵循一定的原则，主要依据来源来定，涉及宿主的种名、菌株号或生物型。命名时，依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字）。

物种属名第一个字母（大写字母）+菌种名前两个字母（小写）+菌株第一个字母+罗马大写数字。

EcoR I 代表Escherichia coli（大肠杆菌）R菌株发现的第一种限制性核酸酶。

如Hin dⅢ限制性内切酶，Hin 指来源于流感嗜血杆菌， d 表示来自菌株 Rd ，Ⅲ表示序号。以前在限制性内切酶和修饰酶前加 R 或 M ，且菌株号和序号小写。但现在限制性内切酶名称中的 R 省略不写。

1986 年下半年发现 615 种限制酶和 98 种甲基化酶； 1998 年发现 10000 种细菌或古细菌中存在 3000 种酶，且酶有 200 多种特异性。到 2005 年 1 月，共发现 4342 种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有 3681 种，包括Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型限制酶各有 59 、3612 、10 种，甲基化指导的限制酶有 3 种，商业化的限制酶有 588 种，在Ⅱ型限制酶中共有 221 种特异性。

（3）限制性核酸内切酶的分类：

根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为三类。

I类：识别特异顺序，序列外随机切割。基因工程中不用。

II类：识别特异顺序，序列内特异切割，回文结构。基因工程中常用。

III类：识别特异顺序，序列外特异切割，非回文结构。基因工程中特殊时候使用。

Ⅱ型（type Ⅱ）限制与修饰系统所占的比例最大，达 93% 。Ⅱ型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割 DNA ，产生带 3'- 羟基和 5'- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需 SAM 。识别序列主要为 4-6bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。

Ⅱ型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在 DNA 链的两个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。

在Ⅱ型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链 DNA 中的一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶（nicking enzyme），如 N.Bst NBI 。

在基因操作中，一般所说的限制酶或修饰酶，除非特指，均指Ⅱ型系统中的种类。II 类限制性核酸酶特点：

1. 内切酶活性与甲基化酶活性分开；

2. 需要Mg2+激活，但无需ATP辅助因子；

3. 特异识别，识别序列一般4-6bp长，偶尔7bp；

4. 识别顺序往往有回文结构；

5. 特异切割：切口有平切和错切两种类型。

（4）限制酶产生的末端

A．限制酶产生匹配粘端（matched ends）

识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end），这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。若在对称轴 5' 侧切割底物， DNA 双链交错断开产生 5' 突出粘性末端，如 Eco RⅠ；若在 3'-侧切割，则产生 3' 突出粘性末端，如 KpnⅠ。

NNG↓AATTCNN Eco RⅠ NNG AATTCNN

NNCTTAA↑GNN NNCTTAA GNN

B．限制酶产生平头末端（Blunt end）

在回文对称轴上同时切割 DNA 的两条链，则产生平末端，如HaeⅢ（GG↓CC）和Eco RV （GAT↓ATC）。产生平末端的 DNA 可任意连接，但连接效率较粘性末端低。

C．同裂酶（isoschizomer）

同裂酶（同切点酶）：来源不同，识别顺序相同或相近，切割序列相同，产生相同或不同的粘性末端。或者说：不同来源的限制酶可以切割相同的序列。

?Sau3A I : 5’-GATC-3’

? 3’-CTAG-5’

?BamH I: 5’-GGATCC-3’

? 3’-CCTAGG-5’

D．同尾酶

同尾酶：来源各异，识别靶序列各不相同，但产生相同的粘性末端。

?Bgl II : 5’-AGATCT-3’

? 3’-TCTAGA-5’

? BamH I: 5’-GGATCC-3’

? 3’-CCTAGG-5’

（5）影响限制性核酸内切酶切反应的因素

?DNA的纯度(蛋白质、酚、氯仿、EDTA、SDS、高浓度的盐离子等)

?DNA的甲基化程度

?酶切消化反应的温度

?DNA的分子结构

?限制性核酸内切酶的缓冲液

A．DNA样品的纯度：

蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等

处理办法：加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶；加大反应总体积；延长反应时间。

B. DNA甲基化程度

大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、Bgl II、Sau3A I不受影响

大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等。

C 反应温度

反应温度大多数为 37℃，一部分为 50-65℃，少数 25-30℃。高温作用酶在 37℃下的活性会下降，多数仅为最适条件下的 10-50% 。如Taq限制酶（正常反应温度为 65℃），在 37℃只有在 65℃活性的 10% ； ApoⅠ（正常反应温度为 50℃）， 37℃只有在 50℃时活性的 50% 。销售商在产品说明中都会标明最佳反应温度。

