论基因克隆的前景与应用---本科论文
目录
绪论（序论）．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1 1．基因、克隆的概念．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1 2．基因克隆研究的主要内容．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1 2．1克隆工具的研究．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1 2．2 技术方法的研究. ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1 2．3 研究对象——目的基因的研究．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1 2．4过程研究．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1 3．克隆研究的历史．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．2 一、基因克隆技术．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．2
1．基因克隆技术的特点．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．3 2．基本方法与技术．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．3 2．1传统的方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．3 2．2近期发展的经典方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．3 3．基因克隆技术的基本步骤．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．5 4．基因克隆技术的表达系统．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．6 二、基因克隆技术早期开创性研究成就和近来的研究成果．．．．．．．．．．．．．．．．6
1．微生物的基因克隆．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．6 1．1微生物基因克隆的工具酶．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．6 1．2微生物基因克隆载体．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．6 1．3微生物人为克隆载体的宿主．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．7 1．4达载体的构建．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．8
1. 5融合蛋白的表达．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．9
2．植物的基因克隆．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．9 3．动物的基因克隆．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．10
三、基因克隆技术的具体应用及发展方向．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11
1.繁殖性克隆．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11
1.1基因克隆技术与遗传育种．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11
1.2 转基因动植物的培育．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11
1.3 医学上的应用．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11
1．4基因克隆和DNA分析在法医学和考古学中的应用．．．．．．．．．．．．．．．．．．12
1. 5特殊动物基因资源的保护．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12
1.6 建立动物模型，制备医用实验动物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12
1.7 生物学基础研究．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12
2. 治疗性克隆．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12
四、基因克隆技术意义与展望．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12
五、结论．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12
六、谢辞．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．13 参考文献．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．14
绪论（序论）
1．基因、克隆的概念
基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种的不同个体表现出不同的性状的根本原因，即所谓“种瓜得瓜，种豆得豆”“龙生龙，凤生凤，耗子生儿会打洞”。基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到表达。
克隆（cloning）这个词源于希腊语中clonos，即嫩枝，clonizo是砍下嫩枝的意思。许多世纪以来，克隆就广泛地应用与农业方面，用这种方法不使用种子就可以把老树的嫩枝经插条变成树苗。英文clone就是使用了这个意思，而克隆是clone的音译。广义上讲，无性繁殖与克隆不同，前者指不经雌雄两性生殖细胞的结合，只由一个生物体产生后代的生殖方式，常见的有孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。植物的压条或嫁接方式产生的新个体也叫无性生殖。后者是人工遗传操作动物繁殖的过程。狭义上二者相同。
在生物的分子、细胞、个体三个不同层次上，“克隆”有不同的含义。
在分子水平上，用分子生物学技术利用细菌或病毒使原来某一片段DNA形成一群DNA分子的过程，叫做分子克隆或DNA克隆，而且相同分子叫一个克隆。
在生物学中，细胞克隆技术的正规名词为细胞培养技术，包括微生物、动物和植物细胞以及动植物组织的培养，而得到大量的细胞或其代谢产物。
自然界普遍存在植物、微生物的克隆，即使高等动物也不例外，同卵双胞胎实际上就是一种胚胎水平上的克隆。
2．基因克隆研究的主要内容
2．1克隆工具的研究
主要的基因克隆载体：原核和真核载体、克隆和表达载体、质粒载体、噬菌体、病毒、黏粒载体等。在细胞内进行自我复制的DNA分子，就是外源基因的运载体，有了它，外源DNA才能进入受体细胞生存和繁殖，从而使基因克隆技术成为可能。主要的工具酶：如限制性核酸内切酶、DNA连接与聚合酶、单链核酸内切酶、核酸外切酶、各种修饰酶等，它们使基因克隆操作在技术上成为可能。以上均在正文简介。
2．2 技术方法的研究
新的克隆方法不断涌现，如以PCR为基础的差异筛选技术、长片段DNA序列测定技术、高通量的基因芯片技术等。
2．3 研究对象——目的基因的研究
2．4过程研究
2．4．1 供核细胞的来源
胚胎细胞和动物胎儿细胞是克隆动物的理想核供体来源。
2．4．2细胞质受体的来源
2．4．3 重构胚的核质适应机理
核移植重构胚胎融合后核质间细胞周期是否同期化、核重编程的能力如何和核质相适应的机制等。
2．4．4 支持体系研究
包括了供核细胞和胞质受体的采集技术和培养体系研究；核移植操作技术和有关设备研究等。
2．4．5 重构胚胎体内和体外培养技术
孕育新生命的重构胚胎需要在什么条件下培养发育，是提高克隆效率的关键。
2．4．6 实用化研究
研究的目的及意义：是为了用它来造福人类，为人类带来利益。如研究（转）基因克隆技术，以获得更多的转基因动物；培育动植物优良品种及医用实验动物；异种动物克隆，用于珍稀濒危动物的克隆和繁殖等等。
2．4．7 应解决的问题
目前（基因）克隆在理论和技术实践方面都还不很成熟，许多应用还处在试验阶段，因此有赖于科学的进步和研究者的不懈努力，争取将它做的更好更美，早日为人类利益服务。
3．克隆研究的历史
1932年，英国作家赫胥黎曾在他的小说《美丽的新世界》中预言，人类科技发展到复制人类自身时，便是世界混乱之日。
明代小说家吴承恩在《西游记》中描写无所不能、会七十二变的孙悟空时，特别描写了他用来战胜敌人的分身术：拔下一撮毛，吹上一口气，就能变成无数个和他一模一样的孙悟空……人们充满复制自我的幻想。
1958年，Steward用胡萝卜根细胞经培养产生植株。
1962年，Gurdon用成体细胞克隆了青蛙。
1963年，我国童第周教授领导的科研组研究鱼类胚胎细胞核移植获得成功。同年，Haldane创造了“clone”一词。
1981年，Illmensee等人用鼠胚胎细胞培育出3只发育正常的小鼠，其后许多科学家都用动物成熟胚胎细胞培育了正常的克隆羊、兔、牛等。
1982年，1999年，2002年科学家们分别克隆出了带有人类基因的转基鼠，克隆羊、牛等。
2001年，科学家将死亡的欧洲盘羊的颗粒细胞移入其卵母细胞构建异种重构胚，移植后获得一个正常体细胞克隆羊，为濒危物种保护提供了借鉴。
2003年，世界上第一匹克隆骡子、马诞生，开创了动物生下它自己的克隆体的先河。
我国哺乳动物细胞核移植已取得成功，至1996年我国科学家已先后获得克隆山羊、牛、猪。
以上只是部分突出例子，从克隆发明至今，科学家的步伐一直在其研究领域上前行。
一、基因克隆技术
先介绍两个概念：
文献中，基因克隆指在体外借助于能自我复制的载体，将目的基因引入到受体（宿主）细胞中进行增殖，以获得大量的DNA片段，或以此为基础，通过工程方法表达出大量相应的基因（蛋白质）产物。一般来说，此技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。而基因工程又称为重组DNA技术、基因克隆、遗传工程、基因操
作等。其核心技术是DNA重组，即基因克隆技术。指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。它按照人们的需要，运用载体将外源基因导入受体细胞，使之获得新的遗传性状或产生所需的基因产物的过程。采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子，在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程即为基因克隆。
1．基因克隆技术的特点：是可以使一个生物体获得与之原有形状完全无关的新性能，从而使人们可在大量扩增的细胞中，将控制某些新型药物合成的目的基因克隆出来，转移到受体细胞进行高效表达，而提取纯化得到大量珍贵药物。
基因克隆技术是一种崭新的获得生物新品种的育种技术，与其他育种技术相比，具有如下特点：
1．1 能像工程一样可按人们的意愿来事先设计和控制。
1．2 人工的、离体的、分子水平上所进行的遗传重组。
1．3 能在动植物和微生物间进行任意、定向的超远源杂交。
2．基本方法与技术
2．1传统的方法．
2．1．1化学合成法：指根据某种已知基因产物氨基酸序列，仔细选择密码子，可推导出该编码基因的核苷酸序列，然后将核苷酸片段挨着缩合起来，成为一个个基因片段。
2．1．2物理化学法．
2．1．2．1密度梯度离心法：利用密度梯度超离心技术可使切割成适当片段的不同DNA按密度大小分开，进而通过与某种放射性标记的mRNA杂交来检验，分离相应的基因。
2．1．2．2单链酶法：用加热或变性试剂处理DNA，双链上A、T配对较多的部位先变成单链，应用核酸酶切除，再离心，获得无单链切口的DNA.
