实验1 大肠杆菌的培养和分离

实验1 大肠杆菌的培养和分离

高二年级班姓名学号：

实验日期：____月日【知识准备】

1．背景知识：

大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）是微生物学和遗传学常用的实验材料，为单细胞原核生物，宽约0.5×1～3微米；具有由肽聚糖组成的细胞壁；周身具鞭毛，能运动。

大肠杆菌是在人和动物肠道中生活的、不会致病的正常栖居菌，但若进入胆囊、膀胱等处也会引起炎症。它能利用多种糖类物质产酸、产气，其代谢类型为异养兼性厌氧型；其代谢活动能产生大肠杆菌素（抑制肠道内其他分解蛋白质的微生物生长），还能合成维生素B和K。它们在肠道中大量繁殖，几乎占粪便干重的1/3。

实验室中用于培养微生物的营养物质称为培养基。按培养基的物理状态可分为：液体培养基和固体培养基。将已知的菌种引入新配制的培养基的过程称为接种。而在固体培养基表面用蘸有菌种的接种环连续划线，既可以达到接种的目的，又可以实现分离菌种的目的。这是因为划线过程中接种环与培养基表面接触，接种环上的菌液逐渐减少，因此划线最后部分细菌间的距离加大，经过培养后可出现由单个细菌细胞形成单菌落，这样就达到了分离细菌的目的。

2．实验原理：

使用通用的细菌培养基（如LB液体培养基）可扩大培养大肠杆菌，使大肠杆菌迅速扩增。

在LB固体平面培养基上对大肠杆菌进行划线分离，经培养后培养基上每一个菌体会形成一个单独的菌落。这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选突变菌株的最简便方法之一。

为保证配制的培养基上只生长大肠杆菌，而不被其他微生物污染，实验过程中要进行无菌操作。3．思考题

（1）为什么培养过程中会出现被其他微生物污染的现象？

（2）进行了无菌操作是否肯定就不会出现被其他微生物污染的现象吗？

（3）本实验的关键步骤——划线分离的目的是什么？

（4）在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线?在操作过程中应注意什么？

【实验目的】

1．利用液体培养基进行大肠杆菌的扩增

2．用固体平面培养基进行大肠杆菌的划线分离 3．了解微生物实验的操作原理和培养条件 【材料用具】

大肠杆菌菌种

装有固体培养基的、已灭菌培养皿；装有LB 液体培养基的、已灭菌的250ml 三角瓶封口膜和橡皮圈 酒精灯 接种环 镊子 装有酒精棉球的广口瓶 恒温培养箱 摇床 【操作流程】

【实验步骤】

1．接种前的准备

进行接种操作前，应先洗手，再用70%的酒精棉球擦拭双手和桌面。

待酒精挥发之后，再点燃酒精灯。 2．接种

（1）接种时的要求

接种过程要在酒精灯火焰附近完成，这是因为在火焰附近形成的上升气流能避免空气中的微生物落入培养基中。

接种环灭菌：将接种环在酒精灯火焰的外焰灼烧灭菌。对金属丝与柄部连接部位也要在火焰上穿梭1－2次。灼烧后的接种环温度较高，为避免烫死菌种，可将其接触培养基或培养容器的内壁冷却后再取菌种。

（2）将固体培养基表面的大肠杆菌菌种转入液体培养基培养

右手执接种环，在火焰上灭菌。用左手握住装有菌种的试管和液体培养基的三角瓶靠近酒精灯火焰，并用右手中指-无名指夹下试管口的棉塞、无名指-小指夹下三角瓶的封口膜，将试管口和三角瓶口在酒精灯的火焰上烧灼灭菌后，再将接种环伸入试管，接触培养基冷却后取菌种。将菌种转入三角瓶的液体培养基中；分别将三角瓶的封口膜和试管的棉塞复原，在封口膜上标记好接种人和接种日期。

（3） 将液体培养基中的大肠杆菌菌种转入固体培养基中划线分离 接种时应以左手持培养皿，在火焰旁用左手拇指、食指及中指使皿盖开启成一缝（培养皿盖不能开大，以避免杂菌落入），用灭菌过的接种环取少许菌种迅速送入培养皿内，在固体培养基的表面连续平行划线4．－．5．条．

，将培养皿转动一定角度后，用接种环通过第1次划线的末端部分做第2次连续平行划线，然后再以同样方法依次操作。（见右图）

划线时接种环应与培养基表面成30°左右，注意划线要轻，不可把培养基划破，也不要使接种环碰到培养皿边缘。（见右下图）

3．培养

（1）将接有菌种和液体培养基的三角瓶在摇床上振荡培养12h，温度控制在37℃左右。

（2）将划线后的固体培养基盖好，在培养皿盖上标记好接种人和接种日期，再将培养皿在37℃恒温培养箱中倒置培养12－24h。

倒置培养的原因是：恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，并在培养皿盖子内凝结成水滴，水滴如果滴落在培养基表面并扩散开来，则会使不同菌落中的菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。