D 酶切反应的缓冲液：

常规缓冲液一般包括提供稳定 pH 值的缓冲剂、 Mg++、 DTT（二硫苏糖醇）以及 BSA（小牛血请白蛋白）。

pH 经常为 7.0-7.9（在 25℃时），用 Tris-HCl 或乙酸调节； Mg++ 作为酶的活性中心，由 MgCl2 和 MgAc 提供；浓度常为 10mM ；DTT 浓度常为 1mM 。有时缓冲液中还要加入 100 g/ml BSA ，但只是少数反应需要。不同的酶对离子强度的要求差异很大，并依次将限制酶缓冲液按离子强度的差异分为高、中、低三种类型，离子强度以 NaCl 来满足，浓度分别为 100mM 、50mM 和 0mM 。

要对 DNA 进行双酶切时，如何选择缓冲液是相当重要的。一方面可选用都合适的缓冲液或通用缓冲液；若找不到共用的缓冲液则先用低浓度的，再加适量 NaCl 和第二种酶；或先用低盐缓冲液再用高盐缓冲液（DNA 可纯化或不纯化）。

2. DNA连接酶

DNA连接酶负责双链DNA中相邻3`-OH与5`-磷酸基团之间的磷酸二酯键的形成。只能连接切口（nick or nike），不能连接缺口（gap）。

最常用T4连接酶。最适连接温度37。C，实际操作4-16。C。

DNA连接酶既可以进行粘接（连接粘性末端），也可以进行端接（连接平头末端），但粘接的效果比端接的效果要好许多倍。

从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多.

提高平头末端连接效率的方法包括：

（1）加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）

（2）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会

（3）加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用

（4）加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM

DNA连接酶的反应条件：

Tris-HCl 50 – 100 mM pH 7.5

MgCl2 10 mM

ATP 0.5 – 1 mM

DTT 5 mM

Volume 10 – 20 ml

T T 4 – 15 ℃ 4 – 16 hr

1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 ℃反应 1 小时，完全连接 1 mg l-DNA （Hind III片段）所需的酶量。

T4 DNA 连接酶（T4 DNA ligase）：

T4 DNA 连接酶的分子量为 68kDa ，催化 DNA 5' 磷酸基与 3' 羟基之间形成磷酸二酯键。反应底物为粘端、切口、平端的 RNA （但效率低）或 DNA 。低浓度的聚乙二醇 PEG （一般为 10%）和单价阳离子（150-200mM NaCl）可以提高平端连接速率。

连接反应条件需要 ATP ，若在 16℃反应，大约需 4 小时；若在 4℃反应，则需反应过夜。

3. DNA聚合酶和Klenow大片段

真核细胞有 4 种 DNA 聚合酶, DNA 聚合酶α位于细胞核内，也许是复合物，有催化细胞增生的作用； DNA 聚合酶β是小分子蛋白质（4.4kDa），曾从小牛胸腺中提出，与细胞增生无关； DNA 聚合酶γ为 100kDa ，利用 RNA 为模板的效率比利用 DNA 为模板的效率高；其它的还有线粒体 DNA 聚合酶，可以催化线粒体 DNA 的合成。

原核细胞有三种 DNA 聚合酶，都与 DNA 链的延长有关。聚合酶Ⅰ是单链多肽，可催化单链或双链 DNA 的延长；聚合酶Ⅱ则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；聚合酶Ⅲ在细胞中存在的数目不多，是促进 DNA 链延长的主要酶。

（1）E.coli DNA 聚合酶Ⅰ的活性

E.coli DNA 聚合酶Ⅰ为单链多肽（109kDa），有三种活性。

① 5'--3' DNA 聚合酶活性。反应底物为单链 DNA 及引物（带 3'-OH 基）或 5' 突出的双链 DNA 。

② 5'--3' 外切核酸酶活性。反应底物是双链 DNA 或 DNA:RNA 杂交体，它可从 5' 端降解双链 DNA ，也降解 RNA:DNA 中的 RNA（RNase H 活性）。