2．1．2．3分子杂交法：利用单链DNA与其互补的序列总有“配对成双”的倾向进行分离与鉴定某一基因。
2．1．3 鸟枪法：又叫散弹射击发。指利用分子杂交等技术在基因文库中去钓取基因，并进行基因克隆的方法。它意味着从含有较多的基因序列克隆中去获取目的基因或序列。
2．1．4 聚合酶链式反应（PCR）技术：又称无细胞克隆系统，它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。PCR技术已经渗透到生物学的各个领域，在分子克隆和获得cDNA全长方面起着重要的作用。利用PCR技术对特定条件下基因的表达进行检测即通过mRNA差别显示（DDRT-PCR）可鉴定和分离出所需的目的基因；通过RT-PCR克隆到目的基因的cDNA区域进行cDNA文库的构建，通过锚定PCR或反向PCR可快速克隆到cDNA末端未知序列、功能基因调控区等。
2．2近期发展的经典方法
2．2．1 逆转录酶促法：以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成互补的DNA,然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段。它使用于未知序列基因或不同物种的高度保守基因的克隆。
2．2．2应用cDNA差异显示分析法：充分发挥PCR能以指数形式扩增双链DNA模板，而仅以线性形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换其两端接失等方法，特异性扩增目的基因片段。另外，mRNA差别显示法是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速方法，是mRNA反转录与PCR相结合的RNA指纹图谱技术。
2．2．3 RACE(rapid amplification of CDNA ends)技术：即cDNA末端快速扩增。是一项在已知CDNA序列的基础上克隆5＇或3＇端缺失序列的技术，很大程度上依赖于RNA连接酶和寡聚帽子的快速扩增。
2．2．4基因的图位克隆法：原理是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上，用与目的基因机密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，在利用此物理图谱通过染色体步移逐步逼近目的基因或通过染色体登录的方法最终找到包含此目的基因的克隆，并通过遗传转化实验证实目的基因的功能。
2．2．5基因芯片法：指高密度固定在固相支持介质（如玻片、硅片、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜等）上的生物信息分子（如寡核苷酸、基因片段、多肽、蛋白质等）的微矩阵。列阵中每个分子的序列及位置都是已知的，并按预先设定好的顺序点阵。基因芯片是生物芯片的一种，其上固定的是核酸类物质，主要用于DNA、RNA分析。分为DNA芯片和微点阵两种。分离目的基因是是指从基因组中发现或找出某个目的（标）基因。其原理是应用已知序列的核酸作为探针进行杂交，对未知核酸序列进行检测。它能在同一时间内分析大量的基因，实现生物基因大规模检测。
2．2．6 酵母双杂交系统分离克隆基因：酵母双杂交系统体系可以发现蛋白相互作用的蛋白的编码基因。这种方法的用途有：验证已知基因间的相互作用；可以快速发现编码蛋白与蛋白间相互作用的特定区域；通过扫描文库与活化区域的作用可以发现相互所用的蛋白，只需一个质粒就可以直接得到编码蛋白的基因，无需制备抗体和纯化蛋白。操作相对简便、快速，不用经过蛋白纯化即可获得编码基因。
2．2．7功能蛋白组分离目的基因：蛋白组是指细胞内全部蛋白的存在及活动方式，即基因组表达产生的总蛋白质的统称。功能蛋白质组是指那些可能涉及到特定功能机理的蛋白质群体。主要研究方法为蛋白质双向电泳。通过高效液相色谱对蛋白质序列进行分析，在借用分子生物学的手段则可以进行目的基因的分离。如免疫筛选法分离目的基因：是通过蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的基因的蛋白基因。
2．2．8插入突变分离克隆目的基因：获得突变体进行未知基因的克隆是常用的方法之一。转座子标签法是将一株携带有功能性转座系统的植物与遗传上有差异的同种植物杂交，因转座因子插入到某一特定的基因序列而破坏了该基因编码的蛋白，进而导致可见的表性的破坏或改变，这样就可以在产生后代中筛选出新型的突变体。
2．2．9 生物信息学在分离克隆基因中的应用：生物信息学是在生命科学的研究中，以计算机为工具对生物信息进行储存、检索、和分析的科学。基因组信息学的首要任务之一就是发现新的基因核心的功能，是发现新基因的重要手段。如利用EST数据库发现新基因（电脑克隆）：寻找到与克隆有关的EST后，用电子cDNA文库进行筛选；通过生物信息学软件进行分析和查询，最终获得一个基因的全长cDNA。
除上述几种基本的方法外，随着生物技术的发展和传统技术的改良，基因可隆的方法又有许多新的技术出现。如Gateway 大规模克隆技术。基因表达序列标记分析（SAGE）；由DDRT-PCR演变而来的代表性差异分析（RDA）；抑制型差减杂交（SSH）——基于反转录的双接头扣除的差异分析；转录活动的DNA 差减杂交技术（TADSH）、利用限制性片段多态性的cDNA-AFLP等等。这些技术作为基因分离可隆的方法，较以前的技术都具有一定的优点，又有各自的不尽相同的用途。
3．基因克隆
基因的克隆
和分离是重组
DNA技术中基本
和重要的部分，没
有克隆化基因就
无法开展基因工
程研究，基因的克
隆首先通过构建
文库，使每个基因
（或DNA片段）
形成一个可扩增
的克隆，然后通过
筛选找到目的基因。
基因克隆基本操作示意图3．1 采用各种方法从复杂的生物体基因组中分离获得带有目的基因的DNA片段。获取的方法：①用限制性内切酶酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。②分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。③人工体外合成基因：用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。④PCR 法扩增基因：用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。
3．2 在体外，将它连接到具有自我复制功能及筛选标记的载体分子上，构建重组DNA分子（也称重组体）。
3．3 将重组体转移到宿主细胞，并随之繁殖而扩增
3．4 从细胞繁殖群体中筛选获得重组体的受体细胞克隆（也叫重组子）。从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性
克隆的过程就是筛选。方法有①插入失活法②PCR筛选和限制酶酶切法
④核酸分子杂交法⑤免疫学筛选法
3．5再提取或筛选扩增的目的基因，以做进一步的分析鉴定。阳性重组体的筛选可利用载体上的遗传标志，包括抗药性、氨基酸合成酸系和颜色反应等。重组DNA的鉴定有多种方法，如限制性酶切图谱、DNA测序，Southern印迹杂交、Northern印迹杂交等，可根据情况酌情使用。
3．6将目的基因克隆到合适的表达载体上，导入宿主细胞，构建高效、稳定的具有功能性表达能力的基因工程细胞。
3．7利用工程技术大规模培养，获得大量的外源基因表达产物。
3．8 产物的分离纯化，并最终获得所需的基因工程产物。
4．基因克隆技术的表达系统。
利用基因克隆技术产生体内用重要价值的生物产品（如蛋白质），是通过将外源基因与表达载体构成的DNA重组体导入受体细胞中高效表达实现的。其表达系统有原核和真核表达系统两大类。
4．1 外源基因在原核细胞中的表达就是使克隆的外源基因在原核细胞中以发酵的方式快速、高效地合成基因产物。
4．2 在真核中的表达系统包括酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞的表达系统。
基因克隆技术具体操作及表达以微生物基因克隆为例简介！
二、基因克隆技术早期开创性研究成就和近来的研究成果
