单核苷酸多态性检测分析技术_高秀丽
遗 传HEREDIT AS (Beijing )27(1):110～122,2005
技术与方法
收稿日期:20040306;修回日期:20040331
作者简介:高秀丽(1976—),女,吉林人,硕士,研究方向:DNA 芯片。 Tel :021-********-8708;E 2mail :gxl-now @https://www.wendangku.net/doc/c415156769.html, 通讯作者:赵建龙(1969—
),男,研究员,博士,研究方向:生物微系统。Tel :021-********-8702;E 2mail :jlzhao @https://www.wendangku.net/doc/c415156769.html, 单核苷酸多态性检测分析技术
高秀丽1,景奉香1,杨剑波2,赵建龙1
(1.中国科学院上海微系统与信息技术研究所,上海200050;2.安徽省农业科学院,合肥230031)
摘 要:单核苷酸多态性(SNP )作为第三代遗传标记已经广泛用于基因作图、疾病相关性分析、群体遗传学及药物研究等领域。文中系统地介绍了目前国内外主要的SNP 检测技术,任何一种SNP 的检测方法都可将之看成由两部分组成,即区分SNP 位点的原理方法和数据的检测分析手段,文章对这两部分做了较详细的介绍,并对SNP 检测技术的发展进行了展望。
关键词:单核苷酸多态性;检测技术
中图分类号:Q524+.3 文献标识码:A
文章编号:0253-9772(2005)01-0110-13
De t e c ti o n f o r Si n gle Nucle oti d e Pol y m o rp his ms
G AO X iu 2Li 1,J I NG Feng 2X iang 1,Y ANG Jian 2Bo 2,ZH AO Jian 2Long 1
(1.Shanghai Institute of Microsystem and In formation Technology Chinese Academy of Science ,Shanghai 200050,China ;
2.Academy of Agricultural Sciences of Anhui Province ,Hefei 230031,China )
Abs t ra ct :As the third generation of genetic markers SNPs (single nucleotide polymorphisms )has been used extentively
in gene mapping ,disease 2correlativity analysis ,population genetics and drug re search.Here methods for detection are reviewed.Most SNP genotyping are a combination of method for interrogating SNPs and analysis tecnique.I t de scribed both parts and give a outlook for detection.
Ke y w or ds :single nucleotide polymorphisms ;detection technology
单核苷酸多态性(single nucleotide polymor 2phisms ,SNPs )主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种,占所有已知多态性的90%以上。SNP 在人类基因组中广泛存在,平均每500～1000个碱基对中就有1个,估计总数可达300万个甚至更多[1]。SNP 所表现的多态性只涉及
到单个碱基的变异,这种变异可由单个碱基的转换
(transition )或颠换(transversion )所引起,也可由碱基的插入或缺失所致。虽然遗传密码由4种碱基组成,但SNP 通常只是一种二等位基因(biallelic ),或二态的遗传变异,即在该位置上存在两种不同的碱基。
随着人类基因组测序工作的完成,单核苷酸多
态性以其分布广泛、数量众多、易于批量检测等优点作为第三代的遗传标记显示出广阔的应用前景。这种“单核苷酸多态性”是决定人类疾病(尤其是多基因疾病)易感性和药物反应差异性的主要因素,因此可以满足对疾病相关基因定位研究的需要,尤其是对多基因遗传病高精度基因定位的要求。另外,比较物种间SNP 的差异也可以了解物种间的亲缘关系和进化的生物学信息。因此,对SNP 的筛选及其检测正成为研究者们广泛关注的焦点。本文就目前已有的SNP 的检测技术较全面的作了介绍。
目前各种SNP 的检测方法区别很大,但是每种SNP 的检测方法我们都可将之看成由两部分组成
即区分SNP 特异位点的原理方法和数据的检测分
析手段。目前对SNP位点区分主要是通过杂交、PCR、分子构象、酶法等来实现,而信号采集手段主要是利用电泳、荧光、芯片、质谱分析等技术。大多数的SNP的检测方法则是这两部分之间的组合,例如在基于杂交方法区分SNP特异位点的方法中可以用荧光法检测[2]也可以和芯片技术结合进行检测[3]。下面本文就这两个部分分别进行介绍。
1 区分SNP位点的方法
1.1 基于杂交的方法
1.1.1 ASO
基于ASO(Allele2sp ecific oligonucleotide等位基因特异核苷酸片段)杂交基础上对SNP进行分析,主要是依赖于短的核苷酸探针在和互补的目的片段进行杂交时完全匹配和有错配两种情况下杂交复合体稳定性的不同而将SNP位点检测出来。这种方法是通过设计一段短的核苷酸探针(一般15～20bp),其中包括了SNP位点,当其与样品DNA杂交时,由于在20bp中一个碱基的差异会导致Tm 值下降5～7.5度,所以通过严格控制杂交条件,就可以鉴定出样品DNA中是否存在SNP[4]。这是最简单的基于杂交原理的检测方法,而在目前的实验中为了提高杂交的严格性,能更好的区分出SNP位点往往采用修饰过的核苷酸探针和样品DNA杂交,简单的如利用PNA(Peptide nucleic acids,肽核酸)探针[5],但PNA作探针也存在一些问题,如其可溶性差,不易参加反应,探针的长度应至少是7个碱基,以确保在室温下能够较好的杂交,对富含鸟嘌呤罗丹明标记的探针存在本底荧光(FP)信号高的问题等[6]。也有报道在探针内人为的插入错配碱基(32nitropyrrole一种碱基的类似物),用这种含有错配碱基的探针杂交时,探针和目的片段之间一个碱基的差异导致Tm值的下降是传统杂交的2倍,因此,大大提高了杂交的特异性[7]。下面就介绍几种其他的改进方法。
1.1.2 LNA
LN As(locked nucleic acids)是一种合成的核酸类似物,其结构是在R N A分子的2′2羟基和核糖环的4′碳原子间连入一个亚甲基的“桥”,由于“桥”的作用使核糖环处于更利于杂交的稳定构象,所以能以很高的亲和性和互补的DN A、R N A或LN A结合,而这种高的亲和性甚至在有一个错配碱基都会大大降低,因此用此作为探针来检测单核苷酸多态性[8]。
1.1.3 Molecular beacons(分子信标)[9]
分子信标是一种新型的发卡结构的寡核苷酸探针,是在样品PCR过程中因和样品DNA杂交后而使自身荧光构象改变从而实现对SNP的检测(原理见图1)
。
图1 分子信标反应原理图
Fi g.1 Op e rati on of m ole c ula r be a c ons
分子信标由称为“茎”(stem)和“环”(loop)的两部分构成,茎部分是由寡核苷酸探针两端互补的序列形成的,又可称之为手臂,环则是探针的中间部分,其序列和待扩增的目的片段互补并含有要检测的SNP位点。在手臂的两个末端分别通过共价的方式结合上一个荧光分子和一个荧光猝灭基团,这样当分子信标游离在溶液时,它以发卡结构存在,荧光分子与猝灭基团在空间距离上挨在一起,十分接近,荧光分子被猝灭,此时溶液无荧光信号。相反当分子信标和其完全互补的目的片段杂交时,其发卡结构被拉开而使荧光分子和荧光猝灭基团在空间上分开从而发射出荧光,其信号可提高900倍[2]。研究表明这种发卡结构的探针在和目的片段杂交时的特异性很高,对于仅相差一个碱基的目的片段都能够区分,因此用于SNP位点的检测,同时我们可以对分子信标标记以不同的荧光信号,从而能够对多个样品的同时检测。