培养12－24h后，若在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌种已被分离。

【实验记录】

请课代表将在37℃恒温培养箱中培养12－24h的培养结果用相机拍摄下来，传给任课教师。

【结果分析】

1.你的培养基上是否有杂种污染？如何判断？

2．用液体培养基与用固体培养基培养时有什么不同？原因是什么？

【创新空间】

你对于本实验的过程和结果有何疑问？对于实验步骤有何改进建议？请将它们写在这里，我们将共同提高！

【实验考核】检查人：

【预习作业】

1．进行接种操作前，应先洗手，再用擦拭和桌面。点燃酒精灯应等待之后再进行。

2．倒平板和接种，都要靠近酒精灯火焰附近操作。这是因为

。

3．接种时，接种环灭菌要特别将在火焰上穿梭1－2次进行灭菌。灼烧后的接种环温度较高，为避免烫死菌种，可将其接触冷却后再取样和接种。

4．接种划线：在固体培养基的表面连续划线条，将培养皿转动一定角度后，用接种环通过第1次划线的做第2次连续平行划线，然后再以同样方法依次操作。

划线时要轻，不可，也不要使接种环碰到培养皿边缘。

划线后盖好培养皿，将培养皿，将培养皿放入恒温培养箱中在培养12－24h，或在室温下培养3d。

实验中需将培养皿倒置的原因是：在培养皿盖子内凝结成的水滴如果滴落在培养基表面并扩散开来，会使很难再分成单菌落，达不到分离的目的。

5．将大肠杆菌菌种由固体转入液体培养基后应将三角瓶放在上振荡培养12h，温度控制在℃左右。

【课后作业】

1．下列有关实验材料大肠杆菌的叙述，不正确的是( ) A．属于单细胞的原核生物B．在固体培养基表面可见其细胞

C．细胞壁成分与植物不同D．细胞中含有DNA和RNA

2．微生物实验中分别采用了高压蒸气、酒精、火焰灼烧等几种不同的灭菌处理，这些方法依次可以用于杀灭什么部位的杂菌( ) A．接种针、手、培养基B．高压锅、手、接种环

C．培养基、手、接种环D．接种针、手、高压锅

3．在获得某种细菌纯净培养物的过程中，操作的关键是( ) A．对所有器皿、培养基灭菌B．接种纯种细菌

C．适宜环境条件下培养D．防止外来杂菌污染

4．微生物实验过程中，常需灭菌。下列灭菌操作中，错误的是……( ) A．用酒精擦拭双手B．用氯气消毒实验用水

C．实验操作应在酒精灯火焰附近进行D．用酒精擦拭玻璃器皿

5．有关划线接种操作的正确做法是………( ) A．接种环、培养皿等已灭菌，整个操作过程中不再灭菌

B．取出菌种后需马上塞上棉塞，然后再划线

C．用沾有菌种的接种环迅速划三至五条平行线即可

D．最后将培养皿倒置，放入培养箱中培养

6．下面是有关细菌划线分离法的叙述，其中正确的是……………( ) A．必须在液体培养基上操作B．划线上一定会出现单个突变菌株

C．此法不能除去污染的杂菌D．划线上一定会出现细菌单菌落

7．将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃恒温箱的目的是………( ) A．对比观察培养基有没有被微生物利用B．对比分析培养基是否被杂菌污染

C．没必要放入未接种的培养基D．为了下次接种时再使用

实验2 分离以尿素为氮源的微生物

高二年级班姓名实验组编号：

实验日期：____月日

【知识准备】

1．背景知识：

脲或称尿素，是蛋白质降解的产物，人和其他哺乳动物如家畜的尿中都含有尿素。自然界中有能够分解尿素的微生物，例如：土壤中有一些细菌含有脲酶，通过降解尿素作为其生长的氮源。

2．实验原理：

（1）利用选择培养基分离得到以尿素作为唯一氮源的细菌

选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。目的是从多种微生物中分离得到所需要的微生物。

在本课题提供的选择培养基的配方中，尿素是培养基中的惟一氮源，因此，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。

（2）利用稀释涂布平板法统计菌落

用一定稀释度的样品溶液在培养基上进行涂布，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过观察菌落数可以确定样品中的细菌数量。恰当的稀释度是成功地统计菌落的关键，一般来讲，每个培养皿中有20个以内的菌落适于计数。为保证结果的可信度，在同一稀释度下，至少要对3个平板进行重复计数，求出平均值。

样品中细菌数量的计算方法是：

平均菌落数÷涂布的稀释液体积×稀释倍数

（3）利用鉴别培养基确定细菌种类：

在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。因此，我们可以通过检测培养基pH变化来判断该化学反应是否发生。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。

3．思考题：

（1）农作物不能直接吸收利用尿素，但尿素却是农业生产上的重要氮肥。农作物如何利用尿素中的氮？

（2）怎样从杂菌中分离得到能利用尿素的细菌?

（3）怎样确定单位体积稀释液中细菌的数量？

（4）如何确定培养基中生长的细菌能够分解尿素？

【实验目的】

1．使用专一的培养基（含尿素）分离专一的细菌（有脲酶的细菌）。

2．使用指示剂颜色的变化检知酶（脲酶）所催化的反应。

3．使用稀释平板法统计菌落数

【材料用具】

尿素固体培养基和LB固体培养基、10-2和10-3土壤稀释液

70%酒精及酒精棉

试管架、有塞试管、广口瓶、镊子、玻璃刮刀、酒精灯、移液器、培养皿、三角瓶【操作流程】

【实验步骤】请在实验前预习并填写。

1．用镊子夹取酒精棉，将手及实验台擦拭干净，待后点燃酒精灯。

2．制备培养基

将两个三角瓶中已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基，在左右时，在旁分别倒入两个培养皿中，在水平的超净台上摇匀，至凝固。

3．制备细菌悬液

将1g土样加入盛有ml无菌水的三角瓶中，振荡min，即成稀释液。吸取上清液ml，转移至盛有 mL的无菌水的无菌大试管中，依此方法制备出稀释液，摇匀，放在试管架上。