基因克隆技术包括了一系列技术，它大约建立于70年代初期。美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人于1972年把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，从此产生了基因克隆技术。1973年，科亨（Cohen）和波伊尔(Boyer)发明了克隆技术，成功地将外源基因转入大肠杆菌细胞并得以表达。从那以后，便迅速发展。如大脑生长激素释放抑制素、胰岛素原前体因子、人胰岛素A与B链基因、人生长激素、干扰素、人尿激酶基因、口蹄疫与狂犬病疫苗等基因的克隆，以及改良品种。
近期的研究成果主要在农业、畜牧业和医药方面取得丰硕成果：如农业上已能培育携带人某些基因、抗病、虫、逆境和高产量高蛋白等的转基因植物。畜牧业上以培育转基因动物为主。医药上已能生产各种生物制品和蛋白质、氨基酸等。
1、微生物的基因克隆
自然界下，微生物大多是通过无性繁殖而形成群体的克隆。微生物基因克隆包括四大要素及其操作步骤。要素：外源目的基因、克隆载体、工具酶和宿主受体细胞。主要步骤为分离或合成基因，体外重组将基因插入载体，重组DNA 导入受体细胞，基因克隆和筛选重组子，克隆的基因进行鉴定或测序和外源基因的表达和基因产物的获得。指对微生物基因进行在基因水平上进行遗传改造。
1．1微生物基因克隆的工具酶
对DNA 片段进行操作，必须要运用能“切断”DNA 的得心应手的工具。工具酶就是对不同来源的DNA 片段进行切割拼接组装。在分离目的基因或切割载体时，需利用特异的限制性核酸内切酶对DNA 进行准确切割。在构建重组DNA 时，需要DNA 连接酶催化，使目的DNA 片段与载体DNA 进行连接。
1．1．1限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶：是指能识别双链DNA 分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA 的一类内切酶。在细菌细胞内限制性酶可以降解外源的DNA 分子，而细菌DNA 甲基化，可以避免本身DNA 分子被酶降解。这是生物的保护机制。
1．1．2DNA 连接酶
将不同的DNA 片段连接在一起的酶叫DNA 连接酶。DNA 连接酶主要来自T 4噬菌体和大肠杆菌。DNA 连接酶主要有两种：一种是T4 DNA 连接酶，另一种是大肠杆菌DNA 连接酶。
1．2微生物基因克隆载体
克隆载体是把一个有用的目的DNA 片段通过重组DNA 技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。其基本要求是：①能进行独立自主复制；
②具有便于外源DNA 的插入和限制酶作用的单一切割位点；③必须具有可供选择的遗传标记，例如具有对抗生素的抗性基因，便于对阳性克隆的鉴别和筛选。基因克隆中使用的载体基本上均来自微生物，主要包括七大类：1．2．1 质粒克隆载体质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，经人工修饰改造后作为克隆载体。大肠杆菌质粒pBR322 是基因克隆中最常用的代表性质粒，是环状双链DNA分子。
1．2．2 λ噬菌体克隆载体是基因克隆中一类有价值的克隆载体。
1．2．3 柯斯质粒载体即粘粒载体，是由λ噬菌体的粘性末端和质粒构建。
1．2．4 M 13 噬菌体载体M 13 是大肠杆菌丝状噬菌体。
1．2．5噬菌体质粒载体是由丝状噬菌体和质粒载体DNA 融合而成，在寄主细胞内以质粒形式存在，复制产生双链DNA 。
1．2．6真核生物的克隆载体：
1．2．6．1酵母质粒载体是利用酵母的2μm 质粒和其染色体组分与细菌质粒pBR322 构建而成的，能分别在细菌和酵母菌中进行复制，所以又称为穿梭载体。
1．2．6．2真核生物病毒载体如哺乳动物、昆虫、植物病毒载体
1．2．7 人工染色体是一类目前能容纳最大外源DNA 片段人工构建的载体。
1．3．微生物人为克隆载体的宿主
为了保证外源基因在细胞中的大量扩增和表达，选择合适的克隆载体宿主就成为基因克隆的重要问题之一。
1．3．1 作为宿主的基本要求特性
一个理想的宿主的基本要求是：①能够高效吸收外源DNA ；②具有使外源DNA 进行高效复制的酶系统；③不具有限制修饰系统，不会使导入宿主细胞内未经修饰的外源DNA 发生降解；④一般为重组缺陷型菌株，使克隆载体DNA 与宿主染色体DNA 之间不发生同源重组；⑤便于进行基因操作和筛选；⑥具有安全性。宿主细胞应该对人、畜、农作物无害或无致病性等。
原核生物的大肠杆菌及真核生物的酿酒酵母，由于它们具有一些突出优点如生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中生长，其遗传学及分子生物学背景十分清楚，因此已成为当前基因克隆宿主。
1．3．2 外源DNA 导入宿主细胞
1．3．2．1外源DNA 导入原核微生物细胞外源DNA 通过转化、转染以及感染等方式被导入原核生物细胞。
1．3．2．2外源DNA 导入真核微生物细胞
外源DNA 导入真核微生物细胞，一般利用蜗牛酶除去酵母细胞壁形成原生质体，再用CaCl2和聚乙二醇处理，重组DNA 以转化方式导入酵母细胞的原生质体，最后将转化后的原生质体置于再生培养基的平板中培养，使原生质体再生出细胞壁形成完整酵母细胞。
1．3．3 基因文库与cDNA 文库的构建
利用重组DNA 技术，可将某一原核微生物或真核微生物染色体基因组的全部遗传信息贮存在由重组体群体（如重组噬菌体群体）构成的基因文库（genomic library ）或cDNA 文库（cDNA library ）之中，以供长期贮存和随时调取克隆基因使用。
1．3．3．1基因文库的构建
所谓基因文库是指生物染色体基因组各DNA 片段的克隆总体。文库中的每一个克隆只含基因组中某一特定的DNA 片段。一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息即全部DNA 序列。构建的简单步骤：①从组织或细胞提取基因组DNA ；②用限制性酶部分水解或机械剪切成适当长度的DNA 片段，经分级分离选出一定大小合适克隆的DNA 片段；③通常采用λ噬菌体或柯斯质粒载体等容载量较大的克隆载体，在适当位点将载体切开；④将基因组DNA 片段与载体进行体外连接；⑤重组体DNA 直接转化细菌或用体外包装的重组λ噬菌体颗粒感染敏感细菌细胞。最后得到携带重组DNA 的细菌群体或噬菌体群体即构成基因文库。
1．3．3．2 cDNA 文库的构建
所谓cDNA 文库是指生物体全部mRNA 的cDNA 克隆总体。其每一个克隆只含一种mRNA 信息。构建步骤：①从生物体或细胞中提取mRNA ；
②利用逆转录酶以寡聚或随机寡聚核苷酸为引物合成cDNA 的一条链；③利用DNA 聚合酶I ，以第一条链作为模板，用适当引物合成第二条链，常用RNA 酶H 在杂交分子的mRNA 链上造成切口和缺口，产生一系列RNA 引物，或是除去杂交分子的mRNA 后，加入随机引物，即可合成第二条链；④与载体的体外连接；⑤噬菌体的体外包装及感染或质粒的转化。由于它不含基因的启动子和内含子，因而序列比基因短，其克隆载体可选用质粒或病毒载体。
1．3．4重组体的筛选与鉴定
在构建文库之后就需要从众多的克隆中，筛选出含有目的基因的重组体，并鉴定其正确性。这通常有三种鉴定方法
1．3．4．1重组体表型特征的鉴定：①抗生素平板法、②插入失活法③插入表达法④β - 半乳糖苷酶显色反应法
1．3．4．2重组DNA 分子结构特征的鉴定①菌落（或噬菌斑）原位杂交②内切酶图谱鉴定③PCR 鉴定④DNA 序列测定
1．3．4．3外源基因表达产物的鉴定：①表达产物免疫活性测定②表达产物生物活性检查③表达产物氨基酸序列测定
1．4表达载体的构建
所谓表达载体是指宿主细胞基因表达所需调节控制序列，能使克隆的基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。原核生物和真核生物的表达载体有一些共同的要求，但两者的基因表达调控机制有很大不同，故需要分别采用原核生物和真核生物的调控原件来构建。当真核生物基因在原核细胞中表达时，表达产物有两种形式：一种是非融合蛋白，另一种是融合蛋白。