③ 3'--5' 外切酶活性。反应底物是带 3'-OH 的双链 DNA 或单链 DNA ，其活性从3'-OH 端降解 DNA ，可被 5'--3' 聚合活性封闭，也可被带 5' 磷酸的 dNMP 所抑制。

④交换（置换）反应。如果只有一种 dNTP 存在， 3'--5' 外切活性将从 3'-OH 端降解 DNA ，然后在该位置发生一系列连续的合成和外切反应，直到露出与该 dNTP 互补的碱基。

总之，在没有 dNTP 的情况下，外切活性占主导地位，而当存在足够的 dNTP 时，外切活性和合成活性将处在动态平衡中，结果使得双链 DNA 成为平末端。

2．E.coli DNA 聚合酶Ⅰ的用途

①利用 E.coli DNA 聚合酶Ⅰ的 5'--3' 外切核酸酶活性，可用切口平移法（nick translation ）标记 DNA ，所有 DNA 聚合酶中只有此酶有此反应。

②用于 cDNA 克隆中的第二链，即单纯的 DNA 聚合活性。但由于具有 5'--3' 外切活性，现在已不再使用，而改用 Klenow 酶和反转录酶。

③对 3' 突出端的 DNA 作末端标记（交换或置换反应），但是此反应用 T4 或 T7 DNA 聚合酶效果会更好

（2）Klenow片断

Klenow DNA 聚合酶是 E.coli DNA polymerase Ⅰ经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去 5'--3' 外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和 3'--5' 外切活性不受影响。也称为 Klenow 片段（Klenow fragment），或E.coli DNA 聚合酶Ⅰ大片段（E.coli DNA polymerase Ⅰ large fragment）。它也可以通过基因工程得到，分子量为76kDa 。

Klenow DNA 聚合酶的活性与 E.coli DNA 聚合酶Ⅰ的活性是一致的。由于没有5'--3' 外切活性，使用范围进一步扩大。

①补平 3' 凹端 DNA 。使用单纯的 DNA 合成活性。注意要加足够的 dNTP ；如果使用带标记的 dNTP ，则可对 DNA 进行末端标记。

②抹平 DNA 3' 凸端。在 3'--5' 外切活性作用下，可切除突出的 3' 凸端。注意必须加足量 dNTP ，否则外切活性不会停止。但由于 T4 和 T7 DNA 聚合酶具更强的 3'--5' 外切活性，现在已经取代了 Klenow DNA 聚合酶的这一作用。

③通过置换反应对 DNA 进行末端标记。但是该作用也已经被 T4 或 T7 DNA 聚合酶代替；它还可以在补平 3' 凹端的过程中进行标记。

④在 cDNA 克隆中合成第二链。

⑤随机引物标记。

⑥应用于 Sanger 双脱氧链末端终止法的 DNA 测序（已经被 T7 DNA 聚合酶取代）。

⑦在体外诱变中，用于从单链模板合成双链 DNA 。

（3）逆转录酶

反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链以及双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA 链。

?以mRNA为模板合成scDNA。

?需要模板，引物，底物

?用于cDNA 文库构建等

4. 单链核酸酶S1

?降解单链DNA或单链RNA, 但对双链不起作用。

?用于降解双链cDNA发夹结构

?单链酶法获取目的基因

降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍。

降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍。

5. 碱性磷酸酯酶

分子克隆中使用的磷酸酶主要来源于牛小肠碱性磷酸酶（Calf intestinal alkaline phosphatase），简称 CIP 或 CIAP ，也有来自细菌的碱性磷酸酶（Bacterial alkaline phosphatase, BAP）。它们均能催化除去 DNA 或 RNA 5' 磷酸的反应。通过去除 5' 磷酸基团，可用于防止 DNA 片段自身连接，或标记（5' 端）前除 DNA 或 RNA 5' 磷酸。 CIAP 可用蛋白酶 K 消化灭活，或在 5mM EDTA 下， 65℃处理或 75℃处理 10 分钟，然后用酚氯仿抽提，纯化去磷酸化的 DNA ，从而去除 CIAP 的活性。与 CIAP 不同， SAP 在 65℃处理 15 分钟后完全并不可逆地失去活性，因此在去除残留活性方面 SAP 更有优势。 BAP