4.用涂布法分离细菌

取样时，尽量只取 ___ 。并按照稀释液浓度由．低到高

．．．的顺序分别吸取ml土壤稀释液加到培养基和培养基的培养皿中（不必更换移液管），再将保存在酒精中的放在上，待刮刀上火焰熄灭，在旁打开培养皿，将菌落涂布在上。

5.细菌的计数

将涂布好的培养皿顶盖上写明实验内容、接种人姓名和接种日期后倒置，放在37℃温度下培养 h。观察并记录菌落数。

【实验记录和数据处理】

1．有菌落的尿素培养基颜色变化是：由色变成色。

2．培养基中菌落数目的统计和计算：

【实验结论】

该样品中（含有/不含有）能分解尿素的细菌，含量约为

个/g

【创新空间】

你对于本实验的过程和结果有何疑问？对于实验步骤有何改进建议？请将它们写在这里，我们将共同提高！

【实验考核】检查人：

后练

习】

1．下

列氮

肥能被植物直接吸收的是( )

①硝酸盐②尿素③磷酸二氢氨④氨

A．①②③④ B．①③④ C．②③④ D．①③

2．土壤中分解尿素的微生物所需氮源为( )

A．硝酸 B．氨 C．尿素 D．蛋白胨

3．将某种细菌接种到彻底灭菌的固体培养基上，经过一段时间后能得到（）

A．无一定形态的群体 B．菌丝 C．单个细菌 D．菌落

4．以下叙述中对尿素培养基进行灭菌的不正确操作是( )

A．对配制好的尿素培养基进行高压蒸汽灭菌

B．用内置滤膜的玻璃漏斗过滤尿素溶液

C．对除尿素以外的培养基成份进行高压蒸汽灭菌

D．在60℃时，把灭菌后的尿素溶液和其它培养基成份混合

5．从土壤中分离能分解尿素的细菌，可以利用选择培养基，其成分中一定有

①尿素②有机氮化合物③无机盐

④有机碳化合物⑤水⑥无机的碳化合物

A．①③④⑤ B．②③④⑤ C．①③⑤⑥ D．②③⑤⑥

6．用来判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置的对照是( )

A．未接种的选择培养基 B．未接种的LB培养基

C．接种了的LB培养基 D．接种了的选择培养基

7．利用稀释平板法进行菌落计数时，使用的培养基种类应该是什么？为保证计数准确，形成一个菌落的最初细菌数应该是多少？（）

A．液体培养基、一个细菌 B．液体培养基、许多细菌

C．固体培养基、一个细菌 D．固体培养基、许多细菌

8．利用稀释平板法进行菌落计数时，培养皿中长满了大小不一的菌落，数量有43个，以下分析中不正确的是（）

A．样品稀释度不足时会出现这种情况 B．接种的菌液中有43个细菌

C．某些菌落是由多个细菌繁殖形成的 D．某些菌落是由单个细菌繁殖形成的

9．用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为10-3的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是( )

A．涂布了2个平板，统计的菌落总数是36，记录36

B．涂布了2个平板，统计的菌落数是13和17，取平均值15

C．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是2、14和16，取平均值11

D．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是15、13和17，取平均值

实验1 大肠杆菌的培养与分离

实验1：大肠杆菌的培养和分离 一、教学要求 二、基本内容 培养 无菌技配制培养基的原 的培养基的配制计算→称量→溶化→调pH 实配制培养基的方法→分装→加棉塞→灭菌→倒验平板 室平板划线法培分离、纯化大肠杆菌 养稀释涂布法系列稀释平板涂布 1．培养基的种类和化学成份 培养基的种类有很多划分标准，按物理性质分：固体培养基和液体培养基（加入琼脂多少）。液体培养基用于扩大培养和工业生产，固体培养基用于菌种分离，鉴定，计数（菌落数量）。 培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。按照微生物的同化作用类型是自养还是异养，碳源不同，自养微生物为无机碳源，如硝化细菌是二氧化碳或碳酸盐，异养微生物为有机碳源，如大肠杆菌是葡萄糖等有机物。 2．常见微生物类群 原核生物（如细菌大肠杆菌――二分裂、革兰氏阴性、异养兼性厌氧性肠道杆菌、蓝藻、支原体、衣原体、放线菌等）、原生生物（草履虫、变形虫等）、真菌（酵母菌――出芽生殖.异养兼性厌氧性微生物、霉菌、食用菌）、病毒等。 细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，无成型的细胞核，只有一环状DNA分子（拟核）。以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌（革兰氏染液染色后，再脱色处理，细菌仍保留染色液的颜色）和革兰氏阴性菌两大类，区别在细胞壁的成分不同。大肠杆菌是革兰氏阴性（细胞壁薄，有荚膜）、兼性厌氧的肠道杆菌。 3．无菌技术 对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。 灭菌方法： 。灼烧灭菌法①接种环、接种针、试管口等使用

(完整版)大肠杆菌培养基配制及培养方法

大肠杆菌培养 一、菌种冻存液的制备 含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。 二、培养基制备 LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4） 液体培养基 胰化蛋白胨 10.0g 酵母粉 5.0g 氯化钠 10.0g 水 1000ml pH 7.4 固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂 三、平板的制备 1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。 2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。所有锥形瓶如上述操作。用记号笔注明培养基名称、配制日期。 4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。 5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。 四、接种大肠杆菌 1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。 3）因实验一般都要求挑取单菌落，故涂平板适应考虑冻存液内细菌数量，若菌量过大应适当稀释。一般方法一获得单菌落的可能性比较大。涂平板应在酒

大肠杆菌的培养

大肠杆菌种子液的制备 牛肉膏蛋白胨培养基的配方： 液体培养基 牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 水 1000ml pH 固体培养基在液体培养基的基础上再加入％－％的琼脂1 试管斜面与平板的制备 （1）称量按培养基配方比例依次准确称取蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、水放入烧杯中。 （2）熔化在上述烧杯中先加入少于所需要量的水，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，药品完全溶解后， 补充水到所需的总体积。将称量好的％琼脂放入已溶的药 品中，再加热熔化，最后补充所损失的水分。 （3）调PH 在未调PH前，先用精密PH试纸测量培养基的原始PH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH, 边加边搅拌，并随时用PH试纸测基PH直到PH达到。反之 用1mol/L HCl进行调节。 （4）分装将培养基分装入三个试管中和三角烧瓶中。其试管装量不超过管高的1/5，三角烧瓶的量不超过1/2加塞培 养基分装完毕后，在试管口和三角烧瓶口上塞上棉塞。