1．4．1 表达系统的要求与主要调控元件在用原核细胞表达真核生物基因时，应注意以下三个问题：①基因的编码区必须是连续的，因此要用切除内含子的cDNA ；②基因必须置于原核细胞启动子、终止子和SD 序列的控制之下，才能被宿主的转录与翻译系统有效识别；③产生的mRNA 必须相对稳定
并能有效进行翻译和蛋白质折叠。此外还要防止外源蛋白被宿主蛋白酶降解。主调控元件如下：
1．4．1．1启动子指RNA 聚合酶结合于DNA 并起始合成RNA 的一段DNA 控制序列。原核基因启动子位于转录起点上游（左侧），它由两段彼此分开且又高度保守的核心序列组成。
1．4．1．2核糖体结合位点
1．4．1．3转录终止子指一段位于基因或操纵子的３＇末端，具有终止转录功能的特定DNA 序列。
1．4．1．4密码子的偏爱性由于密码子的简并性，一个氨基酸可有多个密码子。
1．4．2表达载体中调节开关的作用在原核基因表达调控中，阻遏蛋白－操纵基因系统起着重要调节开关的作用。当阻遏蛋白与操纵基因相结合时，能够阻止基因的转录。加入诱导物，使其与阻遏蛋白结合，解除阻遏，从而启动基因转录。
1．4．3 非融合蛋白的表达所谓非融合蛋白是指外源蛋白不与宿主蛋白融合，使其自身单独表达。
1．4．3．1非融合蛋白表达载体为了在原核细胞中表达这非融合蛋白，可将带有起始密码子的真核基因插入到合适的原核启动子和SD 序列下游。经转录和翻译，就可在原核细胞中，表达出非融合蛋白。
1．4．3．2 外源蛋白的分泌表达如果合成的外源蛋白能不断从细胞内分泌出来，不仅可免受宿主细胞中蛋白酶的降解，而且有利分泌。
1．4．3．3包涵体当外源蛋白在大肠杆菌高水平表达时，常常在细胞质内聚集而形成包涵体。在于提高外源蛋白的表达水平和对产物的纯化。
1．5 融合蛋白的表达
所谓融合蛋白是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的杂合蛋白。
1．5．1融合蛋白的表达载体为了获得正确编码的外源蛋白，外源基因编码区在插入表达载体中原核基因编码区时，阅读框架应保持一致，翻译时才不会产生移码突变。
1．5．2表达融合蛋白的优点融合蛋白较易获得高效表达。融合蛋白的N 端总选择天然的高效表达的宿主蛋白质，其mRNA 具有较强的翻译能力。融合蛋白在细胞内比较稳定。
1．5．3 融合蛋白中目的蛋白的分离纯化①酶法。②化学法
微生物的基因克隆主要应用于优良菌种的保存和发酵工程生产抗生素等生物制品。将在下文介绍。
2、植物的基因克隆
由于植物发育，生理生化，分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识，运用先进的酶学和生物学技术及植物基因工程中的基因添加、基因消减等方发，已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆境、不育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。其基本原理和微生物基因克隆大体相同。其策略与方法有：
2．1功能克隆
就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆。特点是用基因表达的产物蛋白质来克隆基因、虽然某一性状的编码基因是未知的。如果对其生理生化及代谢途径研究的比较清楚,就可以分离和纯化控制该
性状的蛋白质。因此功能克隆的关键是分离出一个纯度很高的蛋白质。目前已构建了天麻cDNA文库,制备抗体探针成功地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因的cDNA克隆,为抗真菌基因在农业、医药等方面的应用打下了基础2．2 定位克隆
根据遗传连锁分析,染色体步移将基因定位到染色体的一个具体位置上后不断缩小筛选区域进而克隆该基因,研究该基因的功能或抗性的生化机制。可将与已知的某一DNA标记连锁的基因在染色体上定位。用这种方法已分别克隆到拟南芥菜、番茄、水稻等植物中的有关抗病基因
2．3转座子标记法
转座子是可从一个基因位置转移到另一位置的DNA片段。通过转座子上的标记基因(如抗药性等)就可检测出突变基因的位置和克隆出突变基因来。利用转座子克隆植物基因的操作步骤主要应是以下几方面：①把已分离得到的转座子与选择标记构建成含转座子的质粒载体。②把转座子导入目标植物。③利用Southern 杂交等技术检测转座子是否从载体质粒中转座到目标植物基因组中。这是转座子定位和分离目标基因所不可缺少的。④转座子插入突变的鉴定及其分离。目前已在玉米、烟草、番茄、亚麻等植物中克隆出抗性基因
2．4人工合成并克隆基因
蜘蛛毒素是一种小肽，它只有37个氨基酸，体外实验表明它能杀死多种对农作物有害的昆虫基因。可根据蜘蛛毒素的氨基酸序列，采用植物偏爱密码子、人工合成并克隆此肽的基因。
2．5表型克隆
有些植物目前并不了解它的基因产物，也没有对它们进行基因定位，但已知植物在表型上存在差异，利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆植物基因就是表型克隆。表型克隆在策略上试图将表型与基因结构或基因表达的特征联系起来，从而分离特定表型相关基因，力求不必事先知道基因的生化功能或图谱定位，根据基因的表达效应就直接分离该基因。已从拟南芥中克隆出赤霉素合成酶基因。
2．6 mRNA差异显示
研究基因表达差异,研究两基因组差异表达基因的分离，为克隆复杂性状相关基因开辟重要的途径。目前已被成功地用来分离小麦热激蛋白基因和水稻蔗糖调节基因。
2．7 减法杂交植物在生长发育过程中不同组织或同一组织的不同发育阶段，由于基因特异性的表达，其mRNA表现不同，这样从表达特异基因的组织中提取mRNA，反转录为cDNA，从无特异基因表达的组织中提取mRNA，两者杂交，在表达特异基因的组织和无特异基因表达的组织中均表达的基因产物形成杂交分子，而特异mRNA转录的cDNA仍保持单链状态，把这种单链cDNA 分离出来即为差异表达的基因。用此技术已克隆了小麦春化相关基因。
2．8PCR扩增克隆
目前已在玉米、水稻、向日葵、巴西豆等植物中分离出富含甲硫氨酸的蛋白及其编码基因。
2．9依据序列同源性克隆基因
生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列。此方法的基本作法是在其它种属的同源基因被克隆的前提下，构建cDNA文库或基因组文库，然后以已知的基因序列为探针来筛选目的克隆。
3、动物的基因克隆
动物基因克隆技术与微生物和植物基因克隆的基本原理与技术方法大体相同。目前主要是动物转基因技术和动物克隆技术的有机结合，以培育转基因动物和基因打靶克隆动物为主。
3．1 转基因动物：指将确定的外源基因（如人的各种基因）通过生殖细胞或早期胚胎导入动物个体的染色体上并能稳定遗传给后代的动物。在其上进行基因操作即为动物转基因技术。
3．2 基因打靶技术。指建立在同源重组、转基因技术、胚胎干细胞培养技术和体细胞培养技术基础上的一种综合技术。即用人们所设计的一段DNA对准靶基因，对目的基因进行剔除、修饰，改变生物体遗传信息，产生新一代转基因动物。
其中涉及动物的克隆主要有胚胎分割、人工受精与胚胎移植、胚胎干细胞核移植、动物胎儿成纤维细胞核移植、体细胞核移植、雌核生殖。其具体应用在下文介绍…
三、基因克隆技术的具体应用及发展方向
基因克隆的广阔应用前景大致可分为两大类：
1．繁殖性克隆：以获得克隆动物为目的的研究方向。
1.1基因克隆技术与遗传育种：主要表现在农作物和动物方面。服务农、林、渔、畜牧业：
农作物方面主要克隆培养能改善光合作用、充分固氮、高产量、高蛋白含量、维生素、延缓衰老、且抗病、害虫、逆境（旱、寒、酸、碱、盐等）、除草剂等抗性基因作物并改良品种，加速繁殖等，另外改善植物营养成分（如氨基酸、糖、脂类、维生素、微量元素等），植物生物反应器等应用也付与实践。动物方面加速动物繁殖及物种优化，如近交动物、无特定病原动物、基因敲除动物等。另外，打破种间隔离，如加速鱼类、骡等优良畜种的培育。利用基因的克隆技术，可满足人们对畜产品的皮、毛、肉等和实验研究动物的需求，即利于开展对生长、发育、衰老和健康的机理及疾病预防、治疗等方面的研究。
1.2 转基因动植物的培育：