抗性强、抗高温和去污剂。

碱性磷酸酯酶的作用是从DNA或RNA的三磷酸核苷酸上除去5`磷酸根残基。主要用于在DNA 5`端进行P32标记以及用于防止酶切片段及载体酶切片段的粘性末端的自连。

T4 多核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase）：

T4 多核苷酸激酶是一种磷酸化酶，可将 ATP 的γ-磷酸基转移至 DNA 或 RNA 的 5' 末端。在分子克隆应用中呈现两种反应，其一是正反应，指将 ATP 的γ-磷酸基团转移到无磷酸的 DNA 5' 端，用于对缺乏 5'-磷酸的 DNA 进行磷酸化。其二是交换反应，在过量 ATP 存在的情况下，该激酶可将磷酸化的 5' 端磷酸转移给 ADP ，然后 DNA 从 ATP 中γ-磷酸而重新磷酸化。在这两个反应中如果使用的 ATP 均为放射性同位素标记[?-32p]ATP ，那么反应的产物都变成末端获得放射性标记的 DNA 。

该酶主要用于对缺乏 5'-磷酸的 DNA 或合成接头进行磷酸化,同时可对末端进行标记。通过交换反应标记 DNA 的 5' 末端，可供 Maxam-Gilbert 法测序、 Sl 核酸酶分析以及其它须使用末端标记 DNA 的提供材料。此酶在高浓度 ATP 时发挥最佳活性， NH4+ 是其强烈抑制剂。

6. 末端脱氧核苷酸转移酶

末端转移酶的作用是将脱氧核糖核苷酸通过磷酸二酯键加到DNA分子的3`-OH末端。主要用于拼接人工接头或在3`端进行引物标记的时候。

分子克隆中常用的末端转移酶来源于小牛胸腺，是存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的 DNA 聚合酶，是一种不依赖于模板的 DNA 聚合酶。在二价阳离子存在下，末端转移酶催化 dNTP 加于 DNA 分子的 3' 羟基端。若 dNTP 为 T 或 C ，此二价阳离子首选 CO2+；若 dNTP 为 A 或 G 此二价阳离子首选 Mg2+。

作为该酶底物的 DNA 可短至 3 个核苷酸，对 3' 羟基突出末端的底物作用效率最高。在离子强度低时，带 5' 突出端或平端的 DNA 也可作为底物，但效率低。因此，该酶可在cDNA 或载体 3' 末端加同聚尾用于克隆；也可用标记的 rNTP、 dNTP 或 ddNTP 来标记 DNA 片段的 3' 末端。

【思考题】

1. 下列五个 DNA 片段中含有回文结构的是【】

Ａ GAAACTGCTTTGAC

Ｂ GAAACTGGAAACTG

Ｃ GAAACTGGTCAAAG

Ｄ GAAACTGCAGTTTC

Ｅ GAAACTGCAGAAAG

2.若载体 DNA 用 M 酶切开，则下列五种带有 N 酶粘性末端的外源 DNA 片段中，能直接

与载体拼接的是【】

M N

Ａ A/AGCTT T/TCGAA

Ｂ C/CATGG ACATG/T

Ｃ CCC/GGG G/GGCCC

Ｄ G/GATCC A/GATCT

Ｅ GAGCT/C G/AGCTC

3. 若将含有 5' 末端 4 碱基突出的外源 DNA 片段插入到含有 3' 末端 4 碱基突出的载体质粒上，又必须保证连接区域的碱基对数目既不增加也不减少，则需用的工具酶是【】I T 4 -DNA 聚合酶 II Klenow III T 4 -DNA 连接酶 IV 碱性磷酸单酯酶