由于分子信标是在样品PCR过程中的退火时期和目的片段特异性杂交,释放荧光,某一循环或循环后的荧光量取决于那时形成的特异的PCR产物,因此也用于PCR产物产量的实时检测。
1.1.4 Scorpion primer
Scorpion primer也是一种对PCR产物进行检测的方法,其特殊的分子结构决定其是一种单分子
111
1期 高秀丽等:单核苷酸多态性检测分析技术
内的杂交机制,和普通的双分子间的杂交机制相比,
这种蝎状探针的分子内杂交具有更快速、有效的特点。和Molcular beacons 相比,Scorpions 更具优越性尤其在少循环PCR 中[10]。
Scorpion primer 是由发卡结构(hairpin loop )的探针部分通过一段称为PCR stopp er (or PCR block 2er )的寡核苷酸和PCR 引物的5′端相连构成。探针部分的结构和Molcular beacons 类似,由互补序列构成的“茎”和包含SNP 位点且和待检测目的片段
互补的“环”构成,荧光分子和猝灭基团分结合在茎
的末端,而PCR stopper 的作用是在PCR 过程中阻止对探针部分的扩增,避免发卡状结构在无待检测片段时通过扩增被打开而产生错误的荧光信号。在对样品进行检测时以Scorpion primer 作为PCR 扩增的引物,当其以样品DNA 作为模板延伸后,Scor 2pion primer 中的的探针部分就可以和同一条DNA 链上的互补部分杂交,而导致自身构象的改变释放出荧光信号(原理见图2
)。
图2 S c orpi on 探针反应机制
Fi g.2 S c orpi on p r obin g me c ha nis m
在此基础上,现已有报道用双蝎状引物(duplex
scorpion primers )检测SNP [11]。这种引物的结构使荧光分子和猝灭基团在引物和其互补部分杂交后空间上分隔开更远的距离,因此大大提高了荧光信号的强度且稳定性好。1.1.5 DASH (dynamic allele 2specific hybridization 动态等位基因特异杂交)
DASH 是利用热动力学实现了在DNA 变性的
同时进行检测[12],不需要额外的酶反应和探针标记等步骤,因此成本较低。和ASO 杂交一样,DASH 也是通过等位特异性寡核苷酸探针和含SNP 位点的靶片段的杂交而实现对变异位点的检测。但不同的是,ASO 是固定在一个温度来实现探针和靶片段的杂交,而DASH 则是在动态的加热过程中实现对杂交双链状态的实时监测,因此比ASO 能更精确检测探针和靶片段的杂交[13]。
2
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DASH的机理非常简单,首先对样品DNA进行PCR扩增,产生一段45～65bp长的含有SNP位点的PCR产物,并且扩增用的一条引物5′端标记有生物素,这样有生物素标记的产物被通过链亲和素包埋的微孔滴定板所固定,生物素标记的那条链连在板上,而另一条互补链被碱溶液(NaOH)洗去,这样就获得样品的单链DNA片段。低温下和等位特异性寡核苷酸探针杂交,形成双链DNA区域,双链特异性的荧光染料插入到该区。插入染料的荧光强度与双链DNA(探针2靶DNA)的量有关。然后不断给样品加热升温并实时检测荧光信号,由于有错配存在的双链的热稳定性较无错配情况下差,因此在先达到解链温度而造成荧光信号的迅速降低,这样我们通过记录荧光信号迅速降低时所对应的温度就可以判定样品中SNP位点的碱基种类。
1.2 基于酶或PCR的方法
这类方法是目前SNP检测中最常用的一类方法,和杂交基础上检测方法相比增加了一步酶催化反应,因此提高了检测的忠实和可靠性。且因为其操作简单,成本低而被广泛的应用。现已有很多种酶用于这类方法中,如DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸酶等。
1.2.1 ARMS
ARMS(amplification refractory mutation sys2 tem扩增抗拒突变系统)[14],又称等位基因特异性PCR(PCR amplification of sp ecific alleles, PASA)[15]、ASA(allele2sp ecific amplification)。此类方法是根据PCR过程中要求引物和模板间的严格互补配对来实现对SNP位点的检测,是基于以下两点:(1)错配出现在引物中部时致使稳定性降低,在严格杂交条件下将不能退火;(2)错配出现在引物3′端时,引物将不能延伸。因此针对不同等位基因设计平行引物,上游引物的3′端和多态性位点互补,这样只有和引物完全互补的序列才能得到扩增,不同的等位基因依赖于所使用的不同引物分别得以扩增。产生的PCR产物可以通过凝胶电泳或是实时的荧光测定来实现对其的分析。
同建立在杂交基础上的检测方法一样,为提高检测的特异性,近年来在此基础上不断有新的改进。
1.2.1.1 Allele2Specific PCR2ET(Allele2Specific PCR with Universal Energy2T rans fer2Labeled primer)
这是一种新的高通量、自动化的SNP检测的方法[16],对每个SNP位点的检测只需一次PCR反应,且不需PCR后的样品处理过程,在一个管子就能完成检测的全过程,在检测手段上只需一种报告试剂就可实现对于多个SNP位点的平行检测,且不需昂贵的实时检测设备,是等位特异性基因PCR和通用ET(Energy2Transfer)标记引物的结合。
在这类PCR反应体系中检测一个SNP位点共需5个引物,两个加尾的等位基因特异性引物、一个反向引物和两个通用的ET标记的引物。这两个不同的加尾的等位基因特异性引物用来检测每个SNP 位点,其3′末端碱基分别互补于SNP的两个等位基因,5′端连有两个21碱基长的不同的尾结构,设计时注意不能和要检测靶片段互补。通用引物的结构和分子信标的结构类似,5′端是含有荧光和猝灭基团的发卡结构,3′端是21个碱基长的“尾”结构,其序列分别对应于等位特异性引物。两个通用引物分别标记有绿色(fluorescein,荧光素)和红色(sul2 forhodamine)染料,这样检测时一种类型的纯合子产生红色荧光,而另一种类型的纯合子产生绿色荧光而杂合子两种荧光西信号都有。
具体反应包括以下几步循环:1)以等位特异性引物进行扩增,产生5′端含有尾结构的片段;2)反向引物扩增合成尾的互补片段;3)标记的通用引物以第2个循环的产物为模板产生5′端含有通用引物的片段;4)以前一步反应的产物为模板合成其互补链,这步反应使ET标记的通用引物5′端的发卡结构打开,而释放出红或绿色的荧光信号(原理见图3)。
1.2.1.2 Bi2PASA(Bidirectional PCR amplification of sp ecific alleles,双向等位基因特异性PCR)双向等位基因特异性PCR是在ARMS基础上发展起来的基于PCR基础上检测SNP的一种方法。对等位基因特异性PCR来说,在一次PCR反应中只能检测SNP的一个等位基因,而不能实现对SNP的两个等位基因同时检测,为实现这个目的人们曾提出了多重等位基因特异性PCR(PCR amplifi2 cation of multiple sp ecific alleles PAMSA)[17]
,在一个反应中加入3条引物而产生两个等位基因PCR产物,因产物片段长度的不同而通过凝胶电泳来区分。但仍有很多问题,如等位特异性引物的扩增效率不同,PCR反应的条件很难确定。因此人们提出了双向等位基因特异性PCR的方法,在一次的PCR
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图3 A/G SNP位点检测步骤原理图
F L:荧光素;SR:硫罗丹明。
Fi g.3 As s a y s c he me of t he re a cti on s t ep s f or A/G SNP a re s how n
F L:Fluorescein;SR:Sulforhodamine.