指在基因组中稳定地整合了人工导入的外源基因的动、植物。外源（目的）基因包括各种动物的生长激素基因、人生长素基因、人胰岛素基因、抗冻蛋白基因、珠蛋白基因、白血病病毒等多种基因。利用转基因动、植物，我们可以加快家畜及作物品种的改良速度，提高肉奶蛋等食物品质，生产珍贵药用蛋白等。目前，利用动物生物反应器生产的药用蛋白已逐渐增多，其中有在血液中表达人血红蛋白的转基因猪；在乳汁中表达α—抗胰蛋白酶的转基因绵羊和表达人抗凝血酶Ⅲ、人组织纤溶酶原激溶剂的转基因山羊和表达人乳鉄蛋白的转基因牛等等。另外，现已培育出能生产携带胰岛素、干扰素、人血蛋白等基因的转基因植物，转基因植物在前文已述。
1.3 医学上的应用：
主要是同种或异种器官移植、进行生物制品和蛋白、中药、化学药物的生产以及生物遗传疾病的预防、治疗和研究等。
同种发面：利用克隆技术培植人体皮肤进行植皮手术，尤其适用于皮肤大面积受损的患者；异种方面：先介绍基因敲除，转基因过程中，外源基因插入到染色体中可能导致某内源基因失活，形成某一基因功能缺失的转基因动物的研究基因结构与功能的方法。将已引起人排异反应的猪细胞膜上的一种糖（α—1，3—
半乳糖）用基因敲除方法培育基因敲除克隆猪，或将人的基因导入其受体用于器官移植。微生物基因克隆主要培养优良菌株，用于发酵工程生产抗生素、干扰素、胰岛素、激素类、生长因子、粒细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子、各种疫苗、单克隆抗体（生物导弹）等生物制品的开发与生产。总之，基因克隆技术潜力巨大，将为医学上展示无比的贡献。
1．4基因克隆和DNA分析在法医学和考古学中的应用
1.4.1 利用DNA分析鉴定犯罪嫌疑人
1.4.2 利用DNA指纹图谱分析血缘关系
1.4.3 通过DNA分析进行性别鉴定
1.4.4 古遗传学——利用DNA研究人类进化
1. 5特殊动物基因资源的保护。
1.5.1 珍稀动物保护如濒危物种大象、犀牛、野生虎、大猩猩、熊、美国野黄牛、大熊猫及鸟类，若能留下已灭绝的动物的组织或细胞，就能通过克隆的技术来挽救或再生。但濒危物种的保护更重要的是靠人类环境意识的提高，加强对动物生存环境的保护，同时要对那些偷猎者们进行严厉的打击。克隆技术仅仅只是挽救的一种弥补措施。
1.5.2 有实验表明，去核的卵母细胞对体细胞的重新编程无种属差异，且可支持胚胎发育。这成为异种克隆的依据。如利用去核的兔卵母细胞进行大熊猫异种克隆等，目前我国科学家已取得一定的进展。
1.6 建立动物模型，制备医用实验动物。
它是进行药理学、毒理学、发育生物学等研究必备的某型。得到相同遗传背景的一群同基因动物，将缩短研究周期，早日为医学服务。
1.7 生物学基础研究
总所周知，21世纪是生物的时代，许多科学家已在生物学基础研究上为人类及动物医学做出了突破性的贡献，获得了诺贝尔医学或生理学奖。。
2. 治疗性克隆。
基因克隆技术与人胚胎干细胞技术和基因打靶技术等相结合，就有可能用患者本人的细胞在体外培育出所需的细胞、组织、甚至器官，以替换或修补损伤的器官等，而不产生免疫排斥反应。利用核移植技术生产用于组织和细胞替代治疗的人类胚胎细胞，其最终目的是用于干细胞治疗，而非得到克隆个体。ES细胞是具有形成所有成年细胞类型潜力的全能细胞，可使之定向分化获得如神经细胞、肌肉细胞、血细胞等细胞类型。
四、基因克隆技术意义与展望
基因克隆技术最成功的成就，是用于治疗和预防的新型生物药物的研制、生产和应用，无疑是基因技术在医学领域中最具革命性的开创和应用。目前基因治疗已用于临床，为人类疾病治疗带来了福音。基因克隆技术已在农业、畜牧业、制药方面取得丰硕成果，为国民经济的发展带来了巨大效益，给人类进步带来新的契机及社会效益。相信在医学的人类疾病相关基因的识别和鉴定，法医学，食品，化工，轻工，能源和环保等实际应用方面会有所突破，其诱人前景是让人难以抵挡的。
五、结论
纵观基因克隆技术的发展史以及中外国家的研究进展，可发现基因克隆技术虽处在理论前沿阶段，但其技术却是在不断成熟、完善之中。从其操作工具、方法与技术、步骤、微生物和动植物的基因克隆过程要点、应用与发展方向及其展
望方面开看，她都是一个既活跃又有吸引力科学研究领域。本课题已展示了最基本的技术方法及应用，而科学的探索是永无止境的，我们应有孜孜不倦的求知精神，在生物学科学领域研究上敢于创新，永不止步！！
六、谢辞
本论文在撰写过程前后参阅了一些书籍和文献，摘引了一些文字及数据，其本意尽可能忠于原作者。同时得到了指导者余潮老师的悉心指引和帮助，谨在此对原作者及指导教师表示衷心感谢！
由于本人尚处于本科学识阶段，水平有限，论文肯定存在缺点和错误，诚恳希望导师或答辩组批评指正。
参考文献
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基因克隆及转基因方法
基因克隆及转基因 一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物 软件是https://www.wendangku.net/doc/c612270542.html,sergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何； （如果克隆的话不能满足条件也没办法。） 不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。 步骤： 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR： 20ul体系：灭菌水13.8ul，若模板为质粒灭菌水14.3ul； 2.5mMdNTP2.0ul；
4植物基因克隆的策略与方法
4植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1功能克隆(functional Cloning) 功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针 从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因 缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该
整个基因克隆实验流程(完整)
一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液 氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管， 加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min 晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。
拟南芥基因克隆的策略与途径
拟南芥基因克隆的策略与途径 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序 已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物 的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字 花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各 国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功 能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的 几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms. 图位克隆（map-based clonig）又称定位克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化机制。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
基因组拷贝数变异及其突变机理与人类疾病