Ａ III

Ｂ I + III

Ｃ II + III

Ｄ I + II + III

Ｅ I + II + III + IV

4. 提高重组率的方法包括【】

I 加大外源 DNA 与载体的分子之比 II 载体分子除磷 III 连接酶过量 IV 延长连接反应时间

Ａ I + II

Ｂ I + II + III

Ｃ I + III + IV

Ｄ II + III + IV

Ｅ I + II + III + IV

基因工程中常用的三种工具酶

一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。 2．类型：来自原核生物，有三种类型。 Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。 Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。 Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。 三种限制酶的区别如下表所示： Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型 DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA 辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP 识别序列特异特异特异 切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处） 与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用 3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。另外用罗马数字代表同一菌株中不同限制酶的编号，现在常用来表示发现的先后次序。如HindⅢ是来自Haemophilus influenzae D（嗜血流感杆菌D 株第三种限制酶）。 4．切割位点和结果：限制酶位点在DNA链上是随机分布的，若识别位点为4bp，则44（256）个核苷酸可遇一个切点。若为6bp，则平均46（4096）个核苷酸才遇到一个切点。限制酶沿回文结构的对称轴切开，则产生平头末端（flush or blunt ends）如BalⅠ。多数限制酶错位

第二章 基因工程工具酶

第二章基因工程工具酶 第—节限制性核酸内切酶 第二节DNA连接酶 第三节DNA聚合酶 第四节末端脱氧核苷酸转移酶 第五节核酸酶 第六节核酸外切酶 第七节碱性磷酸酶 第八节T4噬菌体多核苷酸激酶 第—节限制性核酸内切酶 1、宿主的限制和修饰现象 2、限制性核酸内切酶的类型 3、限制性核酸内切酶的命名 4、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 4.1识别位点的长度识别靶序列长度4、5、6 bp居多，也有识别7、 8bp的 4.2 识别序列结构：回文对称 4.3 切割位置：（1）内部（大多数）；（2）两端（3）同裂酶与同尾酶 4.4 Ⅱ型限制性核酸内切酶不具有甲基化功能 4.5 Ⅱ型内切酶可以对单链DNA的切割 4.6 星号活性(star activity) （1）星活性产生的原因 （2）抑制星星活性的条件(措施) 5、Ⅱ型限制性核酸内切酶的酶切反应 5.1 标准酶解体系的建立 5.2 酶切反应的基本步骤 5.3 终止反应常用方法：

（1）加EDTA：（2）加SDS（3）加热：（4）其它 5.4 多酶联合酶解策略： （1）对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切 （2）对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法 5.5 DNA分子酶切常用缓冲液 5.6 内切酶对DNA分子的不完全酶解 5.7 内切酶酶解反应中的注意事项 6、影响限制性核酸内切酶活性的因素 6.1. DNA的纯度 6.2 DNA的甲基化程度 6.3 酶切消化反应温度 6.4 缓冲液(Buffer) 6.5 DNA分子的构型 6.6 反应时间 6.7 酶量使用 第二节DNA连接酶 1、DNA连接酶的发现 2、概念及其特点 3、DNA连接酶的种类 ?大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端。 ?T4噬菌体的连接酶：不但能连接粘性末端，还能连接平末端。 ?T4噬菌体RNA连接酶：催化单链DNA或RNA的5’磷酸与相邻的3’羟基共价连接。 4、DNA连接酶的反应体系

基因工程的工具——酶与载体

1.2基因工程的基本操作程序 一、教材分析 《基因工程的基本操作程序》是人教版选修3专题1基因工程中第2节内容，本节是《基因工程》专题的核心，上承《DNA重组技术的基本工具》一节，下接《基因工程的应用》。 对于基因工程，学生接触得很少，文字描述中会感到抽象，为此，教材中采用形象化得呈现方式简述了基因工程基本操作程序的四个步骤。例如，基因文库中把基因组文库比作国家图书馆，而把cDNA文库比作某市图书馆，这样便于学生理解和掌握。此外，在教材处理中还呈现主干，割舍枝杈，将非主干内容以《生物技术资料卡》、《拓展视野》等方式呈现，做到有主有次。 二、学情分析 学生经过上一节的学习已经掌握DNA重组技术所需三种基本工具的作用及基因工程载体所需条件等知识，具备学习基因工程的基本操作程序一节的基础；而且经过一年必修教材的学习，学生的生物基础知识较扎实，思维的目的性、连续性和逻辑性已初步建立。但基因工程一节对学生来说难点较多，如果处理不好，会变成简单的死记硬背。因此在教学过程中，应在教师引导下适时加强学生解决问题和运用概念图等生物学语言归纳结论等方面的能力。 三、教学目标 3.1 知识目标 ⑴简述基础理论研究和技术进步催化了基因工程 ⑵简述基因工程的原理和基本步骤 3.2 能力目标 ⑴学会运用概念图总结基因工程的基本步骤及方法 ⑵尝试运用基因工程原理，提出解决某一实际问题的方案 3.3 情感态度与价值观 ⑴关注基因工程的发展 ⑵认同基因工程的应用促进生产力的提高 四、教学重点与难点 4.1 教学重点基因工程基本操作程序的四个步骤 4.2 教学难点 ⑴从基因文库中获取目的基因 ⑵利用PCR技术扩增目的基因 五、教学整体思路 采用从“整体-部分-整体”的教学思路，首先引用基因工程案例使学生从整体上了解基因工程的四个步骤，其次采用分步探究的形式帮助学生理解各个步骤的原理、方法和过程，最后教师引导学生用概念图将所学的知识从整体上再次整合。

