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三乙胺对HPLC影响

作者

William J. Long and John W. Henderson, Jr. 安捷伦科技公司

2850 Centerville Road Wilmington, DE USA

摘要

在中性pH 条件下分析碱性化合物时，为减少峰拖尾，三乙胺(TEA)是广泛使用的流动相添加剂。在本研究中，在不加TEA 的情况下，用Eclipse Plus C18柱分离难分离的化合物得到了尖锐的对称峰。硅醇基活性更低的Eclipse Plus C18柱具有与其它C18柱相似的选择性，因而使其成为分析药物和其它含氨基化合物的首选HPLC 柱。

引言

用反相HPLC 分离碱性化合物时，色谱峰的拖尾问题是大多数色谱工作者非常关注的问题。碱性和含氮化合物能形成能满足分离和定量要求的对称峰。由于许多生物活性化合物都含氮，因此给这些药物和植化成份的HPLC 分析带来了困扰。

不加三乙胺进行含氮化合物的色谱分离应用

有几种克服硅醇基相互作用所致峰拖尾的办法。常用

的措施是降低流动相的pH 值，一般pH 值小于3时硅醇基将不再引起峰拖尾。在pH 值小于3时，硅胶基质上的硅醇基被质子化（硅醇基的pKa 约为3.5），从而使硅醇基与溶质的相互作用减少。但是，这样也可能改变了分离的选择性和分离度，因此也不一定是好的选择。

第二个措施是提高流动相的离子强度。通过增加流动相的缓冲容量，抑制碱性化合物与硅胶之间的相互作用。但是，当增加的缓冲液在仪器内外/在进行色谱分析时发生沉淀，特别是在泵密封垫上发生沉淀时，可能会带来其它问题。应注意根据缓冲范围使用适当的缓冲液。表1列出了几种最常用的缓冲液。另一个可能的解决办法是在流动相中添加三乙胺(TEA)。TEA 作为一种竞争碱，

减少了固定相硅醇基的可用性，也减少了分析物与硅醇基之间的相互作用。

药物/功能食品

一些色谱工作者不赞成在流动相中加入竞争性胺，因为这使流动相添加了额外成分，将给色谱柱造成不可恢复的改变。要从色谱柱上洗掉较强的胺，如TEA，非常困难。这一现象的一个例子就是，系统中使用TEA后，正离子模式电喷雾LC/MS一直有m/z为102的离子，说明污染的不只是柱子，还有管路[1]。要除去TEA，需要用5%到10%的醋酸清洗系统。也就是说，被TEA修饰过的柱子不再适用于那些流动相中不含TEA的应用。TEA的作用是竞争性碱，让可能反应的硅醇基饱和，从而减少峰拖尾的可能性。对大多数分析来说，10 mM的TEA已经足够，但许多情况下可能使用得更多。而且，TEA的碱性很强，如果添加到没有缓冲或弱缓冲能力的流动相中，可能导致溶剂pH值急剧升高，可能会损坏色谱柱，进而影响分离，最终缩短柱寿命。最好的解决办法是使用对TEA需求最少的色谱柱。

Eclipse Plus采用了专利的硅胶处理技术，改进了键合和封端工艺，不用添加TEA，靠色谱柱本身就能降低峰拖尾。实验部分

所有分析都在Agilent 1200上进行，系统包括一个自动进样器、二极管阵列检测器、二元泵、脱气机、柱温箱。法莫替丁、甲氰脒胍和哌仑西平样品购自Sigma Aldrich（St. Louis，MO，美国）。将这些样品溶解在50/50 M eCN乙腈/水中。白毛茛样品在当地购买，按照参考文献2中的步骤，用70/30/0.1% v/v/v水/乙腈/磷酸提取，超声、离心，用提取溶剂稀释。黄藤素、黄连素和白毛莨碱标准购自Sigma Aldrich，用流动相配制。用这些标准品鉴定白毛茛提取物。