反应中区分出纯合子和杂合子[18]。在Bi2PASA中,两个等位基因特异性PCR反应以相对的方向进行扩增。在反应中共有4个引物,两个外测引物(P和Q)和两个内侧等位特异性引物(A和B),这样在杂合子中一共会扩增出3个片段,含一个等位基因的片段AQ、含第二个等位基因的片段PB和以两个外测引物扩增出的片段PQ。在纯合子中会扩增出两个片段PQ和AQ,或者是PQ和PB。然后用简单的凝胶电泳就可实现对产物的分析。而为了提高这种方法的特异性Shu Y e等提出了Tetra2primer ARMS2PCR的方法,即在两个内侧等位特性引物的3′端22位置人为的引入错配碱基[19],并且和MADGE(microplate array diagonal gel eclec2 trophoresis)技术结合,实现了对SNP位点的高通量的检测。
1.2.2 Taqman法[20]
这种方法也称为核酸外切酶法(5′2nuclease as2 say),是在PCR过程中实现等位特异性杂交,而不需以往等位特异性杂交中样品PCR后分离及洗涤等步骤。该技术的基本原理是利用Taq酶的5′核酸外切酶活性,在这个PCR反应中除了两个传统的PCR引物P1、P2外,还有第三个引物P3即等位特异性Taqman探针,含有待检测的SNP位点,特异结合在P1结合位点的下游。P3探针的5′端和3′端分别标有荧光基团和猝灭基团,因P3的3′端被猝灭基团封阻而不能以自身为引物进行扩增。在PCR反应中,Taq酶以P1为引物合成新的DNA 链,随着反应的进行Taq酶接触到P3并激发其5′
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?3′外切酶活性,使P3从5′端开始降解,最后DNA 链得以延伸而P3探针上的荧光基团和猝灭基团由于不再在一个分子上了,荧光基团释放荧光信号。荧光信号的强弱与PCR产物的数量成比例。
这种检测方法的优点是闭管进行,因而减少了PCR污染的风险,但探针标记的成本较高,且因其采用荧光猝灭及双末端标记技术,猝灭难以彻底,本底较高。
1.2.3 引物延伸法(primer extension)
这是依赖DNA聚合酶来分辨碱基多态性位点的一类方法,其特异性比建立在等位特异性杂交的方法要高[21]。这类方法有多种名称[22]如单核苷酸引物延伸(single nucleotide primer extension, SnuPE)、引物指导的核苷酸合成(primer2guided nu2 cleotide incorpration)、TDI(template2directed2 terminator incorpration),其中Minisequencing(微测序)是这类方法最常用的一种称呼。Minisequencing 反应首先扩增出含有SNP位点的一段DNA,然后进行Minisequencing反应,加入一检测引物,其3′末端碱基紧挨于多态性碱基,在DNA聚合酶及标记的ddNTP的存在下进行一个碱基的延伸反应,延伸的这个碱基就是多态性碱基。Minisequencing反应前必须对PCR产物进行纯化以去除其中含有的PCR 引物及dNTP,因为PCR引物会和延伸引物竞争产生多个扩增片段,而多余的dNTP会使延伸反应延伸多个碱基。关于引物延伸产物检测,已经报道了许多方法,如放射性同位素标记法,发光检测法、凝胶为基础的荧光检测法和质谱分析法、变性高压液相色普法等。
目前Minisequencing的反应形式已经从液相发展到固相。液相反应形式[23],是利用凝胶电泳来对Minisequencing反应前PCR产物进行的纯化,在溶液中进行Minisequencing反应,然后再通过凝胶电泳对Minisequencing引物进行分离,在这类方法中放射性同位素32P或33P被作为检测基团,因Minise2 quencing引物在标有32P或33P的ddNTP的存在下延伸,凝胶电泳后就能通过放射自显影术而直接被观察到,也可用来进行定量的分析。这类方法的优点是可以用不同长度的Minisequencing引物在一个反应中对多个SNP位点进行检测,但相应的也带来需多步处理分离的繁琐,如凝胶回收PCR产物等。而固相反应(solid2phase minisequencing)的形式就避免了这种繁琐的操作步骤而被大范围的使用,将其中的一种反应物固定在固相的支持物上,通过对固相支持物的洗脱而实现对不同产物的分离,操作简单方便易于自动化的分析。在固相minisequenc2 ing反应中往往通过生物素-亲和素间的反应来实现固定的目的,利用生物素标记的一条引物使PCR 产物带上生物素,再通过亲和素或链霉亲和素包被的微量滴定板[24]或磁性微粒[25]、微球[26]对PCR产物捕获,再通过碱或加热方式使PCR双链变性,洗去未标记的互补链后就可以进行minisequencing反应了。和上述的将PCR产物固定在固相支持物上不同还可将Minisequencing引物固定,将引物固定在杂交膜或微量滴定板上进行minisequencing反应。近年来发展了以阵列为基础的minisequencing 反应(arrayed primer extension,APEX),是以近年来新发展起来的生物芯片(DNA chip)为固相支持物的微型化检测手段,多条引物可以通过其5′端被共价结合在小的玻璃载体上[27],可以有效的对每个样品的多个SNP位点进行检测,具有十分广阔的应用前景。
和minisequencing反应机理类似还有一种方法称为Pyro sequencing[28],其是利用发光计作为检测设备,反应中要用到DNA聚合酶、APT硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase)。DNA聚合酶在一种dNTP 的存在下进行引物延伸反应,而引物的成功延伸将伴随焦磷酸的释放,焦磷酸在荧光素酶的存在下能引一种发化学发光反应,通过发光计的实时监测来达到检测的目的。
1.2.4 连接酶连接反应(oligonucleotide ligation assay,OLA或ligase chain reaction LCR)
DNA连接酶对特异杂交到靶DNA片段上的两个相邻的寡核苷酸片段进行连接反应时,对连接位点处的碱基互补配对要求很高,特别是对3′端,只有和靶DNA片段完全互补的情况下才能发生连接反应[29]。利用DNA连接酶的这个反应特性和PCR 技术相结合就可以实现对SNP位点的检测。现在已发展了若干种改进的LCR,如Gap2LCR等[30],以下介绍两种:
1.2.4.1 CCR(combined chain reaction,联合链式反应)[31]
这是一种利用DNA聚合酶和DNA连接酶两种
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1期 高秀丽等:单核苷酸多态性检测分析技术