第二章_基因工程中常用的工具酶

第二章基因工程中常用的工具酶 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。 §2-1 核酸内切限制酶 定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图） 一、限制修饰系统的种类（图） 二、限制性内切酶的定义、命名 1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。 2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 例如：Hin dⅢ前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 Eco RI—Escherichia coli RI Hin dⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ Sac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ) 三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点 a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA分子中的特定序列，但它们的切割作用却是 随机的，在距特异性位点至少1000bp的地方可以随机地切割DNA分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。——远距离随机切割 b. Ⅲ型核酸内切限制酶大约从距离识别序列25bp处切割DNA分子。——远距离定点 切割 c.Ⅰ型核酸内切限制酶和Ⅲ型核酸内切限制酶，在切割反应过程中，都会沿着DNA分 子移动，因此是一种需要能量的过程。——需要能量的反应 d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶，一般都是大型的多亚基的复合物，既具有内切酶活性， 又具有甲基化酶活性。——内切酶活性和甲基化酶活性 四、Ⅱ型核酸内切限制酶的特点 (1)基本特点： ①在双链DNA分子上有一个特殊的靶子序列，即所谓的识别序列，并由此切割DNA 分子形成链的断裂；——识别序列 ②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；——单链切割

基因工程基因操作过程中的工具酶

基因工程基因操作过程中的工具酶 09生物工程（2）班0902012010 摘要：基因工程涉及众多的工具酶可粗略的分为限制酶，连接酶，聚合酶和修饰酶四大类。其中，以限制性核酸内切酶和DNA连接酶在分子克隆中的作用最为突出。 关键词：基因工程工具酶聚合酶连接酶内切酶 正文：一、基因工程工具酶 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。 所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。 在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。 二、限制性核酸内切酶及其应用 （一）限制性核酸内切酶的发现 当λ(k)噬菌体侵染E.coli B时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coli B的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB 甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。Eco B核酸酶不能识别已甲基化的序列。 最早分离出的限制内切酶是在1968年，Meselson和Yuan，大肠杆菌B和K 菌株，Eco B和Eco K，是I型的，没有实用价值。 首个II型限制内切酶是在1970年，由H.O.Smith等从Heamophilus influenzae 的Rd菌株中Hin d II 。使得DNA分子的体外精确切割成为可能。 从此，相关研究展开。如NEB公司的提取和克隆。目前已纯化出3000种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的。 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ）：是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3，5－磷酸二酯键。 （二）限制性核酸内切酶的分类 分为I型、II型和III型。