（5）包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名 称、配制日期。 （6）灭菌将上述培养基以,121℃,15min高压蒸气灭菌。 （7）倒平板，取三个已消毒的培养皿，在无菌操作台上用三角烧瓶中的培养基倒制三个平板培养基，冷却。 （8）搁置斜面将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁在玻璃棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的 一半为宜。 2 接种大肠杆菌斜面种子 (1) 取实验室储备的大肠杆菌BL21种子，在酒精灯附近， 用接种环在已制备好的斜面上接种上大肠杆菌。 (2) 将接种好的斜面放入37℃的恒温培养箱子中培养24h。 3 制备平板种子 (1) 在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌的斜面，用无菌 生理盐水将菌种冲洗下来，再用无菌生理盐水将其梯度 稀释为1倍，10倍，100倍和1000倍，用移液枪分别吸 取各梯度的溶液涂布平板(每个梯度涂布三个平板，每次 吸取溶液100ul)，然后在37℃培养箱中过夜。 （12）次日，挑取生长状态好，特征明显的单个菌落，接种于新鲜灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中37℃，170r/min 恒温振荡培养18h作种子培养液。

大肠杆菌的培养

大肠杆菌的培养 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998

大肠杆菌种子液的制备 牛肉膏蛋白胨培养基的配方： 液体培养基 牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 水 1000ml pH 固体培养基在液体培养基的基础上再加入％－％的琼脂 1 试管斜面与平板的制备 （1）称量按培养基配方比例依次准确称取蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、水放入烧杯中。 （2）熔化在上述烧杯中先加入少于所需要量的水，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，药品完全溶解后，补充水到所需的 总体积。将称量好的％琼脂放入已溶的药品中，再加热熔化，最后 补充所损失的水分。 （3）调PH 在未调PH前，先用精密PH试纸测量培养基的原始PH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH,边加边搅拌， 并随时用PH试纸测基PH直到PH达到。反之用1mol/L HCl进行 调节。

（4）分装将培养基分装入三个试管中和三角烧瓶中。其试管装量不超过管高的1/5，三角烧瓶的量不超过1/2加塞培养基分装完毕后， 在试管口和三角烧瓶口上塞上棉塞。 （5）包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、配制日期。（6）灭菌将上述培养基以,121℃,15min高压蒸气灭菌。 （7）倒平板，取三个已消毒的培养皿，在无菌操作台上用三角烧瓶中的培养基倒制三个平板培养基，冷却。 （8）搁置斜面将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁在玻璃棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。 2 接种大肠杆菌斜面种子 (1) 取实验室储备的大肠杆菌BL21种子，在酒精灯附近，用接种环在 已制备好的斜面上接种上大肠杆菌。 (2) 将接种好的斜面放入37℃的恒温培养箱子中培养24h。 3 制备平板种子 (1) 在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌的斜面，用无菌生理盐水将菌 种冲洗下来，再用无菌生理盐水将其梯度稀释为1倍，10倍，100 倍和1000倍，用移液枪分别吸取各梯度的溶液涂布平板(每个梯度 涂布三个平板，每次吸取溶液100ul)，然后在37℃培养箱中过 夜。

实验1-大肠杆菌的培养与分离

实验1大肠杆菌的培养和分离 、教学要求 、基本内容 1培养基的种类和化学成份 培养基的种类有很多划分标准，按物理性质分：固体培养基和液体培养基（加入琼脂多少）。液体培养基用于扩大培养和工业生产，固体培养基用于菌种分离，鉴定，计数（菌落数量）。 培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。按照微生物的同化作用类型是自养还是异养，碳源不同，自养微生物为无机碳源，如硝化细菌是二氧化碳或碳酸盐，异养微生物为有机碳源，如大肠杆菌是葡萄糖等有机物。 2 ?常见微生物类群 原核生物（如细菌大肠杆菌一一二分裂、革兰氏阴性、异养兼性厌氧性肠道杆菌、蓝藻、支原体、衣原体、放线菌等）、原生生物（草履虫、变形虫等）、真菌（酵母菌——出芽生殖. 异养兼性厌氧性微生物、霉菌、食用菌）、病毒等。 细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，无成型的细胞核， 只有一环状DNA分子（拟核）。以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌（革兰氏染液染色后，再脱色处理，细菌仍保留染色液的颜色）和革兰氏阴性菌两大类，区别在细胞壁的成分不同。大肠杆菌是革兰氏阴性（细胞壁薄，有 荚膜）、兼性厌氧的肠道杆菌。 3 ?无菌技术 对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。 ①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法。

②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱。 ③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。 ④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。 4 ?培养基的配制原则 目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。 营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。 pH要适宜：细菌培养基pH中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。 5.实验操作步骤 （1）配制培养基：计算T称量T溶化T调pH T分装T加棉塞T火菌T倒平板（形成斜面是为增大接种面积）。 我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分 离。以下为本实验中培养基配置步骤： ①称量：准确称取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。配置LB 固体培养基时还需加1g琼脂。 ②溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂，整个 过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。 ③调pH :用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。 ④灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养 基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。 ⑤倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60C左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其 过程是：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；② 右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口 的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放 置。 倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。向培养皿中转 移已灭菌的培养基时，也不要把培养基沾在皿壁上。否则，空气中杂菌会在这些粘附培养基 上繁殖，并污染皿内培养基。 （2）接种 微生物接种的最常用方法是平板划线法和稀释涂布法。 平板划线法（方法简单，考试的主要考查点）：通过接种环在琼脂固体培养基表面连 续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面（也是分离纯化的方法）。在第一 次划线后都从上次划线末端开始的目的是获得由单个细菌形成的标准菌落。 稀释涂布平板法（操作复杂，单菌落更易分开）：将菌液进行一系列梯度稀释，并将 不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单 个细菌形成的标准菌落。 1 ?划线分离法：用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少。划线到最后，可使细菌间的距离加大。在培养10? 20h后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。 其操作步骤是：将培养皿底部用拇指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微 打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内，在平板培养基 的一边，作第1次平行划线3?5条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第 1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。 划线时，接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将