HEREDITAS (Beijing) 2011年8月, 33(8): 857―869 ISSN 0253-9772 https://www.wendangku.net/doc/c612270542.html, 综 述 收稿日期: 2011?04?07; 修回日期: 2011?06?03 基金项目:国家自然科学基金项目(编号: 30890034, 31000552), 教育部新世纪优秀人才支持计划项目(编号: NCET-09-0322)和上海市浦江人才 计划项目(编号: 10PJ1400300)资助 作者简介:杜仁骞, 在读博士研究生, 研究方向: 基因组拷贝数变异。E-mail: renqian.du@https://www.wendangku.net/doc/c612270542.html, 通讯作者:张锋, 博士, 副教授, 博士生导师, 研究方向: 人类遗传学和医学遗传学。E-mail: feng.fudan@https://www.wendangku.net/doc/c612270542.html, DOI: 10.3724/SP.J.1005.2011.00857 基因组拷贝数变异及其突变机理与人类疾病 杜仁骞1,2, 金力1,2,3, 张锋1,2 1. 复旦大学生命科学学院现代人类学教育部重点实验室, 上海200433; 2. 复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室, 上海200433; 3. 复旦大学生物医学研究院, 上海200032 摘要: 拷贝数变异(Copy number variation, CNV)是由基因组发生重排而导致的, 一般指长度为1 kb 以上的基因 组大片段的拷贝数增加或者减少, 主要表现为亚显微水平的缺失和重复。CNV 是基因组结构变异(Structural variation, SV)的重要组成部分。CNV 位点的突变率远高于SNP(Single nucleotide polymorphism), 是人类疾病的重要致病因素之一。目前, 用来进行全基因组范围的CNV 研究的方法有: 基于芯片的比较基因组杂交技术(array-based comparative genomic hybridization, aCGH)、SNP 分型芯片技术和新一代测序技术。CNV 的形成机制有多种, 并可分为DNA 重组和DNA 错误复制两大类。CNV 可以导致呈孟德尔遗传的单基因病与罕见疾病, 同时与复杂疾病也相关。其致病的可能机制有基因剂量效应、基因断裂、基因融合和位置效应等。对CNV 的深入研究, 可以使我们对人类基因组的构成、个体间的遗传差异、以及遗传致病因素有新的认识。 关键词: 拷贝数变异; 突变机理; 疾病; 人类基因组 Copy number variations in the human genome: their mutational mechanisms and roles in diseases DU Ren-Qian 1,2, JIN Li 1,2,3, ZHANG Feng 1,2 1. MOE Key Laboratory of Contemporary Anthropology , School of Life Sciences , Fudan University , Shanghai 200433, China ; 2. State Key Laboratory of Genetic Engineering , School of Life Sciences , Fudan University , Shanghai 200433, China ; 3. Institutes of Biomedical Sciences , Fudan University , Shanghai 200032, China Abstract: Copy number variation (CNV) is the main type of structure variation (SV) caused by genomic rearrangement, which mainly includes deletion and duplication of sub-microscopic but large (>1 kb) genomic segments. CNV has been recognized as one of the main genetic factors underlying human diseases. The mutation rate (per locus) of CNV is much higher than that of single nucleotide polymorphism (SNP). The genome-wide assays for CNV study include array-based comparative genomic hybridization (aCGH), SNP genotyping microarrays, and next-generation sequencing techniques. Various molecular mechanisms are involved in CNV formation, which can be divided into two main categories, DNA re-combination-based and DNA replication-based mechanisms. CNVs can be associated with Mendelian diseases, sporadic diseases, and susceptibility to complex diseases. CNVs can convey clinical phenotypes by gene dosage, gene disruption, gene fusion, and position effects. Further studies on CNVs will shed new light on human genome structure, genetic varia-tions between individuals, and missing heritability of human diseases. Keywords: copy number variation; mutational mechanism; diseases; human genome
基因克隆的几种常见方法
基因克隆得几种常见方法 基因（gｅｎe)就是遗传物质得最基本单位,也就是所有生命活动得基础。不论要揭示某个基因得功能,还就是要改变某个基因得功能,都必须首先将所要研究得基因克隆出来。特定基因得克隆就是整个基因工程或分子生物学得起点。本文就基因克隆得几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列得基因克隆就是基因克隆方法中最为简便得一种。获取基因序列多从文献中查取，即将别人报道得基因序列直接作为自己克隆得依据。现在国际上公开发行得杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及得基因序列在基因库中注册，拟发表得文章中仅提供该基因在基因库中得注册号(acｃｅssion numｂer）,以便别人参考与查询。目前，世界上主要得基因库有１）EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室得基因库，其网上地址为; （2)Genbank，为设在美国国家卫生研究院(ＮIＨ）得基因库，其网上地址为;（3)Swｉssport与TＲEMBＬ,Swissport就是一蛋白质序列库,其所含序列得准确度比较高,而TREMBＬ只含有从EＭBＬ库中翻译过来得序列。目前,以Geｎbａnk得应用最频繁。这些基因库就是相互联系得,在Genbank注册得基因序列,也可能在Swisspoｒt注册。要克隆某个基因可首先通过Inｔeｒnet查询一下该基因或相关基因就是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都就是免费得,因而极易将所感兴趣得基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异得引物，通过PＣＲ从基因组中克隆该基因,也可以通过RＴ-PCＲ克隆cＤNA。