结果与讨论

图1是Eclipse Plus C18柱和另一种C18柱上分离三种治溃疡药物：法莫替丁、甲氰脒胍和哌仑西平（添加TEA和不加TEA）的色谱图。这三种含氨基药物的结构见图2。甲氰脒胍和法莫替丁是组胺H2-受体拮抗剂，通过关闭产生胃肠液的通路治疗治溃疡。哌仑西平是一种M1-竞争性毒蕈碱受体拮抗剂，能抑制胃酸的产生。治溃疡药是最常用的药物。从图1中可以看出，加入10 mM的TEA后，三种分析物在C18柱上的峰形得到了改善。加入TEA后哌仑西平峰的拖尾因子从没加TEA的1.74变为1.02。但我们注意到，只要换成Eclipse Plus C18柱，甲氰脒胍和哌仑西平的峰形和柱效都有了改善。实际上，这些峰的拖尾因子与使用了TEA的C18非常接近，柱效更高。用Eclipse Plus C18分析时，不需要任何流动相改性剂就能得到很好的峰形和柱效。

图1.使用Eclipse Plus C18柱和另一种C18柱时离子化硅醇基对峰形的影响

图2.含氨基治溃疡药物的结构

图3显示了Eclipse Plus C18柱在分析功能食品白毛茛中的应用。白毛茛一直用做抗菌、抗炎、减充血剂，用于治疗各种肠道紊乱，是使用最广泛的功能食品原料之一。采用一种通用的方法[2]，评价Eclipse Plus

C18和另一种C18柱，加TEA 和不加TEA

的分离效果。图3.

离子化硅醇基对白毛茛根提取物峰形的影响

图4.白毛茛含氨基活性成分的结构

在这个例子中，我们测定了500-mg 市售白毛茛根的提取物。白毛茛的两个主要成分是黄连素和白毛茛碱。

方法中提到了黄藤素，但是在测定的植物Hydrastis Canadensis L （北美黄连）中没有检测到。这些氨基

化合物的结构见图4。

从色谱图中可以看出两点。第一，与另一个C18柱相比，黄连素在Eclipse Plus C18上的峰形有所改进。第二，随着TEA的添加，C18柱的选择性有了明显改善。最后要注意的一点是，在含TEA的色谱图开始处有许多鬼峰或负峰。因为添加组分(14 mM TEA)加入到流动相中后，又加酸重新调节pH，简单的流动相变复杂了，甚至变脏了。包括高质量的新鲜试剂的最好的实验室操作，可以避免这一问题，但流动相污染的可能性仍然存在。更好的选择是不加TEA。

结论

由氨基和硅醇基离子化产生的峰拖尾现象，通常可以通过降低流动相pH、增加缓冲液离子强度，或添加竞争碱，如TEA，得到缓解。这些措施虽然减少了峰拖尾，但也可能给方法开发带来挑战，如选择性或分离度变差，降低柱寿命等。新的解决方案是用Eclipse Plus C18固定相。它的硅醇基活性低，能为碱性化合物提供卓越峰形和柱效。参考文献

1.H. Rütters, Th. M?hring, J. Rullk?tter, J. Griep-

Raming, and J.O. Metzger, “The persistent

memory effect of triethylamine in the analysis

of phospholipids by liquid chromatography/

mass spectrometry,” Rapid Commun. Mass

Spectrom.2000, 14, 122-123.

2.H. A. Weber, M. K. Zart, A. E. Hodges, H. M.

Malloy, B. M. O’Brien, L. A. Moody, A. P. Clark,

R. K. Harris, J. D. Overstreet, and C. S. Smith,

“Chemical comparison of goldenseal (Hydrastis canadensis L.) root powder from three

commercial suppliers,” J Agric Food Chem.

2003 Dec 3; 51(25):7352-8.

Columns used in this work.

Eclipse Plus C18 4.6 x 150 mm, 3.5 μm

(PN 959963-902)

Eclipse Plus C18 4.6 x 75 mm, 3.5 μm

(PN 959933-902)

本文中所含信息仅适用于研究，不可用于诊断。

安捷伦对本资料中的错误，及因使用本资料所引发的相关损失不承担任何责任。

本资料中的信息、介绍和性能指标如有更改恕不另行通知。? 安捷伦科技公司，20072007年8月，中国印刷5989-6068CHCN

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