高中生物大肠杆菌的培养和分离(学案)

大肠杆菌的培养和分离 ——基础知识和操作过程梳理 一、大肠杆菌 细菌是单细胞的原核生物。细菌细胞的结构有细胞壁、细胞膜、细胞质等。细菌无成型的细胞核，细胞壁由肽聚糖组成。由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。革兰氏阳性菌细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素；革兰氏阴性菌细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素。革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。 大肠杆菌是革兰氏阴性、异养兼性厌氧型肠道杆菌。在肠道中一般对人无害，但任何大肠杆菌进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用，它的质粒是最常用的运载体，它也是基因工程中常用的受体细胞。 二、培养基配置 微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。有的化合物既是碳源又是氮源、能源。生长因子是微生物生长不可缺少的微量有机物，但不一定需要外界补充，有的微生物可以自身合成。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。 我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分离。以下为本实验中培养基配置步骤： 1．称量：准确称取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。配置LB固体培养基时还需加1g琼脂。 2．溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。 3．调pH：用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。 4．灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。 5．倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。

大肠杆菌一般培养方法

使用牛肉膏蛋白胨培养基? 组成成分：牛肉膏 3g,蛋白胨 10g,Nacl 5g,琼脂 15～20g,水1000mL,～。? 具体配置步骤：? 1.称药品?按实际用量计算后,按配方称取各种药品放入大烧杯中.牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶解后倒入大烧杯;也可放在称量纸上称量,随后放入热水中,牛肉膏使与称量纸分离,立即取出纸片.蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速.? 2.加热溶解?在烧杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉网上,小火加热,并用玻棒搅拌,待药品完全溶解后再补充水分至所需量.若配制固体培养基,则将称好的琼脂放入己溶解的药品中,再加热融化,此过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出,最后补足所失的水分.? 3. 调pH?检测培养基的pH,若pH偏酸,可滴加lmol/L NaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸检测,直至达到所需pH范围.若偏碱,则用lmol/L HCl进行调节.pH 的调节通常放在加琼脂之前.应注意pH值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度.?

4.过滤?液体培养基可用滤纸过滤,固体培养基可用4层纱布趁热过滤,以利培养的观察.但是供一般使用的培养基,这步可省略.? 5.分装?按实验要求,可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内.分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染. 分装量:固体培养基约为试管高度的l/5,灭菌后制成斜面.分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜.半固体培养基以试管高度的1/3为宜,灭菌后垂直待凝.? 6.加棉塞?试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞.棉塞的形状,大小和松紧度要合适,四周紧贴管壁,不留缝隙,才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用.要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内,以防棉塞脱落.有些微生物需要更好的通气,则可用8层纱布制成通气塞.有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞.? 7.包扎?加塞后,将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸,以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞.若培养基分装于试管中,则应以5支或7支在一起,再于棉塞外包一层牛皮纸,用绳扎好.然后用记号笔注明,培养基名称,组别,日期.?

大肠杆菌的培养和分离

一、大肠杆菌的培养和分离 用__________扩大培养，再用__________分离，形成一个个单独的菌落。 __________培养基是细菌通用培养基；__________培养基是植物组织培养通用培养基2.细菌分离方法比较 __________分离法---方法简单； __________分离法—单菌落易分离，操作复杂 3.灭菌操作 ①灭菌操作的首要条件是各种器皿必须是无菌的 ②各种培养基必须是无菌 4.培养和分离步骤 __________→__________→__________培养__________分离→培养保存 5.灭菌与消毒 二、分离以尿素为唯一氮源的微生物 1.实验原理 （1）利用尿素的细菌含有__________，通过降解_______作为其生长的氮源，其反应式如下：（NH2）2C=O+H2O----脲酶→____________________2 （2）利用指示剂（______）颜色变化检验脲酶所催化的反应，若酚红由__________色变为__________色，证明尿素以被脲酶水解产生__________ 2实验步骤 制备__________培养基和以______为唯一氮源固体培养基→制备细菌__________，并稀释至10-3、10-4、10-5、10-6→__________分离→培养保存 注意：在恒温箱中培养时，培养皿要__________—防止凝结的蒸馏水滴到培养基上 3预测结果： ①LB全素固体培养基上__________； ②以尿素为唯一氮源固体培养基__________； ③一定时间内，菌落周围出现__________区域； ④用浓度为10-4和10-5土壤稀释液接种，__________土壤稀释液更容易形成单菌落。 高考及高考模拟题