酶进行DNA 扩增反应的检测方法(图4),和以PCR
为基础的检测方法不同其是依赖于引物5′端和模板间的错配来区分碱基多态性,CCR 反应分为4步:1)DNA 模板的变性;2)引物和单链模板间的退火;3)DNA 聚合酶(无5′-3′外切酶活性)催化引物延伸4)延伸引物的3′端和下游引物5′端间的连接。反应中设计两套引物,两个外侧引物和两个内侧检测引物,两个内侧检测引物的5′端都对应于多态性碱基位点,如果检测引物的5′端和模板间没有完全匹配的话,延伸的外侧引物就不能和检测引物连接起来,因而不能形成全长的片段,从而实现对SNP 位点的检测。和LCR 相比,CCR 的第一个优点是快速简单,仅需DNA 的分离、CCR 扩增、琼脂糖凝胶电泳检测产物几步,第二CCR 产生的产物片段大,分子量较高,通过E B 染色的琼脂糖凝胶电泳就可实现对产物的检测而不需引物标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳或放射自显影等繁琐技术
。
图4 CCR 反应示意图
Fi g.4 As s a y s c he me of CCR
1.2.4.2 L 2RCA (ligation 2rolling circle amplication ,
连接2滚环扩增反应)
[32]
这种方法通过对挂锁探针(开口的环状探针,
padlock probe )的连接来区分碱基多态性位点,然后利用滚环扩增对信号放大实现检测。和其他一些检测方法不同其不需预扩增,能直接对基因组DNA 检测,这种方法可以达到从1ng 的基因组DNA 中实
现对SNP 的检测[33],并且通过合适缓冲液的选择可以实现同管反应和检测,因而是一种低成本的高通量检测方法。这里用的挂锁探针比一般性杂交用的探针要长的多,其5′端和3′端各有10个左右的碱基分别和靶DNA 片段互补,且3′末端正对应于SNP 位点的多态性碱基,这样在其和模板靶DNA 杂交后就形成了开口的环状探针,在DNA 连接酶的作用下,只有3′末端和SNP 位点互补的探针才能被连接成环,环化了的挂锁探针就可用标记的引物进行滚环扩增,对检测样品的量起了扩大作用而提高了检测的灵敏度。
1.2.5 RF LP (restriction fragment length polymor 2phism ,限制性片段长度多态性)
限制性内切酶是一类识别DNA 特异位点(通常4～6bp ),并在特异位点进行切割的酶类。酶切位点的特异性意味着对特定DNA 等位基因的完全消化会产生同样的片段序列。而碱基的替换或插入、缺失可以产生或消除一个特定酶切位点,从而改变酶切割后产生片段的大小和数目。这些酶切片段带型的不同称为限制性片段长度多态性。如果SNP 产生和消除了某个限制性内切酶位点,则可以通过对PCR 产物进行酶切、电泳加以检测。用RF LP 检测SNP 位点具有一定准确性,方法简便、快速,可以进行大量样本的分析。但实际中大约一半的SNP 位点并不改变限制性酶切位点,可以通过设计包含酶切位点的错配引物来克服[34],但错配的引物在PCR 扩增时可能会产生一定的困难。近年来报道用MADGE (microtiter array diagonal gel elec 2trophoresis technique )技术来对限制性酶切后的片
段电泳分离,实现了对SNP 位点的高通量检测[35]。1.2.6 Invader assay [36]1999年,由Third Wave Technoligies 公司研究人员发明(原理见图5),是利用一种外切酶FE N (flap endonuclease )的特异性对SNP 位点进行识
别。反应中需两种探针,插入探针(invader probe ,
up stream oligonucleotide )和信号探针(signal probe ,downstream oligonucleotide ),两个探针均和靶DNA 模板互补杂交,并且信号探针的5′端和插入探针的3′端产生至少一个碱基的重叠,从而产生一个两叉状的插入复合物(invasive complex )结构,其能被特异性的外切酶FE N 所切割,将信号探针的5′端重叠部分切除,5′端的切除常和荧光信号的改变相连作
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为检测的手段,或者也可以用质普分析来检测。在对SNP 位点进行检测时,设计上游寡核苷酸和下游信号探针在多态性位点处产生一个碱基的重叠,在此位点出现的错配将大大降低FE N 的切割速率,只能达到正确配对时的1/300,从而实现对SNP 的高效检出
。
图5 Inva de r a s s a y 检测示意图
Fi g.5 As s a y s c he me of inva de r a s s ay
invader assay 方法检测SNP 时,只有两个探针
与模板完全配对后才可以形成插入复合物的结构,
因此其检测结果比简单杂交的准确性好,且FE N 的酶切特异性非常高,酶切产物是均一的寡核苷酸,易与其他杂质成分区分,检测无需电泳,另外在检测前不用进行PCR 扩增,消除了PCR 引入突变导致假阳性的因素,所以具有广泛的应用前景。
固相插入切除法(solid phase invasive cleava ge assay )是invader assay 的一种改进,实现了对多个SNP 位点的平行分析,是在96微孔板上进行酶切反
应,可以从ng 级的基因组DNA 中实现对每个SNP 的检测[37]。近年来人们在DN A 芯片上进行invader
assay ,是一种更有效的高通量分析SNP 的方法[38],
是将信号探针固定于芯片上,上游插入探针可以在液相中加入也可以固定于芯片上,特别是高密度DNA 芯片的产生,得以实现500000个SNP 位点的一步检测。1.2.7 UCAN
这是2001年5月日本Kyoto 等发明的一种检测SNP 的方法(原理见图6),在无需PCR 仪等其他设备下一个小时内就能完成对SNP 的检测。这种方法用插入一段RNA 的DNA 作为聚合酶反应的引物(DNA 2RNA 2DNA ;DRD primer ),且引物的3′末端
被化学基团封阻,此反应中除DNA 聚合酶外还用到RNase H 。在进行SNP 检测时,若靶DNA 和引物中的RNA 部分完全匹配,RNase H 消化引物RNA 部分而去除了封阻的3′末端,使DNA 聚合酶的延伸反应得以进行。与此相反若靶DNA 和引物中的RNA 部分有错配碱基出现时,RNase H 就不能切除RNA 部分,引物封阻的3′端阻碍了聚合酶的延伸反应,这样根据延伸反应的进行与否就可实现对SNP 的检测。K yoto 等人已用这种方法实现了对c 2K i 2ras (一种人类的癌基因)和CYP2C19(P450家族成员)中SNP 的检测。这种UCAN 方法能在一小时内从10ng 的基因组DNA 中实现对SNP 的检测,是一种有