基因工程载体和工具酶

基因工程的载体和工具酶 第一节 载体 引言 基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达， 制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于 来实现。 作为基因克隆的载体必须具备以下特性： ⑴载体必须是复制子。 ⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。 ⑶具备多克隆位点（MCS ）,便于外源基因插入。 ⑷自身分子量较小，拷贝数高。 ⑸在宿主细胞内稳定性高。 一、质粒载体 （一） 质粒的生物学特性 （1） 质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状 （少数为线形和 RNA ） DNA 分 子。 广泛从在于细菌细胞中， 比病毒更简单。 在霉菌、 蓝藻、 酵母和一些动植物细胞中也发现了 质粒， 目前对细菌的质粒研究得比较深入， 特别是大肠杆菌的质粒。 大肠杆菌的质粒主要有 F 质粒（F 因子）、R 质粒（抗药性因子）和 Col 质粒（大肠杆菌素因子）三种。 （2） 质粒的大小差异很大，最小的只有 1kb,只能编码中等大小的 2-3种蛋白质分子，最大 的达到 200kb 。 （ 3 ）质粒的生存在寄主细胞中 “友好 ”地“借居”，离开了寄主它本身无法复制；同时质粒往 往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。 （4） 质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将 质粒分为两种复制型： 严紧型"质粒（stigent plasmid ），拷贝数为1-3 ；松弛型"质粒（relaxed plasmid ） ,拷贝数为 10-60。不过即使是同一质粒， 其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生 长环境也可能有很大的变化。 （5） 质粒的不亲和性 两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。 载体 质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。 ⑹ 质粒的转移 转移性质粒，含有 tra 基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。 非转移性质粒，不含 tra 基因；可以为转移性质粒所带动转移。 （ 7）质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种， （二） 质粒 DNA 的制备 有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。 目前一般使用碱变性法制备质粒 DNA 。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解 细胞，将质粒 DNA 与染色体 DNA 分开及除去蛋白质和 RNA 。 1. 碱变性法质粒提取的原理： 根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 片断之间，在拓扑学上的差异而发展 出来的。 在pH 值12.0?12.5范围内时，线性的 DNA 会被变性而共价闭合环状质粒 DNA 却不 会被变 性。 通过冷却或恢复中性 pH 值使之复性，线性染色体形成网状结构，而 cccDNA 可以准确 迅速复性， 通过离心去除线性染色体，获得含有 cccDNA 的上清液，最后用乙醇沉淀，获得 质粒 DNA 。 2. 碱变性法提取质粒的步骤： 而目的基因本身无法进行复 “载体 ”及其“寄主细 胞

基因工程的工具酶

基因工程的工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 碱性磷酸酶 末端脱氧核苷酸转移酶 限制性核酸内切酶 是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。 是体外剪切基因片段的重要工具 限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定 防御机制: 任何物种都有排除异物、保护自身的防御机制 人：免疫系统 细菌：限制与修饰系统 寄主控制的限制与修饰现象 限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段, 各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA 双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。 限制酶(restriction enzyme) 修饰酶(modifying enzyme) 核酸酶切位点： 既可以在3ˊ,5ˊ-磷酸二酯键的3ˊ酯键处（A）， 也可以在5ˊ酯键处（B）切断磷酸二酯键

1）核酸限制性内切酶的类型 2）核酸限制性内切酶的基本特性 3）同裂酶和同尾酶 4）核酸限制性内切酶的命名法 5）影响核酸限制性内切酶活性的因素 限制性核酸内切酶的类型及特性 按照限制酶的组成、与修饰酶活性的关系以及切断核酸的情况不同，分为三类： Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型 第一类（I型）限制性内切酶： 能识别专一的核苷酸顺序 并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链 但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的 这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因 如：Eco B、Eco K等 第二类(II型)限制性内切酶： 能识别专一的核苷酸顺序（回文对称顺序） 并在该顺序内的固定位置上切割双链 是DNA重组技术中最常用的工具酶之一 这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的 回文对称顺序：有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同 切割后形成具有粘性末端（cohesive end）的DNA片段 切割后形成具有平末端（blunt end）的DNA片段 限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段没有突出的单链

基因工程中常用的工具酶模板

第二章基因工程中常见的工具酶 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。§2-1核酸内切限制酶 定义: 核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列, 并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 到当前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。 核酸内切限制酶的发现及其生物功能( 图) 一、限制修饰系统的种类( 图) 二、限制性内切酶的定义、命名 1.定义: 广义指上述三个系统中的限制酶; 狭义指II型限制酶。 2.命名: 限制酶由三部分构成, 即菌种名、菌系编号、分离顺 序。 例如: Hin dⅢ前三个字母来自于菌种名称H.influenzae, ”ｄ” 表示菌系为ｄ型血清型; ”Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 Eco RI—Escherichiacoli RI