大肠杆菌实验

大肠杆菌感受态细胞制备与质粒DNA的转化 一、实验目的 1）掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。 2）学习和掌握质粒DNA的转化和筛选方法及操作步骤。 二、实验原理 本实验以E.coli DH 5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pBS质粒共保温实现转化。由于所用pBS质粒带有长那霉素抗性基因。因此可以通过长那霉素抗性来筛选转化子。如果受体细胞没有转入pBS，则在含长那霉素的培养基上不能生长。能在长那霉素培养基上生长的受体细胞肯定已经导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳酶切等进一步鉴定。 三、仪器及试剂 仪器：恒温摇床、CO2细胞培养箱、台式高速冷冻离心机、超净工作台、低温冰箱、恒温水浴锅、制冰机、分光光度计、移液枪、Eppendrof管。 试剂：LB培养基(在950mL水中加入10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl、用1mol/L NaOH调制pH=7.2.加入至1L，121℃高压灭菌20min) 长那霉素储存液：100mg/mL 含长那霉素的LB固体培养基：(1L LB液体培养基中加入20g琼脂粉，将配好的LB固体培养基高压灭菌后，冷却至60℃左右，加入长那霉素储存液，使其终浓度为50μg/mL。摇匀后铺板，每皿倒15mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净) 1mol/L CaCl2储存液质粒DNA10ng/Μl 四、实验步骤 1 感受态细胞的制备 1）从LB平板上挑选新活化的E.coli DH 5α单菌株，接种于3~5mL LB液体培养基中，37℃下震荡过夜培养，12h左右，直至对数生长后期。

2）将该菌悬浮液以1:50的比例接种于5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h至OD600为0.5左右。 3）将5mL培养液转入4个1.5mL离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下，5000rpm离心5min。 4）弃去上清液，用预冷的1mL 0.1 mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15~20min后，40℃下5000rpm离心5min。 2 铺平板 将配好灭菌的LB固体培养基加热融化，待冷却至60℃左右后，加入长那霉素储存液，使其终温度为50μg/mL，摇匀后铺板，每皿倒约15mL。室温放置过夜至冷凝水挥发干净。 3 感受态细胞的转化 1）取100μl感受态细胞悬浮液，加入5μLpBS质粒DNA溶液，轻轻摇匀，冰上放置30min。 2）42℃水浴热激70s，热激后迅速置于冰上冷却3~5min。 3）向管中加入400μl LB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃震荡培养1h。使细菌恢复到正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。 4）将上述菌液摇匀，取200μl涂布于含长那霉素的筛选平板上，正面放置0.5h。待菌液完全被吸收后倒置培养皿，37℃培养16~24h， 5）对照实验： 对照组1：以同体积的无菌二次水代替DNA溶液，其他操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2：以同体积的无菌二次水代替DNA溶液，取5μl菌液，稀释100万倍，涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。 五、实验数据记录处理 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，各培养皿中的菌落数如下表所示：

大肠杆菌生化实验

细菌常用生理生化反应实验结果观察 一结果观察 １葡萄糖发酵实验 直接观察试管, 试管变黄者为葡萄糖发酵阳性菌,不变者为阴性菌. 左边为恶臭假单胞菌，有气泡并变为黄色；右边为大肠杆菌, ２V. P. 反应和甲基红试验: 将培养好的液体培养基分装于两个干净的小试管中,在一管中滴入2-3滴甲基红试剂, 溶液变红的为甲基红阳性菌,不变的为甲基红阴性菌. 在另一管中加入V. P. 试剂,在37℃保温15分钟, 变红者为阳性菌,不变者为阴性菌. VP，图为右边为大肠杆菌，溶液变红，为阳性菌。 ３吲哚实验 在培养好的液体培养基中加入1厘米高的乙醚,振荡,静置分层,加入2-4滴吲哚试剂,在掖面交界出现红色者为吲哚反应阳性菌,不变者为阴性菌.

左边为大肠杆菌，出现红色阳性菌；右边为产气杆菌，颜色不变，阴 性菌。 ４硝酸盐还原实验 在点滴板上滴入革里斯试剂A液和B液，如过溶液变红说明有亚硝酸盐，为硝酸盐还原阳性菌，如果不变色需要再倒出部分培养基在另外的小孔中再滴如耳苯胺试剂，如果变蓝，说明此菌为阴性菌；如果不变色，说明此菌为硝酸盐还原强阳性菌． 右下方恶臭假单胞菌，加入革里斯试剂A、B后不变色，再加入二苯 胺试剂后变蓝，为阴性菌；左上方大肠杆菌为红色。 ５柠檬酸盐实验 直接观察斜面，斜面变兰色者为柠檬酸盐利用阳性菌，不变者为阴性菌．

左边产生蓝色，产气杆菌阳性；右边为大肠杆菌，阴性。 ６明胶水解 向培养好的明胶培养基中加入酸性氯化汞或三氯乙酸溶液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为明胶水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌． 左边为大肠杆菌，出现透明圈，阳性；右边为枯草杆菌，阴性菌。 7 淀粉水解实验 向培养好的淀粉培养基平板上加入碘液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为淀粉水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌．

高中生物《大肠杆菌的培养和分离》学案1 浙教版选修1

高中生物《大肠杆菌的培养和分离》学案1 浙 教版选修1 一、大肠杆菌细菌是单细胞的原核生物。细菌细胞的结构有细胞壁、细胞膜、细胞质等。细菌无成型的细胞核，细胞壁由肽聚糖组成。由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。革兰氏阳性菌细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素；革兰氏阴性菌细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素。革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。大肠杆菌是革兰氏阴性、异养兼性厌氧型肠道杆菌。在肠道中一般对人无害，但任何大肠杆菌进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用，它的质粒是最常用的运载体，它也是基因工程中常用的受体细胞。 二、培养基配置微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。有的化合物既是碳源又是氮源、能源。生长因子是微生物生长不可缺少的微量有机物，但不一定需要外界补充，有的微生物可以自身合成。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分离。以下为本实验中培养基配置步骤：

1、称量：准确称取各成分。蛋白胨0、5g，酵母提取物0、25g，氯化钠0、5g，加水50ml。配置LB固体培养基时还需加1g 琼脂。 2、溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。 3、调pH：用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。 4、灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。 5、倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。向培养皿中转移已灭菌的培养基时，也不要把培养基沾在皿壁上。否则，空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。 三、灭菌和消毒