效、经济的检测方法,能在今后的药物基因组学(pharmacogenomics )中得到进一步的应用。
图6 UCAN 原理示意图
Fi g.6 S c he matic rep re s e nt ai on of UCAN
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11 1期 高秀丽等:单核苷酸多态性检测分析技术
1.3 以构象为基础的方法
这类方法是基于SNP位点引入DNA分子后引起其构象的改变或Tm值的不同,从而表现在电泳迁移率的不同,而将突变体检测出来。
单链构象多态性(single2strand conformational poly2morphism,SSCP)可检测单个碱基的改变,在不同系统中突变检出率达70%～90%以上,是一种高效、方便的SNP检测方法[39]。在非变性的条件下,单链DNA具有一定的折叠结构,这种折叠结构是由它的核苷酸序列决定的。SSCP的灵敏性就是依赖于SNP对折叠的影响和折叠如何影响目的序列的电泳迁移率。其策略是,将PCR扩增的待检片段与去离子甲酰胺混合,接着95℃变性解链,再骤冷到冰中,然后通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。
温度梯度凝胶电泳(temp erature gradient gel2 electrophoresis,TGGE)[40]是利用不同构象的分子具有不同的变性温度(Tm)来进行分离的。在正常情况下,DNA分子呈双链结构状态,随着温度的升高,DNA双链构象发生改变,当温度升高到一定温度时就开始解链,由完整的双链变为分叉双链,最后DNA双链完全解开变为单链DNA。这种分子构象的改变影响了其电泳迁移率,DNA双链的打开直接导致迁移率下降,这样DNA片段可以通过在聚丙烯酰胺凝胶电泳中设置温度梯度来进行分离。在SNP 检测中,因为一个碱基的改变引起在不同温度下DNA双链的解链行为不同,即一个碱基的突变可以使DNA片段的迁移率不同,从而达到在温度梯度电泳中分离的效果。和此方法类似,变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient ge electrophoresis, DGGE)[41]是依靠变性剂使Tm值不同的分子分离,其原理为:双链DNA在变性梯度凝胶(变性剂浓度从小到大)的泳动过程中,其解链的速度和程度与其序列密切相关;在恰当的条件下,只要有一个碱基对的差异即可相互分开。
在SSCP和DGGE基础上发展起来的DHPLC (denaturing high performance liquid chromato2 graphy,变性高效液相色谱检测),是一种新的高通量筛选DNA序列多态性的技术[42],其原理是用离子对反向高效液相色谱法分离并检测异源双链。具有半自动化、快速、检出率高、适合大片段等优点,且不需配制凝胶。样品在变性条件下,泳动于55℃左右的特殊吸收剂中,只需电泳6min即可完成50～700bp基因片段的分离,SNP的有无最终表现为色谱峰的峰形或数目的差异。
1.4 直接测序的方法
对于一些比较小、外显子相对较少的基因的SNP检测可直接测序,其检测效率可以达到100%,其主要流程是:PCR扩增目的片段→纯化、回收→4种荧光标记(ddNTP)测序反应→过柱去除多余的荧光和引物→测序仪上电泳并用测序软件分析。
2 检测分析技术
检测分析技术发展到现在主要有凝胶电泳、荧光检测、DNA芯片(DNA chip,oligonucleotide mi2 croarray)和质谱检测等。
2.1 凝胶分析技术
建立在凝胶基础上的检测分析方法是一种成本低廉的检测方法,板电泳形式已经被用于很多种SNP的检测中,如MASDA是杂交法和凝胶检测的结合[43],凝胶检测和引物延伸法的结合[25],但具有制胶过程繁琐费力的缺点。近年来用毛细管电泳代替传统的琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳,因其柱细可减小电流,使热量的产生减少,同时又扩大了散热面积,减小了柱径向温度梯度,所以分离效率高,省时、省力,能在20min之内分离长至数千的碱基片段,还可以同时处理多个样品,常和SSCP、DGGE等技术结合使用。另外一种实用高效的电泳分离技术是MADGE(microtiter array diagonal gel elec2 trophoresis),对ARMS或RF LP[35]产生的等位特异性产物进行快速有效的分离。
2.2 荧光检测技术
荧光检测是目前多数SNP检测方法中所采用的分析技术,具有自动化程度高、方便的特点,且能进行实时监测,虽然所需设备成本较高,仍被广泛的应用。例如在基于杂交方法区分SNP特异位点的方法中可以用荧光法检测[2],另外基于Taqman方法[20]、引物延伸[44],区分SNP位点时都可以用荧光法检测。但在这些检测系统中相应的也存在一些缺陷,如读取数据前未反应的荧光试剂必须去除,一般在检测反应前需PCR的预扩增来准备反应所需的模板,寡核苷酸探针需固定在一些固相的表面上。
目前荧光分析技术主要是基于两种分析原理,一种是荧光共振能量转迁移(Fluorescence reso2
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nance energy transfer,FRET)另一种是荧光偏振(Fluorescence polarization,FP)。荧光共振能量迁移的原理是:当两个荧光基团靠近时,高能量荧光基团会将受激发产生的能量转移到相临的低能量荧光基团上,即荧光基团被猝灭基团所猝灭,而无荧光信号的产生。而当这两个基团间在空间上分开时则产生荧光信号。基于这种原理的荧光分析技术已经用于分子信标[10]、scorpion primer[11]、Taqman法[20]、Invader assay[36]等中。与此不同荧光偏振的原理是[45]:当荧光分子被一束平行的偏振光激发时,也会发射出偏振的荧光,而发出偏振光的程度与荧光分子的旋转速度成比例,由于大的分子的旋转速度慢偏振的发射光被检测到,而小的荧光分子由于旋转速度快而不能检测到偏振荧光。荧光偏振的检测方法也用于引物延伸、Taqman法、Invader assay等方法中,因其不需使用猝灭基团而大大降低了成本,并且在引物延伸检测法中探针不需标记、纯化而被广泛用于SNP的检测中。
2.3 DNA芯片