值得注意得就是,由于物种与分离株之间得差异,为了保证PＣR扩增得准确性,有必要采用两步扩增法,即neｓted PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质得基因扩增出来。在基因文库中注册得蛋白质序列都可以找到相应得ＤNA或cDNＡ序列。如蛋白质序列就是自己测定得，那么需要设计至少１对简并引物(dｅgｅneｒated ｐrimeｒ),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆得基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物得特异性。 另外,在基因克隆之后，如还要进一步做表达研究，所使用得PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶，而采用其她有自我检测（reading proｏf)功能得酶,如pfｕ。这样可以避免由于扩增过程中出现得点突变或终止密码子而导致整个研究结论得错误。 ２根据已知探针克隆基因 这也就是基因克隆得一种较直接得方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理得基因组DNＡ杂交,最后将所识别得片段从胶中切下来，克隆到特定得载体（质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中得拷贝数。
基因克隆的几种常见方法
基因克隆的几种常见方法 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession number),以便别人参考和查询。目前,世界上主要的基因库有1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为 https://www.wendangku.net/doc/c612270542.html,/ebi-home.html;(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为 https://www.wendangku.net/doc/c612270542.html,/web/search/index.html;(3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物种和分离株之间的差异,为了保证PCR 扩增的准确性,有必要采用两步扩增法,即nested PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引物(degenerated primer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。 另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。 2 根据已知探针克隆基因 这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。但在探
基因克隆和表达
Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.wendangku.net/doc/c612270542.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006
项目名称∶水稻细菌性条斑菌致病基因的克隆与功能分析
项目1 项目名称：水稻细菌性条斑菌致病基因的克隆与功能分析 申请教师：孙文献 职称：教授 联系电话： 电子邮箱： 项目概况： 水稻细菌性条斑病, 简称细条病，是我国长江流域及南方稻区的主要病害之一。该病主要为害叶片。该病的病原为Xanthomonas oryzae pv.oryzicola （Xoc）称稻生黄单胞菌条斑致病变种。该病原与水稻上另一个重要病原细菌白叶枯菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）同属于黄单胞杆菌属，但为不同的致病变种。虽然Xoo与Xoc在遗传、生理生化性状与外部形态上非常相似，但是，它们在致病性与致病机理上有显著的差异，Xoc通过叶片气孔侵染，而Xoo则通过叶片边缘的水孔侵染。另外，目前在水稻基因资源中找到许多抗Xoo的抗性基因，而很少有Xoc抗性基因的报道。对Xoc致病基因的挖掘将对控制该病害有着重要的理论与应用价值。 预测在细条病菌致病中起重要作用的因子有几类：由三型分泌系统分泌的效应因子，由II型分泌系统分泌的胞外酶与胞外多糖，以及与产生DSF和c-di-GMP信号分子相关的基因及由其调控的基因。然而，这些基因如何调控基因表达，如何在致病过程中起作用？目前，仍然未知。该项目将首先利用同源重组敲除Xoc致病相关基因，获得Xoc基因缺失突变体，鉴定突变体的表型与对水稻的致病性，推测这些基因在致病性中的作用；其次，利用GUS 酶活反应或者RT-PCR研究突变体中一些已知的重要调控基因的表达情况，了解并归纳致病基因的信号传导途径；最后，通过转基因技术，在水稻或拟南芥植物中表达Xoc的致病效应因子，研究效应因子在植物中对抗病反应的抑制作用。综合以上几方面，初步阐明Xoc的致病的分子机理。深入研究Xoc致病相关基因将对制定一套对细条病的防控措施有很好的指导意义；并有可能针对性地选择杀菌剂或抗生素的准确靶标。 项目2 项目名称：番茄SlHIR1基因的分离及其在疮痂病过敏反应中的功能初探 申请教师：杨文才 职称：教授 联系电话： 电子邮箱： 项目概况： 番茄疮痂病(bacterial spot)是由黄单胞杆菌属(Xanthomonas)的多个种引起的一种细菌性病害。在我国，该病平均发病率为10-20%，重病区达46-100%；平均减产20-30%，重
基因克隆基本实验方法
重组质粒的连接、转化及筛选 第一节概述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。 外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种： 1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。 2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。 3、带有平末端是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA 浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。 特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。 本实验所使用的载体质粒DNA为pBS,转化受体菌为E. coli DH5α菌株。由于pBS上带有Ampr 和lacZ 基因,故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α-互补现象筛选相结合的方法。 因pBS带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pBS DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。 pBS上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pBS和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为α-互补现象筛选。 第二节材料、设备及试剂 一、材料 外源DNA片段: 自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知; 载体DNA: pBS质粒(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互补能力的菌株。 二、设备 恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，电热恒温培养箱，电泳仪无菌，工作台，微量移液枪，eppendorf管。 三、试剂 1、连接反应缓冲液(10×)：0.5mol/L Tris·Cl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫苏糖醇(DTT)(过滤灭菌），500μg/ml 牛血清清蛋白(组分V.Sigma 产品）（可用可不用），10mol/L A TP（过滤灭菌）。 2、T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。 3、X-gal储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20℃。 4、IPTG储液(200mg/ml): 在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。