Hin dⅢ—Haemophilusinfluensae dⅢ Sac I(II)—Streptomycesachromagenes I(Ⅱ) 三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点 a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA分子中的特定序列, 但它们的切割作用却是随机的, 在距特异性位点至少1000bp的地方能够随机地切割DNA分子, 因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。——远距离随机切割 b.Ⅲ型核酸内切限制酶大约从距离识别序列25bp处切割DNA分 子。——远距离定点切割 c.Ⅰ型核酸内切限制酶和Ⅲ型核酸内切限制酶, 在切割反应过程 中, 都会沿着DNA分子移动, 因此是一种需要能量的过程。——需要能量的反应 d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶, 一般都是大型的多亚基的复合 物, 既具有内切酶活性, 又具有甲基化酶活性。——内切酶活性和甲基化酶活性 四、Ⅱ型核酸内切限制酶的特点 (1)基本特点: ①在双链DNA分子上有一个特殊的靶子序列, 即所谓的识别序 列, 并由此切割DNA分子形成链的断裂; ——识别序列 ②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布, 一般不是彼此直接 相正确; ——单链切割部位 ③因此, 断裂的结果形成的DNA片段, 也往往具有互补的单链

基因工程的载体和工具酶

第二章基因工程的载体和工具酶 【教学时数】9小时 【教学目录与学时分配】 2.1 载体（6） 2.1.1 质粒载体 2.1.2 噬菌体载体 2.1.3 其他载体 2.1.4 穿梭载体与表达载体 2.2 工具酶（3） 2.2.1 限制性内切核酸酶 2.2.2 DNA聚合酶和Klenow大片段 2.2.3 DNA连接酶 2.2.4 碱性磷酸酶 2.2.5末端脱氧核苷酸转移酶 【教学目的】 让学生掌握什么是基因工程的载体，有哪些典型的基因工程载体，哪些常用的基因工程工具酶，什么情况下使用工具酶等基本常识。 【教学重点】 常用基因工程载体的结构、工具酶的用途。 【教学难点】 基因工程载体的结构和使用 【教学方式】 多媒体讲解结合启发讨论式教学 第一节载体 一、质粒载体（3） 【教学重点】 质粒载体的构建与标记基因；克隆质粒载体的克隆过程 【教学难点】 质粒的结构 【教学过程与内容】 载体是指运载外源DNA有效的进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。 作为载体必须满足的条件：①有多种限制性内切酶的切点，但每一种酶最好只有一个切点；②外源DNA插入以后载体在受体细胞中自我复制；③有便于选择的标记基因；④具有促进外源DNA表达的调控区。 2.1.1 质粒载体 质粒是在许多种细菌中发现的染色体外的遗传因子。它是闭合环状双链DNA分子，大小1kb到200kb不等。能自主复制，但要利用寄主细胞复制染色体的同一组酶系。有某些基因，如抗药性基因，对寄主的生长是有利的。 质粒的复制分松弛型和严谨型两种。松弛型质粒是指质粒的复制跟细菌染色体的复制不同步，一般在一个菌体内能复制10-200 拷贝；严谨型质粒是指质粒复制跟细菌染色体同步，一般含有1-10 拷贝。 一、质粒的基本特性 1．质粒的复制 通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制

基因工程常用的工具酶

基因工程常用的工具酶 常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系 生物制药0911 刁亚军学号:2009423134 引言:在基因工程的研究和发展过程当中，有许多必不可少的因素影响和制约着基因工程的进展。本篇综述主要讲述的是基因工程常用的一些工具酶，他们包括限制性内切酶，DNA聚合酶，T4噬菌体DNA连接酶，T4多聚核苷酸激酶，碱性磷酸酶，核酸酶。这些酶在基因工程中发挥着非常重要的作用。 限制性内切酶 限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。 限制性内切酶的由来 一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组

限制性核酸内切酶 成，第四个字母表示菌株(品系)。例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。限制性内切酶（restriction endonuclease）:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。别名Endodeoxyribonuclease简称限制酶酶反应限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。它能识别外源DNA并将其降解。单位定义在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。性状制品不含非专一的核酸水解酶(由10单位内切酶与1μg λDNA，保温16小时所得的凝胶电泳图谱的稳定性表示),这类酶主要是从原核生物中分离出来的，迄今已经从近300多种不同的微生物中分离出约4000种限制酶。 类型 根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。 第一型限制酶