DNA芯片(microarray,DNA chip)技术是近10年左右才发展起来的一种高新技术,简单的说是面积不大的基片表面(玻璃片或硅片)上有序地点阵排列了一系列固定于一位置的寡核苷酸探针。在1 cm2的固相表面上可以固定10000个寡核苷酸探针分子,由于该技术可以将大量的探针同时固定于支持物上,所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析,从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度底、检测目的分子数量少、效率底等问题,使人们更快速准确地获取样品中的生物信息,是一种新兴的高通量、微型化和自动化的检测手段。DNA芯片常与等位特异性杂交和酶法两种区分原理结合起来对SNP进行检测。
杂交型芯片是利用等位特异性杂交来对SNP 位点进行区分[46]。将等位基因特异性寡核苷酸(ASO)共价固定于玻璃载片上,用荧光素标记的引物对基因组DNA扩增,然后将产生的荧光素标记DNA链与微阵列杂交,用计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得结合于芯片上的目的基因的荧光信号,通过计算机处理即可给出目的基因SNP位点的信息。
电促核酸杂交芯片(电子芯片)[47,48]也是利用等位特异性杂交来对SNP位点进行区分。但与其不同的是这种芯片不是用化学的方法将探针固定在芯片上,其为带有阳电荷的硅芯片、芯片经热氧化,制成1mm×1mm的阵列、每个阵列含多个微电极,在每个电极上通过氧化硅沉积和蚀刻制备出样品池。将连接链亲和素的琼脂糖覆盖在电极上,在电场作用下生物素标记的探针即可结合在特定电极上。在电子芯片上杂交过程的完成也是电场的作用下完成的,样品DNA在电场的作用下以极快的速度移往测试点,电促杂交,反应加速,在数分钟内可完成全过程。杂交结束后,改变电场方向,并配合升温,使异常体结合不稳定,用负电荷将异常结合物排走,从而保留了正确的杂交体,因而大大提高了检测的精确度。具有杂交速度快,可大大缩短分析时间的特点,但制备复杂、成本高是其不足。
利用酶的特异性来区分多态性位点,其特异性要比等位特异性杂交高的多,在其和DNA芯片的连用中已经报道的有Minisequencing[27,49]和Invader assay[38]
等,前文已述,此不再详述。
利用DNA芯片对SNP位点进行检测,基因组DNA因其复杂性和低浓度而不能直接作为检测的对象,因此必须对基因组DNA进行预扩增,小于200bp长度的PCR产物会有较好的杂交效果。为满足DNA芯片的高平行性分析要求常用多重PCR 来对基因组扩增,但多重PCR的条件较难控制,且对PCR产物小的扩增具有倾向性。
2.4 质谱检测技术
质谱技术的基本原理是样品分子离子化后,根据不同离子间的荷质比(m/e)的差异来分离并确定分子量。基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MA LDI2TOF2MS)在SNP的检测中已得到应用。引物延伸法结合MA LDI2TOF2MS[50]是利用质谱技术检测SNP中常用的一种形式,和一般性的引物延伸反应相比,其在引物的5′端引入生物素,使延伸的产物能被固相结合从而达到纯化的目的。利用质谱分析一个样品只需几秒钟,一天可以分析数千个样品,具有快速、准确、自动化程度高和高通量等特点,但主要的问题是需对分析样品进行纯化后才能检测。最近提出的G OOD Assay[51]对此进行了改进,通过化学修饰省去了纯化的步骤而大大节约了检测的成本。
3 结束语
SNP研究是目前人类基因组研究的一个热
911
1期 高秀丽等:单核苷酸多态性检测分析技术
点[52],其应用范围将更加宽广,对群体遗传学、制药业、法医学、癌症及遗传性疾病甚至进化的研究都将产生不可估量的影响。而近期SNPs研究的目标是人类全部编码区的SNPs开发及制作高密度的SNPs图[53]。目前,不仅在人类染色体上,而且在其他生物的基因组上也已建立了SNP图谱。美国、西欧及日本等国的政府、科研机构及部分私人公司正斥巨资研究开发SNP图谱,使得储存在公共数据库里的SNP数量正在已几何级数迅速增长。人们也可以很方便的通过互联网查阅有关SNP的信息。
目前,SNP的测定方法已经比较成熟,已有一些商业化的检测试剂盒的出现,如Acyclo PrimeT M2 FP(PerkinE lmer Life Sciences,Bo ston,MA)、Snap2 shotT M(Applied Bio systems)、RE ADITT M (Promega Corporation)等。SNP应用范围的日益广泛将要求SNP的检测朝向快速、经济、小型化、自动化、高通量的方向发展。在分离方法上,CE的引入使SNP的分析更加快速、高效且更易于自动化;用质谱议检测切割反应产生的小信号分子,以及用固定的“挂锁探针”和“滚环扩增”可以直接从基因组DNA进行SNP分型,有望最终消除对PCR的需求。而DNA芯片技术的出现为发展SNP的检测技术提供了更有效的手段,满足了SNP检测求。美国的A ffymetrix公司开发出BRCA1(乳癌基因1号)芯片、p53芯片等,Research Genetics公司开发了集成1500个SNP的DNA芯片,涵盖了人类基因组全部24条染色体,检测时只需0.5μg的DNA样品就可以进行1次全基因扫描。
总之,作为第三代遗传标记,随着技术的发展, SNP的应用潜力将会不断的发掘和体现。
参考文献(Ref e r e nc e s):
[1] Brookes A J.The essence of SNPs.Gene,1999,234:177～
186.
[2] Tyagi S,Bratu D P,K ramer F R.Multiclor molecular beacons for
allele discrimination.Nat Biotechnol,1998,16:49～53.
[3] J anet A,Nila A,X iyin Chen.New Developments in high2through2
put resequencing and variation detection using high density mi2
croarrays.Human Mutation,2002,19:402～409.
[4] Wallace R B,J Shaffer,R F Murphy,J Bonner,T H irose,K I2
takura.Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to
phiX174DNA:The effect of single base pair mismatch.Nucl
Acids Res,1979,6:3543～3557.[5] Nikiforov T T,J eong S.Detection of hybrid formation between
peptide nucleic acids and DNA by fluorescence polarization in the presence of polylysine.Anal Biochem,1999,275:248～253.