基因克隆方法步骤
克隆步骤 一、目的片段的回收纯化 1．柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500ul 平衡液BL,12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）。 2．将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。 3．向胶块中加入加入溶液PC(0.1g加入100ul，注意没过胶块)，50℃水浴放置10min左右，期间不断温和地上下翻转离心管，已确保胶块 充分溶解。 4．将上一步所得溶液加入一个吸附柱（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收 集管中。 5．向吸附柱CB2中加入600ul漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 重新放回收集管中。 6．重复步骤5. 7．将吸附柱CB2放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。 8．将吸附柱CB2放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加40ul的无菌水。室温放置2min，12000rpm离心2min， 收集DNA溶液。(可以将离心后的溶液重新加到柱子中再回收一次) 9．取2ulDNA加入loading buffer点样，电泳检测是否回收出来样品。 二、目的片段与载体的连接 1. 将回收的目的片段与T 载体连接，反应体系如下： 目的片段 4 .5μL pMD19-T simple Vector 0.5μL SolutionⅠ 5 μL Total 10 μL
gfp基因的克隆与表达
基因工程实验设计 题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达 专业：生工1001 ：会淼 2013年3月13 实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 实验方法; 通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。 1.材料与方法： 1.1.1 实验材料 克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性切酶 Bam H1、 Not Ⅰ 1.1.2 仪器设备 Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管 1.1.3 试剂及溶液 分装后于121 ℃高压灭菌20 min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）； 溶液Ⅰ 50 mL 葡萄糖50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L 121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存； 溶液Ⅱ 100 mL NaOH 0.2 mol/L
4植物基因克隆的策略与方法
植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它ＤＮA顺序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列，确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆，育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等，19９５;舒群芳等,199７),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。?1功能克隆（funｃtｉonal Cloｎing) 功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆（Colｌis,1995)。其具体作法是：在纯化相应的编码蛋白后构建cDＮＡ文库或基因组文库,DNＡ文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,（2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针，从ｃＤNA入载体表达库中筛选相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst１和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高对
灰质葡萄孢（Bｏtrytiｓ cineｒce)的抗性，在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因经过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性很有意义(Hａin等,１985)。Kondo等198９年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DNA做了克隆和序列分析(Kondo等,1989）。周兆斓等构建了水稻ｃDNA文库，分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的ｃDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化，使害虫因缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucｕmｂer Mｏｓaic virus)（CMV)，并克隆了编码该病毒外壳蛋白的cDNA基因(胡天华等,19８９)。王春香等从感病的烟草叶片中分离纯化了马铃薯x病毒(ｐotato ｖｉruｓ X， pvx）,克隆了完整的马铃薯x病毒外壳蛋白基因，并将外壳蛋白基因转入马铃薯中，以期获得抗pｖｘ病毒的栽培种马铃薯(王春香等,1991)。病毒外壳蛋白（Ｃoａt proteiｎ cp)基因的成功克隆，可使转基因植物中产生病毒外壳蛋白基因介导的抗性(Coat Proteｉn Mediated Rｅsiｓtａnｃｅ CPMR)或病毒ＣP-ＲN Ａ介导的抗性。Vａｎｋａn 报道从真菌中成功的克隆出无毒基因Avr9，可直接利用此基因介导广谱高效的基因工程植物（Van Ｋan 等,１9９1)。我们１9９5年构建了天麻cDＮA文库,制备抗体探针成功地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因的ｃDNA克隆,为抗真菌基因在农业、医药等方面的应用打下了基础(舒群芳等,1995;舒群芳 等,1997)。功能克隆的特点是用基因表达的产物蛋白质来克隆基因、