大肠杆菌微生物培养实验报告及评价标准

实验1 微生物的分离、培养及计数 实验原理 纯化分离：人为提供适宜的菌落生长的条件（包括营养、温度、Ph 等）。用平板划线法，通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞菌落。 筛选：转基因大肠杆菌有抗氨苄青霉素基因，所以在含有氨苄青霉素的LB 培养基中可以正常繁殖长成菌落。而普通的大肠杆菌没有抗氨苄青霉素基因，咋含有氨苄青霉素的LB 培养基中不能繁殖。由此可进行大肠杆菌的筛选。 梯度稀释并计数：通过浓度梯度稀释把液体培养基培养的大肠杆菌稀释到一定浓度，用稀释涂布平板法，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。由此可计数计算大肠杆菌的数量。 实验目的 1. 通过制备LB 固体培养基，对平板进行划线等，学会使用固体LB 平板。 2. 通过用液体培养基，学会对微生物进行扩大培养。 3. 通过稀释，学会用计数器对微生物进行计数。 实验材料和药品 待分离的大肠杆菌菌液、高压蒸汽灭菌锅、LB 固体培养基、LB 液体培养基、接种环、玻璃涂布器、培养皿、恒温培养箱、摇床、酒精灯、无菌水、移液枪、EP 管 实验步骤（用简单的流程图表示）

实验数据的记录与分析（如照片、表格等） 稀释倍数104105 大肠杆菌单个菌落个数837799111812 平均数86.313.7 浓度 1.726×1070.274×107 实验结果与讨论 结果：稀释了105计算出来的结果约为1.726×107ml/cm^3 稀释了104计算出来的结果约为0.274×107ml/cm^3 全组数据计算出来结果为2.233×107ml/cm^3 讨论： 在稀释倍数为104的试验中大肠杆菌菌落较少，原因可能是在稀释过程操作中，震荡不够，而且由于不小心洒了半管104稀释液，所以取液接种的时候底层的大肠杆菌数量偏少了。也有可能是靠近酒精灯附近使得温度升高杀死了一部分细菌或者降低了活性。 从实验图片中可以看出，涂布过程中由于操作失误导致固体培养基上不平滑，有多处破损，细菌在破损处的生长大多是不规则的连续紧挨在一起的，所以不便于菌落的计数，也会影响最终实验数据。 课后提问 使用稀释涂布平板计数法，计算出来的细菌数量与实际相比是偏大还是偏小呢？误差有多

大肠杆菌的保存与培养

一．菌种的保存 重组DNA 分子(质粒、噬菌体、粘性质粒)必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。 通常采用宿主菌是大肠杆菌，根据不同载体需求，选用不同品系大肠杆菌 1. 概述：大肠杆菌其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此，而变异性，使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变，给菌种保藏带来了困难。由于存在变异，即菌种常出现所谓的退化，主要指理想性状的丧失，从而导致发育缓慢，存活率和产质量降低等现象，菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌。能够长期在研究上应用。 2. 微生物的变异速度，通常情况下，与其新陈代谢速度有关，微生物代谢活力旺盛，它的变异速度快，代谢活动微弱，变异速度就慢。并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的积累。人们利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物活动处于微弱活动或不活动状态，以减少变异的发生。 3. 菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的 改变外，还不允许污染任何杂菌。此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。 4. 常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等保护剂。 5. 甘油低温保存法(－70℃—－196℃)的特点 i. 甘油菌低温保存的基本原理是：在-70℃或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。在0℃—-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。因此，为了避免0℃—-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌. ii. 使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后贮存于-70℃或液氮中。复苏后细菌仍能生长，活力不受任何影响。 二、菌种的复苏 复苏菌种时，用接种环或牙签挑取少许冻结的菌种到平皿上，37℃培养8-12小时即可。甘油菌从冰箱取出使用时应置于低温或0℃冰浴中，用完尽快放回，接种时挑取表面已融化部分即可，不可全溶，因反复冻融会导致细胞壁破裂。

大肠杆菌实验报告

大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选 0740063 阿噟兰 1.前言 抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。DNA 对紫外线（UV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式有DNA 链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265 nm。选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。 在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。 紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。 因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。 2.材料和方法 实验材料、仪器和试剂 菌种：大肠杆菌 仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器 试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水 实验方法 2.2.1制备培养基 普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基（400ml）： 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min，倒平板，4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml 筛选培养基(200ml)：含抗生素50mg/L。（卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，能结合细菌核糖体的30S亚基上的16SrRNA，阻断细菌蛋白质的合成。） 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml），按配方先不要加硫酸卡那霉素配制然后115℃15min灭菌，取出培养基后冷却至60℃时将硫酸卡那霉素加入培养基中，充分震荡混匀，倒平板，2皿*15ml*5组+2皿*15ml=12皿*15ml=180ml 2.2.2制备菌悬液（106 ~ 108个/mL） ①固体培养：大肠杆菌划线或涂布接种于固体培养基，37℃培养24-48h。 ②菌悬液：用适量生理盐水刮洗菌落，倒入一个无菌小三角瓶（或试管）中，充分振荡使菌

实验1 大肠杆菌的培养和分离.doc

实验1 大肠杆菌的培养和分离 ——基础知识和操作过程梳理一、大肠杆菌细菌是单细胞的原核生物。细菌细胞的结构有细胞壁、细胞膜、细胞质等。细菌无成型的细胞核，细胞壁由肽聚糖组成。由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。革兰氏阳性菌细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素；革兰氏阴性菌细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素。革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。大肠杆菌是革兰氏阴性、异养兼性厌氧型肠道杆菌。在肠道中一般对人无害，但任何大肠杆菌进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用，它的质粒是最常用的运载体，它也是基因工程中常用的受体细胞。二、培养基配置微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。有的化合物既是碳源又是氮源、能源。生长因子是微生物生长不可缺少的微量有机物，但不一定需要外界补充，有的微生物可以自身合成。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对ph、特殊营养物质以及氧气的要求。我们一般用lb液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在lb固体培养基上划线分离。以下为本实验中培养基配置步骤： 1．称量：准确称取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。配置lb固体培养基时还需加1g 琼脂。 2．溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50ml。配置lb固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊

底而导致烧杯破裂。 3．调ph：用1mol/l naoh溶液调节ph至偏碱性。 4．灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml lb液体培养基和50ml lb固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。 5．倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。向培养皿中转移已灭菌的培养基时，也不要把培养基沾在皿壁上。否则，空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。 三、灭菌和消毒 1．无菌技术：①对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；②将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；③为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰旁进行； ④避免已灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 2．消毒方法：①日常生活经常用到的是煮沸消毒法；②对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法；③对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后使用紫外线进行物理消毒；④实验操作者的双手使用酒精进行消毒。 3．灭菌方法：①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；②培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅；③表面灭菌和空气灭菌等使

大肠杆菌微生物培养实验报告及评价标准

实验原理 纯化分离：人为提供适宜的菌落生长的条件（包括营养、温度、Ph 等）。用平板划线法，通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞菌落。 筛选：转基因大肠杆菌有抗氨苄青霉素基因，所以在含有氨苄青霉素的LB 培养基中可以正常繁殖长成菌落。而普通的大肠杆菌没有抗氨苄青霉素基因，咋含有氨苄青霉素的LB 培养基中不能繁殖。由此可进行大肠杆菌的筛选。 梯度稀释并计数：通过浓度梯度稀释把液体培养基培养的大肠杆菌稀释到一定浓度，用稀释涂布平板法，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。由此可计数计算大肠杆菌的数量。 实验目的 1. 通过制备LB 固体培养基，对平板进行划线等，学会使用固体LB 平板。 2. 通过用液体培养基，学会对微生物进行扩大培养。 3. 通过稀释，学会用计数器对微生物进行计数。 实验材料和药品 待分离的大肠杆菌菌液、高压蒸汽灭菌锅、LB 固体培养基、LB 液体培养基、接种环、玻璃涂布器、培养皿、恒温培养箱、摇床、酒精灯、无菌水、移液枪、EP 管 实验步骤（用简单的流程图表示） 实验数据的记录与分析（如照片、表格等）

实验结果与讨论 结果：稀释了105计算出来的结果约为×107ml/cm^3 稀释了104计算出来的结果约为×107ml/cm^3 全组数据计算出来结果为×107ml/cm^3 讨论： 在稀释倍数为104的试验中大肠杆菌菌落较少，原因可能是在稀释过程操作中，震荡不够，而且由于不小心洒了半管104稀释液，所以取液接种的时候底层的大肠杆菌数量偏少了。也有可能是靠近酒精灯附近使得温度升高杀死了一部分细菌或者降低了活性。 从实验图片中可以看出，涂布过程中由于操作失误导致固体培养基上不平滑，有多处破损，细菌在破损处的生长大多是不规则的连续紧挨在一起的，所以不便于菌落的计数，也会影响最终实验数据。 课后提问 使用稀释涂布平板计数法，计算出来的细菌数量与实际相比是偏大还是偏小呢？误差有多大？有没有误差更小的更准确的方法来计数？

大肠杆菌培养实验报告

大肠杆菌培养实验报告 篇一：大肠杆菌检测实验报告 国标法测定大肠杆菌样本的细菌总数 实验目的 实验原理：国标法操作的原理 实验器材： 培养箱，10只移液管，1只250ml锥形瓶，5只大试管，试管架，4个平皿，500ml大烧杯1个，电子天平，纱布，脱脂棉，灭菌锅，PH计或PH试纸，100ml量筒，橡皮手套，超净台 实验药品： 磷酸盐缓冲液，蒸馏水，LB培养基，琼脂，5%NaOH，5%HCl 实验步骤： 一： 10只移液管，1只250ml锥形瓶，5只大试管，4个平皿，500ml大烧杯1个，100ml量筒进行洗涤，然后一起放入高压蒸汽灭菌锅中在121摄氏度条件下灭菌20min。灭完菌后烘干，完成后放入超净台中。 用酒精擦拭超净台，紫外消毒30min 二： 1：用电子天平称取成品LB 3.1241g和琼脂1.8756g放入250ml的洁净锥形瓶中。 2：用量筒量取125ml的蒸馏水

加入该锥形瓶中，制成培养基。 3：用棉花堵住该锥形瓶的瓶口，用牛皮纸包住瓶口，用橡皮筋扎牢，再将培养基放入灭菌锅中在121摄氏度之下灭菌20min。 4：灭完菌后放入超净台中备用。 三： 1：取1只无菌250ml锥形瓶，用量筒向其中加入49ml PBS 2：将1ml样品加入到该锥形瓶中，摇匀制成1:50的细菌溶液。 3：取4只试管，编号1—4 4：用无菌移液管分别向4只试管中加入9ml的PBS 5：用1ml无菌移液管从样品中移取1ml菌液加入到1中.震荡试管使菌液均匀。 6：用1ml无菌移液管从1号试管中移取1ml的细菌溶液加入2号试管中，摇匀 7：用另一只1ml无菌移液管从2号试管中移取１ｍｌ细菌溶液，加入3中，摇匀．．．．．．以此类推直至4只试管中均加入了细菌溶液。 9：取4只平皿，编号1—4 10：分别用4只无菌移液管从这4只试管中移取１ｍｌ的菌液置于4只平皿中，加入４５—５０摄氏度温度下的培养基，约１５ｍｍ厚度。缓慢旋转平皿使菌液与培养基混合均匀；待培养基冷凝后倒置。