[6] Simeonov A,N ikiforov T T.Single nucleotide polym orphism genotyp2
ing using shor,fluorescently labeled locked nucleic(PNA)probes and fluorescence polarization detection.Nucl Acids Res,2002, 30:17e91.
[7] G uo Z,Liu Q,Smith L M.Enhanced discrimination of single nu2
cleotide polymorphisms by artificial mismatch hybridization.Na2 ture Biotechnology,1997,15:331～335.
[8] Simeonov A,Nikiforov T T.Single nucleotide polymorphism
genotyping using short,fluorescently labeled locked nucleic (PNA)probes and fluorescence polarization detection.Nucl Acids Res,2002,30:17e91.
[9] Tyagi S,K ramer F R.Molecular beacons:probes that fluoresce
upon hybridization.Nature Biotechnol,1996,14:303～308. [10]Thelwell N,Millington S,Solinas A.Mode of action and applica2
tion of Scorpion primers to mutation detection.Nucleic Acids Res,2000,28:19.
[11]Antonio Solinas,Lynda J Brown,Catherine Mc Keen,John M
Mellor,J amie Nicol,Nicky Thelwell,T om Brown.Duplex Scor2 pion primers in SNP analysis and FRET applications.Nucleic Acids Res,2001,29:20e96.
[12]W M H owell,M Jobs,U G yllensten,A J Brookes.Dynamic al2
lele2specific hybridization.Nature Biotechnology,1997,17:87～88.
[13]J A Prince,A J Brookes.T owards high2throughput genotyping of
SNPs by dynamic allele2specific hybridization.Expert Rev Mol Diagn,2001,1(3):89～95.
[14]C R Newton,A G raham,L E Heptinstall,S J Powell,C Sum2
mers,N Kalsheker,J C Smith,A F Markham.Analysis of any point mutation in DNA.The amplification refractory mutation system(ARMS).Nucleic Acids Res,1989,17:2503～2516. [15]Sommer S S,A R G roszbach,C D K Bottema.PCR amplifica2
tion of specific alleles(PASA)is a general method for rapidly detecting known single2base changes.BioTechniques,1992, 12:82～87.
[16]Myakishev M V,K hripin Y,Hu S,Hamer D H.H igh2Throughput
SNP genotyping by allele2specific PCR with universal energy2 transfer2labeled primers.Genome Res,2001,11:163～169. [17]Dutton C,S S Sommer.Simultaneous detection of multiple sin2
gle2base alleles at a polymorphic site.BioTechniques,1991, 11:700～702.
[18]Qiang Liu,Erik C Thorland,John A Heit,Steve S Sommer.
Overlapping PCR for Bidirectional PCR Amplification of Specific Alleles:A Rapid One2Tube Method for Simultaneously Differen2 tiating H omozygotes and Heterozygotes.Genome Res,1997,7: 389～398.
[19]Shu Y e,Sahar Dhillon,X iayi Ke,Andrew R Collins,Ian N M
021遗 传HEREDIT AS(Beijing)2005 27卷
Day.An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms.Nucleic Acids Res,2001,29:17e88.
[20]Livak KJ Allelic.discrimination using fluorogenic probes and the
5′2nuclease assay.Genet Anal,1999,14(5～6):143.
[21]Landegren U,Nilsson M.Reading bits of genetic in formation:
Mthods for single2nucleotide polymorphism analysie.Genome Res,1998,8:769～776.
[22]Syvanen A C.From gels to chips:“minisequencing”primer ex2
tension for analysis of point mutations and single nucleotide poly2 morphisms.Human Mutation,1999,13:1～10.
[23]K rook I M Stratton,SO’Rahilly.Rapid and simultaneous detec2
tion of multiple mutations by pooled and multiplex single nu2 cleotide primer extension:application to the study of insulin2re2 sponsive glucose transporter and insulin receptor mutations in non2insulin2dependent diabetes.Hum Mol Genet,1992,1:391～395.
[24]Syvanen A C,E Ikonen,T Manninen,M Bengstrom,H Soder2
lund,P Aula,L Peltonen.Convenient and quantitative detection of the frequency of a mutant allele using solid2phase minise2 quencing application to aspartylglucosaminuria in finland.Ge2 nomics,1992a,12:590～595.
[25]T Pastinen,J Partanen,A C Syvanen.Multiplex,fluorescent
solid2phase minisequencing for efficient screening of DNA se2 quence variation.Clin Chem,1996,42:1391～1397.
[26]Chen J,M A Iannone,M S Li,J D Taylor,P Rivers,A J Nel2
son,KA Slentz2Kesler,A Roses,M P Weiner.A microsphere2 based assay for multiplex single nucleotide polymorphism analy2 sis using single base chain extension.Genome Res,2000,10: 549～557.
[27]Pastinen T,K urg A,Metspalu A,Peltonen L,Syvanen A C.
Minisequencing:a specific tool for DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide arrays.Genome Res,1997,7:606～614. [28]Ahmadian A,G harizadeh B,G ustafsson A C,Sterky F,Nyren
P,Uhlen M,Lundeberg J.Single2Nucleotide polymorphism analysis by pyrosequencing.Anal Biochem,2000,280:103～110.
[29]Landegren U,Kaiser R,Sanders J,H ood L.A ligase2mediated
gene detection technique.Sience,1988,241:1077～1080. [30]Osiowy C.Sensitive Detection of H BsAg Mutants by a Gap Lig2
ase Chain Reaction Assay.Journal of Clinical Microbiology, 2002,40(7):2566～2571.
[31]W Bi,P J Stambrook1CCR:a rapid and simple approach for mu2
tation detection.Nucleic Acids Res,1997,25(14):2949～2951.
[32]Qi X,Bakht S,Devos KM,Gale M D,Osbourn A.L2RCA(lig2
ation2rolling circle amplification):a general method for genotyp2 ing of single nucleotide polymorphisms(SNPs).Nucleic Acids Res,2001,29:22e116.
[33]Faruqi A F,H osono S,Driscoll M D,Dean F B,Alsmadi O,
Bandaru R,K umar G,G rimwade B,Z ong Q,Sun Z,Du Y,
K ingsmore S,K nott T,Lasken R S.H igh2throughput genotyping of single nucleotide polymorphisms with rolling circle amplifica2 tion.Genomics,2001,2:4.
[34]Cohen J B,A D Levinson.A point mutation in the last intron re2
sponsible for increased expression and transforming activity of the c2Ha2ras oncogene.Nature,1988,334:119～124.
[35]Day I N M,S E Humphries.E lectrophoresis for genotyping:Mi2
crotiter array diagonal gel electrophoresis on horizontal poly2 acrylamide gels,hydrolink,or agarose.Anal Biochem,1994, 222:389～395.
[36]Lyamichev V,Mast A L,Hall J G.Polymorphism identification
and quantitative detection of genomic DNA by invasive cleavage of oligonucleotides probes.Nat Biotechnol,1999,17:292～296.
[37]Wilkins Stevens Priscilla,Hall J eff G,Lyamichev Victor,Neri
Bruce P,Lu Manchun,Wang Liman,Smith Lloyd M,Kelso David M.Analysis of single nucleotide polymorphisms with solid phase invasive cleavage reaction.Nucleic Acids Res,2001, 29:16e77.
[38]Lu M,Shortreed M R,Hall J G.A surface invasive cleavage as2
say for highly parallel SNP analysis.Human Mut,2002,19:416～422.
[39]RUAN Qing2G uo,LU Chun2Y e.Review of gene mutation array.
Foreign Medical Sciences(Section of Genetics),1998,21(5): 225～231.
阮庆国,陆春叶.基因突变分析技术综述.国外医学遗传学分册,1998,21(5):225～231.
[40]CHE N Han2K ui,FE NG X in.Temperature gradient gelelec2
trophoresis(TGGE)technology and its application.Progress in Biochemisty and Biophysics,1999,26(3):297～299.
陈汉奎,冯 忻.温度梯度凝胶电泳技术及应用.生物化学与生物物理进展,1999,26(3):297～299.
[41]LU Li2Hua,ZH ANG Jia2Xun,ZH U Y i2Chuan.Denaturing gradient
gelelectrophoresis system used in mutations detecting.Letters in Biotechnology,2001,12(3):208～210.
陆利华,张家洵,朱一川.变性梯度凝胶电泳装置及其在DNA 突变检测中的初步应用.生物技术通讯,2001,12(3):208～210.
[42]LI AO Lin2Chuan,ME NG Hai2Y ing,HOU Y i2Ping,ZH ANG Si2
Zhong,Y AN Y ou2Y i,SU Zhi2G uang,LI Y ing2Bi,WU Jin,ZH ANG Ji.Analysis of temperature2modulated high2performance liquid chromatography as a tool for detection of single nucleotide poly2 morphism.Chin J Med Genet,2000,17(3):204～207.
廖林川,孟海英,侯一平,张思仲,颜有仪,苏智广,李英碧,吴瑾,张 霁.用温度调控高效液相色谱探索基因组单核苷酸多态性的方法研究.中华医学遗传学杂志,2000,17(3):204～207.
[43]A P Shuber,L A Michalowsky,G S Nass,J Skoletsky,L M
H ire,S K K otsopoulos,M F Phipps,D M Barberio,K W
K linger.H igh throughput parallel analysis of hundreds of patient
121
1期 高秀丽等:单核苷酸多态性检测分析技术
samples for more than100mutations in multiple disease genes.
Hum Mol Gene,1997,6:337～347.
[44]Chen X,Levine L,K wok P Y.Fluorescence polarization in ho2
mogeneous nucleic analysis.Genome Res,1999,9:492～498.
[45]K work P Y.SNP genotyping with fluorescence polarization de2
tection.Hum Muta,2002,19:315～323.
[46]Warrington J A,Shah N A,Chen X,J anis M,Liu C,K ondapalli
S,Reyes V,Savage M P,Zhang Z,Watts R,De G uzman M, Berno A,Snyder J,Baid J.New developments in high2through2 put resequencing and variation detection using high density mi2 croarrays.Hum Muta,2002,19:402～409.
[47]Sosnowski R G,Tu E,Butler W F,O’Connell J P,Heller M J.
Rapid determination of single base mismatch mutations in DNA hybrids by direct electric field control.Proc Natl Acad Sci, 1997,94:1119～1123.
[48]Patrick N G illes,David J Wu,Charles B Foster,Patrick J Dil2
lon,Stephen J Chanock.Single nucleotide polymorphic discrim2 ination by an electric dot blot assay on semiconductor mi2 crochips.Nature Biotechnology,1999,17:365～370.
[49]Pastinen T,Raitio M,Lindroos K,Tainola P,Peltonen L,Syva2
nen A C.A system for specific,high2throughput genotyping by
allele2specific primer extension on microarrays.Genome Res, 2000,10:1031～1042.
[50]Bray M S,Boerwinkle E,Doris P A.H igh2throughput multiplex
SNP genotyping with MA LDI2TOF mass spectrometry:practice, problems and promise.Hum Muta,2001,17:296～304. [51]Sascha Sauer,David H Gelfand,Francis Boussicault,Keith
Bauer,Fred Reichert,Ivo G G ut.Facile method for automated genotyping of single nucleotide polymorphisms by mass spec2 trometry.Nucleic Acids Res,2002,30:5e22.
[52]LI U Wan2Qing,HE Lin.SNP—Tracing new blueprint for human
genome.Heredita s(Beijing),1998,20(6):38～40.
刘万清,贺 林.SNP———为人类基因组描绘新的蓝图.遗传, 1998,20(6):38～40.
[53]Wang D G,Fan J B,Siao C J,Berno A,Y oung P,Sapolsky R,
G handour G,Perkins N,Winchester E,Spencer J,K ruglyak L,
Stein L,Hsie L,T opaloglou T,Hubbell E,Robinson E, Mittmann M,Morris M S,Shen N,K ilburn D,Rioux J,Nusbaum C,Rozen S,Hudson T J,Lander E https://www.wendangku.net/doc/c415156769.html,rge2scale identifica2 tion,mapping,and genotyping of single2nucleotide polymor2 phisms in human genome.Science,1998,280:1077～1082.
“2005年生物技术前沿与发展专题研讨会”即将召开
“2005年生物技术前沿与发展专题研讨会”与“2005年中国国际科学仪器及实验室装备展览会(CISI LE 2005)”同期召开,展会集中展示生物技术、分析测试、实验室技术领域的先进技术与仪器设备,预计参展厂商达五百多家,是我国生物技术及相关领域重要的专业盛会和成果交易平台。会议期间将组织参观CISI LE 2005。
一、会议时间:2005年3月10～11日,报到时间:2005年3月9日
二、会议地点:北京展览馆报告厅(北京市西直门外大街135号)
三、主办单位:中国生物工程杂志社
四、会议主要议题
1、基因表达和分离纯化技术
2、DNA重组及转基因技术
3、蛋白质工程技术
4、细胞和原生质融合技术
5、酶和细胞固定化技术
6、动植物细胞大规模培养技术
7、动物胚胎工程技术
8、现代微生物发酵技术
9、现代生物反应工程
10、现代生物分离工程技术
五、联系方式
通讯地址:北京市中关村北四环西路33号中国生物工程杂志社,邮编:100080
联系电话:010-********,82686611-6631传真:010-********
Email:biotech@https://www.wendangku.net/doc/c415156769.html,联系人:寿景依,张宏翔
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